Summary
Her præsenterer vi detaljerede forarbejdnings protokoller for billeddannelse delikate vævsprøver ved hjælp af scanning elektronmikroskopi (SEM). Tre forskellige forarbejdningsmetoder, nemlig disilazan disilazana (HMDS) kemisk tørring, enkel lufttørring, og kritisk punkt tørring er beskrevet for at forberede stive æggeskaller, embryoner på tidlige udviklingsmæssige stadier, og svampekulturer henholdsvis.
Abstract
Selv om scanning elektronmikroskopi (SEM) er ved at blive udbredt til den ultra-strukturelle analyse af forskellige biologiske og ikke-biologiske prøver, metoder, der er involveret i behandling af forskellige biologiske prøver involverer unikke praksis. Alle konventionelle praksisser beskrevet i litteraturen til behandling af prøver stadig finde nyttige applikationer, men subtile ændringer i prøven forberedelse kan ændre billedkvalitet, samt, indføre artefakter. Derfor, ved hjælp af en unik prøveforberedelse teknik specifikt for den type væv analyseret er nødvendig for at opnå en god kvalitet billede med ultrastrukturel opløsning. Fokus i denne undersøgelse er at give den optimale prøveforberedelse protokoller for billeddannelse embryoner, stive æggeskaller, og svampe kulturer ved hjælp af SEM. Følgende optimeringer blev anbefalet for at give gode resultater for de tre forskellige delikate biologiske prøver undersøgt. Brug af mildere fikser som 4% PARAFORMALDEHYD eller 3% glutaraldehyd efterfulgt af dehydrering med ethanol-serien er obligatorisk. Svampemycelium på agar blokke opnået ved slide kulturer giver en bedre ultrastrukturel integritet i forhold til kulturer taget direkte fra agar plader. Kemisk tørring af embryoner med HMDS giver tørring uden at indføre overflade spændings artefakter sammenlignet med kritisk punkt tørring. HMDS forebygger revner forårsaget af krympning, da prøverne er mindre skrøbelige under tørring. Men for svampe kulturen giver kritisk punkt tørring acceptabel billedkvalitet sammenlignet med kemisk tørring. Æggeskaller kan imældes uden særlige forberedelsestrin, bortset fra grundig vask og lufttørring før montering. Præparationsmetoder blev standardiseret baseret på acceptabel billedkvalitet opnået ved hvert forsøg.
Introduction
Scanning elektronmikroskop (SEM) ultrastrukturel analyse og intracellulære Imaging supplement lys mikroskopi for tredimensionelle profilering af prokaryoter, planter, og dyr. Den høje rumlige opløsning af en SEM gør det til en af de mest alsidige og kraftfulde teknikker til rådighed til undersøgelse af mikrostrukturelle egenskaber af prøver på nanometer til mikrometer skala. Udtørrede prøver er løst til kompositoriske og topografiske strukturer med intense detaljer, som giver grundlaget for at udvikle gyldige konklusioner om funktionelle relationer1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9. ved tolkning af SEM-billeder af biologiske prøver er det en stor udfordring at skelne mellem indfødte strukturer og de artefakter, der oprettes under forarbejdningen. SEM drives normalt ved meget høje støvsugere for at undgå interferens fra gasmolekyler, der påvirker de primære, sekundære eller sensorer elektronstråler, der udsendes fra prøve10,11. Også, biologiske materialer er modtagelige for stråling skader på grund af deres dårlige eller ikke-ledende egenskaber. Det er vigtigt for de enheder indlæst i SEM at være helt tør og fri for organiske forurenende stoffer for at eliminere enhver mulig udgasning i en høj vakuum miljø10,11. Da biologiske prøver for det meste består af vand, er der behov for yderligere tilberednings teknikker for at sikre, at de indfødte strukturer bevares.
Den opnåede opløsning er baseret på optimering af tilberedningsmetoder, der er specifikke for modeltyper og anvendte instrumentelle parametre. Således, det er nødvendigt at undgå at bruge generelle forarbejdningstrin for alle vævstyper. Nogle biologiske prøver vil kræve mindre strenge behandling for at bevare deres struktur, mens mere tid og pleje kan være nødvendig for sarte typer af prøver for at undgå indførelse af tørring artefakter, såsom svind og kollaps. Prøveforberedelse er et kritisk skridt i SEM Imaging; resultaterne af morpreuometriske undersøgelser er bemærkelsesværdigt påvirket af prøvens forberedelsesprocedure12,13. Almindelige tilberednings trin for mange biologiske prøver er fiksering, udtørring og belægning med et metal som guld, platin eller Palladium for at omdanne deres overflader til at være ledende for SEM-analyse. Karakteren og kombinationen af de anvendte trin vil variere afhængigt af vævstype og de specifikke mål for undersøgelsen. Opladning ophobning, følsomhed over for vakuum og elektronstråle skader udgør problemer ved behandling af bløde sarte biologiske prøver, nødvendiggør yderligere behandling skridt til at bevare den oprindelige struktur af objektet. Ved hjælp af konventionelle metoder såsom osmium dinitrogentetraoxid fastsættelse, og dehydrering forårsage svind og sammenbrud af sarte væv14,15,16,17. Formålet med undersøgelsen er at etablere elegante metoder, der er afledt ved at kombinere ideer fra tidligere undersøgelser med modifikationer til at forberede og billede bløde sarte væv (f. eks, krybdyr embryoner, æggeskal af malede skildpadder, og svampekulturer).
Udvælgelse af en passende fastgørelsesmetode er det første vigtigste skridt for mikroskopisk analyse af biologiske prøver. Fastgørelse af vævet umiddelbart efter isolering fra en organisme er afgørende for at forhindre ændringer i deres morfologi på grund af nedbrydning. En effektiv fikserende bør opsige cellulære processer ved at gennemtrænge cellerne hurtigt og opretholde virkningen irreversibelt at stabilisere strukturen af prøven til at modstå både efterfølgende forarbejdningstrin og undersøgelse under SEM17 , 18. selv om flere kemiske og fysiske fikserings metoder er kendt, er kemisk fiksering mere almindeligt anvendt til biologiske prøver for at undgå cellulære ændringer som følge af autolyse, forrådnelse og tørre effekter. Der er talrige fiksativ kemiske formuleringer diskuteret i litteratur17,19,20,21,22,23, fikater, at arbejde ved denaturering og koagulerende biologiske makromolekyler, og dem, der fastsættes ved kovalent tværgående makromolekyler. Alkoholer anvendes som denatureringsmidler, der bevarer ultrastruktur meget dårligt og bruges mest til let mikroskopi og anbefales ikke til elektron mikroskopisk analyse. Tværbindende fikser som formaldehyd, glutaraldehyd og osmium tetroxid skaber intermolekylære og intramolekoleculære tværbindende mellem makromolekyler i vævene, hvilket giver fremragende bevaring af ultra-strukturer11 ,24,25,26. Biologiske prøver er følsomme over for temperatur. Temperaturen i begyndelsen af fiksering anbefales at være 4 °C for at reducere den laterale mobilitet af membran proteiner, at bremse udbredelsen af intercellulære molekyler, og at bremse satsen for fiksering11. Den tid, der kræves til fastgørelse af væv, afhænger i høj grad af prøvens størrelse og den hastighed, hvormed fikserings formen diffuserer og reagerer med komponenterne i prøven. En overnatning fiksering i 4% PARAFORMALDEHYD eller 3% glutaraldehyd i PBS ved 4 °c er den foretrukne metode til SEM analyse af enheder, der anvendes i dette studie for deres sekventielle penetrerende egenskaber, som tillader mindre delikate prøver, der skal behandles17 , 18 , 19 , 20 , 27. et trin efter fiksering med osmium dinitrogentetraoxid elimineres ikke kun på grund af dets toksiske karakter, men det konstateredes også, at der ikke var nogen ekstra fordel ved at forbedre billedkvaliteten for de prøver, der blev analyseret i dette studie.
Biologiske prøver indeholder væsker, der forstyrrer SEM-operationen; Derfor skal prøverne tørres, før de indsættes i SEM prøvekammeret. Når dehydrering er sikret, skal opløsningsmidlet fjernes fra vævet uden at skabe artefakter i prøverne på grund af overfladespændingen/tørring. Tre forskellige tørre metoder blev almindeligt anvendt under behandling af væv til SEM Imaging: lufttørring, kritisk punkt tørring, og frysetørring prøver28,29,30,31. Få undersøgelser rapporterer alle tre tørring metoder producerer identiske resultater med animalske vævsprøver28,29,30,31. En generel praksis, der anvendes til mindre prøver, er kemisk dehydrering ved stigende koncentrationsserier af alkohol og hexamethyldisilazan (HMDS), men større prøver tørres ved hjælp af et kritisk punkt tørring (CPD) instrument32. Under tørringsprocessen, betydelige kræfter dannet i små hulrum, der passerer gennem prøven ved en væske/gas grænseflade; Dette kan endda føre til et fuldstændigt sammenbrud af de hule strukturer33. Enhver deformation, der opstår på grund af behandlingen, kan derefter forveksles som en naturlig strukturel egenskab ved præparatet. Således bør det generaliserede fænomen til forarbejdning elimineres, og en unik tørring proces bør være standardiseret for hver type væv, især når sarte væv prøver analyseres.
I flere forsøg udført ved hjælp af forskellige kombinationer af alle de ovennævnte processer, vi standardiseret de metoder, der kan bruges til SEM analyse af tre sarte væv: krybdyr embryoner, æggeskaller af malede skildpadder, og svampe kulturer. Udviklingsmæssige biologer og morfologer beskriver normal og unormal morfogenese under embryo udvikling i repræsentative hvirveldyr. Undersøgelser af gensignalerings veje afhænger af den morfologiske beskrivelse af nye strukturer. For at undgå pludselige ændringer i hvirveldyr embryo struktur under SEM analyse, anbefaler vi kemisk tørring efter dehydrering. Kemisk tørring ved hjælp af HMDS er den relativt nyeste tørring metode og fordelene omfatter relativ hurtighed, brugervenlighed, tabte omkostninger, og den begrænsede ekspertise og udstyr behov9. CPD er en almindeligt anvendt tørring teknik ved hjælp af passaging CO2 på tværs af prøverne ved en bestemt temperatur og tryk. Vi identificerede, at HMDS er egnet til tørring af blødt sarte væv og gør det muligt at behandle større prøver sammenlignet med kritisk punkt tørring, hvilket forårsagede omfattende deformation af embryonale væv. Flere metoder er blevet brugt til at forberede prøver til SEM Imaging til at studere morfologiske egenskaber af svampe34. Svampe prøver er almindeligvis fastgjort i osmium dinitrogentetraoxid efterfulgt af ethanol dehydrering og kritisk punkt tørring, som kan give tilfredsstillende resultater, selv om de toksiske virkninger af osmium dinitrogentetraoxid6,7,35 og miste svampemidler, mens skiftende løsninger under behandlingen er udtalt ulemper. Prøve forberedelses teknikken ved hjælp af lufttørring uden fiksering er også blevet praktiseret36 men resulterer i skrumpet og kollapsede strukturer, og observation af sådanne prøver kan let misfortolkes, mens karakterisere arterne. Svampe hypha mister sin integritet i kontakt med væsker og en jævn tørring kan ikke opnås for at genoprette strukturen. På grund af denne effekt, frysetørring er almindeligt anvendt til tørring af bløde væv som svampemycelium. Frysetørring fungerer godt for rene materialer, men tilstedeværelsen af eventuelle salte eller sekretion vil skjule overflade detaljer, der vil blive identificeret kun på SEM visning fase. Vi koblede slide kultur metoden med glutaraldehyd fastgørelse og kritisk punkt tørring for at give strukturelle detaljer af intakt svampe hyfer og sporer. Selv om CPD tørring forårsagede svind i embryoner, det resulterede i velbevarede myceliale strukturer, når kombineret med glutaraldehyd fiksering. Æggeskallen er af største betydning for embryo af ovipar dyr ved ikke kun at fungere som en beskyttende beklædning, men også at give mekanisk stabilitet, permeabilitet til gas og vand, og en calcium reserve til det udviklende embryon. Ferskvands skildpadde æggeskaller klassificeres som "stive" baseret på deres struktur, og på grund af deres tilgængelighed har fået betydelig opmærksomhed fra biologer1,2,3,4 , 5 , 6 , 7 , 37 , 38.
Vi detaljer enkle metoder til nem undersøgelse af æggeskal og Shell membraner af malet skildpadde, der kan anvendes til enhver stiv æggeskal arter. Forberedelses metoderne blev evalueret ud fra den resulterende billedkvalitet og reducerede potentielle artefakter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: malet skildpadde (Chrysemys picta) æg, der anvendes i denne undersøgelse blev indsamlet i løbet af nesting sæson af maj til juni 2015-16 fra Rice Creek Field Station, Oswego New York med tilladelse fra New York State Department of Environmental Bevaring (DEC).
1. kemisk tørring metode til at behandle embryoner til SEM
- Saml skildpadde æg fra marken steder i nesting sæsonen. Forbered inkubations kamrene på forhånd, lavet af plastikkasser med låg (L x b x H) 6,7 cm x 25,4 cm x 10,2 cm fyldt med strøelse medium fremstillet med en fugtig blanding af vermiculit og tørv mos (1:1 ratio). Lav 4-6 huller på ca 0,25 cm langs siderne af kasserne og på låget for at tillade luftning.
- Fjern forsigtigt jorden fra reden for at afdække æggene. Tør overfladen af skildpadde æg med fortyndet jod tinktur (1:25000) for at kontrollere mikrobiel kontaminering under inkubationen. Placer kløerne adskilt fra hinanden, kan koblings størrelsen af malet skildpadde variere fra 5-9 æg og placere et maksimum på 8-9 æg pr kasse.
Bemærk: omhyggeligt håndtere æggene under indsamling, aftørring, mærkning og placering inde i kasserne. Placering og tilpasning af æg skal være den samme, som de blev lagt, enhver bevægelse vil hæmme embryo udvikling. - Manuelt begrave æggene halvt i strøelse, dække og placere boksen inde i inkubator sat ved 30 °C. Æggene inkubates i 10-17 dage for at få de embryonale stadier 12, 13 og 18, der anvendes i dette studie. Tilsæt destilleret vand til delvis våd strøelse medium hver anden dag for at undgå dehydrering og for at opretholde fugtniveau for normal udvikling af embryonerne.
Bemærk: inkubation og midlertidige embryoner er ifølge en komplet udviklings tabel offentliggjort tidligere39. - Fastgør embryonerne ved at lave det første snit på den ene side af dorsalen og æggeblomme membranen sammen, lodret til den lange akse ved hjælp af spidset saks. Indsæt saksen forsigtigt i æggeblommen for at undgå at skære den embryonale skive. Skær nu den laterale side af ægget langs den lange akse og skær derefter den anden side af ægget langs den korte akse.
- Skræl Åbn det exciserede stykke med embryonet side op med tang. Skær den anden side af æggeskallen og Placer det fjernede stykke i fosfat bufferet saltvand (PBS ved en pH-værdi på 7,4).
Bemærk: skildpadden æg er fyldt med meget viskøs æggeblomme og Rygsiden af embryonet klæder til æggeskal membranen. Ægge membranen i nærheden af embryonet ændres med inkubationen fra gennemsigtigt hvidt til en uigennemsigtig, chalky hvid. Dette gør det muligt at finde embryonet i midten af den lange akse og ses som en mørk forkalknet plet fra udvendig40,41. - Brug et stereomicroskop til at isolere embryonerne sammen med blomme membranen ved at skrælle dem fra æggeskallen ved hjælp af pincet. Fjern ekstraembryonale membraner ved hjælp af pincet og mikro-saks. Embryonet overføres ved hjælp af en embryo ske til frisk PBS i en Petri skål for at vaske blod eller æggeblomme.
- Brug klare 12-brønd plader til at fastgøre embryonerne natten over i 4% PARAFORMALDEHYD i PBS ved 4 °C eller i 2-3% glutaraldehyd i PBS. Placer en til tre embryoner i hver brønd afhængigt af størrelsen af embryonerne. Sørg for fuldstændig infiltration (prøverne vises hvide) for ældre embryoner ved at forlænge fikserings tiden i 2-3 dage. Skyl embryoer 3x med frisk PBS i 5 min hver skylning.
Bemærk: undgå at beskadige overfladen af embryonet ved hjælp af polystyren skær med polyester mesh bunde til 12-brønd plader til at overføre prøver fra et opløsningsmiddel til et andet. - Dehydrat prøverne ved hjælp af en række ethanol-koncentration i destilleret vand: 30%, 50%, 70%, 80%, 95%, og 100% og behandle prøver for 1 time i hver dehydrering opløsning. Gentag trin med 100% ethanol to gange for at sikre fuldstændig dehydrering. Hvis det ikke anvendes med det samme, opbevares prøverne i 70% ethanol ved-20 °C i en længere periode.
- Tørre embryoner ved hjælp af en serie af hexamethyldisilazana (HMDS) til 100% ethanol koncentration: 1:2, 2:1 og 100%. Prøverne udtages i hver opløsning i 20 minutter, og Petri skålen holdes delvist dækket under processen.
Bemærk: Udfør alle trin, der involverer HMDS i Røghætte med nødvendigt personligt beskyttelsesudstyr, da HMDS er meget giftigt. - Lad embryonerne i den endelige 100% HMDS-opløsning helt eller delvist dækkes i en stinkhætte med overnatning ved fordampning af HMDS, så prøverne er klar til montage og sputter belægning. Dæk skålen til at eliminere støv, som sætter sig over prøverne.
Bemærk: vævet vil fremstå hvidt efter fuldstændig tørring og delvist tørrede prøver vil se gult i farve, forlade disse væv i røg hætte i længere tid. - Vælg størrelsen af aluminium stubbe og Carbon klæbebånd pr størrelse af prøven analyseret. Monter de tørrede prøver forsigtigt på en almindelig aluminiums stift (12,7 mm x 8 mm) ved hjælp af en dobbelt pind Carbon ledende tape (12 mm).
- Introducere monterede prøver i kammeret af sputter Coater til pels prøven med en meget tynd film af guld for at eliminere Charge effekt. Guldplade prøverne til 60-120 s ved en 35 mA sputter.
- Monter stubbe på de tilsvarende pore plader ved at fastgøre setskruerne forsvarligt. Prøveholderen overføres til eller fra prøvekammeret i SEM ved hjælp af prøve udvekslings værktøjet. Billede prøverne i høj vakuum tilstand med en accelererende stråle spænding på 10 kV og emissions strøm 10 μA.
Bemærk: bær altid handsker, mens du håndterer prøver, prøveholdere, monterings Stubs og Overførselsværktøjer for at undgå fedt kontaminering fra hænderne til SEM-systemet. - Test alternative teknikker, der er anført nedenfor for at sammenligne opløsningen af enheder opnået fra ovenstående procedure.
- Inkluder en efter fiksering med 1% osmium dinitrogentetraoxid i 1 time ved stuetemperatur efter trin 1,7.
- Helt eller delvist fjerne HMDS i trin 1,10 for hurtig hurtig fordampning af HMDS.
- Behandl embryoner efter trin 1,8 ved hjælp af kritisk punkt tørring (CPD) ved at følge trin 3.3-3.4.
2. klargøring af æggeskallen til SEM ved hjælp af en luft-tørring metode
- Indsaml og Inkuber de malede skildpadde (Chrysemys picta) æg for at fastsætte embryonerne som angivet i trin 1.1-1.7.
- Gem æggeskaller i destilleret vand efter embryo fiksation i trin 2,1. Rengør æggeskaller grundigt ved at suge i destilleret vand i mindst 1 time for at eliminere æggeblomme og albumin kontaminering.
- Lufttørre æggeskaller efter vask på sarte antistatiske klude i røgudemhætten natten over. Opbevar tørrede æggeskaller i rene prøveflasker mærket med nummer og trin.
- Monter, sputter coat og billede prøverne ved at følge trinene specificeret i trin 1.11-1.13.
3. kritisk punkt tørring metode til at forberede svampe kulturer for SEM
- Oprette slide kulturer
- Forbered kartoffel dextrose agar (PDA) medier til svampekulturer: Tilsæt 39 g PDA effekt i 1 L destilleret vand i en Erlenmeyer kolbe. Bland godt ved at hvirvler kolben og autoklave mediet ved 121 °C i 30 min. Lad medie opløsningen køle af, og tilsæt derefter antibiotikummet chloramphenicol (25 μg/mL) ved hjælp af en steril mikropipette.
Bemærk: efter sterilisering skal agar opløsningen være varm, og den vil ikke størkne snart. Cool det nok, så det ikke vil inaktivere antibiotika. - Bland det ved at hvirvlende og hælde plader (ca. 10-12 mL medier for hver 10 cm Petri skål), forsigtigt stak op og lad størkne.
- Brug en steril skalpel klinge til at skære små blokke af agar omkring 1/2 til 3/4 af en tomme. Fjern og Placer en agar blok på et rent glas mikroskop slide.
- Placer diaset i en ren Petri skål for at forhindre kontaminering og bevare fugt under inkubationen.
- Løft sliden af bunden af Petri skålen ved hjælp af et sterilt tandstikker for at skabe overfladespænding mellem pladen og sliden for at fjerne glas diaset uden at forstyrre den sarte vækst efter inkubation.
- Brug en steril løkke eller en nål til at overføre nogle af svampene fra prøve inokulum til hver af de fire sider af agar blokken på sliden.
- Anbring en ren dækseddel på overfladen af agar-blokken efter inokulering. Tilsæt et par dråber sterilt destilleret vand til Petri skålen rundt om sliden for at sikre fugt til de voksende svampe.
- Pladen forseges delvist ved hjælp af paraffin folie, og pladen inkubates ved 30 °C i et passende tidsrum (for Fusariumarter inkuber i 36 til 48 h).
- Fjern sliden fra Petri skålen og Adskil den tætsiddende dækseddel fra agar-blokken ved hjælp af sterile pincet. Agar-blokkene fastsættes til 3% glutaraldehyd i PBS natten over ved 4 °C.
- Forbered kartoffel dextrose agar (PDA) medier til svampekulturer: Tilsæt 39 g PDA effekt i 1 L destilleret vand i en Erlenmeyer kolbe. Bland godt ved at hvirvler kolben og autoklave mediet ved 121 °C i 30 min. Lad medie opløsningen køle af, og tilsæt derefter antibiotikummet chloramphenicol (25 μg/mL) ved hjælp af en steril mikropipette.
- Dehydrat prøverne ved at passere gennem en ethanolserie: 10%, 25%, 50%, 75% og 90% med 15 min. pr. ændring. Behandl prøverne til endelig dehydrering med to ændringer i 100% ethanol, som varer 30 minutter hver for at sikre fuldstændig mætning.
- Kritisk punkt tørring: Placer dehydrerede prøver i kammeret i CPD-apparatet. Forsegl og afkøle kammeret ved at åbne ventilerne for at tillade væske CO2 i og udluftning af ethanol, indtil væsken Co2 fylder fuldstændigt kammeret.
- Forsegl og Opvarm kammeret langsomt for at opnå et kritisk punkt, når kammer trykket overstiger 1000 PSI, og temperaturen overstiger 31 °C, er væske-og gasfasen i CO2 i ligevægt. Langsomt dræne CO2 fra kammeret og prøven som gas for at undgå virkninger af overfladespænding.
- Udfør montering, guldbelægning og billeddannelse af prøverne ved at følge trinene specificeret i trin 1.11-1.13.
- Udfør komparativ analyse ved kemisk tørring af prøverne fra trin 3,2 ved hjælp af HMDS ved at følge trin 1.9-1.13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 Vis scanning elektron mikrografisk analyse af malet skildpadde (Chrysemys picta) embryoner. Malede skildpadde æg indsamlet og inkuberet på en strøelse medium, monteret på aluminium stubbe efter kemisk tørring blev brugt til SEM Imaging (figur 1a-E). En lateral visning af et Stage 12-embryon viser de kraniofaciale strukturer; maxillær fremtrædende rækker ud over mandibulær og begrænser en velafmærket nasal pit medially; fem pharyngeale buer blev også observeret (figur 1F). Nydannede somitter i det bageste hale område af embryonet er let tællelige sammenlignet med den segmenterede krop somites. Forelimb knopper vises længere sammenlignet med baglemmer knopper og punkter mere caudally end ventrally. En veldefineret udvækst af en rygrygnings højderyg ses langs hele den tværgående flanke region af stadiet 15 embryo (figur 1G. På Stage 18, malede skildpadder besidder en kort, svagt projicerer snude. Den nedre næb hviler i den øvre kæbe og er lidt opvendt med en klemme krog, der passer ind i den centrale hak af den øvre næb (figur 1H). Den øvre kæbe af de malede skildpadder viser en hakket udseende danner en mediale U-V formet distale spids med en lille nippet til på hver side, en lille ægge tand begynder at danne på spidsen af den øvre kæbe. Lemmer knopper, der dukkede længere under tidligere stadier danner en padle-lignende struktur i etaper 13-14 med digital plade vagt angivet. Lemmer mesenchyme afgrænset af den apikale ectodermal højderyg ses langs de forreste-posterior margener (figur 1I-J).
Figur 2 viser ultra-strukturel analyse af Chrysemys picta ægge og Shell membran ved hjælp af SEM Imaging. Malede skildpadde æggeskaller blev fremstillet som beskrevet ovenfor og blev udsat for lufttørring efter vask med dobbeltdestilleret vand (figur 2A, B). Æggeskaller monteret på aluminium stubbe med dobbeltsidet Carbon tape (figur 2C) blev afbildet ved hjælp af SEM. En lateral visning af skallen viste ydre kalkholdige æggeskaller lag fast knyttet til den indre filamentøse Shell membran (figur 2D). Den udvendige overflade af æggeskallen består af velfrem trædende mineraliserede Shell enheder, lavet af kugleformede/sfæriske knuder arrangeret i grupper og mellem tilstødende Shell enheder en koncentration af små afrundede depressioner eller porer i forskellige størrelser blev observeret (figur 2E). Knuder fra hver gruppe af Shell-enheder mødes ved et tilslutnings vejkryds, midterpunktet (figur 2F). Den ydre overflade blev manuelt skrællet med tang til at observere overfladen af Shell membranen. Der blev set rækker af centrale plaques, som giver fastgørelsespunktet mellem Shell enhederne og underliggende fiber membran med flere lag (figur 2G).
Figur 3 viser den morfologiske Karakteristik af skurv svampe isolat fra dias kulturer observeret ved hjælp af SEM Imaging. Arrangement af slide kultur setup etableret (figur 3A) viser svampevækst på agar blokken inden for to dage af inokulation. Kolonier vokser hurtigt med hvidt til cremefarvet luftmycelium (figur 3B). SEM Imaging efter kritisk punkt tørring og sputter belægning af agar skiver afslørede svampe hyphae, buet conidia, og ris som sporer. Konidiophorer blev set på sidelinjen fra septate Aerial hyfer (figur 3C). Makroconidia fremstillet på kortere, forgrenede konidiophorer er moderat buede, med korte, stump apikale og uden forskel pediellate basal celler meste septate (figur 3D).
Figur 4 viser de komparative resultater for forarbejdning af lignende prøver ved hjælp af alternative teknikker. Nedsænke hoveder i stadie 15 embryoner i HMDS og tørring ved gradvis fordampning viser velbevarede craniofaciale strukturer, næsten ingen svind eller forvrængning ses med forlængede tider med langsom fordampning fra HMDS (figur 4A). Embryoner efter fast med osmium dinitrogentetraoxid viste ingen forskel i billedkvaliteten, bortset fra let svind af væv sammenlignet med langsom behandling af HMDS (figur 4B). Tørring af embryoner ved at fjerne HMDS helt eller delvis tillader hurtig fordampning resulterer i strukturel forvrængning og svind (figur 4C), mens langsom fordampning løst fremragende overfladestrukturer af et tilsvarende iscenesat embryo ( Figur 4 A). tørre artefakter blev set i embryonerne behandlet med CPD teknik forårsager omfattende svind og ødelæggelse af væv (figur 4D, E). Agar skiver fra slide kulturer viser ufuldstændig tørring af svampe isolat med HMDS behandling sammenlignet med CPD (figur F). Komplet tørring opnås med CPD behandling af agar skiver med en godt tørret, hvid prøve, der viser intakt høj opløsning strukturelle egenskaber af svampe hyfer og sporer (figur 4g-g '). Agar blokke med svampe kulturer synes skrumpet og gul i farve gør dem ikke egnet til SEM Imaging (figur 4h-h ').
Figur 1 : Scanning af elektron mikrografer Chrysemys picta embryoner fremstillet ved kemisk tørring. A) Chrysemys picta, der indlejrede i avlssæsonen på Rice Creek Field Station, Oswego, ny. B) velkonstrueret reden udefra. C) overflade jord fjernes med omhu for at eksponeres for de æg, der er lagt. D) æg, som anbringes i inkubations kammeret med strøelse. E) montering af embryoner på aluminiums stubbe efter kemisk tørring, E4, der viser det sputter-belagte embryon. (F) lateral visning af Stage 12 embryo, der viser ansigts strukturer, lemmer knopper og somiter. (G) veldefineret rygnings højderyg og padle formede lemmer knopper ses på stadie 15. H) craniofaciale strukturer af fase 18 embryo, der viser øvre og nedre kæbe, Bemærk en lille ægge tand dannet på spidsen af den øvre næb. (I) dorsale syn på højre forbimb på stadie 13-14 og et nærbillede af Aer (J) ved grænsen til dorsal-ventral. Skala stænger: F-H, 500 μm; I, 100 μm og J, 10 μm. nøgler: MB, midbrain; NP, nasal pit; MXP, maxillær fremtrædende; PA, faryngealt buer; h, hjerte; fl, forbimb; s, somite; hl, Bagben; t, halespids; CR, carapacial Ridge; et, ægge tand; oC, mundhulen; e, øje; UJ, øvre kæbe; LJ , nedre kæbe; m, mesenchyme, Aer, apikale ectodermal højderyg. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Ultrastrukturelle analyser af den luft tørrede æggeskal og Shell membranen af malede skildpadde æg. A) efter fikse ringen af embryonerne blev æggeskaller vasket grundigt i destilleret vand for at fjerne æggeblomme og albumin. (B) rene æggeskaller var lufttørret mindst natten over. (C) montering af en æggeskal på aluminium Stubs. D) radial visning af Shell-fragment, der viser det udvendige kalkholdige lag og den indre Shell membran. E) udvendigt kalkholdige lag viser kugleformede Shell enheder (su) arrangeret i grupper og porer set i mellem disse enheder (stjerner). F) forstørret visning af en knude, der viser midterpunktet (c) mellem Shell enhederne. (G) fjernelse af kalkholdige lag viser den ydre overflade af Shell membranen med depressioner venstre brudt fra Shell enheder. Skala stænger: E, 100 μm; F, 10 μm og G, 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Forberedelse af svampe kulturen til SEM-billeddannelse. (A) skematisk diagram til at vise opsætningen af slide kultur. B) hvide, farvede svampe kolonier, som ses på agar-blokken efter to dages inkubation ved 30 °c. (C) SEM-billede, der viser en del af Mycelium af Fusarium solani, sorte asterisker , der markerer makroconidia i sporodochia, en pil der peger på phialide, og pilespidser rettet mod microconidia, Scale bar, 10 μm. (D) forstørret billede af septate chlamydosporer, skala stang 5 μm. taster: AB, agar blok; CS, Cover slip; f, svampe kultur. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Komparativ analyse af alternative teknikker til behandling af lignende prøver. (A) frontal visning af malet skildpadde hoved tørret med langsom fordampning af HMDS (a), efter post-fastsættelse med osmium dinitrogentetraoxid (B), hurtig hurtigere fordampning af HMDS (C), og CPD (D-E). Herunder en post-fiksering trin ved hjælp af osmium dinitrogentetraoxid ikke viser nogen synlig forskel i billedkvaliteten sammenlignet med HMDS behandling uden efter fiksering. Deformationer ses efter hurtig fordampning af HMDS, mens gradvis tørring med langsom fordampning giver en bedre overfladestruktur. Forskellige grader af svind og kollapsede strukturer ses i de regioner af hjernen, øjne og facial propooer i embryoner behandlet med CPD.f) montering af glide kulturer, der er behandlet med HMDS (1), CPD (2) og sputter belagt CPD-behandlet prøveeksemplar (3) på aluminiums Stubs. (g-g ') Komplet tørring set som intakt hvid farvet agar skive med svampe podes opnået ved CPD bevare strukturer af svampemycelium og sporer af Fusarium solani. (h-h ') Utilstrækkelig tørring af glide kultur, krympning og beskadiget strukturel integritet set med HMDS konserveringsteknik. Skala stænger: A-E, 500 μm; G-H, 2 mm og g'-H ', 20 μm. taster: et, ægge tand; oC, mundhulen; e, øje; UJ, øvre kæbe; LJ, underkæben; sorte asterisker, makroconidia i sporodochia; pil, phialide; og arrowheads, microconidia. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I vores undersøgelse, forskellige fikseringsmidler, dehydrering og tørring metoder blev testet til at forberede tre forskellige delikate biologiske prøver til SEM Imaging: embryoner, æggeskaller, og svampekulturer. SEM er almindeligt anvendt til overflade analyse, så fikserings penetration er mindre om, men det skal forstås, at dårligt faste interne strukturer vil forårsage indadgående svind eller/og kollapsede overflade strukturer. Forlænget fikserings tidspunkt bør også overvejes for større vævsprøver, der erstatter den fiksering opløsning et par gange afhængigt af fikserings varigheden. På grund af aktiv interaktion mellem fikseringen og vævet, ville cellernes osmotiske egenskaber ændre sig betydeligt. Vævs væsker ville fortynde fikseringen og dermed en aldehyd effekt, der bidrager til den samlede osmolalitet, kan forsømmes for så vidt angår virkninger på celle volumen. Også, formaldehyd ville trænge hurtigere ind i væv og er mere effektiv som Cross-linker sammenlignet med glutaraldehyd. En buffered formaldehyd-glutaraldehyd blanding blev også rapporteret til fastsættelse af en bred vifte af væv, selv om for monolag og celle suspensioner fortyndede opløsninger var mere egnet til fastgørelse15,16. Men de fortyndede opløsninger er også hypertoniske, og derfor er aldehyderne ikke selv osmotisk aktive. For sarte prøver, der anvendes i denne undersøgelse, blev PBS ved pH 7,4 anvendt som et køretøj til fikseringsmidler, da fosfat buffere menes at være mere lig de cytoplasmiske miljøer af de fleste biologiske prøver. Desuden er osmolariteten identificeret til at befinde sig inden for det fysiologiske område, der kræves til prøven, mens PBS fungerer som et køretøj til fastgørelses agenten. Efter fiksering med osmium dinitrogentetraoxid anbefales ofte til forskellige biologiske prøver16,22,42 , men er blevet elimineret for alle de biologiske prøver, der anvendes i dette studie. Prøver uden osmium tetroxid gav skarpe billeder og prøver, der var fastgjort med osmium dinitrogentetraoxid, gav ikke-skelne resultater (figur 4A). Osmium-tetroxid forårsager forvrængning af blad vævsstrukturer og giver dårligere prøve konservering sammenlignet med glutaraldehyd-og formaldehyd-blandingen43, og det er blevet antydet, at en ophobning af osmium-molekyler kan hæmme infiltration af dehydrerings midler og overgangsmidler, der anvendes i CPD, og opløsningsmidler som HMDS, der anvendes til kemisk tørring. Virkningen er vævs specifik og udelukker ikke osmium tetroxid vil ikke have nogen effekt på billedkvaliteten for den type sarte prøver, der analyseres i dette studie. For andre typer væv kan brugen af osmium tetroxid elimineres med forlænget primær fiksering.
HMDS tørrede skildpadde embryoer viste velbevarede overflader og mindre forvrængning eller svind sammenlignet med CPD (figur 4). CPD minimerer chancen for forvrængning i celle morfologi og artefakter produktion på grund af nul eller minimal overfladespænding skabt under processen. CPD kan dog forårsage en potentiel fysisk risiko for sarte skrøbelige prøver. I overensstemmelse med vores observation, HMDS gav lignende eller højere kvalitet billeddannelse ved at minimere overfladespændingen forårsaget på grund af tørring baseret på tidligere undersøgelser offentliggjort44,45,46,47. Sammenlignet med CPD-behandling bevarede HMDS strukturelle detaljer i det organiske meshværk fortræffeligt i ætsede biventiler og Barnacle skaller48 og gav høj opløsning af de strukturelle træk ved den komplekse interne organisation af mermithid kartoffelcystenematoder49 og insekternes indre væv28. Tørre pladens artefakter blev set i store mængder på de enheder, der blev fremstillet af CPD-teknikken sammenlignet med HMDS-teknikken. Membranen blebs og pellet artefakter blev forøget i cervikale celler fremstillet ved hjælp af CPD teknik50. HMDS reagerer med vand for at fremstille hexamethyldisiloxan og ammoniak, som begge fordampe fra objektet. HMDS er almindeligt anvendt i gaskromatografi til at skabe af ethere af forbindelser såsom sukkerarter, aminosyrer, alkoholer, og mange andre forbindelser. Det vides ikke, om HMDS reagerer med nogle af disse forbindelser i væv. HMDS kan kryds forbinde proteiner og stivne vævet under tørringsprocessen28, selv om den nøjagtige årsag til, at HMDS giver bedre bevaring af embryoner, ikke kan forklares med undtagelse af vævs specificitet. Baseret på resultaterne af vores undersøgelse, CPD forårsagede omfattende svind i forhold til HMDS, og er meget mere egnet til behandling af embryonale væv, især for at analysere overfladestruktur for tidlige iscenesat embryoner. Den mekanisme, hvormed HMDS virker på vævs tørring, er ikke blevet belyst, selv om langsom tørring med gradvis fordampning i absolutte vandfri omgivelser kan være en grund til at opnå en fremragende overfladestruktur af dyrene.
Små stykker agar blokke med svampe kolonier fra tidligere etablerede slide kulturer blev brugt i dette studie for at undgå problemer med at opretholde den oprindelige fluffiness af både måtten. CPD tørring af agar stykker med svampe kolonier resulterede i en vaskeeffekt, mens ændringer i fiksere, buffere, og ethanol blev fundet for at være et bedre valg overvinde vanskelighederne med frysetørring. HMDS, der fungerer godt for embryoner i alle faser var ude af stand til at løse svampekulturer, mens lufttørring med HMDS udgjorde et betydeligt problem: curling op og miste den strukturelle stivhed. Mens CPD fungerer godt for svampekulturer, det induceret øjeblikkelig skade på embryoner især på tidlige stadier i udviklingen, forårsager svind på overfladen. Der blev ikke observeret nogen ladning eller tørring af artefakter, når HMDS og CPD blev anvendt til henholdsvis embryoner og svampekulturer. For stiv væv som æggeskaller af skildpadder, ingen særlig behandling er nødvendig bortset fra vask og lufttørring ved stuetemperatur før montering til billeddannelse.
Uanset tilberedningsmetoden bør der anvendes gradvise ethanolgraduerings trin for at reducere potentialet for tørring af artefakter. I første omgang blev både HMDS og CPD prøver fundet at have overflade artefakter med svind efter dehydrering og tørring protokoller til rådighed i litteraturen. Efter en række standardiseringer, vi fastslået, at artefakter var resultatet af alkohol dehydrering. Det er vigtigt at bruge en langsom dehydrering proces ved hjælp af mere gradvis ethanol stigninger under dehydrering. Desuden bør varigheden af hver iteration være længere for embryoner i forhold til svampekulturer. Yderligere, et yderligere trin på 100% ethanol sikret fuldstændig ensartet mætning. HMDS kan fjernes helt eller delvist for at tillade lufttørring af prøver, men udvidet udsættelse for HMDS og gradvis lufttørring ved fordampning blev fundet at være effektiv for embryoner for at undgå afbrydelse (figur 4A, C) forårsaget af store overflade spænding som observeret for mikrobiel celle fastgørelse51. Nedsænke prøver i HMDS og langsom tørring natten afslørede en fremragende overfladestruktur i Daphnia arter52 tyder på, at bløde sarte væv kunne drage fordel af den langsomme tørring proces. Acceptabel billedkvalitet for embryoner kan opnås ved langsom kemisk tørring ved gradvist at øge koncentrationen af HMDS til ethanol efter dehydrering.
Alle prøver blev monteret på aluminium stubbe ved hjælp af en dobbeltsidet Carbon tape til at give en ledende overflade, et tyndt lag af farveløs neglelak kunne også anvendes, hvis den samme prøve skal afbildet i en anden retning. Prøverne kan let fjernes fra stubbe, når neglelak bruges på stub overfladen og positionering prøverne i alternative fly er muligt i forhold til at bruge dobbeltsidet Carbon tape. Da prøverne er nonledende, er det nødvendigt at sputter et tyndt lag af metal på prøverne for at øge konduktiv heden. Et guld mål blev brugt i denne undersøgelse under sputter belægning, og guld-Palladium giver også lignende resultater undgå opladning effekter. Den korrekte stråle spænding er prøve afhængig, for let coatede prøver, billeddannelse med en Mark emission SEM ved 2-5 kV vil give en god definition af overfladestrukturer. For væv med passende belægning, 5 kV generelt giver bedre signal uden mere stråle penetration. For enheder, der mangler dybde og er belagt med guld alene, billeddannelse ved en højere spænding (10 kV) tillod bedre visualisering af overfladetopografi.
Forberedelse af sarte væv til SEM udgør særlige udfordringer, og en række prøveforberedelse teknikker kan bruges til at overvinde og minimere billeddannelse artefakter. Vi leverer omfattende metoder til behandling af tre forskellige delikate biologiske vævsprøver til SEM-billeddannelse: embryoner, stive æggeskaller og svampekulturer. I vores undersøgelse, subtile ændringer af populære metoder til rådighed fra tidligere offentliggjorte undersøgelser blev foretaget, og vi identificerede de mest hensigtsmæssige dehydrering og tørring metoder, der er specifikke for hver delikat vævstype. Disse protokoller kan tilpasses for at opnå acceptabel SEM-billedkvalitet fra lignende biologiske prøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Dr. Daniel Baldassarre, SUNY Oswego for nyttige diskussioner og kommentarer til manuskriptet. Denne undersøgelse blev støttet af Rice Creek Associate Grants, Oswego; Challenge giver SUNY Oswego og National Science Foundation (NSF) små tilskud til PGL og JG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Fischer Scientific | S25127A | for slide cultures |
| Aluminum pin stub | Tedpella | 16111 | 12.7 mm x 8 mm |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: Potato Dextrose Agar | BD 213400 | DF0013-17-6 | Media for isolation and cultivation of Fungi, yeast and molds |
| Chloramphenicol | Fischer BioReagents | BP904-100 | Antibiotic for media |
| Coarse Vermiculite | Greenhouse Megastore | SO-VER-12 | bedding medium |
| Clear 12- well plate | Corning | 07-201-589 | for fixing embryo |
| Coverslips | Fischer Scientific | S17525B | for slide culture |
| Critical Point Dryer | Quorum CPD | EMS850 | critical point drying |
| Culture dishes | Fischer Scientific | 08 747B | DISH PETRI 100X10MM 12/PK |
| Ethanol | Fischer Scientific | A406P 4 | dehydration agent |
| Forceps- Aquarius Tweezers | Tedpella | 5804 | style 4, length 108mm, widh x thickness 0.017 x 0.17 mm |
| Glutaraldehyde | Fischer Scientific | G151-1 | fixative |
| Gold target for sputter coater | DENTON VACUUM | TAR001-0158 | Gold Target, 2.375″ D X .002″ |
| Hexamethyldisilazana | Fischer Scientific | C19479-5000 | chemical drying agent |
| Kim wipes | Kimtech | S-8115 | cleaning |
| Microscope slides | Thermo Scientific | 67-762-16 | for slide culture |
| Microscopy Scissors | Tedpella | 1327 | Double pointed, stainless steel, 100 mm L (3-5/8"). |
| Micro-scissors | Tedpella | 1346 | Vannas-type, straight, 80mm L |
| Moria Perforated Embryo Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Length 14.5 cm, tip diameter 20 mm, spoon depth 5 mm |
| Netwell Inserts | Corning | 0330B09 | 15 mm Inserts with 74 µm Mesh Size Polyester Membrane act as handy carriers during specimen processing into different solvents |
| Paraformaldehyde | Fischer Scientific | T353 500 | fixative |
| Peat moss | Walmart- Miracle Gro | 551705263 | bedding medium |
| PELCO tabs double stick carbon conductive tape | Tedpella | 5000 | 12 mm OD |
| Sputter coater | DENTON VACUUM | DESK V | thin metal coating |
| SEM | JEOL USA | JEOL JSM 6610LV scanning electron scope | electron microscopy |
References
- Packard, M. J. Ultrastructural Morphology of the Shell and Shell Membrane of Eggs of Common Snapping Turtles (Chelydra serpentina). Journal of Morphology. 165 (2), 187-204 (1980).
- Solomon, S. E., Watt, J. M. The structure of the eggshell of the leatherback turtle (Dermochelys coriacea). Animal Technology. 36 (1), 19-27 (1985).
- Sahoo, G., Mohapatra, B. K., Sahoo, R. K., Mohanty-Hejmadi, P. Ultrastructure and Characteristics of Eggshells of the Olive Ridley Turtle (Lepidochelys olivacea) from Gahirmatha, India. Acta Anatomica. 156, 261-267 (1996).
- Mitrus, S. The calcareous layer eggshell of the turtle Emys Orbicularis: Ultrastructure and composition. Italian Journal of Zoology. 70 (1), 13-16 (2003).
- Chang, Y., Chen, P. Y. Hierarchical structure and mechanical properties of snake (Naja atra) and turtle (Ocadia sinensis) eggshells. Acta Biomaterialia. 31, 33-49 (2016).
- Samson, R. A., Stalpers, J. A., Verkerke, W. A simplified technique to prepare fungal specimens for scanning electron microscopy. Cytobios. 24, 7-11 (1979).
- Kaminskyj, S. G. W., Dahms, T. E. S. High spatial resolution surface imaging and analysis of fungal cells using SEM and AFM. Micron. 39, 349-361 (2008).
- Wisse, E., et al. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World Journal of Gastroenterology. 16 (23), 2851-2866 (2010).
- Braet, F., De Zanger, R., Wisse, E. Drying cells for SEM, AFM and TEM by hexamethyldisilazane: a study on hepatic endothelial cells. Journal of Microscopy. 186 (1), 84-87 (1997).
- Echlin, P. Handbook of Sample Preparation for Scanning Electron Microscopy and X-Ray Microanalysis. , UK: Springer. (2009).
- Bell, P. B., Safiejko-Mroczka, B. Preparing whole mounts of biological specimens for imaging macromolecular structures by light and electron microscopy. International Journal of Imaging System Technology. 8 (3), 225-239 (1997).
- Bahr, G. F., Bloom, G., Friberg, U. Volume changes of tissues in physiological fluids during fixation in osmium tetroxide or formaldehyde and during subsequent treatment. Experimental Cell Research. 12 (2), 342-355 (1957).
- Baker, J. R. Principles of biological microtechnique; a study of fixation and dyeing. , Wiley. London Methuen; New York. (1958).
- Glauert, A. M. Practical methods in electron microscopy. Journal of Microscopy. 3, 5-65 (1974).
- Hayst, M. A. Biological Applications. Principles and techniques of electron microscopy, 4th ed. , Cambridge University Press. 13-105 (1970).
- Pathan, A. K., Bond, J., Gaskin, R. E. Sample preparation for SEM of plant surfaces. Materials Today. 12 (1), 32-43 (2010).
- Hayat, M. A. Electron microscopy: Biological applications. 4th ed. , Cambridge University Press. New York. (2000).
- Hayat, M. A. Fixation for electron microscopy. , Academic Press. New York. (1981).
- Karnovsky, M. J. A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolarity for use in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 27, 137-138 (1965).
- McDowell, E. M., Trump, B. F. Histologic fixatives suitable for diagnostic light and electron microscopy. Archives Pathology and Laboratory Medicine. 100, 405 (1976).
- Wisse, E., et al. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World Journal of Gastroenterology. 16 (23), 2851-2866 (2010).
- Fischer, E. R., Hnasen, B. T., Nair, V., Hoyt, F. H., Dorward, D. W. Scanning Electron Microscopy. Current Protocols in Microbiology. , Unit2B.2 (2012).
- Magalhaes, M., et al. Embryonic development of the Giant South American River Turtle, Podocnemis expansa (Testudines: Podocnemididae). Zoomorphology. 136 (4), 523-537 (2017).
- Hopwood, D. Fixatives and fixation: a review. The Histochemistry Journal. 1 (4), 323-360 (1969).
- Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde fixation. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 33 (8), 845-853 (1985).
- Bell, P. B., Rundquist, I., Svensson, I., Collins, V. P. Formaldehyde sensitivity of a GFAP epitope, removed by extraction of the cytoskeleton with high salt. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 35 (12), 1375-1380 (1987).
- Hayat, M. A. Glutaraldehyde: Role in electron microscopy. Micron and Microscopica Acta. 17 (2), 115-135 (1986).
- Nation, J. L. A new method using hexamethyldisilazane for preparation of soft insect tissues for scanning electron microscope. Stain Technology. 58 (6), 347-351 (1983).
- Bray, D. F., Bagu, J., Koegler, P. Comparison of hexamethyldisilazane (HMDS), Peldri II, and critical point drying methods for scanning electron microscopy of biological specimens. Microscopy Research Technique. 26 (6), 489-495 (1993).
- Barre, C., O'Neil, D., Bricelj, V. M. Preparation of large bivalve specimens for scanning electron microscopy using Hexamethyldisilazane (HMDS). Journal of Shellfish Research. 25 (2), 639-641 (2006).
- Lee, J. T. Y., Chow, K. L. SEM sample preparation for cells on 3D scaffolds by freeze-drying and HMDS. SCANNING. 33, 1-14 (2011).
- Araujo, J. C., et al. Comparison of hexamethyldisilazane and critical point drying treatments for SEM analysis of anaerobic biofilms and granular sludge. Journal of Electron Microscopy. 52, 429-433 (2003).
- Boyde, A., Bailey, E., Jones, S. J., Tamarin, A. Dimensional changes during specimen preparation for scanning electron microscopy. SEM/IITRI. 10, 507-518 (1977).
- Read, N. D., Porter, R., Beckett, A. A comparison of preparative techniques for the examination of the external morphology of fungal material with the scanning electron microscope. Canadian Journal of Botany. 61 (8), 2059-2078 (1983).
- Melo, I. S., Faull, J. L. Scanning electron microscopy of conidia of Thichoderma stromaticum, a biocontrol agent of witches broom disease of cocoa. Brazilian Journal of Microbiology. 35, 330-332 (2004).
- Pathan, A. K., Bond, J., Gaskin, R. E. Sample preparation for scanning electron microscope of plant surfaces- Horses for courses. Micron. 39, 1049-1061 (2008).
- Packard, G. C., Taigen, T. L., Packard, M. J., Boardman, T. J. Water relations of pliable-shelled eggs of common snapping turtle (Chelydra serpentine). Canadian Journal of Zoology. 58, 1404-1411 (1979).
- Packard, M. J., Packard, G. C., Boardman, T. J. Structure of eggshells and water relations of reptilian eggs. Herpetologica. 38, 136-155 (1982).
- Cordero, G. A., Janzen, F. J. An Enhanced Developmental Staging Table for the Pianted Turtle, Chrysemys picta (Testudines: Emydidae). Journal of Morphology. 275, 442-455 (2014).
- Yntema, C. L. Procurement and use of turtle embryos for experimental procedures. The Anatomical Record. 149, 577-586 (1964).
- Matsubara, Y., Kuroiwa, A., Suzuki, T. Efficient harvesting methods for early-stage snake and turtle embryos. Development Growth Differentiation. 58, 241-249 (2016).
- Moran, P., Coats, B. Biological Sample Preparation for SEM Imaging of Porcine Retina. Microscopy Today. , 10-12 (2012).
- Bray, D. F., Bagu, J., Koegler, P. Comparison of hexamethyldisilazane (HMDS), Peldri II, and critical point drying methods for scanning electron microscopy of biological specimens. Microscopy Research Technique. 26, 489-495 (1993).
- Botes, L., Price, B., Waldron, M., Pitcher, G. C. A simple and rapid Scanning Electron Microscope preparative technique for delicate "Gymnodinioid" Dinoflagellates. Microscopy Research Technique. 59, 128-130 (2002).
- Dekker, N. P., Lammel, C. J., Brooks, G. F. Scanning Electron Microscopy of piliated Neisseria gonorrhoeae processed with hexamethyldisilazane. Journal of Electron Microscopy. 19, 461-467 (1991).
- Fratesi, S., Lynch, F. L., Kirkland, B. L., Brown, L. R. Effects of SEM preparation techniques on the appearance of bacteria and biofilms in the Carter Sandstone. Journal of Sedimentary Research. 74, 858-867 (2004).
- Jung, S. W., Joo, H. M., Park, J. S., Lee, J. H. Development of a rapid and effective method for preparing delicate dinoflagellates for scanning electron microscopy. Journal of Applied Phycology. 22, 313-317 (2010).
- Bernd, S., Bentley, D. Use of HMDS (hexamethyldisilazane) to dry organic microstructures in etched bivalve mollusk and barnacle shells. Nautilus -Greenville then Sanibel. 116, 25-31 (2002).
- Bowen, W. R., Hemann, C. C., Johnson, A. A., Good, B. H. Mermithid Nematodes: SEM Observations Comparing Hexamethyldisilazane and Critical Point Drying Methods. Journal of the Arkansas Academy of Science. 44, Article 6 (1990).
- Jusman, J., Ng, S. C., Osman, N. A. A. Investigation of CPD and HMDS Sample Preparation Techniques for Cervical Cells in Devloping Computer-Aided Screening System Based on FE-SEM/EDX. The Scientific World Journal. 289817, 1-11 (2014).
- Hazrin-Chong, N. H., Manefield, M. An alternative SEM drying method using hexamethyldisilazane (HMDS) for microbial cell attachment studies on sub-bituminous coal. Journal of Microbiological Methods. 90, 96-99 (2012).
- Laforsch, C., Tollrian, R. A new preparation technique of daphnids for Scanning Electron Microscopy using hexamethyldisilazane. Arch Hydrobiology. 149 (4), 587-596 (2000).
