Summary
여기에서, 우리는 주사 전자 현미경 검사법 (SEM)를 사용하여 섬세한 조직 견본을 화상 진찰을 위한 상세한 처리 프로토콜을 제시합니다. 세 가지 다른 처리 방법, 즉, hexamethyl disilazana (HMDS) 화학 건조, 간단한 공기 건조 및 임계 점 건조는 각각 경질 계란 껍질, 초기 발달 단계에서 배아 및 곰팡이 배양을 준비하기 위해 설명됩니다.
Abstract
주사 전자 현미경 검사법 (SEM)은 다양한 생물학적 및 비 생물학적 샘플의 초구조 적 분석에 널리 사용되고 있지만, 다른 생물학적 샘플 처리에 관련된 방법은 독특한 관행을 포함한다. 샘플 처리를 위한 문헌에 설명된 모든 기존 관행은 여전히 유용한 응용 프로그램을 찾을 수 있지만 샘플 준비의 미묘한 변화는 이미지 품질을 변경하고 아티팩트를 도입할 수 있습니다. 따라서, 분석된 조직의 종류에 특이적인 독특한 시료 제제 기술을 사용하여 초구조적 분해능으로 양질의 이미지를 얻을 필요가 있다. 이 연구의 초점은 SEM을 사용하여 화상 진찰 배아, 단단한 계란 껍질 및 곰팡이 문화를 위한 최적 견본 준비 프로토콜을 제공하기 위한 것입니다. 연구된 세 가지 섬세한 생물학적 샘플에 대해 좋은 결과를 얻으려면 다음 최적화가 권장되었습니다. 4% 파라포름알데히드 또는 3% 글루타랄데히드와 같은 더 온화한 고정식을 사용하고 에탄올 시리즈를 사용한 탈수증이 필수적입니다. 슬라이드 배양에 의해 얻어진 한천 블록에 곰팡이 균사체는 한천 플레이트에서 직접 가져온 배양에 비해 더 나은 초구조적 무결성을 산출합니다. HMDS를 사용하여 배아의 화학적 건조는 임계 점 건조에 비해 표면 장력 아티팩트를 도입하지 않고 건조를 제공합니다. HMDS는 시료가 건조 중에 덜 부서지기 때문에 수축으로 인한 균열을 방지합니다. 그러나 곰팡이 배양의 경우, 임계 점 건조는 화학 적 건조에 비해 허용 가능한 이미지 품질을 제공합니다. 달걀 껍질은 장착 전에 철저한 세척 및 공기 건조를 제외하고는 특별한 준비 단계없이 이미지화 할 수 있습니다. 준비 방법론은 각 시험에서 얻은 허용 가능한 이미지 품질에 기초하여 표준화되었다.
Introduction
주사 전자 현미경 (SEM) 초구조 분석 및 세포 내 이미징 은 원핵 생물, 식물 및 동물의 3 차원 프로파일링을위한 광 현미경 검사법을 보완합니다. SEM의 높은 공간 해상도는 나노미터에서 마이크로미터 척도까지 시편의 미세 구조적 특성을 검사하는 데 사용할 수 있는 가장 다재다능하고 강력한 기술 중 하나입니다. 건조 된 표본은 기능적 관계에 대한 유효한 결론을 개발하기위한 기초를 제공하는 강렬한 세부 사항으로 조성및 지형 구조로 해결1,2,3 , 4개 , 5개 , 6개 , 7명 , 8개 , 9. 생물학적 표본의 SEM 이미지를 해석 할 때, 그것은 네이티브 구조와 처리 중에 생성 된 유물을 구별하는 큰 도전이다. SEM은 일반적으로 샘플10,11로부터방출되는 1차, 이차 또는 역산 전자 빔에 영향을 미치는 가스 분자로부터의 어떠한 간섭을 피하기 위해 매우 높은 진공에서 작동한다. 또한 생물학적 물질은 가난하거나 비전도성 특성으로 인해 방사선 손상에 취약합니다. SEM에 적재된 시편은 고진공환경(10,11)에서발생하는 모든 배출을 제거하기 위해 모든 유기 오염물질이 완전히 건조되고 프리되어야 한다. 생물학적 표본은 대부분 물로 구성되어 있기 때문에, 네이티브 구조물이 유지되도록 하기 위해 추가적인 준비 기술이 필요합니다.
얻어진 해상도는 시편 유형 및 활용된 기악 파라미터에 특정한 준비 방법을 최적화하는 데 기반을 두고 있습니다. 따라서 모든 조직 유형에 대해 일반화 된 처리 단계를 사용하지 않아도됩니다. 일부 생물학적 표본은 구조를 보존하기 위해 덜 엄격한 처리가 필요하며 수축 및 붕괴와 같은 건조 아티팩트의 도입을 피하기 위해 섬세한 유형의 시료에 더 많은 시간과 주의가 필요할 수 있습니다. 시료 전처리는 SEM 이미징에서 중요한 단계입니다. 형태측정 연구의 결과는 표본 준비 절차12,13에의해 현저하게 영향을 받습니다. 많은 생물학적 시료에 대한 일반적인 준비 단계는 금, 백금 또는 팔라듐과 같은 금속으로 고정, 탈수 및 코팅을 통해 표면을 SEM 분석을 위한 전도성으로 변환합니다. 사용된 단계의 성질 및 조합은 조직의 유형 및 연구의 특정 목표에 따라 달라질 것이다. 전하 축적, 진공 및 전자 빔 손상에 대한 민감성은 부드러운 섬세한 생물학적 샘플을 처리할 때 문제를 야기하며, 물체의 기본 구조를 유지하기 위한 추가 처리 단계가 필요합니다. 오스뮴 테트옥사이드 고정, 탈수 등의 종래의 방법을 사용하여 14,15,16,17의섬세한 조직의 수축 및 붕괴를 야기한다. 이 연구의 목적은 초기 연구의 아이디어를 준비하고 이미지화하기 위한 수정과 결합하여 파생된 우아한 방법론을 확립하는 것입니다(예: 파충류 배아, 페인트거북이의 달걀 껍질, 곰팡이 문화).
적합한 고정 방법의 선택은 생물학적 표본의 현미경 분석을위한 첫 번째 가장 중요한 단계입니다. 유기체로부터 분리 된 직후 조직을 고정하는 것은 분해로 인한 형태 변경을 방지하는 데 필수적입니다. 효과적인 고정식은 세포에 신속하게 침투하여 세포 과정을 종료하고 SEM17하에서 후속 처리 단계 및 검사를 모두 견딜 수 있도록 시료의 구조를 안정화시키는 효과를 비가역적으로 유지해야 합니다. , 18. 여러 화학 적 및 물리적 고정 방법이 알려져 있지만, 화학 적 고정은 자동 용해, 부패 및 건조 효과로 인한 세포 변화를 피하기 위해 생물학적 표본에 더 일반적으로 사용됩니다. 문학17,19,20,21,22,23,변성 및 생물학적 거대 분자를 응고하고, 공유적으로 가교하는 거대 분자에 의해 고쳐진 분자. 알코올은 매우 가난하게 초구조를 보존하는 변성 고정제로 사용되며 주로 가벼운 현미경 검사법에 사용되며 전자 현미경 분석에는 권장되지 않습니다. 포름알데히드, 글루타랄데히드 및 오스뮴 테트옥사이드와 같은 가교 고정제는 조직 내의 거대 분자 간에 분자 간 및 분자 간 가교를 생성하여 초구조체11의 우수한 보존을 제공합니다. ,24,25,26. 생물학적 샘플은 온도에 민감합니다. 고정의 시작 부분에 온도는 막 단백질의 측면 이동성을 감소시키고, 세포 간 분자의 확산을 늦추고, 고정 속도(11)를느리게 하기 위해 4°C로 하는 것이 좋습니다. 조직 을 고정하는 데 필요한 시간은 주로 시료의 크기와 고정이 시편의 구성 요소와 반응하는 속도에 달려 있습니다. 4°C에서 PBS에서 4% 파라포름알데히드 또는 3% 글루타랄데히드의 하룻밤 고정은 더 작은 섬세한 샘플을 처리 할 수 있도록 순차적 침투 특성에 대해본 연구에 사용되는 표본의 SEM 분석을위한 바람직한 방법입니다17 , 18세 , 19세 , 20개 , 27. 오스뮴 테트옥사이드를 이용한 사후 고정 단계는 독성 특성으로 인해 제거될 뿐만 아니라 본 연구에서 분석된 샘플의 이미지 품질을 향상시키는 추가적인 이점을 구현하지 못하는 것으로 나타났다.
생물학적 샘플에는 SEM 작동을 방해하는 유체가 포함되어 있습니다. 따라서 샘플을 SEM 샘플 챔버에 삽입하기 전에 건조해야 합니다. 탈수가 보장되면 표면 장력/건조로 인해 시편에 아티팩트를 만들지 않고 조직에서 용매를 제거해야 합니다. 세 가지 다른 건조 방법은 SEM 이미징을위한 조직을 처리하는 동안 일반적으로 사용되었다 : 공기 건조, 임계 점 건조, 및 동결 건조 샘플28,29,30,31. 동물 조직 샘플28,29,30,31과동일한 결과를 생성하는 세 가지 건조 방법 모두를 보고하는 연구는 거의 없습니다. 더 작은 견본을 위해 이용되는 일반적인 방법은 알콜과 hexamethyldisilazane (HMDS)의 상승 농도 시리즈에 의하여 화학적 탈수입니다, 그러나 더 큰 견본은 임계 점 건조 (CPD) 계기32를사용하여 건조됩니다. 건조 과정에서, 액체/기체 계면에 의해 시편을 통과하는 작은 공동에서 형성된 상당한 힘; 이것은 심지어 중공 구조(33)의완전한 붕괴로 이어질 수 있습니다. 처리로 인해 발생하는 모든 변형은 시편의 기본 구조 적 특징으로 오인 될 수 있습니다. 따라서, 처리를 위한 일반화현상은 제거되어야 하고 섬세한 조직 견본이 분석될 때 특히 조직의 각 모형을 위한 유일한 건조 프로세스가 표준화되어야 합니다.
위에서 언급한 모든 프로세스의 다양한 조합을 사용하여 수행된 여러 시험에서 파충류 배아, 페인트 거북이의 달걀 껍질 및 곰팡이 배양이라는 세 가지 섬세한 조직의 SEM 분석에 사용할 수 있는 방법을 표준화했습니다. 발달 생물학자와 형태학자는 대표적인 척추동물에서 배아 발달 중에 정상적이고 비정상적인 형태 형성을 설명합니다. 유전자 신호 통로에 대한 조사는 새로운 구조의 형태학적 설명에 달려 있습니다. SEM 분석 도중 척추동물 배아 구조에 있는 어떤 급격한 변경든지 피하기 위하여는, 우리는 탈수다음 화학건조를 추천합니다. HMDS를 이용한 화학건조는 비교적 최신의 건조 방법이며 상대적 민첩성, 사용 편의성, 비용손실, 필요한 제한된 전문 지식 및 장비 9. CPD는 특정 온도 및 압력에서 시편에 걸쳐 CO2를 통과하는 것을 사용하여 일반적으로 사용되는 건조 기술입니다. 우리는 HMDS가 연약한 섬세한 조직을 건조시키기에 적합하고 배아 조직에 광대한 변형을 일으킨 임계 점 건조에 비해 더 큰 샘플을 가공할 수 있다는 것을 확인했습니다. 몇몇 방법은 균류34의형태학적 특성을 공부하기 위하여 SEM 화상 진찰을 위한 견본을 준비하기 위하여 이용되었습니다. 곰팡이 시편은 일반적으로 오스뮴 테트옥사이드에 고정된 후 에탄올 탈수 및 임계 점 건조가 뒤따르며, 이는 오스뮴 테트옥사이드6,7,35의 독성 효과가 있지만 만족스러운 결과를 제공할 수 있습니다. 처리 하는 동안 솔루션을 변경 하는 동안 곰 팡이 재료를 잃고 단점이 발음 된다. 고정없이 공기 건조를 이용한 시료 전처리 기술도36개 시행되었으나 수축 및 붕괴된 구조물을 초래하며, 이러한 시편의 관찰은 종을 특성화하면서 쉽게 잘못 해석될 수 있다. 곰팡이 하이pha는 액체와 접촉하는 무결성을 잃고 심지어 건조는 구조를 복원하기 위해 달성되지 않을 수 있습니다. 이 효과 로 인해, 동결 건조는 일반적으로 곰 팡이 균 사 체와 같은 연약한 조직을 건조에 사용 됩니다. 동결 건조는 깨끗한 재료에 적합하지만 염이나 분비물의 존재는 SEM 보기 단계에서만 식별되는 표면 세부 사항을 모호하게 합니다. 우리는 글루타랄데히드 고정 및 임계 점 건조와 슬라이드 배양 방법을 결합하여 손상되지 않은 곰팡이 하이페 및 포자의 구조적 세부 사항을 산출합니다. CPD 건조는 배아의 수축을 일으켰지만, 글루타랄알데히드 고정과 결합될 때 잘 보존된 균사 구조가 발생했습니다. 달걀 껍질은 보호 커버링 역할을 할뿐만 아니라 기계적 안정성, 가스와 물에 대한 투과성 및 개발 배아를위한 칼슘 예비를 제공함으로써 oviparous 동물의 배아에 1 차적으로 중요합니다. 민물 거북 달걀 껍질은 구조에 따라 "경직된"으로 분류되며, 그가용성으로 인해 생물학자 1, 2,3,4에서 상당한 관심을 받고 있습니다. , 5개 , 6개 , 7명 , 37세 , 38.
우리는 어떤 단단한 계란 껍질 종에 적용 할 수있는 페인트 거북이의 계란 껍질과 껍질 막의 쉬운 검사를위한 간단한 방법을 자세히 설명합니다. 준비 방법론은 결과이미지 품질과 감소된 잠재적 아티팩트를 기반으로 평가되었습니다.
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Protocol
참고 : 이 연구에 사용되는 페인트 거북이(Chrysemys picta)계란은 뉴욕 주 환경부로부터 얻은 허가를 받아 2015-16 년 5 월부터 6 월까지 뉴욕 주 라이스 크릭 필드 스테이션에서 수집되었습니다. 보존 (12 월).
1. SEM용 배아를 처리하는 화학 건조 방법
- 둥지 시즌 동안 필드 사이트에서 거북이 계란을 수집합니다. 뚜껑 (L x W x H) 6.7 cm x 25.4 cm x 10.2 cm버미와 토탄 모스 (1 :1 비율)의 촉촉한 혼합물로 준비 침구 매체로 채워진 플라스틱 상자로 만든 미리 배양 챔버를 준비합니다. 상자의 측면과 뚜껑을 따라 약 0.25cm의 4-6 구멍을 만들어 폭기를 허용합니다.
- 둥지에서 토양을 부드럽게 제거하여 알을 발견하십시오. 배양 중에 미생물 오염을 제어하기 위해 희석 된 요오드 팅크 (1:25,000)로 거북이 계란의 표면을 닦으십시오. 클러치는 서로 분리놓고, 그려진 거북이의 클러치 크기는 5~9개의 달걀과 상자당 최대 8~9개의 달걀을 놓는다.
참고 : 수집, 닦기, 라벨 링 및 상자 내부에 배치하는 동안 계란을 조심스럽게 처리하십시오. 계란의 위치 및 정렬은 누워 있던 것과 동일해야 하며, 어떤 운동도 배아 발달을 억제합니다. - 계란을 침구에 반으로 직접 묻고, 30°C로 설정된 인큐베이터 내부에 상자를 덮고 놓습니다. 이 연구에서 각각 사용되는 배아 단계 12, 13 및 18을 얻기 위해 10-17일 동안 난자를 배양하였다. 증류수를 첨가하여 매일 침구 매체를 부분적으로 적시고 탈수를 방지하고 배아의 정상적인 발달을 위해 수분 수준을 유지합니다.
참고: 배양 및 발판 배아는39이전 간행된 완전한 발달 표에 따라 입니다. - 뾰족한 가위를 사용하여 등쪽 달걀 껍질과 노른자 멤브레인의 한쪽에 첫 번째 컷을 만들어 긴 축으로 수직으로 고정시킵니다. 배아 디스크를 절단하지 않도록 조심스럽게 노른자에 가위를 삽입합니다. 이제 긴 축을 따라 계란의 측면을 잘라 다음 짧은 축을 따라 계란의 다른 쪽을 잘라.
- 껍질을 벗기고 배아 측을 위로 밀어 내어 적당히 열어 보냅니다. 달걀 껍질의 다른 측면을 잘라 내고 절제 된 조각을 인산염 완충 식염수 (7.4의 pH에서 PBS)에 넣습니다.
참고 : 거북이 달걀은 점성이 높은 달걀 노른자로 채워지고 배아의 등쪽은 달걀 껍질 막에 부착됩니다. 배아 근처의 달걀 껍질 막은 반투명 한 흰색에서 불투명한 백악질 흰색으로 배양으로 바뀝습니다. 이를 통해 긴 축의 중심에 배아를 찾아내고외부(40,41)로부터어두운 석회화된 반점으로 볼 수 있다. - 입체 현미경을 사용하여 집게를 사용하여 달걀 껍질에서 껍질을 벗겨 노른자 막과 함께 배아를 분리하십시오. 집게와 마이크로 가위를 사용하여 배아 외 막을 제거하십시오. 배아 숟가락을 사용하여 배아를 페트리 접시에 신선한 PBS로 옮겨 혈액이나 노른자를 씻으시다.
- 명확한 12 웰 플레이트를 사용하여 4 °C또는 PBS에서 2-3 % 글루타랄데히드에서 PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드에서 밤새 배아를 고정하십시오. 배아의 크기에 따라 각 우물에 1~3개의 배아를 놓습니다. 2-3 일 동안 고정 시간을 연장하여 오래된 배아에 대한 완전한 침투 (샘플이 흰색으로 나타납니다)를 확인하십시오. 신선한 PBS로 배아를 3x 5분 동안 헹구고 헹구어 보시고 자합니다.
참고: 폴리에스테르 메쉬 하의가 있는 폴리스티렌 인서트를 사용하여 12웰 플레이트에 폴리스티렌 인서트를 사용하여 한 용매에서 다른 용매로 시편을 옮기십시오. - 증류수에서 일련의 에탄올 농도를 사용하여 샘플을 탈수: 30%, 50%, 70%, 80%, 95%, 및 100% 각 탈수 용액에서 1시간 동안 샘플을 치료한다. 완전한 탈수성을 보장하기 위해 100% 에탄올로 단계를 두 번 반복합니다. 즉시 사용하지 않을 경우 샘플을 -20°C에서 70% 에탄올로 장기간 보관하십시오.
- 일련의 hexamethyldisilazana (HMDS)를 사용하여 건조 배아를 100% 에탄올 농도: 1:2, 2:1 및 100%. 샘플을 각 용액에 20 분 동안 두고 페트리 접시를 부분적으로 덮어 둡니다.
참고: HMDS는 독성이 매우 높기 때문에 필요한 개인 보호 장비를 갖춘 연기 후드에 HMDS와 관련된 모든 단계를 수행하십시오. - 배아를 최종 100% HMDS 용액에 완전히 또는 부분적으로 덮은 후 하룻밤 동안 HMDS 증발을 돕고 샘플을 장착 및 스퍼터 코팅에 사용할 준비가 남겨 둡니다. 샘플을 통해 먼지가 침전을 제거하기 위해 접시를 덮습니다.
참고 : 조직은 완전한 건조 후 흰색으로 나타나고 부분적으로 건조 된 샘플은 노란색으로 보이며, 이 조직을 연기 후드에 더 오랜 시간 동안 둡니다. - 분석된 샘플크기당 알루미늄 스텁 및 탄소 접착제 테이프의 크기를 선택합니다. 이중 스틱 탄소 전도성 테이프(12mm)를 사용하여 말린 샘플을 표준 알루미늄 핀 스텁(12.7mm x 8mm)에 조심스럽게 장착합니다.
- 스퍼터 코터의 챔버에 장착 된 샘플을 도입하여 전하 효과를 제거하기 위해 매우 얇은 금 막으로 시편을 코팅하십시오. 금 판 은 35 mA 스퍼터에서 60-120 s의 표본을 플레이트.
- 세트 나사를 단단히 고정하여 스텁을 해당 모공 플레이트에 장착합니다. 샘플 교환 도구를 사용하여 샘플 홀더를 SEM의 샘플 챔버 로 또는 밖으로 이송합니다. 10kV의 가속 빔 전압과 방출 전류 10 μA로 고진공 모드에서 샘플을 이미지화합니다.
참고: 시료, 시료 홀더, 마운팅 스텁 및 이송 도구를 취급하는 동안 항상 장갑을 착용하여 손에서 SEM 시스템으로의 그리스 오염을 방지하십시오. - 위의 절차에서 얻은 표본의 분해능을 비교하기 위해 아래에 나열된 대체 기술을 테스트합니다.
- 1.7단계 후 실온에서 1% 오스뮴 테트옥사이드를 함유한 후 고정을 포함합니다.
- HMDS의 빠른 신속한 증발을 위해 1.10단계에서 HMDS를 부분적으로 또는 완전히 제거합니다.
- 3.3-3.4단계까지 임계점 건조(CPD)를 이용하여 1.8단계 후 배아를 처리한다.
2. 공기 건조 방법을 사용하여 SEM용 달걀 껍질 준비
- 1.1-1.7단계에 명시된 대로 배아를 고치기 위해 그려진거북이(Chrysemys picta)알을 수집하고 배양한다.
- 2.1단계에서 배아 고정 후 증류수에 달걀 껍질을 저장합니다. 노른자와 알부민 오염을 제거하기 위해 적어도 1 시간 동안 증류수에 담가 달걀 껍질을 철저히 청소하십시오.
- 밤새 연기 후드에 섬세한 정전기 방지 물티슈를 씻은 후 공기 건조 계란 껍질. 말린 달걀 껍질을 번호와 단계로 표시된 깨끗한 표본 병에 보관하십시오.
- 1.11-1.13 단계에 명시된 단계에 따라 시편을 장착, 스퍼터 코팅 및 이미지화합니다.
3. SEM을 위한 곰팡이 배양준비를 위한 임계점 건조방법
- 슬라이드 문화대 설정
- 곰팡이 배양을 위한 감자 덱스트로스 한천(PDA) 배지 준비: 에를렌마이어 플라스크에 증류수 1L에 PDA 전력 39g을 추가합니다. 플라스크를 소용돌이치며 30분 동안 121°C에서 매체를 오토클레이브합니다.
참고 : 살균 후, 한천 용액은 뜨거워야하며 곧 굳어지지 않을 것입니다. 항생제를 비활성화하지 않도록 충분히 식힙니다. - 소용돌이로 섞어서 접시(각 10cm 페트리 접시마다 약 10-12 mL의 용지)를 붓고 조심스럽게 쌓아 고체화시워 주세요.
- 멸균 메스 블레이드를 사용하여 한천의 작은 블록을 1/2에서 3/4 인치 정도 잘라냅니다. 한천 블록을 제거하고 깨끗한 유리 현미경 슬라이드에 놓습니다.
- 슬라이드를 깨끗한 페트리 접시에 놓아 오염을 방지하고 배양 중에 수분을 보존합니다.
- 멸균 이쑤시개를 사용하여 페트리 접시 의 바닥에서 슬라이드를 들어 올려 플레이트와 슬라이드 사이의 표면 장력을 만들어 배양 후 섬세한 성장을 방해하지 않고 유리 슬라이드를 제거합니다.
- 멸균 루프 또는 바늘을 사용하여 시편 접종에서 슬라이드의 한천 블록의 네 면 각각으로 곰팡이의 일부를 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 사용한다.
- 접종 후 한천 블록의 표면에 깨끗한 커버 슬립을 놓습니다. 슬라이드 주변의 페트리 접시에 멸균 증류수 몇 방울을 떨어뜨려 성장하는 곰팡이의 수분을 보장합니다.
- 파라핀 필름을 사용하여 플레이트를 부분적으로 밀봉하고 적절한 시간 동안 플레이트를 30 °C에서 배양하십시오 (푸사리움 종은 36 ~ 48 h동안 배양하십시오).
- 페트리 접시에서 슬라이드를 제거하고 멸균 집게를 사용하여 한천 블록에서 단단히 부착 된 커버 슬립을 분리합니다. 한천 블록을 PBS에서 3% 글루타랄데히드에서 밤새 4°C에서 고정한다.
- 곰팡이 배양을 위한 감자 덱스트로스 한천(PDA) 배지 준비: 에를렌마이어 플라스크에 증류수 1L에 PDA 전력 39g을 추가합니다. 플라스크를 소용돌이치며 30분 동안 121°C에서 매체를 오토클레이브합니다.
- 에탄올 계열을 통과하여 샘플을 탈수: 10%, 25%, 50%, 75% 및 90% 변화당 15분. 100% 에탄올에서 각각 30분 간 지속되는 두 가지 변화로 최종 탈수시 시료를 처리하여 완전한 포화를 보장합니다.
- 임계 점 건조: 탈수된 샘플을 CPD 장치의 챔버에 놓습니다. 액체 CO2가 챔버를완전히 채울 때까지 밸브를 열고 액체 CO2를 배출하고 에탄올을 배출하도록 밀봉하여 챔버를 냉각시웁니다.
- 챔버 압력이 1000 psi를 초과하고 온도가 31 °C를 초과할 때 임계 점을 달성하기 위해 챔버를 천천히 밀봉하고 가열하며, CO2의 액체 및 기체 상은 평형상태입니다. 표면 장력의 영향을 피하기 위해 챔버와 샘플을 가스로 서서히배출합니다.
- 1.11-1.13 단계에 명시된 다음 단계로 시편을 장착, 금 도금 및 이미징을 수행합니다.
- 1.9-1.13 단계까지 HMDS를 사용하여 3.2 단계에서 시편을 화학적으로 건조하여 비교 분석을 수행합니다.
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Representative Results
도 1은 도장된거북이(Chrysemys picta) 배아의 주사 전자 현미경 분석을 보여준다. 도색된 거북이 알을 침구 배지상에 채취하고 배양하고, 화학건조 후 알루미늄 스텁에 장착하여 SEM 이미징에 사용하였다(도1A-E). 단계 12 배아의 측면보기는 두개안면 구조물을 보여줍니다; 상악 가루는 하악을 넘어 확장하고 잘 표시된 비강 구덩이 내측을 제한; 5개의 인두 아치도 관찰되었다(그림1F). 배아의 후방 꼬리 부위에 새로 형성된 소미트는 분절된 몸소미에 비해 쉽게 계산할 수 있다. 앞다리 싹은 뒷다리 싹에 비해 더 이상 나타나고 통풍구보다 더 많은 포인트. 갑피 능선의 잘 정의된 아웃성장은 단계 15 배아의 전체 사지 측면 영역을 따라 보입니다(도1G. 18단계에서, 그려진 거북이는 짧고, 약하게 투영되는 주전자를 가지고 있다. 하부 부리가 위턱 내에 놓여 있으며 상부 부리의 중앙 노치에 맞는 단자 후크로 약간 뒤집힌다(그림1H). 그려진 거북이의 윗턱은 양쪽에 작은 커프가있는 내측 U-V 모양의 말단 끝을 형성하는 노치 모양을 보여주며, 작은 달걀 치아가 윗턱 의 끝에서 형성되기 시작합니다. 초기 단계에서 더 이상 나타난 사지 싹은 디지털 플레이트가 모호하게 표시된 13-14 단계 동안 패들 모양의 구조를 형성합니다. 상피 외엽 능선에 의해 경계된 사지 중간엽은 전방 후방 마진을 따라 보입니다(도1I-J).
그림 2는 SEM 이미징을 사용하여 크리세미스 피타 달걀 껍질 및 쉘 멤브레인의 초구조 분석을 보여줍니다. 도장된 거북이 달걀 껍질은 전술한 바와 같이 수득되었고 이중 증류수로 세척한 후 공기 건조를 행하였다(도2A,B). 양면 카본 테이프(그림2C)가 있는 알루미늄 스텁에 장착된 달걀 껍질은 SEM을 사용하여 이미지화되었습니다. 껍질의 측면 도면은 외부 석회질 계란 껍질 층이 내부 필라멘트 쉘 멤브레인에 단단히 부착되는 것을 보였다(도2D). 달걀 껍질의 외부 표면은 잘 구별 된 광물화 쉘 단위로 구성되어 있으며, 구형 / 구형 결절로 구성되어 있으며 인접한 쉘 단위 사이에 는 다양한 크기의 작은 둥근 우울증 또는 기공의 농도가 있었습니다. 관찰됩니다(그림2E). 쉘 단위의 각 그룹에서 적절은 연결 접합부, 중심점에서 만난다(도2F). 외부 표면은 포셉을 사용하여 수동으로 박리하여 쉘 멤브레인의 표면을 관찰하였다. 쉘 유닛과 기본 다층 섬유막 사이의 부착 점을 제공하는 중앙 플라크의 행이 보였다 (그림2G).
도 3은 SEM 이미징을 사용하여 관찰된 슬라이드 배양으로부터 아코시세테 곰팡이 분리의 형태학적 특성을 나타낸다. 슬라이드 배양 설정설정(도3A)은 접종 후 2일 이내에 한천 블록상에서 곰팡이 성장을 나타냈다. 식민지는 크림 색 공중 균사체에 흰색으로 빠르게 성장 (그림3B). 한천 슬라이스의 임계점 건조 및 스퍼터 코팅에 따른 SEM 이미징은 포자처럼 곰팡이 하이페, 곡선 코니디아 및 쌀을 밝혀냈습니다. 코니디오포어는 격막공중하이파로부터 측면으로 발생하는 것을 보였다(도3C). 더 짧은, 분지 conidiophores에 생성된 Macroconidia는 적당히 구부러져, 짧은, 무딘 정점 및 불분명하게 pedicellate 기저 세포는 주로 septate (그림3D).
도 4는 대체 기술을 사용하여 유사한 시편을 처리하기 위한 비교 결과를 나타낸다. HMDS에서 15 단계 배아의 침지 및 점진적 증발에 의한 건조는 잘 보존 된 두개안면 구조를 보여 주며, HMDS에서 느린 증발의 연장 된 시간동안 거의 수축이나 왜곡이 보이지 않는다 (그림4A). 오스뮴 테트옥사이드로 고정식 배아는 HMDS 느린 처리에 비해 조직의 약간의 수축을 제외하고는 이미지 품질에 뚜렷한 차이를 보이지 않았다 (그림4B). HMDS를 부분적으로 또는 완전히 제거하여 배아를 건조시켜 빠른 증발을 허용하여구조적 왜곡 및 수축(도 4C)을 초래하는 반면, 느린 증발은 유사하게 단계적 배아의 우수한 표면 구조를 해결한 반면, 그림 4 A). 건조 아티팩트는 CPD 기술로 처리된 배아에서 보였으며, 이는 광범위한 수축 및 조직의 파괴를 야기하였다(도4D,E). 슬라이드 배양으로부터의 한천 슬라이스는 CPD에 비해 HMDS 처리로 분리된곰팡이의 불완전한 건조를 보여준다(도 F). 완전한 건조는 잘 건조된 백색 견본으로 한천 슬라이스의 CPD 처리로 달성되며, 곰팡이 하이페 및 포자의 고분해능 구조적 특징을 그대로 보여주는 것이다(도4G-G'). 곰팡이 배양액을 가진 한천 블록은 SEM 이미징에 적합하지 않은 색상으로 수축되고 노란색으로 나타납니다 (그림4H-H').
그림 1 : 전자 현미경 현미경 스캔 크리세미스 피타 화학 건조에 의해 준비 배아. (A) 크리세미스 피타,뉴욕 주 오스웨고 라이스 크릭 필드 스테이션에서 번식기 동안 중첩. (B) 외부에서 잘 구성된 둥지. (C) 표면 토양을 제거 하 여 알을 노출 하 여 낳은. (D) 침구 배지로 인큐베이션 챔버에 계란을 넣습니다. (e) 배아를 화학건조 후 알루미늄 스텁에 장착하고, E4는 스퍼터 코팅 배아를 나타낸 것을 나타낸 다. (F) 얼굴 구조, 사지 싹 및 소미족을 나타내는 12 단계 배아의 측면 보기. (G) 잘 정의 된 갑피 능선과 패들 모양의 사지 싹은 15 단계에서 볼 수 있습니다. (H) 위턱과 하악을 나타내는 18단계 배아의 두개안면 구조는 상부 부리의 끝에 형성된 작은 난자 치아를 주목한다. (I) 13-14 단계에서 오른쪽 앞다리의 등쪽보기와 등쪽 - 복부 경계에서 AER (J)의 클로즈업 뷰. 스케일 바: F-H, 500 μm; 나, 100 μm, 및 J, 10 μm. 키: MB, 중뇌; np, 비강 구덩이; mxp, 상악 두드러기; pa, 인두 아치; h, 심장; fl, 앞다리; s, somite; hl, 뒷다리; t, 꼬리 팁; cr; 갑상선 능선; et, 계란 치아; 구강, 구강 , 아래턱; m, 중간엽, AER, 상피 외피 능선. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 공기건조 계란껍질과 도장거터알의 껍질막을 초구조분석합니다. (A) 배아를 고정한 후, 난자를 증류수로 철저히 세척하여 노른자와 알부민을 제거하였다. (B) 깨끗한 달걀 껍질을 적어도 하룻밤 동안 공기 건조시켰다. (C) 알루미늄 스텁에 달걀 껍질을 장착 합니다. (D) 외부 석회질 층 및 내부 쉘 멤브레인을 나타내는 쉘 단편의 방사형 보기. (e) 외측 석회질층은 구형 쉘 유닛(su)을 이들 단위(별표) 사이에 보이는 그룹과 모공으로 배열한 것을 나타낸다. (F) 쉘 단위 사이의 중심점(c)을보여주는 결절의 확대된 뷰입니다. (G) 석회질층의 제거는 쉘 유닛에서 부러진 우울증을 가진 쉘 멤브레인의 외부 표면을 나타낸다. 스케일 바: E, 100 μm; F, 10 μm 및 G, 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : SEM 이미징을 위한 곰팡이 문화 준비 (A) 슬라이드 문화체육관광부 의 설정을 표시하는 회로도다. (B) 30°C에서 2일간 배양한 후 한천 블록에서 볼 수 있는 백색색 곰팡이 식민지. (C) SEM 이미지 후사리움 솔라니의균사체의 섹션을 보여주는, 스포로도키아에서 매크로 코니디아를 표시하는 검은 별표, 피알리드를 가리키는 화살표, 마이크로코니디아를 향한 화살촉, 스케일 바, 10 μm.(D) septate 클라미도스포어, 스케일 바 5 μm. 키: ab, 한천 블록; cs, 커버슬립; f, 곰팡이 배양. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 유사한 시편을 처리하기 위한 대체 기술의 비교 분석. (a) 도색된 거북이 머리의 정면 보기는 HMDS (A)의 느린 증발로 건조, 오스뮴 테트옥사이드 (B)로 사후 고정 후, HMDS (C) 및 CPD(D-E)의 빠른 증발. 오스뮴 테트옥사이드를 이용한 후고착 단계를 포함하면 사후 고정 없이 HMDS 처리에 비해 이미지 품질에 뚜이시 차이가 나타나지 않는다. 변형은 HMDS의 빠른 증발 후에 보이며, 느린 증발로 점진적인 건조는 더 나은 표면 구조를 제공합니다. 수축 및 붕괴 된 구조의 다른 정도는 CPD로 처리 된 배아에서 뇌, 눈및 얼굴 돌출부 영역에서 볼 수 있습니다. (F) HMDS (1), CPD (2) 및 스퍼터 코팅 CPD 처리 표본 (3)으로 처리 된 슬라이드 배양물의 장착 알루미늄 스텁. (G-G') 완전한 건조는 푸사리움 솔라니의곰팡이 균사체와 포자의 구조를 보존하는 CPD에 의해 달성된 곰팡이 접종을 가진 그대로 흰색 색의 한천 슬라이스로 보입니다. (H-H') HMDS 보존 기술로 볼 수있는 슬라이드 배양, 수축 및 손상된 구조적 무결성의 부적절한 건조. 스케일 바: A-E, 500 μm; G-H, 2 mm, 및 G'-H', 20 μm. 키: et, 계란 치아; oc, 구강; e, 눈; uj, 위턱; lj, 아래턱; 검은 별표, 스포로도키아의 마크로코니디아; 화살, 피알리드; 및 화살촉, 마이크로 코니디아. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
우리의 연구에서, 다른 고정 에이전트, 탈수 및 건조 방법은 SEM 화상 진찰을 위한 3개의 다른 섬세한 생물학 견본을 준비하기 위하여 시험되었습니다: 배아, 계란 껍질 및 곰팡이 배양. SEM은 일반적으로 표면 해석에 사용되므로 고정 관통은 덜 중요하지만 내부 구조가 잘못 고정되면 내부 수축 또는/축소된 표면 구조가 발생할 수 있음을 이해해야 합니다. 연장된 고정 시간은 또한 더 큰 조직 견본을 위해 고려되어야 합니다, 고정 기간에 따라서 고정식 해결책을 몇 번 대체하. 고정식과 조직 사이의 활발한 상호 작용으로 인해 세포의 삼투 특성이 상당히 변할 것입니다. 조직 유체는 고정제를 희석시킬 것이고 따라서 전반적인 삼투에 기여하는 알데히드 효과는 세포 부피에 대한 영향이 우려되는 한 무시될 수 있다. 또한, 포름알데히드는 조직에 더 빨리 침투하고 글루타랄데히드에 비해 크로스 링커로 더 효과적입니다. 완충된 포름알데히드-글루타랄데히드 혼합물은 또한 다양한 조직을 고정하기 위해 보고되었지만, 단층 및 세포 현탁액의 희석 된 용액은15,16을고정하는 데 더 적합하였다. 그러나 희석 된 해결책은 또한 고압적이며, 따라서 알데히드는 스스로 삼투압적으로 활성화되지 않습니다. 본 연구에서 사용된 섬세한 시료의 경우, pH 7.4의 PBS는 인산염 완충제가 대부분의 생물학적 시료의 세포질 환경과 더 유사하다고 생각되기 때문에 고정제의 비히클로서 사용되었습니다. 또한, 삼투압은 PBS가 고정제에 대한 비히클로서 작용하는 동안 샘플에 필요한 생리학적 범위 내에 있는 것으로 확인된다. 오스뮴 테트옥사이드를 사용한 후 고정은 다양한 생물학적 샘플16,22,42에 종종 권장되지만 본 연구에서 사용되는 모든 생물학적 샘플에 대해 제거되었습니다. 오스뮴 테트옥사이드가 없는 샘플은 선명한 이미지와 오스뮴 테트옥사이드로 고정된 시편을 산출하여 구별할 수 없는 결과를 산출했습니다(그림4A). 오스뮴 테트옥사이드는 잎 조직 구조의 왜곡을 일으키고 글루타랄데히드와 포름알데히드혼합물(43)에비해 더 가난한 시편 보존을 산출하며, 오스뮴 분자의 축적이 침투를 억제할 수 있다고 제안되어 왔다. CPD에 사용되는 탈수제 및 과도제, 및 화학 건조에 사용되는 HMDS와 같은 용매. 이 효과는 조직특이적이며 이 연구에서 분석된 섬세한 시편의 유형에 대한 이미지 품질에는 영향을 미치지 않을 것이다. 오스뮴 테트옥사이드의 다른 유형의 조직 사용에 대 한 확장 된 기본 고정으로 제거 될 수 있습니다.
HMDS 건조 거북 배아 시편은 CPD에 비해 잘 보존된 표면, 및 수축이 적은 것으로 나타났다(도 4). CPD는 공정 중에 생성된 표면 장력이 0또는 최소로 인해 셀 형태및 아티팩트 생산에서 왜곡될 가능성을 최소화합니다. 그러나 CPD는 섬세한 깨지기 쉬운 시료에 잠재적인 물리적 위험을 초래할 수 있습니다. 우리의 관찰에 따라, HMDS는 44,45,46,47에발표된 이전연구에 기초하여 건조로 인한 표면 장력을 최소화함으로써 유사하거나 더 높은 품질의 이미징을 산출하였다. CPD 처리에 비해 HMDS는 에칭 된 바이 밸브 및 바나클 쉘(48)에서 유기 메쉬 워크의 구조적 세부 사항을 우수하게 보존하고 mermithid의 복잡한 내부 조직의 구조적 특징을 고해상도로 제공했습니다. 선충(49)과 곤충 내부 조직28. 건조 플레이트 아티팩트는 HMDS 기술에 비해 CPD 기술에 의해 제조된 시편에 대해 다량으로 보였다. 막 검점 및 펠릿 아티팩트는 CPD 기술50을이용하여 제조된 자궁경부세포에서 증가하였다. HMDS는 물과 반응하여 히사메틸디실록산과 암모니아를 생성하며, 둘 다 물체에서 증발합니다. HMDS는 일반적으로 설탕, 아미노산, 알코올 및 수많은 다른 화합물과 같은 화합물의 실릴 에테르를 만들기 위해 가스 크로마토그래피에 사용됩니다. HMDS는 조직에 있는 이 화합물의 몇몇과 반응하는 경우에 알려지지 않습니다. HMDS는 건조 과정28동안 단백질을 교차 연결하고 조직을 경직시킬 수 있지만, HMDS가 배아의 더 나은 보존을 제공하는 정확한 이유는 조직 특이성을 제외하고는 설명될 수 없었다. 우리의 조사 결과에 근거하여, CPD는 HMDS에 비해 광대한 수축을 일으켰고, 특히 초기 단계적 배아의 표면 구조를 분석하기 위해 배아 조직 을 처리하는 데 훨씬 더 적합합니다. HMDS가 조직 건조에서 작동하는 메커니즘은 해명되지 않았지만 절대 무수 환경에서 점진적인 증발로 느린 건조는 동물의 우수한 표면 구조를 얻는 이유가 될 수 있습니다.
이전에 설립 된 슬라이드 문화에서 곰팡이 식민지와 한천 블록의 작은 조각은 균사 매트의 원래 솜털을 유지하는 문제를 피하기 위해이 연구에서 사용되었다. 곰팡이 콜로니가있는 한천 조각의 CPD 건조는 세척 효과를 가져왔으며, 고정제, 완충제 및 에탄올의 변화는 동결 건조의 어려움을 극복하는 더 나은 선택인 것으로 나타났습니다. 모든 단계의 배아에 잘 작동하는 HMDS는 곰팡이 배양을 해결할 수 없었고, HMDS로 공기 건조는 심각한 문제를 제기했습니다: 컬링과 구조적 강성 상실. CPD는 곰팡이 문화에 잘 작동하지만, 특히 발달 초기 단계에서 배아에 즉각적인 손상을 일으켜 표면에 수축을 일으켰습니다. HMDS와 CPD가 각각 배아 및 곰팡이 배양에 사용되었을 때 충전 또는 건조 아티팩트가 관찰되지 않았습니다. 거북이의 달걀 껍질과 같은 단단한 조직의 경우 이미징을 위해 장착하기 전에 실온에서 세척 및 공기 건조를 제외하고는 특별한 가공이 필요하지 않습니다.
제조 방법에 관계없이 점진적 인 에탄올 그라데이션 단계를 사용하여 건조 아티팩트의 가능성을 줄여야합니다. 처음에 HMDS 및 CPD 샘플은 모두 문헌에서 사용할 수 있는 탈수 및 건조 프로토콜에 따라 수축이 있는 표면 아티팩트를 가지고 있는 것으로 나타났습니다. 일련의 표준화 후, 우리는 유물이 알코올 탈수의 결과라고 결정했습니다. 탈수 시 점진적인 에탄올 증가를 사용하여 느린 탈수 과정을 사용하는 것이 중요합니다. 또한, 각 반복의 기간은 곰팡이 문화에 비해 배아에 대한 더 이상해야한다. 또한, 100% 에탄올에서의 추가 단계는 완전한 균일한 포화를 보장한다. HMDS는 시료의 공기 건조를 허용하기 위해 완전히 또는 부분적으로 제거될 수 있지만, 증발에 의한 HMDS 및 점진적 공기 건조에 대한 확장된 노출은 큰 표면으로 인한 중단을 피하기 위해 배아에 효과가 있는 것으로 나타났습니다(그림4A,C). 미생물 세포 부착에 대한 관찰로 장력51. HMDS에 침지시고 밤새 느린 건조는 다프니아 종52의 우수한 표면 구조를 밝혀 부드러운 섬세한 조직이 느린 건조 과정에서 혜택을 누릴 수 있음을 시사합니다. 배아에 대한 허용 가능한 화질은 탈수 후 에탄올에 대한 HMDS의 농도를 점진적으로 증가시킴으로써 느린 화학적 건조로 얻을 수 있다.
모든 샘플은 양면 카본 테이프를 사용하여 알루미늄 스텁에 장착하여 전도성 표면을 제공했으며, 동일한 샘플을 다른 방향으로 이미지화해야 하는 경우에도 무색 매니큐어의 얇은 코트를 사용할 수 있습니다. 매니큐어가 스텁 표면에 사용될 때 샘플을 스텁에서 쉽게 제거할 수 있으며 양면 탄소 테이프를 사용하는 것에 비해 다른 평면에 샘플을 배치하는 것이 가능합니다. 시료는 전도성이 있으므로 전도도를 높이기 위해 시료에 얇은 금속 층을 스퍼터링할 필요가 있습니다. 이 연구에서는 스퍼터 코팅 시 금 타겟이 사용되었으며, 금 팔라듐은 충전 효과를 피하는 유사한 결과를 산출합니다. 올바른 빔 전압은 시료에 따라 달라지며, 가볍게 코팅된 시편에 대해 2-5kV에서 필드 방출 SEM을 사용하여 이미징하면 표면 구조에 대한 좋은 정의를 제공합니다. 적절한 코팅이 있는 조직의 경우, 5 kV는 일반적으로 빔 침투가 더 없이 더 나은 신호를 제공합니다. 깊이가 부족하고 금으로만 코팅된 시편의 경우, 더 높은 전압(10kV)으로 이미징하면 표면 지형을 더 잘 시각화할 수 있습니다.
SEM을 위한 섬세한 조직의 준비는 특유한 도전을 제기하고, 견본 준비 기술의 범위는 화상 진찰 아티팩트를 극복하고 최소화하기 위하여 이용될 수 있습니다. 우리는 SEM 화상 진찰을 위한 3개의 다른 섬세한 생물학 조직 견본을 가공하는 포괄적인 방법을 제공합니다: 배아, 단단한 계란 껍질 및 곰팡이 배양. 우리의 조사에서, 이전에 간행된 연구 결과에서 유효한 대중적인 방법에 미묘한 변경이 만들어졌습니다, 우리는 각 섬세한 조직 모형에 특정한 가장 적당한 탈수및 건조 방법을 확인했습니다. 이러한 프로토콜은 유사한 생물학적 샘플로부터 허용 가능한 SEM 이미지 품질을 얻기 위해 적응될 수 있었다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다
Acknowledgments
저자는 다니엘 발다사르 박사에게 감사드리고 싶습니다, SUNY 오스웨고 는 원고에 대한 유용한 토론과 의견에 대한. 이 연구는 라이스 크릭 준회원 보조금에 의해 지원되었다, 오스웨고; 도전 은 PGL과 JG에 SUNY 오스웨고와 국립 과학 재단 (NSF) 작은 보조금을 부여합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Fischer Scientific | S25127A | for slide cultures |
| Aluminum pin stub | Tedpella | 16111 | 12.7 mm x 8 mm |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: Potato Dextrose Agar | BD 213400 | DF0013-17-6 | Media for isolation and cultivation of Fungi, yeast and molds |
| Chloramphenicol | Fischer BioReagents | BP904-100 | Antibiotic for media |
| Coarse Vermiculite | Greenhouse Megastore | SO-VER-12 | bedding medium |
| Clear 12- well plate | Corning | 07-201-589 | for fixing embryo |
| Coverslips | Fischer Scientific | S17525B | for slide culture |
| Critical Point Dryer | Quorum CPD | EMS850 | critical point drying |
| Culture dishes | Fischer Scientific | 08 747B | DISH PETRI 100X10MM 12/PK |
| Ethanol | Fischer Scientific | A406P 4 | dehydration agent |
| Forceps- Aquarius Tweezers | Tedpella | 5804 | style 4, length 108mm, widh x thickness 0.017 x 0.17 mm |
| Glutaraldehyde | Fischer Scientific | G151-1 | fixative |
| Gold target for sputter coater | DENTON VACUUM | TAR001-0158 | Gold Target, 2.375″ D X .002″ |
| Hexamethyldisilazana | Fischer Scientific | C19479-5000 | chemical drying agent |
| Kim wipes | Kimtech | S-8115 | cleaning |
| Microscope slides | Thermo Scientific | 67-762-16 | for slide culture |
| Microscopy Scissors | Tedpella | 1327 | Double pointed, stainless steel, 100 mm L (3-5/8"). |
| Micro-scissors | Tedpella | 1346 | Vannas-type, straight, 80mm L |
| Moria Perforated Embryo Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Length 14.5 cm, tip diameter 20 mm, spoon depth 5 mm |
| Netwell Inserts | Corning | 0330B09 | 15 mm Inserts with 74 µm Mesh Size Polyester Membrane act as handy carriers during specimen processing into different solvents |
| Paraformaldehyde | Fischer Scientific | T353 500 | fixative |
| Peat moss | Walmart- Miracle Gro | 551705263 | bedding medium |
| PELCO tabs double stick carbon conductive tape | Tedpella | 5000 | 12 mm OD |
| Sputter coater | DENTON VACUUM | DESK V | thin metal coating |
| SEM | JEOL USA | JEOL JSM 6610LV scanning electron scope | electron microscopy |
References
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