Summary
在这里，我们提出了使用扫描电子显微镜（SEM）成像精细组织样本的详细处理方案。介绍了三种不同的处理方法，即六甲基二甲苯（HMDS）化学干燥、简单空气干燥和临界点干燥，分别用于制备硬质蛋壳、早期发育阶段的胚胎和真菌培养。
Abstract
虽然扫描电子显微镜（SEM）被广泛用于各种生物和非生物样品的超结构分析，但处理不同生物样本的方法涉及独特的实践。处理样品文献中描述的所有传统做法仍然能找到有用的应用，但样品制备中的细微变化可以改变图像质量，并引入伪影。因此，需要使用特定于所分析的组织类型的独特样品制备技术，以获得具有超结构分辨率的高质量图像。本研究的重点是为使用SEM成像胚胎、硬质蛋壳和真菌培养物提供最佳的样品制备方案。建议进行以下优化，为所研究的三种不同的精细生物样品提供良好的结果。必须使用较温和的固定剂，如4%甲醛或3%谷醛，然后与乙醇系列脱水。与直接取自琼脂板的培养物相比，通过滑动培养体获得的琼脂块上的真菌菌丝具有更好的超结构完整性。与临界点干燥相比，使用 HMDS 的胚胎的化学干燥无需引入表面张力伪影即可进行干燥。HMDS 可防止因收缩而导致的开裂，因为样品在干燥过程中易碎性较小。然而，对于真菌培养，与化学干燥相比，临界点干燥可提供可接受的图像质量。蛋壳可以成像，没有特殊的准备步骤，除了彻底清洗和空气干燥之前安装。根据每次试验获得的可接受的图像质量，对制备方法进行了标准化。
Introduction
扫描电子显微镜 （SEM） 超结构分析和细胞内成像补充光显微镜，用于原核生物、植物和动物的三维轮廓分析。SEM 的高空间分辨率使其成为可用于检查纳米到微米尺度的样品的微观结构特性的最通用和最强大的技术之一。干燥标本被解析为具有强烈细节的组成和地形结构，这为制定关于功能关系1、2、3的有效结论奠定了基础,4,5,6,7,8,9.在解释生物标本的SEM图像时，区分原生结构和加工过程中产生的工件是一个很大的挑战。SEM通常在非常高的真空度下工作，以避免气体分子对样品10、11发出的初级、二级或背散射电子束的任何干扰。此外，生物材料由于其不良或非导电特性而易受辐射损伤。装载到SEM的样品必须完全干燥，没有任何有机污染物，以消除在高真空环境中任何可能的排气10，11。由于生物标本主要由水组成，因此需要额外的准备技术，以确保保留原生结构。
获得的决议基于针对试样类型和所利用的工具参数优化制备方法。因此，有必要避免对所有组织类型使用通用处理步骤。一些生物标本需要较不严格的处理来保存其结构，而对精细类型的样品可能需要更多的时间和护理，以避免引入干燥伪影，如收缩和坍塌。样品制备是SEM成像的关键步骤;形态学研究的结果受到标本制备程序12、13的显著影响。许多生物样品的常见制备步骤是固定、脱水和涂上金属（如金、铂或铂金），以将其表面转化为导电性，用于 SEM 分析。使用的步骤的性质和组合将因组织类型和研究的具体目标而异。电荷积聚、对真空和电子束损伤的敏感性在加工柔软细腻的生物样品时会造成问题，因此需要额外的处理步骤来保留物体的原生结构。使用传统方法，如四氧化二氮固定，脱水导致收缩和脆弱的组织崩溃14，15，16，17。研究的目的是建立优雅的方法，通过将早期研究的想法与修改相结合，制备和形象软细腻组织（例如，爬行动物胚胎、画龟蛋壳和真菌培养）。
选择合适的固定方法是生物标本微观分析的第一步。从有机体分离后立即修复组织对于防止其形态因分解而改变至关重要。有效的固定剂应通过快速渗透细胞并不可逆转地保持效果来终止细胞过程，以稳定样品的结构，以承受 SEM17下的后续处理步骤和检查,18.虽然已知几种化学和物理固定方法，但化学固定更常用于生物标本，以避免由于自干、再反应和干燥效应而发生任何细胞变化。文献中讨论了许多固定化学制剂，第17、19、20、21、22、23，修复剂通过变性和凝固生物大分子，以及那些通过共价交联大分子修复的分子。酒精被用作变性固定剂，保持超细结构很差，主要用于光显微镜，不推荐用于电子显微分析。甲醛、谷醛和四氧化二氮等交联固定剂在组织内的大分子之间产生分子间和分子内交联，为超结构提供出色的保存11 ，24，25，26.生物样品对温度敏感。建议固定开始时的温度为4°C，以降低膜蛋白的横向流动性，减缓细胞间分子的扩散，减缓固定速度11。固定组织所需的时间很大程度上取决于样品的大小和固定剂扩散和与标本组件发生反应的速度。在4°C的PBS中一夜之间固定4%的甲醛或3%谷醛，是本研究中使用的试样SEM分析的首选方法，其顺序渗透特性允许处理较小的精细样品17,18,19,20,27.消除四氧化二氮的固定后步骤，不仅由于其毒性，而且发现没有实现任何额外的优势，以提高图像质量的样本在本研究中分析。
生物样本含有干扰SEM操作的液体;因此，在将样品插入SEM样品室之前，需要干燥。一旦确保脱水，溶剂必须从组织中取出，而不会由于表面张力/干燥而使伪影进入标本。在SEM成像的处理组织中，常用三种不同的干燥方法：空气干燥、临界点干燥和冷冻干燥样品28、29、30、31。很少有研究报告所有三种干燥方法产生相同的结果与动物组织样本28，29，30，31。用于较小标本的一般做法是通过酒精和六甲基二甲苯（HMDS）的浓度上升系列进行化学脱水，但较大的样品使用临界点干燥（CPD）仪器32进行干燥。在干燥过程中，通过液体/气体界面通过试样的小腔中形成相当大的力;这甚至会导致空心结构完全坍塌33。由于处理而发生的任何变形都可能被误认为是试样的原生结构特征。因此，应消除加工的广义现象，并针对每种组织进行标准化独特的干燥过程，特别是在分析精细组织标本时。
在使用上述所有工艺的各种组合进行的几项试验中，我们标准化了可用于三个精细组织的SEM分析的方法：爬行动物胚胎、画龟的蛋壳和真菌培养。发育生物学家和形态学家描述了代表性脊椎动物胚胎发育过程中的正常和异常形态形成。基因信号通路的研究取决于新结构的形态描述。为了避免在SEM分析期间脊椎动物胚胎结构发生突变，我们建议在脱水后进行化学干燥。使用HMDS的化学干燥是比较最新的干燥方法，其优点包括相对快速、易用、成本损失、专业知识和设备有限等。CPD 是一种常用的干燥技术，在特定温度和压力下在试样上使用传交 CO 2。我们确定HMDS适合干燥软细腻组织，并允许处理较大的样品，与临界点干燥相比，这给胚胎组织造成了广泛的变形。已采用多种方法制备SEM成像样本，以研究真菌34的形态特征。真菌标本通常固定在四氧化二氮中，然后是乙醇脱水和临界点干燥，这可能提供令人满意的结果，尽管四氧化二氮的毒性作用是六、七、三五在加工过程中改变溶液时，真菌材料的流失是明显的缺点。使用无固定性空气干燥的样品制备技术也已经实践了36种，但会导致结构收缩和坍塌，在描述物种特征时，对此类标本的观察很容易被误解。真菌性子宫在与液体接触时会失去完整性，可能无法恢复结构，无法进行均匀干燥。由于这种效果，冷冻干燥通常用于干燥软组织，如真菌菌丝。冷冻干燥适用于清洁材料，但任何盐或分泌物的存在将遮盖仅在 SEM 观察阶段才能识别的表面细节。我们将滑动培养方法与谷醛固定和临界点干燥相结合，从而产生完好的真菌水肿和孢子的结构细节。虽然CPD干燥导致胚胎收缩，但当它与谷醛固定相结合时，它导致保存完好的菌丝结构。蛋壳不仅对动物胚胎具有首要作用，而且具有机械稳定性、气体和水的渗透性，以及发育中的胚胎的钙储备。淡水龟蛋壳根据其结构被归类为"刚性"，由于它们的可得性，受到生物学家1、2、3、4的高度重视。,5,6,7,37,38.
我们详细介绍了简单的方法，以方便检查蛋壳和壳膜的彩绘龟，可以应用于任何刚性蛋壳物种。根据生成的图像质量和减少的潜在伪影来评估制备方法。
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Protocol
注：本研究中使用的彩绘海龟（Chrysemys picta）蛋是在2015年5月至6月的筑巢季节从纽约州Oswego的Rice Creek现场站收集的，并经纽约州环境部许可。保护（DEC）。
1. 用于SEM处理胚胎的化学干燥方法
- 在筑巢季节从野外收集海龟蛋。提前准备孵化室，由带盖子（L x W x H） 6.7 厘米 x 25.4 厘米 x 10.2 厘米的塑料盒制成，填充了用湿润的紫玉石和泥炭苔混合物制备的床上用品（1：1 比例）。沿盒子的两侧和盖子上打4-6个约0.25厘米的孔，以便进行曝气。
- 轻轻地从巢中取出土壤，以揭开鸡蛋。用稀释的碘精剂（1：25，000）擦拭海龟蛋的表面，以控制孵育过程中的微生物污染。将离合器彼此分开，彩绘海龟的离合器尺寸可能从 5-9 个鸡蛋不等，每盒最多放置 8-9 个鸡蛋。
注：在收集、擦拭、贴标签和放入包装箱时小心处理鸡蛋。卵子的位置和排列需要与产卵相同，任何运动都会抑制胚胎发育。 - 将鸡蛋一半手动埋在床上用品中，盖上盖子，将盒子放在30°C的培养箱内。孵育卵子10-17天，获得本研究分别使用的胚胎阶段12、13和18。每隔一天加入蒸馏水，使床上用品介质部分湿润，以避免脱水，并保持胚胎正常发育的水分水平。
注：孵化和分期胚胎是根据39日公布的完整发育表。 - 修复胚胎，在背蛋壳和蛋黄膜的一侧进行第一次切割，用尖剪刀垂直到长轴。小心地将剪刀插入蛋黄中，以避免切割胚胎盘。现在沿着长轴切割鸡蛋的侧边，然后沿着短轴切割鸡蛋的另一侧。
- 用钳子将切出的片子与胚胎侧向上剥开。切下蛋壳的另一侧，将切除的片子放入磷酸盐缓冲盐水中（PBS，pH值为7.4）。
注：龟蛋充满高粘性蛋黄，胚胎的背侧附着在蛋壳膜上。胚胎附近的蛋壳膜随着半透明白的孵化而改变，从不透明的白色变为不透明的白色。这允许一个人定位在长轴的中心的胚胎，并被视为一个黑暗的钙化点从外部40，41。 - 使用立体显微镜分离胚胎和蛋黄膜，用钳子从蛋壳中剥离。使用钳子和微剪刀去除胚胎外膜。使用胚胎勺将胚胎移植到培养皿中的新鲜PBS中，以洗洗任何血液或蛋黄。
- 使用透明12孔板将胚胎在PBS中的4%甲醛中过夜，在4°C或2-3%的PBS中甲醛中固定。根据胚胎的大小，在每个井中放置一至三个胚胎。通过将固定时间延长 2-3 天，确保对较老的胚胎进行完全渗透（样品将呈白色）。用新鲜的PBS冲洗胚胎3次，每次冲洗5分钟。
注：避免使用聚酯网底聚苯乙烯插入物，将试样从一种溶剂转移到另一种溶剂，避免损坏胚胎表面。 - 在蒸馏水中使用一系列乙醇浓度的脱水样品：30%、50%、70%、80%、95%和100%，并在每个脱水溶液中处理样品1小时。用100%乙醇重复两次此步骤，以确保完全脱水。如果不立即使用，将样品储存在-20°C的70%乙醇中，时间更长。
- 干燥胚胎使用一系列六甲基二甲苯（HMDS）至100%乙醇浓度：1：2、2：1和100%。将样品留在每个溶液中20分钟，并在过程中保持培养皿部分覆盖。
注：在烟雾罩中执行涉及 HMDS 的所有步骤，并配备必要的个人防护装置，因为 HMDS 具有剧毒。 - 将胚胎留在最终的 100% HMDS 溶液中，全部或部分覆盖在烟气罩中过夜，帮助 HMDS 蒸发，使样品准备好安装和溅射涂层。盖上盘子，消除样品上的灰尘沉降。
注：组织在完全干燥后会出现白色，部分干燥的样品将呈黄色，将这些组织留在烟罩中更长时间。 - 根据所分析的样品尺寸选择铝根和碳胶带的大小。使用双棒碳导电胶带（12 mm）小心地将干燥样品安装在标准铝销存根（12.7 mm x 8 mm）上。
- 将安装的样品引入溅射涂布机的造型室，为试样涂上非常薄的金膜，以消除电荷效应。金板的标本为60-120s在35 mA溅射。
- 通过牢固地固定固定套螺钉，将存根安装到相应的孔板。使用样品交换工具将样品支架转移到或移出 SEM 的样品室。在高真空模式下对样品进行成像，加速光束电压为 10 kV，发射电流为 10 μA。
注：在处理样品、样品支架、安装存根和转移工具时，务必戴上手套，以避免油脂从手到 SEM 系统受到污染。 - 测试下面列出的替代技术，以比较从上述程序获得的试样分辨率。
- 在步骤 1.7 之后，在室温下，在室温下加入 1% 的四氧化二氮的固定后。
- 在步骤 1.10 部分或完全移除 HMDS，以便快速蒸发 HMDS。
- 在步骤 1.8 后使用临界点干燥 （CPD） 按照步骤 3.3-3.4 处理胚胎。
2. 使用空气干燥方法为SEM准备蛋壳
- 收集并孵育涂漆的海龟（Chrysemys picta）卵子，以修复步骤1.1-1.7中指定的胚胎。
- 在步骤 2.1 中胚胎固定后，将蛋壳保存在蒸馏水中。将蒸馏水浸泡至少 1 小时，彻底清洁蛋壳，消除蛋黄和白蛋白污染。
- 在通风罩中清洗一些精致的防静电湿巾后，空气干燥的蛋壳。将干燥的蛋壳储存在标有编号和阶段的清洁试样瓶中。
- 按照步骤 1.11-1.13 中指定的步骤安装、溅射涂层并成像试样。
3. 为SEM制备真菌培养的临界点干燥方法
- 建立幻灯片文化
- 为真菌培养准备马铃薯脱脂琼脂（PDA）介质：在Erlenmeyer烧瓶中1升蒸馏水中加入39克PDA能量。在121°C下将烧瓶和高压灭菌管旋转30分钟，让介质溶液冷却，然后使用无菌微移液器加入抗生素氯霉素（25微克/mL）。
注：灭菌后，琼脂溶液应为热，不会很快凝固。冷却足够，以免使抗生素灭活。 - 混合通过漩涡和倒板（约10-12 mL的介质每10厘米培养皿），小心堆叠，让凝固。
- 使用无菌手术刀切开约1/2至3/4英寸的小块琼脂。取出一个琼脂块，放在干净的玻璃显微镜幻灯片上。
- 将滑轨放在干净的培养皿中，以防止污染并在孵育过程中保持水分。
- 使用无菌牙签将滑移从培养皿底部升起，在板和滑片之间产生表面张力，以去除玻璃滑轨，而不会破坏孵育后的微妙生长。
- 使用无菌循环或针头将一些真菌从试样接种转移到滑道上琼脂块的四面。
- 接种后，在琼脂块表面放置一个干净的盖玻片。在滑梯周围的培养皿中加入几滴无菌蒸馏水，以确保生长的真菌具有水分。
- 部分使用石蜡薄膜密封板，并在 30°C 孵育板一段适当的时间长度（对于Fusarium物种孵育 36 至 48 小时）。
- 从培养皿中取出滑轨，并使用无菌钳将紧密粘附的盖玻片与琼脂块分开。在4°C下将琼脂块固定在PBS中的3%谷醛中过夜。
- 为真菌培养准备马铃薯脱脂琼脂（PDA）介质：在Erlenmeyer烧瓶中1升蒸馏水中加入39克PDA能量。在121°C下将烧瓶和高压灭菌管旋转30分钟，让介质溶液冷却，然后使用无菌微移液器加入抗生素氯霉素（25微克/mL）。
- 通过乙醇系列使样品脱水：10%、25%、50%、75%和90%，每次更换15分钟。在 100% 乙醇中进行两次最终脱水的样品处理，每次更换 30 分钟，以确保完全饱和。
- 临界点干燥：将脱水样品放入 CPD 设备室中。通过打开阀门让液体 CO2中并排出乙醇来密封和冷却腔室，直到液体 CO2完全填满腔室。
- 当腔室压力超过1000 psi且温度超过31°C时，将腔室缓慢密封和加热，达到临界点，CO2的液和气相处于平衡状态。缓慢地将CO2从造型室和样品中排出，以避免表面张力的影响。
- 按照步骤 1.11-1.13 中指定的步骤执行安装、镀金和成像试样。
- 按照步骤 1.9-1.13，使用 HMDS 对步骤 3.2 中的试样进行化学干燥，从而执行比较分析。
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Representative Results
图1显示了彩绘龟（Chrysemys picta）胚胎的扫描电子微图分析。在床上用品介质上收集和孵育的彩绘海龟蛋，在化学干燥后安装在铝根上，用于SEM成像（图1A-E）。阶段12胚胎的横向视图显示颅面结构;上颌突出延伸到下颌外，并限制在一个标记良好的鼻腔坑;还观察到5个咽喉拱门（图1F）。与分段体体体体体体相比，胚胎后尾部区域新形成的索米特很容易计数。与后肢芽相比，前肢芽看起来更长，并且比发泄的点更花边。在阶段15胚胎的整个肢体侧翼区域（图1G）上，可以看到一个清晰定义的甲壳脊生长。在第18阶段，彩绘海龟拥有一个短的，笨拙的喷鼻。下嘴位于上颚内，并带有一个端子钩，可插入上嘴的中央凹槽（图1H）。彩绘海龟的上颚有凹口外观，形成一个中U-V形远端尖，两侧各有一个小尖，一颗小蛋牙开始在上颚的尖端形成。在早期阶段出现更长时间的肢体芽在13-14阶段形成桨状结构，数字板隐约表示。沿前-后边缘（图1I-J）观察由外皮脊划定的肢体等位。
图2显示了使用SEM成像对Chrysemys picta蛋壳和壳膜的超结构分析。彩绘龟蛋壳如上文所述，在用双蒸馏水洗涤后进行空气干燥（图2A，B）。安装在铝根上带有双面碳胶带的蛋壳（图2C）使用SEM进行成像。外壳的横向视图显示外层蛋壳层牢固地附着在内丝壳膜上（图2D）。蛋壳的外表面由具有良好区分的矿化壳单元组成，由球状/球形结核组成，这些结核排列成群，在相邻的壳体单元之间，集中了各种尺寸的小圆凹陷或孔隙。观察到 （图 2E）。每组壳单元的结节在连接交汇点（中心点（图2F）处相遇。外表面用钳子手动剥离，以观察外壳膜的表面。可以看到一排排中央斑块，它提供了壳体单元和底层多层纤维膜之间的附着点（图2G）。
图 3显示了使用 SEM 成像观察到的从滑动培养物中分离的类霉菌的形态特征。建立的滑动培养方案（图3A）显示接种后两天内琼脂块上的真菌生长。菌落迅速生长与白色到奶油色的空中菌丝（图3B）。在琼脂片的临界点干燥和溅射涂层后，SEM成像揭示了真菌性水肿、弯曲的锥形和水稻样孢子。从隔板航空水肿（图3C）横向看到锥体。在较短的分枝锥体上产生的宏锥体是中度弯曲的，具有短的、钝的、模糊的基底细胞，主要是分体细胞（图3D）。
图 4显示了使用替代技术处理类似样本的比较结果。将第15阶段胚胎的头部浸入HMDS中，通过逐渐蒸发干燥，显示出保存完好的颅面结构，几乎看不到从HMDS缓慢蒸发的延长时间收缩或变形（图4A）。与HMDS处理缓慢相比，四氧化二氮固定后的胚胎在图像质量上没有显著差异，只是组织略有收缩（图4B）。通过部分或完全去除HMDS来干燥胚胎，允许快速蒸发，导致结构变形和收缩（图4C），而缓慢的蒸发解决了类似阶段胚胎的优良表面结构（图 4A）在用CPD技术处理的胚胎中可以看到干燥伪影，导致组织大面积收缩和破坏（图4D，E）。与CPD相比，从滑动培养物中分离的Agar切片显示真菌分离物的不完全干燥与CPD（图F）。通过CPD处理琼脂片，具有干燥、白色试样，显示了真菌水红和孢子的完整高分辨率结构特征（图4G-G'）。实现完全干燥。具有真菌培养物的Agar块在颜色上出现收缩和黄色，使它们不适合SEM成像（图4H-H'）。
图 1： 扫描电子显微图克雷塞米斯·皮克塔由化学干燥制备的胚胎。（A） Chrysemys picta，在纽约州奥斯韦戈的米溪田站繁殖季节筑巢.（B） 从外面构造良好的巢穴.（C） 表面土壤被小心去除，以暴露所产的蛋。（D） 用床上用品将鸡蛋放入孵育室。（E） 在化学干燥后将胚胎安装到铝根上，E4 显示溅射涂层胚胎。（F） 第12阶段胚胎的横向视图，显示面部结构、肢体芽和躯孔。（G） 在阶段15处可以看到定义良好的甲壳脊和桨状肢体芽。（H） 显示上颌和下颚的18期胚胎的颅面结构，注意在上嘴尖形成的小蛋牙。（I） 第 13-14 阶段右前肢的背观，以及背-腹边界处 AER （J） 的特写视图。刻度条：F-H，500 μm;I， 100 μm， 和 J， 10 μm.键： mb， 中脑; np， 鼻孔; mxp， 上垂突出; pa， 咽喉拱门; h， 心脏; fl， 前肢; s， somite; hl， 后肢; t， 尾尖; c， 甲角脊; et; 蛋牙; oc， 口腔; e， 眼睛， uj， 上颌;，下颚;m， 美因，AER， 锥形外皮脊.请点击此处查看此图的较大版本。
图 2：对风干蛋壳和彩绘龟蛋壳膜的超结构分析。（A） 修复胚胎后，在蒸馏水中彻底清洗蛋壳，以去除蛋黄和白蛋白。（B） 清洁蛋壳至少一夜之间被风晒。（C） 将蛋壳安装到铝根上。（D） 外壳碎片的径向视图，显示外层钙层和内壳膜。（E） 外钙层显示球状壳单位（su） 排列成组和毛孔，在这些单位 （星号） 之间看到。（F） 表示壳体单位之间的中心点 （c） 的结核的放大视图。（G） 去除钙质层显示外壳膜的外表面，留下的凹陷从壳单元中破碎。刻度条： E， 100 μm;F，10 μm和G，20μm。请点击这里查看这个数字的较大版本。
图 3：为SEM成像准备真菌培养。（A） 显示幻灯片区域性设置的原理图.（B） 在30°C孵育两天后，在琼脂块上看到的白色真菌菌落。（C） SEM 图像显示Fusarium Solani的一段菌丝，黑色星号标记在孢陀的宏锥体，箭头指向 phialide，箭头指向微锥体， 刻度条，10 μm. （D） 放大的色谱衣原体图像， 刻度栏 5 μm.键： ab， 琼脂块; cs， 盖玻片; f， 真菌培养.请点击此处查看此图的较大版本。
图 4：对加工类似标本的替代方法进行比较分析。（A）涂漆的正面视图干燥， HMDS （ A ）蒸发缓慢，后用四氧化二氮（ B ）固定后， HMDS （ C ）和 CPD（ D - E ）蒸发速度较快。与HMDS治疗相比，使用四氧化二氮的固定后步骤在图像质量上没有表现出任何明显差异。HMDS 快速蒸发后出现变形，而缓慢蒸发的逐渐干燥可提供更好的表面结构。在用CPD（F）处理的胚胎中，在大脑、眼睛和面部突出区域可以看到不同程度的收缩和折叠结构。铝存根。（G-G'）完全干燥被视为完整的白色彩色琼脂片与真菌接种实现由CPD保存真菌菌丝结构和孢子的Fusarium solani。（H-H'）使用 HMDS 保存技术看到的滑动培养的干燥不足、收缩和结构完整性受损。刻度条：A-E，500 μm;G-H，2毫米和G'--H'，20μm键：et，蛋牙;oc，口腔;e，眼睛;uj，上颚;lj，下颚;黑色星号，孢陀龙的宏锥体;箭头，菲利德;和箭头，微锥体。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
在我们的研究中，测试了不同的固定剂、脱水和干燥方法，为SEM成像制备三种不同的精细生物样本：胚胎、蛋壳和真菌培养物。SEM 通常用于表面分析，因此固定渗透不太令人担心，但必须了解，固定性内部结构固定不良将导致向内收缩或/和曲面结构坍塌。较大的组织样本也应考虑延长固定时间，根据固定持续时间，多次更换固定溶液。由于固定剂和组织之间的主动相互作用，细胞的渗透特性将显著改变。组织液会稀释固定剂，因此，就对细胞体积的影响而言，可以忽略导致整体渗透性的醛效应。此外，甲醛可以更快地渗透到组织中，并且与谷醛相比，作为交叉链接器更有效。一种缓冲的甲醛-谷醛混合物也报告用于固定各种组织，虽然对于单层和细胞悬浮液稀释溶液更适合固定15，16。然而，稀释的溶液也是高托的，因此醛本身不是渗透活性的。对于本研究中使用的精细样品，pH 7.4 的 PBS 被用作固定剂的工具，因为磷酸盐缓冲液被认为更类似于大多数生物样品的细胞质环境。此外，当PBS作为固定剂的载体时，被识别为在样品所需的生理范围内。在研究中使用的所有生物样本中，通常推荐使用四氧化二氮进行固定后，用于各种生物样本16、22、42。没有四氧化二氮的样品产生了清晰的图像，而用四氧化二氮固定的样品产生了无法区分的结果（图4A）。与谷醛和甲醛混合物43相比，四氧化二氮造成叶组织结构变形，产生较差的标本保存，并提出，积累四氧化二氮分子可以抑制渗透。CPD中使用的脱水剂和过渡剂，以及用于化学干燥的HMDS等溶剂。其效果是组织特异性的，排除四氧化二氮对本研究中分析的精细标本类型的图像质量没有任何影响。对于其他类型的组织，使用四氧化二氮可以通过扩展的初级固定消除。
HMDS干龟胚胎标本显示保存完好的表面，与CPD相比，变形或收缩较少（图4）。由于过程中产生的零或最小表面张力，CPD 将细胞形态和工件生产中变形的可能性降至最低。然而，CPD可对脆弱的脆弱样品造成潜在的物理危害。根据我们的观察，HMDS通过最小化干燥引起的表面张力，根据先前发表的研究44，45，46，47，产生了类似或更高的质量成像。与CPD处理相比，HMDS在蚀刻双壳和藤壳48中出色地保留了有机网状结构的结构细节，并高分辨率地描绘了复杂的内部结构结构结构特征。线虫49和昆虫内部组织28。与 HMDS 技术相比，在 CPD 技术制备的试样上大量看到干燥板伪像。使用CPD技术50，在宫颈细胞中增加了膜球和颗粒伪影。HMDS 与水发生反应，产生六甲二甲氧烷和氨，这两种物质均从物体中蒸发。HMDS 通常用于气相色谱，以产生糖、氨基酸、酒精和许多其他化合物的硅基醚。目前尚不清楚HMDS是否与组织中的某些化合物发生反应。HMDS可能在干燥过程中将蛋白质交联并使组织变硬，尽管HMDS更好地保存胚胎的确切原因无法解释，除非组织特异性。根据我们的研究结果，与HMDS相比，CPD造成了广泛的收缩，并且更适合于胚胎组织处理，特别是分析早期阶段胚胎的表面结构。HMDS处理组织干燥的机制尚未得到阐明，尽管在绝对无水环境中缓慢干燥，逐渐蒸发可能是获得动物优良表面结构的一个原因。
本研究使用了具有以前已建立的滑动培养物的真菌菌落的小块琼脂块，以避免保持菌丝垫的原始蓬松性的问题。具有真菌菌落的琼脂片的CPD干燥产生了洗涤效果，而固定剂、缓冲液和乙醇的变化是克服冷冻干燥困难的更好选择。对所有阶段胚胎都有效的HMDS无法解决真菌培养，而使用HMDS进行空气干燥则带来了一个严重的问题：卷曲和失去结构刚度。虽然CPD对真菌培养效果良好，但它对胚胎的即时损伤，特别是在发育的早期阶段，导致表面收缩。当HMDS和CPD分别用于胚胎和真菌培养时，未观察到充电或干燥伪影。对于海龟蛋壳等硬质组织，除了在室温下进行清洗和空气干燥外，无需进行特殊处理，然后安装进行成像。
无论采用何种制备方法，都应使用渐进乙醇梯度步骤来降低干燥伪影的可能性。最初，发现HMDS和CPD样品在文献中提供的脱水和干燥方案后具有收缩表面伪影。经过一系列的标准化，我们确定这些伪像是酒精脱水的结果。在脱水期间使用更渐进的乙醇增加的缓慢脱水过程至关重要。此外，与真菌培养相比，胚胎每次迭代的持续时间应该更长。此外，在 100% 乙醇上再增加一个步骤可确保完全均匀饱和。HMDS 可以完全或部分去除，以便对样品进行空气干燥，但发现长时间接触 HMDS 和蒸发逐渐干燥空气对胚胎有效，以避免因大表面造成的干扰（图 4A，C）微生物细胞附着物51的张力。将标本浸入 HMDS 和一夜缓慢干燥中，发现Daphnia 物种52中具有出色的表面结构，这表明软细组织可以从缓慢干燥过程中受益。通过脱水后逐渐增加HMDS对乙醇的浓度，通过缓慢化学干燥获得胚胎可接受的图像质量。
所有样品均采用双面碳胶带安装在铝根上，以提供导电表面，如果需要以不同方向成像同一样品，也可使用薄涂层无色指甲油。与使用双面碳胶带相比，在存根表面使用指甲油时，可轻松从存根中取出样品，并将样品定位在替代平面中。由于样品不导电，因此有必要在样品上溅出一层薄薄的金属，以增加导电性。本研究在溅射涂层过程中使用了一个金靶，而金铂也会产生类似的结果，避免充电效果。正确的光束电压取决于样品，对于轻涂层试样，在 2-5 kV 的场发射 SEM 成像将很好地定义表面结构。对于涂层充足的组织，5 kV 通常提供更好的信号，而不会有更多的光束穿透。对于缺乏深度且仅涂有黄金的试样，在更高的电压（10 kV）下成像可以更好地可视化表面地形。
为 SEM 制备精细组织带来了独特的挑战，并且可以使用一系列样品制备技术来克服和最小化成像伪影。我们提供用于SEM成像处理三种不同精细生物组织样本的综合方法：胚胎、硬质蛋壳和真菌培养。在我们的调查中，对以前发表的研究中的流行方法进行了细微的改变，我们确定了每种精细组织类型所特有的最合适的脱水和干燥方法。这些协议可以加以调整，以便从类似的生物样品中获得可接受的SEM图像质量。
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Disclosures
作者没有什么可透露的
Acknowledgments
作者要感谢丹尼尔·巴尔达萨雷博士，纽约州立大学奥斯韦戈对手稿的有益讨论和评论。这项研究得到了奥斯韦戈的米溪联合助学金的支持;挑战赠款纽约奥斯威戈和国家科学基金会（NSF）小额赠款给PGL和JG。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Fischer Scientific | S25127A | for slide cultures |
| Aluminum pin stub | Tedpella | 16111 | 12.7 mm x 8 mm |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: Potato Dextrose Agar | BD 213400 | DF0013-17-6 | Media for isolation and cultivation of Fungi, yeast and molds |
| Chloramphenicol | Fischer BioReagents | BP904-100 | Antibiotic for media |
| Coarse Vermiculite | Greenhouse Megastore | SO-VER-12 | bedding medium |
| Clear 12- well plate | Corning | 07-201-589 | for fixing embryo |
| Coverslips | Fischer Scientific | S17525B | for slide culture |
| Critical Point Dryer | Quorum CPD | EMS850 | critical point drying |
| Culture dishes | Fischer Scientific | 08 747B | DISH PETRI 100X10MM 12/PK |
| Ethanol | Fischer Scientific | A406P 4 | dehydration agent |
| Forceps- Aquarius Tweezers | Tedpella | 5804 | style 4, length 108mm, widh x thickness 0.017 x 0.17 mm |
| Glutaraldehyde | Fischer Scientific | G151-1 | fixative |
| Gold target for sputter coater | DENTON VACUUM | TAR001-0158 | Gold Target, 2.375″ D X .002″ |
| Hexamethyldisilazana | Fischer Scientific | C19479-5000 | chemical drying agent |
| Kim wipes | Kimtech | S-8115 | cleaning |
| Microscope slides | Thermo Scientific | 67-762-16 | for slide culture |
| Microscopy Scissors | Tedpella | 1327 | Double pointed, stainless steel, 100 mm L (3-5/8"). |
| Micro-scissors | Tedpella | 1346 | Vannas-type, straight, 80mm L |
| Moria Perforated Embryo Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Length 14.5 cm, tip diameter 20 mm, spoon depth 5 mm |
| Netwell Inserts | Corning | 0330B09 | 15 mm Inserts with 74 µm Mesh Size Polyester Membrane act as handy carriers during specimen processing into different solvents |
| Paraformaldehyde | Fischer Scientific | T353 500 | fixative |
| Peat moss | Walmart- Miracle Gro | 551705263 | bedding medium |
| PELCO tabs double stick carbon conductive tape | Tedpella | 5000 | 12 mm OD |
| Sputter coater | DENTON VACUUM | DESK V | thin metal coating |
| SEM | JEOL USA | JEOL JSM 6610LV scanning electron scope | electron microscopy |
References
- Packard, M. J. Ultrastructural Morphology of the Shell and Shell Membrane of Eggs of Common Snapping Turtles (Chelydra serpentina). Journal of Morphology. 165 (2), 187-204 (1980).
- Solomon, S. E., Watt, J. M. The structure of the eggshell of the leatherback turtle (Dermochelys coriacea). Animal Technology. 36 (1), 19-27 (1985).
- Sahoo, G., Mohapatra, B. K., Sahoo, R. K., Mohanty-Hejmadi, P. Ultrastructure and Characteristics of Eggshells of the Olive Ridley Turtle (Lepidochelys olivacea) from Gahirmatha, India. Acta Anatomica. 156, 261-267 (1996).
- Mitrus, S. The calcareous layer eggshell of the turtle Emys Orbicularis: Ultrastructure and composition. Italian Journal of Zoology. 70 (1), 13-16 (2003).
- Chang, Y., Chen, P. Y. Hierarchical structure and mechanical properties of snake (Naja atra) and turtle (Ocadia sinensis) eggshells. Acta Biomaterialia. 31, 33-49 (2016).
- Samson, R. A., Stalpers, J. A., Verkerke, W. A simplified technique to prepare fungal specimens for scanning electron microscopy. Cytobios. 24, 7-11 (1979).
- Kaminskyj, S. G. W., Dahms, T. E. S. High spatial resolution surface imaging and analysis of fungal cells using SEM and AFM. Micron. 39, 349-361 (2008).
- Wisse, E., et al. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World Journal of Gastroenterology. 16 (23), 2851-2866 (2010).
- Braet, F., De Zanger, R., Wisse, E. Drying cells for SEM, AFM and TEM by hexamethyldisilazane: a study on hepatic endothelial cells. Journal of Microscopy. 186 (1), 84-87 (1997).
- Echlin, P. Handbook of Sample Preparation for Scanning Electron Microscopy and X-Ray Microanalysis. , UK: Springer. (2009).
- Bell, P. B., Safiejko-Mroczka, B. Preparing whole mounts of biological specimens for imaging macromolecular structures by light and electron microscopy. International Journal of Imaging System Technology. 8 (3), 225-239 (1997).
- Bahr, G. F., Bloom, G., Friberg, U. Volume changes of tissues in physiological fluids during fixation in osmium tetroxide or formaldehyde and during subsequent treatment. Experimental Cell Research. 12 (2), 342-355 (1957).
- Baker, J. R. Principles of biological microtechnique; a study of fixation and dyeing. , Wiley. London Methuen; New York. (1958).
- Glauert, A. M. Practical methods in electron microscopy. Journal of Microscopy. 3, 5-65 (1974).
- Hayst, M. A. Biological Applications. Principles and techniques of electron microscopy, 4th ed. , Cambridge University Press. 13-105 (1970).
- Pathan, A. K., Bond, J., Gaskin, R. E. Sample preparation for SEM of plant surfaces. Materials Today. 12 (1), 32-43 (2010).
- Hayat, M. A. Electron microscopy: Biological applications. 4th ed. , Cambridge University Press. New York. (2000).
- Hayat, M. A. Fixation for electron microscopy. , Academic Press. New York. (1981).
- Karnovsky, M. J. A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolarity for use in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 27, 137-138 (1965).
- McDowell, E. M., Trump, B. F. Histologic fixatives suitable for diagnostic light and electron microscopy. Archives Pathology and Laboratory Medicine. 100, 405 (1976).
- Wisse, E., et al. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World Journal of Gastroenterology. 16 (23), 2851-2866 (2010).
- Fischer, E. R., Hnasen, B. T., Nair, V., Hoyt, F. H., Dorward, D. W. Scanning Electron Microscopy. Current Protocols in Microbiology. , Unit2B.2 (2012).
- Magalhaes, M., et al. Embryonic development of the Giant South American River Turtle, Podocnemis expansa (Testudines: Podocnemididae). Zoomorphology. 136 (4), 523-537 (2017).
- Hopwood, D. Fixatives and fixation: a review. The Histochemistry Journal. 1 (4), 323-360 (1969).
- Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde fixation. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 33 (8), 845-853 (1985).
- Bell, P. B., Rundquist, I., Svensson, I., Collins, V. P. Formaldehyde sensitivity of a GFAP epitope, removed by extraction of the cytoskeleton with high salt. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 35 (12), 1375-1380 (1987).
- Hayat, M. A. Glutaraldehyde: Role in electron microscopy. Micron and Microscopica Acta. 17 (2), 115-135 (1986).
- Nation, J. L. A new method using hexamethyldisilazane for preparation of soft insect tissues for scanning electron microscope. Stain Technology. 58 (6), 347-351 (1983).
- Bray, D. F., Bagu, J., Koegler, P. Comparison of hexamethyldisilazane (HMDS), Peldri II, and critical point drying methods for scanning electron microscopy of biological specimens. Microscopy Research Technique. 26 (6), 489-495 (1993).
- Barre, C., O'Neil, D., Bricelj, V. M. Preparation of large bivalve specimens for scanning electron microscopy using Hexamethyldisilazane (HMDS). Journal of Shellfish Research. 25 (2), 639-641 (2006).
- Lee, J. T. Y., Chow, K. L. SEM sample preparation for cells on 3D scaffolds by freeze-drying and HMDS. SCANNING. 33, 1-14 (2011).
- Araujo, J. C., et al. Comparison of hexamethyldisilazane and critical point drying treatments for SEM analysis of anaerobic biofilms and granular sludge. Journal of Electron Microscopy. 52, 429-433 (2003).
- Boyde, A., Bailey, E., Jones, S. J., Tamarin, A. Dimensional changes during specimen preparation for scanning electron microscopy. SEM/IITRI. 10, 507-518 (1977).
- Read, N. D., Porter, R., Beckett, A. A comparison of preparative techniques for the examination of the external morphology of fungal material with the scanning electron microscope. Canadian Journal of Botany. 61 (8), 2059-2078 (1983).
- Melo, I. S., Faull, J. L. Scanning electron microscopy of conidia of Thichoderma stromaticum, a biocontrol agent of witches broom disease of cocoa. Brazilian Journal of Microbiology. 35, 330-332 (2004).
- Pathan, A. K., Bond, J., Gaskin, R. E. Sample preparation for scanning electron microscope of plant surfaces- Horses for courses. Micron. 39, 1049-1061 (2008).
- Packard, G. C., Taigen, T. L., Packard, M. J., Boardman, T. J. Water relations of pliable-shelled eggs of common snapping turtle (Chelydra serpentine). Canadian Journal of Zoology. 58, 1404-1411 (1979).
- Packard, M. J., Packard, G. C., Boardman, T. J. Structure of eggshells and water relations of reptilian eggs. Herpetologica. 38, 136-155 (1982).
- Cordero, G. A., Janzen, F. J. An Enhanced Developmental Staging Table for the Pianted Turtle, Chrysemys picta (Testudines: Emydidae). Journal of Morphology. 275, 442-455 (2014).
- Yntema, C. L. Procurement and use of turtle embryos for experimental procedures. The Anatomical Record. 149, 577-586 (1964).
- Matsubara, Y., Kuroiwa, A., Suzuki, T. Efficient harvesting methods for early-stage snake and turtle embryos. Development Growth Differentiation. 58, 241-249 (2016).
- Moran, P., Coats, B. Biological Sample Preparation for SEM Imaging of Porcine Retina. Microscopy Today. , 10-12 (2012).
- Bray, D. F., Bagu, J., Koegler, P. Comparison of hexamethyldisilazane (HMDS), Peldri II, and critical point drying methods for scanning electron microscopy of biological specimens. Microscopy Research Technique. 26, 489-495 (1993).
- Botes, L., Price, B., Waldron, M., Pitcher, G. C. A simple and rapid Scanning Electron Microscope preparative technique for delicate "Gymnodinioid" Dinoflagellates. Microscopy Research Technique. 59, 128-130 (2002).
- Dekker, N. P., Lammel, C. J., Brooks, G. F. Scanning Electron Microscopy of piliated Neisseria gonorrhoeae processed with hexamethyldisilazane. Journal of Electron Microscopy. 19, 461-467 (1991).
- Fratesi, S., Lynch, F. L., Kirkland, B. L., Brown, L. R. Effects of SEM preparation techniques on the appearance of bacteria and biofilms in the Carter Sandstone. Journal of Sedimentary Research. 74, 858-867 (2004).
- Jung, S. W., Joo, H. M., Park, J. S., Lee, J. H. Development of a rapid and effective method for preparing delicate dinoflagellates for scanning electron microscopy. Journal of Applied Phycology. 22, 313-317 (2010).
- Bernd, S., Bentley, D. Use of HMDS (hexamethyldisilazane) to dry organic microstructures in etched bivalve mollusk and barnacle shells. Nautilus -Greenville then Sanibel. 116, 25-31 (2002).
- Bowen, W. R., Hemann, C. C., Johnson, A. A., Good, B. H. Mermithid Nematodes: SEM Observations Comparing Hexamethyldisilazane and Critical Point Drying Methods. Journal of the Arkansas Academy of Science. 44, Article 6 (1990).
- Jusman, J., Ng, S. C., Osman, N. A. A. Investigation of CPD and HMDS Sample Preparation Techniques for Cervical Cells in Devloping Computer-Aided Screening System Based on FE-SEM/EDX. The Scientific World Journal. 289817, 1-11 (2014).
- Hazrin-Chong, N. H., Manefield, M. An alternative SEM drying method using hexamethyldisilazane (HMDS) for microbial cell attachment studies on sub-bituminous coal. Journal of Microbiological Methods. 90, 96-99 (2012).
- Laforsch, C., Tollrian, R. A new preparation technique of daphnids for Scanning Electron Microscopy using hexamethyldisilazane. Arch Hydrobiology. 149 (4), 587-596 (2000).
