Summary
Här presenterar vi detaljerade bearbetnings protokoll för avbildning av känsliga vävnadsprov med hjälp av scanningelektronmikroskopi (SEM). Tre olika bearbetningsmetoder, nämligen, hexametyldisilazana (HMDS) kemisk torkning, enkel lufttorkning, och kritisk punkt torkning beskrivs för beredning av styv äggskal, embryon i tidiga utvecklingsstadier, och svamp kulturer respektive.
Abstract
Även om scanning elektronmikroskopi (SEM) används i stor utsträckning för den ultrakonstrukturella analysen av olika biologiska och icke-biologiska prover, innebär metoder involverade i bearbetning av olika biologiska prover unika metoder. Alla konventionella metoder som beskrivs i litteraturen för bearbetning prover fortfarande hitta användbara program, men subtila förändringar i provet preparatet kan förändra bildkvaliteten, samt införa artefakter. Därför, med hjälp av en unik provberedning teknik som är specifika för den typ av vävnad analyseras krävs för att få en god kvalitet bild med ultrastrukturella upplösning. Fokus för denna studie är att ge optimala provberedning protokoll för Imaging embryon, stela äggskal, och svamp kulturer med SEM. Följande optimeringar rekommenderades att ge goda resultat för de tre olika känsliga biologiska prover studeras. Användning av mildare fixeringsmedel som 4% PARAFORMALDEHYD eller 3% glutaraldehyd följt av uttorkning med etanol serien är obligatoriskt. Svamp mycel på agar block som erhålls genom bild kulturer ger en bättre ultrastrukturella integritet jämfört med kulturer tagna direkt från agar plattor. Kemisk torkning av embryon med HMDS ger torkning utan att införa ytspännings artefakter jämfört med kritisk punkt torkning. HMDS förhindrar sprickbildning orsakad av krympning eftersom proverna är mindre spröda under torkning. Men för svamp kultur, kritisk punkt torkning ger acceptabel bildkvalitet jämfört med kemisk torkning. Äggskal kan avbildas utan särskild förberedelsesteg förutom grundlig tvättning och lufttorkning före montering. Berednings metoderna standardiserades utifrån godtagbar bildkvalitet som erhållits vid varje försök.
Introduction
Scanning elektronmikroskop (SEM) ultrastrukturell analys och intracellulära Imaging komplettera ljus mikroskopi för tredimensionell profilering av prokaryoter, växter och djur. Den höga rumsliga upplösningen av en SEM gör den till en av de mest mångsidiga och kraftfulla tekniker som finns för undersökning av mikrostrukturella egenskaper hos prover vid nanometer till mikrometerskalan. Desiccated prover är beslutna att kompositionella och topografiska strukturer med intensiv detalj, som ger Stiftelsen för att utveckla giltiga slutsatser om funktionella relationer1,2,3 , 4 , ,5 , 6 , 7 , 8 , 9. vid tolkning av SEM-bilder av biologiska preparat är det en stor utmaning att skilja mellan inhemska strukturer och de artefakter som skapas under bearbetningen. SEM drivs i allmänhet med mycket höga vakuum för att undvika störningar från gasmolekyler som påverkar de primära, sekundära eller bakåtspridda elektronstrålar som avges från provet10,11. Dessutom är biologiskt material mottagliga för strålningsskador på grund av deras fattiga eller icke-ledande egenskaper. Det är viktigt för de prover som lastas i SEM att vara helt torr och fri från alla organiska föroreningar för att eliminera eventuella outgassing i en högvakuum miljö10,11. Eftersom biologiska preparat består mestadels av vatten, krävs ytterligare förberedande tekniker för att säkerställa att de inhemska strukturerna bibehålls.
Den erhållna resolutionen bygger på att optimera förberedelse metoder som är specifika för preparat typer och instrumentella parametrar utnyttjas. Därför är det nödvändigt att undvika att använda generaliserade bearbetningssteg för alla vävnadstyper. Vissa biologiska prover kommer att kräva mindre stränga bearbetning för att bevara sin struktur medan mer tid och omsorg kan behövas för känsliga typer av prover för att undvika införandet av torkning artefakter, såsom krympning och kollaps. Provberedning är ett kritiskt steg i SEM Imaging; resultaten av morphometriska studier är anmärkningsvärt påverkade av preparat berednings procedurerna12,13. Vanliga förberedelsesteg för många biologiska prover är fixering, uttorkning och beläggning med en metall som guld, platina eller Palladium för att omvandla sina ytor för att vara ledande för SEM-analys. Arten och kombinationen av steg som används kommer att variera beroende på vilken typ av vävnad, och de specifika målen för studien. Laddning uppbyggnad, känslighet för vakuum och elektronstråle skador utgör problem vid bearbetning av mjuka känsliga biologiska prover, vilket kräver ytterligare bearbetning steg för att behålla den ursprungliga strukturen av objektet. Använda konventionella metoder som osmium grundämnetetroxide fastställande, och uttorkning orsaka krympning och kollapsen av känsliga vävnader14,15,16,17. Syftet med studien är att etablera eleganta metoder som bygger på att kombinera idéer från tidigare studier med modifikationer för att förbereda och avbilda mjuka, ömtåliga vävnader (t. ex. reptilembryon, äggskal av målade sköldpaddor och svamp kulturer).
Val av lämplig infästnings metod är det första viktigaste steget för Mikroskopisk analys av biologiska preparat. Fastställande av vävnader omedelbart efter isolering från en organism är viktigt att förhindra förändring i deras morfologi på grund av nedbrytning. En effektiv fixativ bör avsluta cellulära processer genom att tränga igenom cellerna snabbt och bibehålla effekten oåterkalleligt att stabilisera strukturen i provet för att motstå både efterföljande bearbetning steg och undersökning enligt SEM17 , 18. även om flera kemiska och fysiska fixeringsmetoder är kända, är kemisk fixering oftare används för biologiska prover för att undvika eventuella cellulära förändringar på grund av autolys, förruttnelse, och torkning effekter. Det finns många fixativ kemiska formuleringar som diskuteras i litteraturen17,19,20,21,22,23, fixeringsmedel som fungerar genom att denaturera och koagulerar biologiska makromolekyler, och de som fixas av kovalent tvärbindning av makromolekyler. Alkoholer används som denaturerande fixeringsmedel som bevarar ultrastruktur mycket dåligt och används mest för ljusmikroskopi och rekommenderas inte för elektron Mikroskopisk analys. Tvärbindning fästmedel som formaldehyd, glutaraldehyd, och osmium grundämnetetroxide skapa intermolekylär och intramolekylära tvärbindning mellan makromolekyler i vävnaderna, vilket ger utmärkt bevarande av Ultra-strukturer11 ,24,25,26. Biologiska prover är känsliga för temperatur. Temperaturen i början av fixering rekommenderas att vara 4 ° c för att minska den laterala rörligheten för membranproteiner, att bromsa spridningen av intercellulära molekyler, och att bromsa graden av fixering11. Den tid som krävs för att fästa vävnader beror till stor del på provets storlek och den hastighet med vilken fixativ sprider sig och reagerar med komponenterna i preparatet. En övernattning fixering i 4% PARAFORMALDEHYD eller 3% glutaraldehyd i PBS vid 4 ° c är den föredragna metoden för SEM analys av prover som används i denna studie för deras sekventiella penetrerande egenskaper, som gör att mindre känsliga prover som skall bearbetas17 , 18 , 19 , 20 , 27. en post-fixering steg med osmium grundämnetetroxide elimineras inte bara på grund av dess giftiga natur utan också funnit att genomföra ingen extra fördel att förbättra bildkvaliteten för de prover som analyseras i denna studie.
Biologiska prover innehåller vätskor som stör SEM-operationen; Proverna måste därför torkas innan de sätts in i SEM-provkammaren. När dehydratisering säkerställs, måste lösningsmedlet avlägsnas från vävnaden utan att skapa artefakter i proverna på grund av ytspänningen/torkning. Tre olika torkmetoder användes vanligen vid bearbetning av vävnader för SEM-avbildning: lufttorkning, kritisk punkt torkning och frys tork prov28,29,30,31. Få studier rapporterar alla tre torkmetoder som producerar identiska resultat med djurvävnadsprover28,29,30,31. En allmän praxis som används för mindre exemplar är kemisk uttorkning genom stigande koncentration serie av alkohol och hexamethyldisilazane (HMDS), men större prover torkas med hjälp av en kritisk punkt torkning (CPD) instrument32. Under torkningsprocessen, stora krafter bildas i små hålrum som leds genom provet genom en vätska/gas gränssnitt; Detta kan även leda till en fullständig kollaps av de ihåliga strukturerna33. Deformationer som uppstår på grund av behandlingen kan då förväxlas med en ursprunglig strukturell egenskap hos preparatet. Således bör det generaliserade fenomenet för bearbetning elimineras och en unik torkprocess bör standardiseras för varje typ av vävnad, särskilt när känsliga vävnadsprov analyseras.
I flera prövningar som utförs med hjälp av olika kombination av alla ovan nämnda processer, standardiserade vi de metoder som kan användas för SEM analys av tre känsliga vävnader: reptil embryon, äggskal av målade sköldpaddor och svamp kulturer. Utvecklingbiologer och morfologer beskriver normala och onormala morfogenes under embryots utveckling hos representativa ryggradsdjur. Utredningar om gen signalvägar beror på den morfologiska beskrivningen av nya strukturer. För att undvika plötsliga förändringar av ryggradsdjur embryot under SEM-analys, rekommenderar vi kemisk torkning efter uttorkning. Kemisk torkning med HMDS är den relativt nyaste tork metoden och fördelarna inkluderar relativ snabbhet, användarvänlighet, förlorad kostnad, och den begränsade expertis och utrustning som behövs9. CPD är en vanligt förekommande torkteknik med hjälp av passaging CO2 över proverna vid en viss temperatur och tryck. Vi identifierade att HMDS är lämplig för torkning av mjuka känsliga vävnader och tillåter större prover som skall bearbetas jämfört med kritisk punkt torkning, vilket orsakade omfattande deformation till embryonala vävnader. Flera metoder har använts för att förbereda prover för SEM Imaging att studera de morfologiska egenskaperna hos svampar34. Svampprover är vanligen fasta i osmium tetroxid följt av etanol uttorkning och kritisk punkt torkning, som kan ge tillfredsställande resultat, även om de toxiska effekterna av osmium grundämnetetroxide6,7,35 och förlora svamp material medan föränderliga lösningar under bearbetningen är uttalade nackdelar. Provet beredning teknik med hjälp av lufttorkning utan fixering har också praktiserats36 men resulterar i krympta och kollapsade strukturer, och observation av sådana prover kan lätt misstolkas medan karakterisera arten. Svamp hypha förlorar sin integritet i kontakt med vätskor och en jämn torkning kan inte uppnås för att återställa strukturen. På grund av denna effekt, frystorkning används ofta för torkning av mjuka vävnader som svamp mycel. Frystorkning fungerar bra för rena material men närvaron av eventuella salter eller sekretion kommer att skymma ytan detalj som kommer att identifieras endast på SEM visning skede. Vi kopplade bild kulturen metoden med glutaraldehyd fastställande och kritisk punkt torkning för att ge strukturella detaljer i intakt svamp hyfer och sporer. Även om CPD torkning orsakade krympning hos embryon, det resulterade i väl bevarade Mycelial strukturer när den kombineras med glutaraldehydfixering. Äggskal är av primär betydelse för embryot till oviparous djur genom att inte bara fungera som en skyddande beläggning utan också att ge mekanisk stabilitet, permeabilitet för gas och vatten, och en kalcium reserv för att utveckla embryot. Sötvatten sköldpadda äggskal klassificeras som "stela" baserat på deras struktur, och på grund av deras tillgänglighet har fått betydande uppmärksamhet från biologer1,2,3,4 , ,5 , 6 , 7 , 37 , 38.
Vi detalj enkla metoder för enkel undersökning av äggskal och skal membran av målade sköldpadda som kan tillämpas på alla stela äggskal arter. Beredningsmetoder utvärderades baserat på resulterande bildkvalitet och minskad potentiella artefakter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: målade sköldpadda (Chrysemys picta) ägg som används i denna studie samlades under häckningsperioden maj till juni 2015-16 från Rice Creek Field Station, Oswego New York med tillstånd från New York State Department of Environmental Bevarande (DEC).
1. kemisk torkmetod för att bearbeta embryon för SEM
- Samla sköldpadda ägg från fält platser under häckningssäsongen. Förbered inkuberingskamrarna i förväg, gjorda av plastlådor med lock (L x b x H) 6,7 cm x 25,4 cm x 10,2 cm fyllda med sängkläder medium beredd med en fuktig blandning av vermikulit och torv mossa (1:1 ratio). Gör 4-6 hål på cirka 0,25 cm längs sidorna av rutorna och på locket för att tillåta luftning.
- Ta försiktigt bort jorden från boet för att avslöja äggen. Torka av ytan av sköldpaddsägg med utspädd jod tinktur (1:25000) för att kontrollera mikrobiell kontaminering under inkubering. Placera klorna åtskilda från varandra, kan kopplingen storlek målade sköldpadda variera från 5-9 ägg och placera högst 8-9 ägg per låda.
Obs: noggrant hantera äggen under insamling, torkning, märkning och placering inuti lådorna. Placering och anpassning av ägg måste vara samma som de lades, någon rörelse kommer att hämma embryots utveckling. - Manuellt begrava äggen hälften i strö, täck och Placera lådan inne i inkubatorn inställd på 30 ° c. Inkubera äggen i 10-17 dagar för att erhålla de embryonala stadierna 12, 13 respektive 18 som används i denna studie. Tillsätt destillerat vatten för att delvis blöta strö medlet varannan dag för att undvika uttorkning och för att bibehålla fuktnivån för normal utveckling av embryona.
Obs: inkubation och embryona är enligt en komplett utvecklings tabell publicerad tidigare39. - Fix embryona genom att göra det första snittet på ena sidan av dorsala äggskal och äggula membran tillsammans, vertikal till den långa axeln med hjälp av spetsiga saxar. Sätt saxen i äggulan noga för att undvika att skära embryonala skivan. Skär nu den laterala sidan av ägget längs den långa axeln och skär sedan den andra sidan av ägget längs den korta axeln.
- Skala öppna den exciderade biten med embryosidan upp med hjälp av pinps. Skär den andra laterala sidan av äggskal och placera den exciderade delen i fosfatbuffrad saltlösning (PBS vid ett pH på 7,4).
Obs: sköldpaddan ägg är fylld med mycket trögflytande äggula och ryggsidan av embryot följer äggskal membranet. Äggskal membranet nära embryot ändras med inkubation från genomskinlig vit till en ogenomskinlig, kalkhaltig vit. Detta gör att man kan lokalisera embryot i mitten av den långa axeln och ses som en mörk förkalkade plats från utsidan40,41. - Använd ett stereomikroskop för att isolera embryona tillsammans med äggula membranet genom att skala dem från äggskal med hjälp av tång. Ta bort extra-embryonala membran med hjälp av pinps och mikro-sax. Överför embryot med hjälp av en embryosked till färsk PBS i en petriskål för att tvätta blod eller äggula.
- Använd tydliga 12-brunn plattor för att fastställa embryon över natten i 4% PARAFORMALDEHYD i PBS vid 4 ° c eller i 2-3% glutaraldehyd i PBS. Placera en till tre embryon i varje brunn beroende på storleken på embryona. Säkerställ fullständig infiltration (prover kommer att visas vita) för äldre embryon genom att förlänga fixering tid för 2-3 dagar. Skölj embryon 3x med färsk PBS i 5 min varje sköljning.
Anmärkning: Undvik att skada embryots yta genom att använda polystyrenskär med polyestermesh-bottnar för 12-well-plattor för att överföra prover från ett lösningsmedel till ett annat. - Dehydrera prover med en serie etanol koncentration i destillerat vatten: 30%, 50%, 70%, 80%, 95%, och 100% och behandla prover för 1 h i varje dehydratisering lösning. Upprepa steget med 100% etanol två gånger för att säkerställa fullständig uttorkning. Om den inte används omedelbart, förvara proverna i 70% etanol vid-20 ° c under en längre period.
- Torra embryon med hjälp av en serie hexamethyldisilazana (HMDS) till 100% etanol koncentration: 1:2, 2:1 och 100%. Lämna proverna i varje lösning för 20 min och hålla petriskål delvis täckt under processen.
Anmärkning: utför alla steg som involverar HMDS i draghuv med nödvändiga personliga skydds redskap eftersom HMDS är mycket giftigt. - Lämna embryona i den slutliga 100% HMDs lösning täckt helt eller delvis i en dragfläkt över natten medhjälp i avdunstning av HMDs, lämnar prover redo för montering och spotta beläggning. Täck skålen för att eliminera damm sedimentering över proverna.
Obs: vävnaden kommer att visas vitt efter fullständig torkning och delvis torkade prover kommer att se gul färg, lämna dessa vävnader i rök huven under en längre tid. - Välj storleken på aluminium och kol tejp per storlek av provet analyseras. Montera de torkade proverna försiktigt på en standard aluminium stift stub (12,7 mm x 8 mm) med dubbel stick Carbon ledande tejp (12 mm).
- Introducera monterade prover i kammaren av spotta bestrykare att belägga preparatet med en mycket tunn film av guld för att eliminera laddningen effekt. Guld plattan exemplaren för 60-120 s vid en 35 mA Sputter.
- Montera skivorna på motsvarande porplåtar genom att fästa fästskruvarna på ett säkert sätt. Överför provhållaren till eller från SEM-provkammaren med hjälp av verktyget Sample Exchange. Bild proverna i högvakuum läge med en accelererande strål spänning på 10 kV och emissions ström 10 μA.
Observera: Använd alltid handskar vid hantering av prover, provhållare, monteringsmedel och överföringsverktyg för att undvika att fett kontamineras från händerna till SEM-systemet. - Testa alternativa metoder som anges nedan för att jämföra upplösningen av prover som erhållits från ovanstående förfarande.
- Inkludera en post-fixering med 1% osmium tetroxid för 1 h vid rumstemperatur efter steg 1,7.
- Helt eller delvis ta bort HMDS i steg 1,10 för snabb snabb avdunstning av HMDS.
- Bearbeta embryon efter steg 1,8 med hjälp av kritisk punkt torkning (CPD) genom att följa steg 3.3-3.4.
2. beredning av äggskal för SEM med hjälp av en lufttorkning metod
- Samla in och inkubera den målade sköldpaddan (Chrysemys picta) ägg för att fastställa de embryon som anges i steg 1.1-1.7.
- Spara äggskal i destillerat vatten efter embryofixering i steg 2,1. Rengör äggskal grundligt genom blötläggning i destillerat vatten i minst 1 h för att eliminera äggula och albumin förorening.
- Lufttorka äggskal efter tvättning på ömtåliga antistatiska våtservetter i draghuv över natten. Förvara torkade äggskal i rena preparat flaskor märkta med nummer och Stadium.
- Montera, spotta Coat och bild proverna genom att följa stegen i steg 1.11-1.13.
3. kritisk punkt torkning metod för beredning av svamp kulturer för SEM
- Skapa bild kulturer
- Förbered potatis dextros agar (PDA) media för svamp kulturer: Tillsätt 39 g PDA-ström i 1 L destillerat vatten i en Erlenmeyer-kolv. Blanda väl genom att snurra kolven och autoklav mediet vid 121 ° c i 30 min. Låt medie lösningen svalna och tillsätt sedan den antibiotiska kloramfenikol (25 μg/mL) med en steril mikropipett.
Anmärkning: efter sterilisering ska agarlösningen vara varm och den kommer inte att stelna snart. Cool det nog så att det inte kommer att inaktivera antibiotika. - Blanda det med virvlande och häll plattor (ca 10-12 mL av media för varje 10 cm petriskål), försiktigt stack upp och låt stelna.
- Använd en steril skalpell blad för att skära ut små block av agar ca 1/2 till 3/4 av en tum. Ta bort och placera ett agarblock på ett rent glas Mikroskop Slide.
- Placera bilden i en ren petriskål för att förhindra kontaminering och bevara fukt under inkubering.
- Höj bilden från botten av petriskål med hjälp av en steril tandpetare för att skapa ytspänning mellan plattan och bilden för att ta bort glas bilden utan att störa den känsliga tillväxten efter inkubering.
- Använd en steril ögla eller en nål för att överföra några av svampen från preparatet inokulum till var och en av de fyra sidorna av agarblocket på bilden.
- Placera en ren täckslip på ytan av agarblocket efter inympning. Tillsätt några droppar sterilt destillerat vatten till petriskål runt bilden för att säkerställa fukt för de växande svampen.
- Försegla plattan delvis med paraffin film och inkubera plattan vid 30 ° c under en lämplig tidsperiod (för Fusarium arter inkubera för 36 till 48 h).
- Ta bort bilden från petriskål och separera tätt sittande täckglas från agarblocket med hjälp av sterila Pinkett. Fixera agarblocken i 3% glutaraldehyd i PBS över natten vid 4 ° c.
- Förbered potatis dextros agar (PDA) media för svamp kulturer: Tillsätt 39 g PDA-ström i 1 L destillerat vatten i en Erlenmeyer-kolv. Blanda väl genom att snurra kolven och autoklav mediet vid 121 ° c i 30 min. Låt medie lösningen svalna och tillsätt sedan den antibiotiska kloramfenikol (25 μg/mL) med en steril mikropipett.
- Torka proverna genom att passera genom en etanol serie: 10%, 25%, 50%, 75% och 90% med 15 min per förändring. Bearbeta proverna för slutlig dehydrering med två förändringar i 100% etanol som varar 30 minuter vardera för att säkerställa fullständig mättnad.
- Kritisk punkt torkning: placera dehydratiserade prover i CPD-apparatens kammare. Försegla och kyla kammaren genom att öppna ventilerna för att tillåta flytande CO2 in och ventilera etanol ut, tills Liquid Co2 fyller kammaren helt.
- Täta och värm kammaren långsamt för att uppnå en kritisk punkt när kammartrycket överskrider 1000 psi och temperaturen överstiger 31 ° c, är vätske-och gas fasen av CO2 i jämvikt. Långsamt dränera CO2 från kammaren och provet som gas för att undvika effekter av ytspänningen.
- Utför montering, guldplätering och avbildning proverna genom att följa steg som specificeras i steg 1.11-1.13.
- Utföra jämförande analys genom kemisk torkning av proverna från steg 3,2 med HMDS genom att följa steg 1.9-1.13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 Visa skanning elektron Mikrografisk analys av målade sköldpadda (Chrysemys picta) embryon. Målade sköldpadda ägg samlas in och inkuberas på ett strö medium, monterad på aluminium-stubbar efter kemisk torkning användes för SEM-avbildning (figur 1a-E). En lateral bild av en etapp 12 embryo visar kraniofacial strukturer; maxillary framträdande sträcker sig bortom mandibular och begränsar en väl markerad nasal grop medialt; fem faryngeala valv observerades också (figur 1F). Nybildade thoraxsegmenten på den bakre svansen regionen av embryot är lätt räknebara jämfört med segmenterade kroppen thoraxsegmenten. Forelimb knoppar verkar längre jämfört med Hind lem knoppar och punkter mer caudally än ventrally. En väldefinierad utväxt av en ryggskölden ås ses längs hela tvären flank region av Stage 15 embryo (figur 1G. På etapp 18, målade sköldpaddor besitter en kort, svagt projicera nos. Den undre näbben vilar i överkäken och är något uppåtvänd med en kopplingsplint som passar in i den övre näbben (figur 1H). Den övre käken av de målade sköldpaddorna visar en spårat utseende bildar en medial U-V formad distala spets med en liten KUSP på varje sida, en liten Egg tand börjar bildas vid spetsen av överkäken. Lem knoppar som dök upp längre under tidigare stadier bildar en paddel-liknande struktur under etapper 13-14 med digital skylt vagt indicerat. Lem Mesenchyme avgränsas av apikala ektodermal åsen ses längs främre-bakre marginalerna (figur 1I-J).
Figur 2 visar Ultra-strukturell analys av Chrysemys picta äggskal och skal membran med SEM Imaging. Målade sköldpaddsäggskal erhölls enligt beskrivningen ovan och utsattes för lufttorkning efter tvättning med dubbelt destillerat vatten (figur 2a, B). Äggskal monterade på aluminium med dubbelsidig koltejp (figur 2C) avbildades med SEM. En lateral bild av skalet visade yttre kalkhaltig äggskal skikt fast knutna till den inre trådformiga skalet membran (figur 2D). Den yttre ytan av äggskal består av väl framstående mineraliserade skalenheter, gjorda av globular/sfäriska knölar arrangerade i grupper och mellan intilliggande skalenheter en koncentration av små rundade fördjupningar eller porer i olika storlekar var observerats (figur 2E). Noduler från varje grupp av Shell enheter möts vid en anslutning korsning, mittpunkten (figur 2F). Den yttre ytan var manuellt skalade med hjälp av tång för att observera ytan av skalet membranet. Rader av centrala plack sågs som ger fästpunkten mellan skalenheter och underliggande flerskiktade fibrös membran (figur 2G).
Figur 3 visar den morfologiska karakteriseringen av ascomycete svampisolat från bild kulturer observerade med SEM Imaging. Schema för bildkultur inställning etablerad (figur 3A) visar svamp tillväxt på agarblocket inom två dagar efter inympning. Kolonier växer snabbt med vita till krämfärgade antenn mycel (figur 3B). SEM Imaging efter kritisk punkt torkning och spotta beläggning av agar skivor avslöjade svamp hyfer, böjda conidia, och ris som sporer. Conidiophores sågs i sidled från septate Aerial hyfer (figur 3C). Makroconidia produceras på kortare, förgrenade konidioforer är måttligt böjda, med korta, trubbiga apikala och otydligt pedicellate basal celler mestadels septate (figur 3D).
Figur 4 visar jämförande resultat för bearbetning av liknande preparat med alternativa metoder. Nedtrappning huvuden av Stadium 15 embryon i HMDS och torkning genom gradvis avdunstning visar väl bevarade kraniofacial strukturer, nästan ingen krympningen eller distorsion ses med förlängda tider av långsam avdunstning från HMDS (figur 4A). Embryon efter fast med osmium tetroxid visade ingen urskiljbar skillnad i bildkvalitet med undantag för liten krympning av vävnad jämfört med HMDS långsam bearbetning (figur 4B). Torkning av embryon genom att avlägsna HMDs helt eller delvis så att snabb avdunstning leder till strukturell distorsion och krympning (figur 4C), medan långsam avdunstning löste utmärkta ytstrukturer hos ett liknande iscensatt embryo ( Figur 4 A). de uttorkande artefakterna sågs i de embryon som behandlades med CPD-tekniken och orsakade omfattande krympning och förstörelse av vävnad (figur 4D, E). Agar skivor från bild kulturer visar ofullständig torkning av svampisolat med HMDS behandling jämfört med CPD (figur F). Fullständig torkning uppnås med CPD-behandling av agar skivor med ett väl torkat, vitt preparat som visar intakta högupplöst strukturella egenskaper hos svamp hyfer och sporer (figur 4g-g). Agar block med svamp kulturer verkar krympt och gult färg gör dem inte lämpar sig för SEM Imaging (figur 4H-h).
Figur 1 : Skanna elektronmikrografer av Mer från Chrysemys picta embryon som framställts genom kemisk torkning. (A) Chrysemys picta, häckande under häckningssäsongen på Rice Creek Field Station, OSWEGO, ny. Bvälkonstruerat bo utifrån. C) jordmån som avlägsnats med försiktighet för att bestrålning av äggen. Dägg som placerats i inkubationskammaren med strömedel. E) montering av embryon på aluminium, efter kemisk torkning, E4 som visar det spotta-belagda embryot. (F) lateral visning av etapp 12 embryo som visar ansikts strukturer, extremiteknoppar och somiter. (G) väldefinierad ryggskölden ås och paddelformade öronsnäckor ses vid etapp 15. H) kraniofaciala strukturer i etapp 18 av embryot som visar övre och undre käken, notera en liten Äggtand som bildas vid spetsen av den övre näbben. I) dorsala syn på höger forelimb vid etapp 13-14 och en närbild av Aer (J) vid den dorsala-ventrala gränsen. Skalstreck: F-H, 500 μm; I, 100 μm och J, 10 μm. tangenter: MB, mitthjärna; NP, nasal grop; MXP, maxillary framträdande; PA, faryngeal valv; h, hjärta; fl, forelimb; s, somite; hl, Hind lem; t, svansspets; CR, karapacial ås; et, ägg tand; oc, munhålan; e, öga; UJ, övre käken; lj , underkäken; m, Mesenchyme, AER, apikal ektodermal ås. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Ultrastrukturella analyser av Lufttorkad Äggskal och skal membran av målade sköldpaddsägg. Aefter det att embryona har fixerats, tvättades äggskal grundligt i destillerat vatten för att avlägsna äggula och albumin. Brena äggskal var lufttorkade åtminstone över natten. C) montering av ett äggskal på aluminium. Dradiell bild av skal fragment som visar yttre kalkskikt och inre skal membran. (E) det yttre kalkskiktet visar klotformiga skalenheter (Su) ordnade i grupper och porer som ses mellan dessa enheter (asterisker). F) förstorad bild av en knöl som visar mittpunkten (c) mellan skal enheterna. (G) avlägsnande av kalkrik skikt visar den yttre ytan av skalet membran med fördjupningar kvar bryts från skalenheter. Skalstreck: E, 100 μm; F, 10 μm och G, 20 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Förberedelse av svampodling för SEM-avbildning. (A) Schematiskt diagram för att visa inställningarna för bild kulturen. B) vita svampkolonier som setts på agarblocket efter två dagars inkubation vid 30 ° c. (C) SEM-bild som visar en sektion av mycel av Fusarium Solani, svarta asterisker som markerar makroconidia i sporodochia, en pil som pekar mot phialide, och pilspetsar riktade till microconidia, Scale bar, 10 μm. (D) förstorade bilden av septate klamydosporer, skal stång 5 μm. nycklar: AB, agar block; CS, Coverslip, f, svamp kultur. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Jämförande analys av alternativa metoder för att bearbeta liknande preparat. (A) frontal syn på målat sköldpadds huvud torkat med långsam avdunstning av HMDs (a), efter efter fixering med osmium tetroxid (B), snabb snabbare avdunstning av HMDs (C), och CPD (D-E). Inklusive ett efter bindnings steg med hjälp av osmium tetroxid visar inte någon synlig skillnad i bildkvalitet jämfört med HMDS-behandling utan efter fixering. Deformationer ses efter snabb avdunstning av HMDS, medan gradvis torkning med långsam avdunstning ger en bättre ytstruktur. Olika grader av krympning och kollapsade strukturer ses i regionerna hjärna, ögon och ansiktsuttryck prominenser hos embryon som behandlats med CPD.F) montering av bild kulturer som behandlats med HMDs (1), CPD (2) och spotta-belagt CPD-behandlat preparat (3) på aluminium. (g-g) Fullständig torkning ses som intakt vit färgad agar skiva med svamp Inokulera uppnås genom CPD bevara strukturer av svamp mycel och sporer av Fusarium Solani. (h-h) Otillräcklig torkning av bildkultur, krympning och skadad strukturell integritet ses med HMDS bevarande teknik. Skalstreck: A-E, 500 μm; G-H, 2 mm, och G'-H ', 20 μm. tangenter: et, Äggtand; oc, munhålan; e, öga; UJ, överkäken; lj, underkäken; svarta asterisker, makroconidia i sporodochia; pil, phialide; och pilspetsar, microconidia. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I vår studie testades olika fixeringsmedel, dehydrering och torkmetoder för att förbereda tre olika känsliga biologiska prover för SEM-avbildning: embryon, äggskal och svamp kulturer. SEM används ofta för ytanalys, så fixativ penetration är mindre om, men det måste förstås att dåligt fasta interna strukturer kommer att orsaka inåt krympande eller/och kollapsade ytstrukturer. Förlängd bindningstid bör också övervägas för större vävnadsprover, som ersätter den fixerande lösningen några gånger beroende på fixeringstid. På grund av aktiv interaktion mellan fixativ och vävnaden, de osmotiska egenskaperna hos celler skulle förändras avsevärt. Vävnadsvätskor skulle späda fixativ och därmed en aldehyd effekt bidrar till den totala osmolalitet kan försummas när det gäller effekter på cell volym berörs. Också, formaldehyd skulle tränga snabbare in i vävnader och är mer effektiv som Cross-Linker jämfört med glutaraldehyd. En buffrad formaldehyd-glutaraldehyd blandning rapporterades också för fastställande av en mängd olika vävnader, även om för enskiktslager och cellsuspensioner utspädda lösningar var mer lämpade för fastställande15,16. Emellertid är de utspädda lösningarna också Hypertonic, således är aldehyder inte sig själv osmotically aktivet. För känsliga prover som används i denna studie, PBS vid pH 7,4 användes som ett medel för fastställande agenter, som fosfatbuffertar tros vara mer liknar cytoplasmiska miljöer av de flesta biologiska prover. Dessutom är osmolaritet identifieras för att vara inom det fysiologiska område som krävs för provet medan PBS fungerar som ett fordon för fixerande medlet. Efter fixering med osmium tetroxid rekommenderas ofta för olika biologiska prover16,22,42 men har eliminerats för alla de biologiska prover som används i denna studie. Prover utan osmium tetroxid gav skarpa bilder och prover som fixats med osmium tetroxid gav omöjlig att skilja resultat (figur 4A). Osmium tetroxid orsakar snedvridning av bladvävnad strukturer och ger sämre preparat bevarande jämfört med glutaraldehyd och formaldehyd blandning43, och det har föreslagits att en ansamling av osmium molekyler kan hämma infiltration av uttorkande agenter och övergångs medel som används i CPD, och de lösningsmedel som HMDs används för kemisk torkning. Effekten är vävnads-specifik och exklusive osmium tetroxid kommer inte att ha någon effekt på bildkvaliteten för den typ av känsliga prover analyseras i denna studie. För andra typer av vävnader kan användning av osmium tetroxid elimineras med förlängd primär fixering.
HMDS torkade sköldpadda embryoprover visade välbevarade ytor, och mindre distorsion eller krympning jämfört med CPD (figur 4). CPD minimerar risken för distorsion i cellmorfologi och artefakter produktion på grund av noll eller minimal ytspänning skapas under processen. CPD kan dock orsaka en potentiell fysisk fara för ömtåliga ömtåliga prover. I linje med vår observation, gav HMDs liknande eller högre kvalitet Imaging genom att minimera ytspänningen orsakad på grund av torkning baserat på tidigare studier publicerade44,45,46,47. Jämfört med CPD-behandling, bevarade HMDS strukturella detaljer i det organiska meshwork utmärkt i etsade biventiler och Barnacle skal48 och gav hög upplösning av de strukturella inslagen i den komplexa interna organisationen av mermithid nematoder49 och insekt inre vävnader28. Den torkning plattan artefakter sågs i stora mängder på de preparat som utarbetats av CPD teknik jämfört med HMDS teknik. Membranet blebs och pellets artefakter ökades i livmoderhalscancer celler som utarbetats med hjälp av CPD-teknik50. HMDS reagerar med vatten för att producera hexamethyldisiloxan och ammoniak, som båda avdunster från objektet. HMDS används ofta i gaskromatografi för att skapa silyletrar av föreningar såsom socker, aminosyror, alkoholer, och många andra föreningar. Det är inte känt om HMDS reagerar med vissa av dessa föreningar i vävnader. HMDS kan korslänka proteiner och stelna vävnaden under torkningsprocessen28, även om den exakta anledningen till att HMDs ger bättre bevarande av embryon inte kunde förklaras med undantag för vävnads specificitet. Baserat på resultaten av vår undersökning, CPD orsakat omfattande krympning jämfört med HMDS, och är mycket mer lämpade för bearbetning av embryonala vävnader, särskilt för att analysera ytstruktur för tidiga iscensatta embryon. Den mekanism genom vilken HMDS fungerar på vävnads torkning har inte klarlagts, även om långsam torkning med gradvis avdunstning i absolut vattenfri omgivning kan vara ett skäl för att få en utmärkt yta struktur av djuren.
Små bitar av agar block med svampkolonier från tidigare etablerade bild kulturer användes i denna studie för att undvika problem med att bibehålla den ursprungliga fluffiness av Mycelial mattan. CPD torkning av agar bitar med svampkolonier resulterade i en tvätteffekt, medan förändringar i fixeringsmedel, buffertar och etanol konstaterades vara ett bättre val att övervinna svårigheterna med frystorkning. HMDS som fungerar bra för embryon i alla stadier kunde inte lösa svamp kulturer, medan lufttorkning med HMDS utgjorde ett betydande problem: curling upp och förlora strukturell styvhet. Medan CPD fungerar bra för svamp kulturer, det inducerade omedelbar skada på embryon särskilt i ett tidigt skede i utvecklingen, orsakar krympning på ytan. Ingen laddning eller torkning artefakter observerades när HMDS och CPD användes för embryon och svamp kulturer, respektive. För styv vävnad som äggskal av sköldpaddor, ingen särskild behandling krävs utom för tvättning och lufttorkning vid rumstemperatur före montering för avbildning.
Oavsett beredningsmetod, bör gradvis etanol gradientsteg användas för att minska risken för torkning artefakter. Initialt, både HMDS och CPD prover konstaterades ha yta artefakter med krympning efter dehydrering och torkning protokoll som finns i litteraturen. Efter en serie av standardiseringar, bestämde vi att artefakterna var resultatet av alkohol dehydrering. Det är viktigt att använda en långsam dehydrering process med mer gradvis etanol ökar under uttorkning. Också, varaktigheten av varje iteration bör vara längre för embryon jämfört med svamp kulturer. Ytterligare, ett ytterligare steg på 100% etanol säkerställde fullständig enhetlig mättnad. HMDS kan avlägsnas helt eller delvis för att tillåta lufttorkning av prover, men utökad exponering för HMDS och gradvis lufttorkning genom avdunstning konstaterades vara effektiva för embryon för att undvika störningar (figur 4A, C) orsakad av stora ytor spänning som observerats för mikrobiell cell bilaga51. Doppa exemplar i HMDS och långsam torkning över natten avslöjade en utmärkt ytstruktur i Daphnia arter52 tyder på att mjuka känsliga vävnader kan dra nytta av den långsamma torkningsprocessen. Acceptabel bildkvalitet för embryon kan erhållas med långsam kemisk torkning genom att gradvis öka koncentrationen av HMDS till etanol efter uttorkning.
Alla prover var monterade på aluminium med hjälp av en dubbelsidig koltejp för att ge en ledande yta, ett tunt skikt av färglösa nagellack kan också användas om samma prov måste avbildas i en annan orientering. Prover kan lätt avlägsnas från de män när nagellack används på stub-ytan och positionering av proverna i alternativa plan är möjligt jämfört med att använda dubbelsidig koltejp. Eftersom proverna är icke-ledande, är det nödvändigt att spotta ett tunt lager av metall på proverna för att öka conductance. Ett guld mål användes i denna studie under spotta beläggning, och guld-Palladium ger också liknande resultat undvika laddnings effekter. Rätt strålspänning är prov beroende, för lätt belagda prover, avbildning med ett fält utsläpp SEM på 2-5 kV kommer att ge en bra definition av ytstrukturer. För vävnader med adekvat beläggning ger 5 kV i allmänhet bättre signal utan mer strål inträngning. För prover som saknar djup och är belagda med guld ensam, Imaging vid en högre spänning (10 kV) får bättre visualisering av ytan topografi.
Beredning av känsliga vävnader för SEM innebär distinkta utmaningar, och en rad provberedningstekniker kan användas för att övervinna och minimera Imaging artefakter. Vi erbjuder omfattande metoder för att bearbeta tre olika känsliga biologiska vävnadsprover, för SEM-avbildning: embryon, stela äggskal och svamp kulturer. I vår undersökning, subtila förändringar av populära metoder tillgängliga från tidigare publicerade studier gjordes, och vi identifierade de lämpligaste dehydrering och torkning metoder som är specifika för varje känslig vävnadstyp. Dessa protokoll kan anpassas för att erhålla godtagbar SEM-bildkvalitet från liknande biologiska prover.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja
Acknowledgments
Författarna skulle vilja tacka doktor Daniel Baldassarre, SUNY Oswego för hjälpsamma diskussioner och kommentarer på manuskriptet. Denna studie stöddes av Rice Creek associerade stipendier, Oswego; Challenge beviljar SUNY Oswego och National Science Foundation (NSF) små bidrag till PGL och JG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Fischer Scientific | S25127A | for slide cultures |
| Aluminum pin stub | Tedpella | 16111 | 12.7 mm x 8 mm |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: Potato Dextrose Agar | BD 213400 | DF0013-17-6 | Media for isolation and cultivation of Fungi, yeast and molds |
| Chloramphenicol | Fischer BioReagents | BP904-100 | Antibiotic for media |
| Coarse Vermiculite | Greenhouse Megastore | SO-VER-12 | bedding medium |
| Clear 12- well plate | Corning | 07-201-589 | for fixing embryo |
| Coverslips | Fischer Scientific | S17525B | for slide culture |
| Critical Point Dryer | Quorum CPD | EMS850 | critical point drying |
| Culture dishes | Fischer Scientific | 08 747B | DISH PETRI 100X10MM 12/PK |
| Ethanol | Fischer Scientific | A406P 4 | dehydration agent |
| Forceps- Aquarius Tweezers | Tedpella | 5804 | style 4, length 108mm, widh x thickness 0.017 x 0.17 mm |
| Glutaraldehyde | Fischer Scientific | G151-1 | fixative |
| Gold target for sputter coater | DENTON VACUUM | TAR001-0158 | Gold Target, 2.375″ D X .002″ |
| Hexamethyldisilazana | Fischer Scientific | C19479-5000 | chemical drying agent |
| Kim wipes | Kimtech | S-8115 | cleaning |
| Microscope slides | Thermo Scientific | 67-762-16 | for slide culture |
| Microscopy Scissors | Tedpella | 1327 | Double pointed, stainless steel, 100 mm L (3-5/8"). |
| Micro-scissors | Tedpella | 1346 | Vannas-type, straight, 80mm L |
| Moria Perforated Embryo Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Length 14.5 cm, tip diameter 20 mm, spoon depth 5 mm |
| Netwell Inserts | Corning | 0330B09 | 15 mm Inserts with 74 µm Mesh Size Polyester Membrane act as handy carriers during specimen processing into different solvents |
| Paraformaldehyde | Fischer Scientific | T353 500 | fixative |
| Peat moss | Walmart- Miracle Gro | 551705263 | bedding medium |
| PELCO tabs double stick carbon conductive tape | Tedpella | 5000 | 12 mm OD |
| Sputter coater | DENTON VACUUM | DESK V | thin metal coating |
| SEM | JEOL USA | JEOL JSM 6610LV scanning electron scope | electron microscopy |
References
- Packard, M. J. Ultrastructural Morphology of the Shell and Shell Membrane of Eggs of Common Snapping Turtles (Chelydra serpentina). Journal of Morphology. 165 (2), 187-204 (1980).
- Solomon, S. E., Watt, J. M. The structure of the eggshell of the leatherback turtle (Dermochelys coriacea). Animal Technology. 36 (1), 19-27 (1985).
- Sahoo, G., Mohapatra, B. K., Sahoo, R. K., Mohanty-Hejmadi, P. Ultrastructure and Characteristics of Eggshells of the Olive Ridley Turtle (Lepidochelys olivacea) from Gahirmatha, India. Acta Anatomica. 156, 261-267 (1996).
- Mitrus, S. The calcareous layer eggshell of the turtle Emys Orbicularis: Ultrastructure and composition. Italian Journal of Zoology. 70 (1), 13-16 (2003).
- Chang, Y., Chen, P. Y. Hierarchical structure and mechanical properties of snake (Naja atra) and turtle (Ocadia sinensis) eggshells. Acta Biomaterialia. 31, 33-49 (2016).
- Samson, R. A., Stalpers, J. A., Verkerke, W. A simplified technique to prepare fungal specimens for scanning electron microscopy. Cytobios. 24, 7-11 (1979).
- Kaminskyj, S. G. W., Dahms, T. E. S. High spatial resolution surface imaging and analysis of fungal cells using SEM and AFM. Micron. 39, 349-361 (2008).
- Wisse, E., et al. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World Journal of Gastroenterology. 16 (23), 2851-2866 (2010).
- Braet, F., De Zanger, R., Wisse, E. Drying cells for SEM, AFM and TEM by hexamethyldisilazane: a study on hepatic endothelial cells. Journal of Microscopy. 186 (1), 84-87 (1997).
- Echlin, P. Handbook of Sample Preparation for Scanning Electron Microscopy and X-Ray Microanalysis. , UK: Springer. (2009).
- Bell, P. B., Safiejko-Mroczka, B. Preparing whole mounts of biological specimens for imaging macromolecular structures by light and electron microscopy. International Journal of Imaging System Technology. 8 (3), 225-239 (1997).
- Bahr, G. F., Bloom, G., Friberg, U. Volume changes of tissues in physiological fluids during fixation in osmium tetroxide or formaldehyde and during subsequent treatment. Experimental Cell Research. 12 (2), 342-355 (1957).
- Baker, J. R. Principles of biological microtechnique; a study of fixation and dyeing. , Wiley. London Methuen; New York. (1958).
- Glauert, A. M. Practical methods in electron microscopy. Journal of Microscopy. 3, 5-65 (1974).
- Hayst, M. A. Biological Applications. Principles and techniques of electron microscopy, 4th ed. , Cambridge University Press. 13-105 (1970).
- Pathan, A. K., Bond, J., Gaskin, R. E. Sample preparation for SEM of plant surfaces. Materials Today. 12 (1), 32-43 (2010).
- Hayat, M. A. Electron microscopy: Biological applications. 4th ed. , Cambridge University Press. New York. (2000).
- Hayat, M. A. Fixation for electron microscopy. , Academic Press. New York. (1981).
- Karnovsky, M. J. A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolarity for use in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 27, 137-138 (1965).
- McDowell, E. M., Trump, B. F. Histologic fixatives suitable for diagnostic light and electron microscopy. Archives Pathology and Laboratory Medicine. 100, 405 (1976).
- Wisse, E., et al. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World Journal of Gastroenterology. 16 (23), 2851-2866 (2010).
- Fischer, E. R., Hnasen, B. T., Nair, V., Hoyt, F. H., Dorward, D. W. Scanning Electron Microscopy. Current Protocols in Microbiology. , Unit2B.2 (2012).
- Magalhaes, M., et al. Embryonic development of the Giant South American River Turtle, Podocnemis expansa (Testudines: Podocnemididae). Zoomorphology. 136 (4), 523-537 (2017).
- Hopwood, D. Fixatives and fixation: a review. The Histochemistry Journal. 1 (4), 323-360 (1969).
- Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde fixation. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 33 (8), 845-853 (1985).
- Bell, P. B., Rundquist, I., Svensson, I., Collins, V. P. Formaldehyde sensitivity of a GFAP epitope, removed by extraction of the cytoskeleton with high salt. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 35 (12), 1375-1380 (1987).
- Hayat, M. A. Glutaraldehyde: Role in electron microscopy. Micron and Microscopica Acta. 17 (2), 115-135 (1986).
- Nation, J. L. A new method using hexamethyldisilazane for preparation of soft insect tissues for scanning electron microscope. Stain Technology. 58 (6), 347-351 (1983).
- Bray, D. F., Bagu, J., Koegler, P. Comparison of hexamethyldisilazane (HMDS), Peldri II, and critical point drying methods for scanning electron microscopy of biological specimens. Microscopy Research Technique. 26 (6), 489-495 (1993).
- Barre, C., O'Neil, D., Bricelj, V. M. Preparation of large bivalve specimens for scanning electron microscopy using Hexamethyldisilazane (HMDS). Journal of Shellfish Research. 25 (2), 639-641 (2006).
- Lee, J. T. Y., Chow, K. L. SEM sample preparation for cells on 3D scaffolds by freeze-drying and HMDS. SCANNING. 33, 1-14 (2011).
- Araujo, J. C., et al. Comparison of hexamethyldisilazane and critical point drying treatments for SEM analysis of anaerobic biofilms and granular sludge. Journal of Electron Microscopy. 52, 429-433 (2003).
- Boyde, A., Bailey, E., Jones, S. J., Tamarin, A. Dimensional changes during specimen preparation for scanning electron microscopy. SEM/IITRI. 10, 507-518 (1977).
- Read, N. D., Porter, R., Beckett, A. A comparison of preparative techniques for the examination of the external morphology of fungal material with the scanning electron microscope. Canadian Journal of Botany. 61 (8), 2059-2078 (1983).
- Melo, I. S., Faull, J. L. Scanning electron microscopy of conidia of Thichoderma stromaticum, a biocontrol agent of witches broom disease of cocoa. Brazilian Journal of Microbiology. 35, 330-332 (2004).
- Pathan, A. K., Bond, J., Gaskin, R. E. Sample preparation for scanning electron microscope of plant surfaces- Horses for courses. Micron. 39, 1049-1061 (2008).
- Packard, G. C., Taigen, T. L., Packard, M. J., Boardman, T. J. Water relations of pliable-shelled eggs of common snapping turtle (Chelydra serpentine). Canadian Journal of Zoology. 58, 1404-1411 (1979).
- Packard, M. J., Packard, G. C., Boardman, T. J. Structure of eggshells and water relations of reptilian eggs. Herpetologica. 38, 136-155 (1982).
- Cordero, G. A., Janzen, F. J. An Enhanced Developmental Staging Table for the Pianted Turtle, Chrysemys picta (Testudines: Emydidae). Journal of Morphology. 275, 442-455 (2014).
- Yntema, C. L. Procurement and use of turtle embryos for experimental procedures. The Anatomical Record. 149, 577-586 (1964).
- Matsubara, Y., Kuroiwa, A., Suzuki, T. Efficient harvesting methods for early-stage snake and turtle embryos. Development Growth Differentiation. 58, 241-249 (2016).
- Moran, P., Coats, B. Biological Sample Preparation for SEM Imaging of Porcine Retina. Microscopy Today. , 10-12 (2012).
- Bray, D. F., Bagu, J., Koegler, P. Comparison of hexamethyldisilazane (HMDS), Peldri II, and critical point drying methods for scanning electron microscopy of biological specimens. Microscopy Research Technique. 26, 489-495 (1993).
- Botes, L., Price, B., Waldron, M., Pitcher, G. C. A simple and rapid Scanning Electron Microscope preparative technique for delicate "Gymnodinioid" Dinoflagellates. Microscopy Research Technique. 59, 128-130 (2002).
- Dekker, N. P., Lammel, C. J., Brooks, G. F. Scanning Electron Microscopy of piliated Neisseria gonorrhoeae processed with hexamethyldisilazane. Journal of Electron Microscopy. 19, 461-467 (1991).
- Fratesi, S., Lynch, F. L., Kirkland, B. L., Brown, L. R. Effects of SEM preparation techniques on the appearance of bacteria and biofilms in the Carter Sandstone. Journal of Sedimentary Research. 74, 858-867 (2004).
- Jung, S. W., Joo, H. M., Park, J. S., Lee, J. H. Development of a rapid and effective method for preparing delicate dinoflagellates for scanning electron microscopy. Journal of Applied Phycology. 22, 313-317 (2010).
- Bernd, S., Bentley, D. Use of HMDS (hexamethyldisilazane) to dry organic microstructures in etched bivalve mollusk and barnacle shells. Nautilus -Greenville then Sanibel. 116, 25-31 (2002).
- Bowen, W. R., Hemann, C. C., Johnson, A. A., Good, B. H. Mermithid Nematodes: SEM Observations Comparing Hexamethyldisilazane and Critical Point Drying Methods. Journal of the Arkansas Academy of Science. 44, Article 6 (1990).
- Jusman, J., Ng, S. C., Osman, N. A. A. Investigation of CPD and HMDS Sample Preparation Techniques for Cervical Cells in Devloping Computer-Aided Screening System Based on FE-SEM/EDX. The Scientific World Journal. 289817, 1-11 (2014).
- Hazrin-Chong, N. H., Manefield, M. An alternative SEM drying method using hexamethyldisilazane (HMDS) for microbial cell attachment studies on sub-bituminous coal. Journal of Microbiological Methods. 90, 96-99 (2012).
- Laforsch, C., Tollrian, R. A new preparation technique of daphnids for Scanning Electron Microscopy using hexamethyldisilazane. Arch Hydrobiology. 149 (4), 587-596 (2000).
