Summary
Burada taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanılarak hassas doku örneklerinin görüntülenmesi için ayrıntılı işleme protokolleri salıyoruz. Üç farklı işleme yöntemi, yani, hexamethyl disilazana (HMDS) kimyasal kurutma, basit hava kurutma, ve kritik nokta kurutma sert yumurta kabukları hazırlamak için açıklanmıştır, erken gelişim aşamalarında embriyolar, ve mantar kültürleri sırasıyla.
Abstract
Taramalı elektron mikroskobu (SEM) çeşitli biyolojik ve biyolojik olmayan numunelerin ultra-yapısal analizinde yaygın olarak kullanılmakla birlikte, farklı biyolojik numunelerin işlenmesinde kullanılan yöntemler benzersiz uygulamalar içerir. Örneklerin işlenmesi için literatürde açıklanan tüm geleneksel uygulamalar hala yararlı uygulamalar bulmak, ancak örnek hazırlama ince değişiklikler görüntü kalitesini değiştirebilir, hem de, eserler tanıtmak. Bu nedenle, analiz edilen doku tipine özgü benzersiz bir numune hazırlama tekniği nin kullanılması, ultrayapısal çözünürlüğe sahip kaliteli bir görüntü elde etmek için gereklidir. Bu çalışmanın odak noktası SEM kullanarak embriyolar, sert yumurta kabukları ve mantar kültürleri görüntüleme için en uygun örnek hazırlama protokolleri sağlamaktır. İncelenen üç farklı hassas biyolojik örnek için iyi sonuçlar vermek için aşağıdaki optimizasyonlar önerildi. %4 paraformaldehit veya %3 glutaraldehit ve ardından etanol serisi ile dehidratasyon gibi daha hafif fiksatiflerin kullanılması zorunludur. Slayt kültürleri tarafından elde edilen agar bloklar üzerindeki mantar miseli, doğrudan agar plakalarından alınan kültürlere göre daha iyi bir ultrayapısal bütünlük sağlar. HMDS ile embriyoların kimyasal olarak kurutulması, kritik nokta kurutmasına kıyasla yüzey gerilimi objeleri kullanılmadan kurutulmasını sağlar. HMDS, numuneler kurutma sırasında daha az kırılgan olduğundan büzülmenin neden olduğu çatlamaları önler. Ancak, mantar kültürü için, kritik nokta kurutma kimyasal kurutma ile karşılaştırıldığında kabul edilebilir görüntü kalitesi sağlar. Yumurta kabukları montajdan önce iyice yıkama ve hava kurutma dışında özel bir hazırlık adımı olmadan görüntülenebilir. Hazırlama metodolojileri, her denemede elde edilen kabul edilebilir görüntü kalitesine göre standartlaştırılmıştır.
Introduction
Taramalı elektron mikroskobu (SEM) ultrastrüktürel analizi ve hücre içi görüntüleme prokaryotların, bitkilerin ve hayvanların üç boyutlu profilini çıkarmak için ışık mikroskobunu tamamlar. Bir SEM'nin yüksek uzamsal çözünürlüğü, onu nanometreden mikrometre ölçeğine kadar numunelerin mikroyapısal özelliklerinin incelenmesi için mevcut olan en çok yönlü ve güçlü tekniklerden biri haline getirir. Kurutulmuş numuneler, fonksiyonel ilişkiler hakkında geçerli sonuçlar geliştirmenin temelini oluşturan, yoğun ayrıntılarla kompozisyon ve topografik yapılara çözülür1,2,3 , 4.2.2 , 5.000 , 6.000 , 7.000 , 8.000 , 9- Biyolojik örneklerin SEM görüntüleri yorumlarken, doğal yapılar ve işleme sırasında oluşturulan eserler arasında ayrım yapmak büyük bir meydan okumadır. SEM genellikle örnek10,11yayılan birincil, ikincil veya geri dağınık elektron ışınları etkileyen gaz molekülleri herhangi bir girişim önlemek için çok yüksek vakumlar çalıştırılır. Ayrıca, biyolojik maddeler kötü veya iletken olmayan özellikleri nedeniyle radyasyon hasarına duyarlıdır. Sem'e yüklenen numunelerin tamamen kuru ve organik kirletici maddelerden arındırılmış olması ve yüksek vakum ortamında gazgiderme olasılığına karşı 10,11. Biyolojik numuneler çoğunlukla sudan oluştuğu için, yerli yapıların korunmasını sağlamak için ek preparatif teknikler gereklidir.
Elde edilen çözünürlük, numune tiplerine ve kullanılan enstrümental parametrelere özgü hazırlama yöntemlerinin optimize edilmesine dayanmaktadır. Bu nedenle, tüm doku tipleri için genelleştirilmiş işleme adımları kullanmaktan kaçınmak gerekir. Bazı biyolojik numuneler yapılarını korumak için daha az sıkı işleme gerektirirken, büzülme ve çökme gibi kurutma eserlerinin piyasaya sürülmesini önlemek için hassas numune türleri için daha fazla zaman ve bakım gerekebilir. Örnek hazırlama SEM görüntülemede kritik bir adımdır; morfometrik çalışmaların bulguları örnek hazırlama prosedürleri12,13tarafından belirgin bir şekilde etkilenmiştir. Birçok biyolojik numune için ortak hazırlık adımları, yüzeylerini SEM analizi için iletken olarak dönüştürmek için altın, platin veya paladyum gibi bir metalle fiksasyon, dehidratasyon ve kaplamadır. Kullanılan adımların niteliği ve kombinasyonu dokunun türüne ve çalışmanın özel hedeflerine bağlı olarak değişir. Şarj birikmesi, vakum ve elektron ışını hasarına duyarlılık yumuşak hassas biyolojik numuneleri işlerken sorun teşkil ederek nesnenin doğal yapısını korumak için ek işleme adımları gerektirir. Osmiyum tetroksit sabitleme gibi konvansiyonel yöntemler kullanarak, ve dehidratasyon büzülme ve hassas dokuların çöküşüneden14,15,16,17. Çalışmanın amacı, yumuşak hassas dokuları (örneğin, sürüngen embriyoları, boyalı kaplumbağaların yumurta kabuğu ve mantar kültürleri) hazırlamak ve imajlandırmak için yapılan değişikliklerle önceki çalışmalardan elde edilen fikirleri birleştirerek elde edilen zarif metodolojiler oluşturmaktır.
Uygun bir sabitleme yönteminin seçilmesi biyolojik örneklerin mikroskobik analizi için ilk önemli adımdır. Bir organizmadan izole sonra hemen dokuların düzeltilmesi çürümeye bağlı morfolojilerinde değişimi önlemek için gereklidir. Etkili bir fiksatif, hücreleri hızlı bir şekilde etkileyerek ve numunenin yapısını stabilize etmek için etkisini geri dönülmez bir şekilde koruyarak hücresel süreçleri sona erdirmeli ve hem sonraki işlem adımlarına hem de SEM17 altında incelemeye dayanmalıdır. , 18. Çeşitli kimyasal ve fiziksel fiksasyon yöntemleri bilinmesine rağmen, kimyasal fiksasyon daha yaygın biyolojik örnekler için otoliz, putrefaction ve kurutma etkileri nedeniyle herhangi bir hücresel değişiklikleri önlemek için kullanılır. Literatürde tartışılan çok sayıda fiksatif kimyasal formülasyonlar vardır17,19,20,21,22,23, denaturing tarafından çalışmak fiksatifler ve biyolojik makromoleküllerin pıhtılaşma, ve kovalent çapraz-bağlantı makromoleküller tarafından düzeltmek olanlar. Alkoller ultrayapıyı çok kötü koruyan ve çoğunlukla ışık mikroskobu için kullanılan ve elektron mikroskobik analizi için tavsiye edilmeyen denaturing fiksatifler olarak kullanılır. Formaldehit, glutaraldehit ve osmium tetroksit gibi çapraz bağlantı fiksatifler dokular içindeki makromoleküller arasında moleküler ve intramoleküler çapraz bağlantı oluşturarak ultra yapıların mükemmel korunmasını sağlar11 ,24,25,26. Biyolojik numuneler sıcaklığa duyarlıdır. Fiksasyon başında sıcaklık membran proteinlerinin yanal hareketliliğini azaltmak için 4 °C olması tavsiye edilir, hücreler arası moleküllerin difüzyonunu yavaşlatmak için, ve fiksasyon hızını yavaşlatmak için11. Dokuların düzeltilmesi için gereken süre büyük ölçüde numunenin boyutuna ve fiksatif in numunenin bileşenleriyle birlikte yayıldığı ve tepki verdiği hıza bağlıdır. 4 °C'de PBS'de %4 paraformaldehit veya %3 glutaraldehit de bir gecede fiksasyon, bu çalışmada kullanılan örneklerin sıralı penetratif özellikleri açısından SEM analizi nde tercih edilen yöntemdir ve daha küçük hassas numunelerin işlenmesine olanak sağlar17 , 18.000 , 19.09.20 , 20.000 , 27- Osmiyum tetroksit ile bir fiksasyon sonrası adım sadece toksik doğası nedeniyle ortadan kaldırılır ama aynı zamanda bu çalışmada analiz örnekleri için görüntü kalitesini artırmak için hiçbir ek avantaj uygulamak bulundu.
Biyolojik numuneler SEM işlemini engelleyen sıvılar içerir; bu nedenle, örneklerin SEM numune odasına yerleştirilmeden önce kurutulması gerekir. Dehidratasyon sağlandıktan sonra, yüzey gerilimi/kuruma nedeniyle numunelere objeler oluşturulmadan çözücü dokudan uzaklaştırılmalıdır. Üç farklı kurutma yöntemleri yaygın SEM görüntüleme için dokuların işlenmesi sırasında kullanılmıştır: hava kurutma, kritik nokta kurutma, ve dondurma kurutma örnekleri28,29,30,31. Birkaç çalışma hayvan dokusu örnekleri28,29,30,31ile aynı sonuçları üreten üç kurutma yöntemleri rapor. Daha küçük numuneler için kullanılan genel bir uygulama alkol ve hexamethyldisilazane konsantrasyon serisi artan kimyasal dehidratasyon vardır (HMDS), ancak daha büyük örnekler kritik bir nokta kurutma kullanılarak kurutulur (CPD) alet32. Kurutma işlemi sırasında, numuneden sıvı/gaz arabirimi ile geçen küçük boşluklarda oluşan önemli kuvvetler; bu bile içi boş yapıların tam bir çöküşüne yol açabilir33. Tedavi nedeniyle meydana gelen herhangi bir deformasyon daha sonra numunenin doğal yapısal bir özelliği olarak yanlış olabilir. Bu nedenle, işleme için genelleştirilmiş fenomen ortadan kaldırılmalı ve özellikle hassas doku örnekleri analiz edildiğinde her doku tipi için benzersiz bir kurutma işlemi standartlaştırılmalıdır.
Yukarıda bahsedilen tüm süreçlerin çeşitli kombinasyonu kullanılarak yapılan çeşitli çalışmalarda, üç hassas dokuların SEM analizi için kullanılabilecek yöntemleri standartlaştırdık: sürüngen embriyoları, boyalı kaplumbağaların yumurta kabukları ve mantar kültürleri. Gelişimbiyologları ve morfolojistler temsili omurgalı hayvanlarda embriyo gelişimi sırasında normal ve anormal morfogenezi tanımlarlar. Gen sinyal yolları üzerinde yapılan araştırmalar yeni yapıların morfolojik tanımına bağlıdır. SEM analizi sırasında omurgalı embriyo yapısında ani bir değişiklik olmasını önlemek için, dehidratasyon sonrası kimyasal kuruma öneririz. HMDS kullanarak kimyasal kurutma nispeten yeni kurutma yöntemi dir ve avantajları göreceli çabukluk, kullanım kolaylığı, kayıp maliyet ve sınırlı uzmanlık ve ekipman9gerekli içerir. CPD, numuneler arasında belirli bir sıcaklık ve basınçta paslama CO2 kullanılarak yaygın olarak kullanılan bir kurutma tekniğidir. HMDS'nin yumuşak hassas dokuların kurutulması için uygun olduğunu ve embriyonik dokularda kapsamlı deformasyona neden olan kritik nokta kurumasına göre daha büyük numunelerin işlenmesine olanak sağladığını belirledik. Mantarların morfolojik özelliklerini incelemek için SEM görüntüleme için örnekler hazırlamak için çeşitli yöntemler kullanılmıştır34. Mantar örnekleri genellikle osmiyum tetroksit etanol dehidratasyon ve kritik nokta kurutma takip sabittir, hangi tatmin edici sonuçlar sağlayabilir,osmiyum tetroksit toksik etkileri 6 rağmen,7,35 ve işleme sırasında çözelti değiştirirken mantar malzemelerini kaybetme dezavantajları belirgindir. Fiksasyon olmadan hava kurutma tekniği de uygulanmıştır36, ancak küçülmüş ve çökmüş yapılarla sonuçlanmıştır ve bu tür örneklerin gözlemi, türleri karakterize ederken kolayca yanlış yorumlanabilir. Mantar hypha sıvılar ile temas bütünlüğünü kaybeder ve hatta kurutma yapısı geri elde olmayabilir. Bu etki nedeniyle, donma-kurutma genellikle mantar misel gibi yumuşak dokuların kurutma için kullanılır. Dondurma kurutma temiz malzemeler için iyi çalışır ancak herhangi bir tuz veya salgı varlığı sadece SEM görüntüleme aşamasında tespit edilecek yüzey detay belirsiz olacaktır. Biz bozulmamış mantar hyphae ve sporların yapısal detayları verim için glutaraldehit sabitleme ve kritik nokta kurutma ile slayt kültür yöntemi birleştiğinde. CPD kurutma embriyolarda büzülme neden olmasına rağmen, glutaraldehit fiksasyonu ile birleştiğinde iyi korunmuş misel yapıları sonuçlandı. Yumurta kabuğu sadece koruyucu bir kaplama olarak hareket değil, aynı zamanda mekanik istikrar, gaz ve su geçirgenliği ve gelişmekte olan embriyo için bir kalsiyum rezervi sağlayarak oviparous hayvanların embriyo için birincil önemtaşımaktadır. Tatlı su kaplumbağası yumurta kabukları kendi yapısına göre "sert" olarak sınıflandırılır veonların durumu nedeniyle biyologlar 1,2,3,4 önemli ilgi almış , 5.000 , 6.000 , 7.000 , 37.000 , 38'e kadar.
Biz herhangi bir sert yumurta kabuğu türlerine uygulanabilir boyalı kaplumbağa yumurta kabuğu ve kabuk membranlar kolay incelenmesi için basit yöntemler detay. Hazırlık metodolojileri, ortaya çıkan görüntü kalitesi ve azaltılmış potansiyel eserlere göre değerlendirildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Bu çalışmada kullanılan boyalı kaplumbağa(Chrysemys picta)yumurtaları Mayıs-Haziran 2015-16 yılları arasında New York Çevre Bakanlığı'ndan alınan izinle Oswego New York'taki Rice Creek Saha İstasyonu'ndan toplanmıştır. Koruma (DEC).
1. SEM için embriyoları işlemek için kimyasal kurutma yöntemi
- Yuvalama mevsiminde tarla sitelerinden kaplumbağa yumurtaları toplayın. Kapaklı plastik kutulardan (L x W x H) 6,7 cm x 25,4 cm x 10,2 cm dolgulu yem ve turba yosunu (1:1 oran) nemli bir karışımla hazırlanan yatak makinesi ile doldurulmuş kuluçka odalarını önceden hazırlayın. Havalandırma yada kapak kenarları nda ve kapağında yaklaşık 0,25 cm'lik 4-6 delik açın.
- Yumurtaları ortaya çıkarmak için toprağı yuvadan yavaşça çıkarın. Kuluçka sırasında mikrobiyal kontaminasyonu kontrol etmek için kaplumbağa yumurtalarının yüzeyini seyreltilmiş iyot tentürü (1:25.000) ile silin. Debriyajları birbirinden ayrı yerleştirin, boyalı kaplumbağanın debriyaj boyutu 5-9 yumurtadan oluşabilir ve kutu başına en fazla 8-9 yumurta yer.
NOT: Kutuların içine toplama, silme, etiketleme ve yerleştirme sırasında yumurtaları dikkatlice kullanın. Yumurtaların konumu ve dizilişi, yatırılan ların aynısı olmalı, herhangi bir hareket embriyo gelişimini engelleyecektir. - Yumurtaların yarısını yatak takımlarına elle gömün, kapağını kapatın ve kutuyu 30 °C'deki kuvöz setine yerleştirin. Bu çalışmada kullanılan 12, 13 ve 18 embriyonik aşamaları elde etmek için 10-17 gün boyunca yumurta kuluçka. Dehidratasyonönlemek ve embriyoların normal gelişimi için nem düzeyini korumak için yatak ortamını her gün kısmen ıslatmak için distile su ekleyin.
NOT: Kuluçka ve evreleme embriyoları daha önce39yayınlanan tam bir gelişim tablosuna göre . - Dorsal yumurta kabuğu ve sarısı membranBirlikte bir tarafında ilk kesim yaparak embriyolar düzeltmek, sivri makas kullanarak uzun eksene dikey. Embriyonik disk kesme önlemek için dikkatle sarısı içine makas yerleştirin. Şimdi uzun eksen boyunca yumurtanın yan tarafını kesin ve sonra kısa eksen boyunca yumurtanın diğer tarafını kesin.
- Peel, embriyo tarafı ile eksponisi kullanarak eksponisi açın. Yumurta kabuğunun diğer yan tarafını kesin ve eksise parçayı fosfat tamponlu saline yerleştirin (pH'da 7.4 pH' da PBS).
NOT: Kaplumbağa yumurtası son derece viskoz yumurta sarısı ile doldurulur ve embriyonun sırt tarafı yumurta kabuğu zarına yapışır. Embriyonun yakınındaki yumurta kabuğu zarı yarı saydam beyazdan opak, tebeşirli beyaza inkübasyonla değişir. Bu bir uzun eksenin merkezinde embriyo bulmak ve dış40,41koyu kalsifiye nokta olarak görülebilir sağlar. - Embriyoları yumurta kabuğundan forceps kullanarak soyarak yumurta zarı ile birlikte izole etmek için bir stereomikroskop kullanın. Forceps ve mikro makas kullanarak ekstra embriyonik membranlar çıkarın. Herhangi bir kan veya sarısı yıkamak için bir Petri kabında taze PBS için bir embriyo kaşığı kullanarak embriyo transferi.
- Embriyoları bir gecede PBS'de %4 paraformaldehitte 4 °C'de veya PBS'de %2-3 glutaraldehitte düzeltmek için 12 kuyulu plakalar kullanın. Embriyoların büyüklüğüne bağlı olarak her kuyuya bir ila üç embriyo yerleştirin. 2-3 gün fiksasyon süresini uzatarak eski embriyolar için tam infiltrasyon (örnekler beyaz görünür) emin olun. Durulama embriyolar taze PBS ile 3x 5 dakika her durulama için.
NOT: Numuneleri bir çözücüden diğerine aktarmak için 12 kuyulu plakalar için polyester örgü dipli polistiren kesici uçlar kullanarak embriyonun yüzeyine zarar vermekten kaçının. - Distile suda bir dizi etanol konsantrasyonu kullanarak dehidrat numuneleri: %30, %50, %70, %80, %95 ve %100 ve her dehidratasyon çözeltisinde 1 saat numune leri tedavi edin. Tam dehidratasyon sağlamak için iki kez% 100 etanol ile adım tekrarlayın. Hemen kullanılmazsa, numuneleri -20 °C'de %70 etanolde daha uzun süre saklayın.
- Kuru embriyolar hexamethyldisilazana bir dizi kullanarak (HMDS) 100% etanol konsantrasyonu: 1:2, 2:1 ve 100%. Her çözeltideki numuneleri 20 dakika bekletin ve petri kabını işlem sırasında kısmen kapalı tutun.
NOT: HMDS son derece zehirli olduğu için gerekli kişisel koruma donanımı ile duman kaputunda HMDS ile ilgili tüm adımları gerçekleştirin. - Son % 100 HMDS çözeltisi tamamen veya kısmen hmds buharlaşmasına yardımcı bir gecede kapalı, montaj ve püskürtme kaplama için örnekleri hazır bırakarak embriyolar bırakın. Örneklerin üzerine yerleşen tozu ortadan kaldırmak için yemeğin üzerini kapatın.
NOT: Doku tamamen kuruduktan sonra beyaz görünür ve kısmen kurutulmuş numuneler sarı renkte görünür, bu dokuları daha uzun süre duman kaputunda bırakır. - Analiz edilen numunenin boyutuna göre alüminyum saplamaların ve karbon yapışkan bandının boyutunu seçin. Kurutulmuş numuneleri çift sopa karbon iletken bant (12 mm) kullanarak standart alüminyum pim saplama (12,7 mm x 8 mm) üzerine dikkatlice monte edin.
- Şarj efektini ortadan kaldırmak için numuneyi çok ince bir altın filmle kaplamak için püskürtücü kaplama odasına monte edilmiş numuneleri tanıtın. Altın plaka 35 mA fışkırtıyor 60-120 s için örnekleri.
- Saplamalar, set ekiplerini güvenli bir şekilde sabitleyerek ilgili gözenek plakalarına monte edin. Örnek değişim aracını kullanarak numune tutucuyu SEM'in numune odasına veya dışına aktarın. Numuneleri 10 kV hızlanan ışın gerilimi ve emisyon akımı 10°A ile yüksek vakum modunda görüntüleyin.
NOT: Ellerden SEM sistemine yağ kirlenmesini önlemek için numuneleri, numune tutucuları, montaj koçanları ve transfer araçlarını kullanırken her zaman eldiven takın. - Yukarıdaki prosedürden elde edilen örneklerin çözünürlüğünü karşılaştırmak için aşağıda listelenen alternatif teknikleri test edin.
- Adım 1.7 sonra oda sıcaklığında 1 saat için% 1 osmiyum tetroksit ile bir post-fiksasyon ekleyin.
- HMDS'nin hızlı hızlı buharlaşması için 1.10 adımda HMDS'yi kısmen veya tamamen çıkarın.
- Kritik nokta kurutulma (CPD) kullanarak adım 1.8'den sonra embriyoları 3.3-3.4 adımlarını izleyerek işleme.
2. Bir hava kurutma yöntemi kullanarak SEM için yumurta kabuğu hazırlanması
- 1.1-1.7 adımlarında belirtildiği gibi embriyoları onarmak için boyalı kaplumbağa(Chrysemys picta)yumurtalarını toplayın ve kuluçkaya yatırın.
- Adım 2.1 embriyo fiksasyon aşağıdaki distile suda yumurta kabukları kaydedin. Yumurta kabuklarını en az 1 saat boyunca distile suda ıslatarak yumurta kabuklarını iyice temizleyerek yumurta kabuğu ve albumin kontaminasyonunu ortadan kaldırın.
- Duman kaputunda hassas antistatik mendilleri bir gecede yıkadıktan sonra hava kuru yumurta kabukları. Kurutulmuş yumurta kabuklarını sayı ve sahne ile etiketlenmiş temiz numune şişelerinde saklayın.
- Montaj, püskürtme kat ve görüntü adımları 1.11-1.13 belirtilen adımları izleyerek örnekleri.
3. SEM için mantar kültürleri hazırlamak için kritik nokta kurutma yöntemi
- Slayt kültürleri oluşturma
- Mantar kültürleri için patates dekstroz agar (PDA) ortam hazırlayın: Bir Erlenmeyer şişesinde 1 L distile su 39 g PDA güç ekleyin. Şişeyi döndürerek iyice karıştırın ve 30 dk.
NOT: Sterilizasyondan sonra agar çözeltisi sıcak olmalı ve kısa sürede katılaşmaz. Antibiyotikleri inaktive etmeyecek kadar soğutun. - Girdap ile karıştırın ve her 10 cm Petri çanak için ortam (yaklaşık 10-12 mL ortam) dökün, dikkatlice yığını ve katılaşmaya izin.
- Bir inç yaklaşık 1/2-3/4 agar küçük blokları kesmek için steril bir neşter bıçak kullanın. Temiz bir cam mikroskop slayt üzerine bir agar bloğu çıkarın ve yerleştirin.
- Kontaminasyonu önlemek ve kuluçka sırasında nemi korumak için kaydırağı temiz bir Petri kabına yerleştirin.
- Kuvöz sonrası hassas büyüme bozmadan cam slayt kaldırmak için plaka ve slayt arasında yüzey gerilimi oluşturmak için steril bir kürdan kullanarak Petri çanak alt slayt kaldırın.
- Bir steril döngü veya bir iğne örnek inoculum gelen bazı slayt üzerinde agar blok dört tarafına aktarmak için kullanın.
- Aşılamayı takiben agar bloğunun yüzeyine temiz bir kapak kaydırın. Büyüyen mantarlar için nem sağlamak için slayt etrafında Petri kabına steril distile su birkaç damla ekleyin.
- Plakayı kısmen parafin filmi kullanarak kapatın ve plakayı uygun bir süre için 30 °C'de kuluçkaya yatırın (Fusarium türleri için 36 ila 48 saat kuluçkaya yatırın).
- Petri kabından kaydırağı çıkarın ve steril çöf örmeler kullanarak sıkıca yapışmış kapak kaymasını agar bloğundan ayırın. 4 °C'de bir gecede PBS%3 glutaraldehit içinde agar blokları düzeltin.
- Mantar kültürleri için patates dekstroz agar (PDA) ortam hazırlayın: Bir Erlenmeyer şişesinde 1 L distile su 39 g PDA güç ekleyin. Şişeyi döndürerek iyice karıştırın ve 30 dk.
- Bir etanol serisinden geçerek numuneleri dehydrate: 10%, 25%, 50%, 75% ve% 90 değişim başına 15 dakika ile. Tam doygunluk sağlamak için her biri 30 dakika süren % 100 etanol iki değişiklik ile son dehidratasyon için örnekleri işleyin.
- Kritik nokta kurutma: Susuz numuneleri CPD cihazının haznesinde yerleştirin. Sıvı CO 2 tamamen hazne doldurur kadar, sıvı CO2 içinde izin ve etanol dışarı havalandırmak için vanalar açarak hazneyi kapatın ve soğutun.
- Oda basıncı 1000 psi'yi aştığında ve sıcaklık 31 °C'yi aştığında, CO 2'nin sıvı ve gaz fazı dengede olduğunda, odayı yavaşça kapatın ve ısıtın. Yüzey geriliminin etkilerini önlemek için CO 2'yi odave numuneyi gaz olarak yavaşça boşaltın.
- 1.11-1.13 adımlarında belirtilen adımları izleyerek montaj, altın kaplama ve görüntüleme işlemleri gerçekleştirin.
- 1.9-1.13 adımlarını izleyerek HMDS kullanarak 3.2 adımdaki numuneleri kimyasal olarak kurutarak karşılaştırmalı analiz ler yapın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1, boyalı kaplumbağa(Chrysemys picta) embriyolarının taramalı elektron mikrografik analizini göstermektedir. Kimyasal kuruduktan sonra alüminyum saplara monte edilen bir yatak makinesinde toplanan ve kuluçkaya yatan boyalı kaplumbağa yumurtaları SEM görüntüleme için kullanılmıştır (Şekil 1A-E). Evre 12 embriyonun yanal görünümü kraniyofasiyal yapıları gösterir; maksiller önem mandibular ötesine uzanır ve iyi işaretlenmiş bir burun çukuru medially sınırlar; beş faringeal kemer de gözlenmiştir (Şekil 1F). Embriyonun arka kuyruk bölgesinde yeni oluşan somitler segmentli vücut somitlerine göre kolayca sayılabilir. Forelimb tomurcukları arka ekstremite tomurcukları ve noktalarventrally daha caudally göre daha uzun görünür. Bir karaayak sırtı iyi tanımlanmış bir büyüme evre 15 embriyotüm ekstremite kanadı bölgesi boyunca görülür (Şekil 1G. 18. aşamada, boyalı kaplumbağalar kısa, zayıf bir burun projektör sahip. Alt gaga üst çene içinde direnilir ve üst gaganın merkezi çeksisine sığan bir terminal kancası ile hafifçe ters çevrilmiş olur (Şekil 1H). Boyalı kaplumbağaların üst çenesi, her iki tarafta küçük bir tepe ile medial U-V şeklinde distal ucu oluşturan çentikli bir görünüm gösterir, küçük bir yumurta dişi üst çene ucunda oluşmaya başlar. Daha önceki aşamalarda daha uzun görünen ekstremite tomurcukları, 13-14. Apikal ektodermal sırt ile çizilmiş ekstremite mezenchyme anterior-posterior marjları boyunca görülür (Şekil 1I-J).
Şekil 2, SEM görüntüleme kullanarak Chrysemys picta yumurta kabuğu ve kabuk zarının ultra-yapısal analizini göstermektedir. Boyalı kaplumbağa yumurta kabukları yukarıda açıklandığı gibi elde edilmiş ve çift distile su ile yıkandıktan sonra hava kurutulmaya maruz kalmıştır (Şekil2A,B). Çift taraflı karbon bandı (Şekil2C) ile alüminyum saplamalar üzerine monte edilen yumurta kabukları SEM kullanılarak görüntülendi. Kabuğun yanal görünümü, dış kaltasiyeli yumurta kabuğu tabakasının iç ipliksi kabuk zarına sıkıca bağlayarak ortaya çıktı (Şekil 2D). Yumurta kabuğunun dış yüzeyi, gruplar halinde düzenlenmiş küresel/küresel nodüllerden yapılmış ve bitişik kabuk üniteleri arasında çeşitli boyutlarda küçük yuvarlak bunalımlar veya gözeneklerin bir konsantrasyonu olan, tanınmış mineralize kabuk ünitelerinden oluşur. gözlenen (Şekil 2E). Her grup kabuk ünitesinden nodüller bir bağlantı kavşağında buluşur, merkez noktası (Şekil2F). Dış yüzey, kabuk zarının yüzeyini gözlemlemek için forceps kullanılarak elle soyuldu. Kabuk üniteleri ile altta yatan çok katmanlı fibröz membran arasındaki bağlanma noktasını sağlayan merkezi plak sıraları görüldü (Şekil 2G).
Şekil 3, SEM görüntüleme kullanılarak gözlenen slayt kültürlerinden askolikenat mantarı izole sinin morfolojik karakterizasyonunu göstermektedir. Aşılamadan sonraki iki gün içinde agar bloğunda mantar büyümesini gösteren slayt kültür kurulumu şeması (Şekil3A)oluşturulmuştur. Beyazdan krem renkli hava miselyumuna doğru hızla büyüyen koloniler (Şekil 3B). Agar dilimlerinin kritik nokta kurutulma ve fışkırtma kaplamasını takiben SEM görüntülemede mantar hyphae, kavisli konidia ve spor lar gibi pirinç saptandı. Konidioforlar septate hava hidrasından (Şekil3C)yanal olarak ortaya çıkmıştır. Kısa, dallı konidiyoforlarda üretilen makrokonidiya orta eğimlidir, kısa, künt apikal ve belirsiz pedicellate bazal hücreler çoğunlukla septate (Şekil3D).
Şekil 4, benzer numunelerin alternatif teknikler kullanılarak işlenmesi için karşılaştırmalı sonuçları göstermektedir. HMDS'de evre 15 embriyoların daldırma başkanları ve kademeli buharlaşma ile kurutma iyi korunmuş kraniyofasiyal yapılar göstermek, neredeyse hiçbir büzülme veya bozulma HMDS yavaş buharlaşma uzun süre görülür (Şekil4A). Osmiyum tetroksit ile sabit sonrası embriyolar, HMDS yavaş işlemeye göre dokunun hafif küçülmesi dışında görüntü kalitesinde ayırt edilebilir bir fark göstermedi (Şekil4B). HMDS'yi kısmen veya tamamen çıkararak embriyoların kurutularak kurutularak hızlı buharlaşma nın yapısal bozulma ve büzülmeye yol açtığı (Şekil4C),yavaş buharlaşma ise benzer şekilde sahnelenmiş bir embriyonun mükemmel yüzey yapılarını çözmüştür ( Şekil 4 A). Kurutma eserler geniş büzülme ve doku imha neden CPD tekniği ile tedavi embriyolarda görüldü (Şekil4D,E). Slayt kültürlerinden agar dilimleri CPD'ye göre HMDS tedavisi ile mantar izole eksik kurutma göstermektedir (Şekil F). Agar dilimlerinin iyi kurutulmuş, beyaz bir numune ile cpd ile işlenmesi ile mantar hyphae ve sporların sağlam yüksek çözünürlüklü yapısal özelliklerini gösteren tam kurutma sağlanır (Şekil4G-G'). Mantar kültürleri ile Agar blokları küçülmüş ve renk sarı onları SEM görüntüleme için uygun hale görünür (Şekil 4H-H').
Şekil 1 : Taramalı elektron mikrografları Chrysemys picta kimyasal kurutma ile hazırlanan embriyolar. (A) Chrysemys picta, Rice Creek Field Station, Oswego, NY üreme sezonunda yuvalama. (B) Dışarıdan iyi inşa edilmiş yuva. (C) Yüzey toprağı, yumurtlamaya özenle çıkarılır. (D) Kuluçka odasına yatak ortası ile yerleştirilen yumurtalar. (E) Kimyasal kuruduktan sonra embriyoların alüminyum saplara monte edilmesi, e4'ün fışkırtma kaplı embriyosunu göstermesi. (F) Yüz yapılarını, ekstremite tomurcuklarını ve somitleri gösteren evre 12 embriyonun yanal görünümü. (G) Evre 15'te iyi tanımlanmış karaayak sırtı ve kürek şeklinde ekstremite tomurcukları görülür. (H) Evre 18 embriyonun üst ve alt çeneyi gösteren kraniyofasiyal yapıları, üst gaganın ucunda oluşan küçük bir yumurta dişine dikkat eder. (I) Evre 13-14'te sağ forelimbun dorsal görünümü ve Dorsal-ventral sınırda AER (J) yakın çekim görünümü. Ölçek çubukları: F-H, 500 μm; I, 100 μm ve J, 10 μm. Tuşları: mb, orta beyin; np, burun çukuru; mxp, maksiller çıkıntı; pa, faringeal kemerler; h, kalp; fl, forelimb; s, somite; hl, arka ekstremite; t, kuyruk ucu; cr, karapacial sırt; et, yumurta diş; oc, oral kavite; e, eyej; , alt çene; m, mezenchyme, AER, apikal ektodermal sırt. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2 : Havayla kurutulmuş yumurta kabuğunun ve boyalı kaplumbağa yumurtalarının kabuk zarının ultrayapısal analizleri. (A) Embriyolar onarıldıktan sonra yumurta kabukları yumurta sarısı ve albumini çıkarmak için distile suda iyice yıkanır. (B) Temiz yumurta kabukları en az bir gecede kurutulur. (C) Bir yumurta kabuğunun alüminyum sapların üzerine montajı. (D) Dış kireçli tabaka ve iç kabuk membranını gösteren kabuk parçasının radyal görünümü. (E) Dış kalsal tabaka, bu birimler (yıldız) arasında görülen gruplar vegözenekler halinde düzenlenmiş küresel kabuk üniteleri (su) gösterir. (F) Mermi üniteleri arasındaki merkez noktayı gösteren bir nodülün büyütülmüş görünümü (c) (G) Kireçli tabakanın çıkarılması kabuk zarının dış yüzeyini kabuk ünitelerinden kopan bunalımlarla gösterir. Ölçek çubukları: E, 100 μm; F, 10 μm ve G, 20 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3 : SEM görüntüleme için mantar kültürü hazırlamak. (A) Slayt kültürünün kurulumünü gösteren şematik diyagram. (B) 30°C'de iki günlük kuluçkadan sonra agar bloğunda görülen beyaz renkli mantar kolonileri. (C) Fusarium solanimiselyumunun bir bölümünü gösteren SEM görüntüsü, sporodochia'da makrokonidiyeyi işaret eden siyah yıldız işaretleri, phialide işaret eden bir ok ve mikrokonidiye doğru giden ok uçları, ölçek çubuğu, 10 μm. (D) Septate chlamydospores, ölçek çubuğu 5 μm. Tuşları büyütülmüş görüntü: ab, agar blok; cs, coverslip; f, mantar kültürü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4 : Benzer numuneleri işlemek için alternatif tekniklerin karşılaştırmalı analizi. (A) Boyalı kaplumbağa başının frontal görünümü HMDS yavaş buharlaşma ile kurutulmuş (A ), osmiyum tetroksit ile post-fixing sonra (B), HMDS hızlı hızlı buharlaşma (C), ve CPD (D-E ). Osmiyum tetroksit kullanarak bir fiksasyon sonrası adım dahil post-fiksasyon olmadan HMDS tedavi ile karşılaştırıldığında görüntü kalitesinde görünür bir fark göstermez. DEFORMASYONLAR HMDS'nin hızlı buharlaşmasından sonra görülürken, yavaş buharlaşma ile kademeli kurutma daha iyi bir yüzey yapısı sağlar. CPD ile tedavi edilen embriyolarda beyin, göz ve yüz çıkıntılarının farklı derecelerde büzülme ve çökmüş yapılar görülür. (F) HMDS (1), CPD (2) ve sputter kaplı CPD işlenmiş numune (3) ile işlenen slayt kültürlerinin montajı alüminyum saplamalar. (G-G'( Komple kurutma mantar misel ve Fusarium solanisporları yapıları koruyarak CPD tarafından elde edilen mantar inoculate ile bozulmamış beyaz renkli agar dilim olarak görülen . (H-H') HMDS koruma tekniği ile görülen slayt kültürünün yetersiz kurutulmasına, büzülmeye ve hasarlı yapısal bütünlükte. Ölçek çubukları: A-E, 500 μm; G-H, 2 mm ve G'-H', 20 μm. Tuşlar: et, yumurta dişi; oc, oral kavite; e, göz; uj, üst çene; lj, alt çene; siyah yıldız, sporodochia makrokonidi; ok, phialide; ve ok uçları, mikrokonidia. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Çalışmamızda sem görüntüleme için üç farklı hassas biyolojik örnek hazırlamak için farklı fiksasyon ajanları, dehidratasyon ve kurutma yöntemleri test edilmiştir: embriyolar, yumurta kabukları ve mantar kültürleri. SEM genellikle yüzey analizi için kullanılır, bu nedenle fiksatif penetrasyon daha az endişe vericidir, ancak kötü sabit iç yapıların içe doğru küçülmeye veya/ve çökmüş yüzey yapılarına neden olacağı anlaşılmalıdır. Daha büyük doku örnekleri için de uzun fiksasyon süresi düşünülmelidir, fiksatif çözeltifikasyon süresine bağlı olarak birkaç kez değiştirerek. Fiksatif ve doku arasındaki aktif etkileşim nedeniyle, hücrelerin ozmotik özellikleri önemli ölçüde değişecekti. Doku sıvıları fiksatif seyreltmek ve böylece genel osmolality katkıda bulunan bir aldehit etkisi hücre hacmi üzerindeki etkileri söz konusu olduğunda ihmal edilebilir. Ayrıca, formaldehit dokulara daha hızlı nüfuz edecek ve glutaraldehit ile karşılaştırıldığında çapraz bağlayıcı olarak daha etkilidir. Bir tamponlu formaldehit-glutaraldehit karışımı da dokuların geniş bir yelpazede sabitleme için bildirilmiştir, monolayers ve hücre süspansiyonlar seyreltilmiş çözeltiler için daha uygun olmasına rağmen15,16. Ancak, seyreltilmiş çözeltiler de hipertonik, bu nedenle aldehitler kendilerini osmotically aktif değildir. Bu çalışmada kullanılan hassas numuneler için pH 7.4'teki PBS sabitleme ajanları için bir araç olarak kullanılmıştır, çünkü fosfat tamponlarının çoğu biyolojik numunenin sitoplazmik ortamlarına daha çok benzemektedir. Ayrıca, PBS sabitleme ajanı için bir araç olarak hareket ederken ozmularity örnek için gerekli fizyolojik aralığı içinde olduğu tespit edilir. Osmiyum tetroksit ile fiksasyon sonrası genellikle çeşitli biyolojik örnekler için tavsiye edilir16,22,42 ama bu çalışmada kullanılan tüm biyolojik örnekler için ortadan kaldırılmıştır. Osmiyum tetroksit içermeyen numuneler net görüntüler ve osmiyum tetroksit ile sabitlenen numuneler ayırt edilemez sonuçlar vermiştir (Şekil4A). Osmiyum tetroksit yaprak dokusu yapılarının bozulmasına neden olur ve glutaraldehit ve formaldehitkarışımı43ile karşılaştırıldığında daha zayıf numune koruma verimleri , ve osmiyum moleküllerinin birikme infiltrasyon inhibe edebileceği ileri sürülmüştür cpd kullanılan dehydrating ajanlar ve geçiş ajanları ve kimyasal kurutma için kullanılan HMDS gibi çözücüler. Etkisi dokuya özgüdür ve osmiyum tetroksit hariç bu çalışmada analiz hassas örneklerin türü için görüntü kalitesi üzerinde herhangi bir etkisi olmayacaktır. Osmiyum tetroksit diğer doku türleri için genişletilmiş primer fiksasyon ile ortadan kaldırılabilir.
HMDS kurutulmuş kaplumbağa embriyosu örnekleri iyi korunmuş yüzeyler gösterdi ve CPD'yegöre daha az bozulma veya büzülme gösterdi (Şekil 4). CPD, işlem sırasında oluşturulan sıfır veya en az yüzey gerilimi nedeniyle hücre morfolojisi ve yapı üretiminde bozulma olasılığını en aza indirir. Ancak, CPD hassas kırılgan numuneler için potansiyel bir fiziksel tehlike neden olabilir. Bizim gözlem doğrultusunda, HMDS önceki çalışmalara göre kurutma nedeniyle oluşan yüzey gerilimini en aza indirerek benzer veya daha kaliteli görüntüleme verdi44,45,46,47. CPD tedavisi ile karşılaştırıldığında, HMDS organik meshwork mükemmel kazınt bivalves ve midye kabukları48 yapısal detayları korunmuş ve mermithid karmaşık iç organizasyonun yapısal özellikleri yüksek çözünürlük sağladı nematodlar49 ve böcek iç dokuları28. Kurutma plakası eserler, HMDS tekniğine göre CPD tekniği ile hazırlanan numuneler üzerinde yüksek miktarlarda görülmüştür. CPD tekniği ile hazırlanan servikal hücrelerde membran blebs vepelet artr›r›lar›. HMDS hexamethyldisiloxane ve amonyağı üretmek için su ile reaksiyona girer, her ikisi de nesneden buharlaşır. HMDS genellikle gaz kromatografisinde şekerler, amino asitler, alkoller ve diğer birçok bileşik gibi bileşiklerin silil eterleri oluşturmak için kullanılır. HMDS dokularda bu bileşiklerin bazıları ile reaksiyona girer eğer bilinmemektedir. HMDS proteinleri çapraz ve kurutma işlemi sırasında doku sertleştirmekolabilir 28, HMDS embriyoların daha iyi korunması sağlar kesin nedeni doku özgüllüğü dışında açıklanamadı rağmen. Araştırmamızın sonuçlarına göre, CPD HMDS ile karşılaştırıldığında geniş bir büzülmeye neden oldu ve özellikle erken sahnelenen embriyoların yüzey yapısını analiz etmek için embriyonik dokuların işlenmesi için çok daha uygundur. HMDS'nin doku kurutma sıcağa ilişkin çalışma mekanizması henüz açıklığa kavuşmamıştır, ancak mutlak susuz ortamda kademeli buharlaşma ile yavaş kuruması hayvanların mükemmel bir yüzey yapısı elde etmek için bir neden olabilir.
Bu çalışmada misel minderinin orijinal kabarıklığını korumak için daha önce kurulmuş slayt kültürlerinden mantar kolonileri ile agar bloklarının küçük parçaları kullanılmıştır. Mantar kolonileri ile agar parçalarının CPD kurutma bir yıkama etkisi ile sonuçlandı, fiksatörler değişiklikler ise, tamponlar, ve etanol donma kurutma ile zorlukların üstesinden daha iyi bir seçim olduğu bulunmuştur. Tüm evredeki embriyolar için iyi çalışan HMDS mantar kültürlerini çözemese de HMDS ile hava kurutma önemli bir sorun teşkil ediyordu: kıvrılmak ve yapısal sertliği kaybetmek. CPD mantar kültürleri için iyi çalışırken, özellikle gelişimin erken aşamalarında embriyolara anında hasar verebiş ve yüzeyde büzülmeye neden oldu. HMDS ve CPD embriyolar ve mantar kültürleri için kullanıldığında şarj veya kurutma objeleri gözlenmemiştir. Kaplumbağaların yumurta kabuğu gibi sert dokular için, görüntüleme için montajdan önce oda sıcaklığında yıkama ve havanın kuruması dışında özel bir işleme gerek yoktur.
Hazırlık yöntemi ne olursa olsun, parça ya da kademeli etanol gradyan adımlar, yapıtların kurutulma potansiyelini azaltmak için kullanılmalıdır. Başlangıçta, hem HMDS hem de CPD örnekleriliteratürde mevcut dehidratasyon ve kurutma protokolleri aşağıdaki büzülme ile yüzey eserler bulundu. Bir dizi standardizasyondan sonra, objelerin alkol dehidratasyonundan kaynaklandığını belirledik. Dehidratasyon sırasında daha kademeli etanol artışları kullanarak yavaş bir dehidratasyon işlemi kullanmak önemlidir. Ayrıca, her yineleme süresi mantar kültürleri ile karşılaştırıldığında embriyolar için daha uzun olmalıdır. Ayrıca, % 100 etanol ek bir adım tam üniforma doygunluğu sağladı. HMDS, numunelerin hava kurutulmasına izin vermek için tamamen veya kısmen çıkarılabilir, ancak HMDS'ye uzun süreli maruzkalma ve buharlaşma ile kademeli hava kurutulması embriyoların bozulmasını önlemek için etkili olduğu bulunmuştur (Şekil4A,C) büyük yüzeyden kaynaklanan mikrobiyal hücre eki için gözlenen gerilim51. HMDS'ye batırılabilen numuneler ve bir gecede yavaş kuruyan lar, Daphnia türleri52'de yumuşak hassas dokuların yavaş kurutma işleminden fayda sağlayabileceğini düşündüren mükemmel bir yüzey yapısı ortaya çıkardı. Embriyolar için kabul edilebilir görüntü kalitesi yavaş kimyasal kurutma ile yavaş yavaş dehidratasyon sonrasında etanol IÇIN HMDS konsantrasyonu artırarak elde edilebilir.
Tüm numuneler iletken bir yüzey sağlamak için çift taraflı karbon bant kullanılarak alüminyum saplamalar üzerine monte edildi, aynı örnek farklı bir yönde görüntülenecekse renksiz oje ince bir kat da kullanılabilir. Saplama yüzeyinde oje kullanıldığında ve numunelerin alternatif düzlemlerde konumlandırılması çift taraflı karbon bandı ile karşılaştırıldığında mümkün olduğunda numuneler saplamalardan kolayca çıkarılabilir. Numuneler iletken olmayan olduğundan, iletkenliği artırmak için numuneler üzerinde ince bir metal tabakası püskürtmek gerekir. Bu çalışmada püskürtme kaplama sıcağa altın bir hedef kullanılmıştır ve altın-paladyum da şarj etkilerini önleyerek benzer sonuçlar vermiştir. Doğru ışın gerilimi numuneye bağımlıdır, hafif kaplanmış numuneler için, 2-5 kV'de bir alan emisyon SEM ile görüntüleme yüzey yapılarının iyi bir tanımını sağlayacaktır. Yeterli kaplamaya sahip dokular için 5 kV genellikle daha fazla ışın penetrasyonu olmadan daha iyi sinyal sağlar. Derinliği olmayan ve sadece altınla kaplanmış numuneler için, daha yüksek voltajda (10 kV) görüntüleme yüzey topografyasının daha iyi görüntülenmesine olanak sağlar.
SEM için hassas dokuların hazırlanması ayırt edici zorluklar teşkil etmektedir ve görüntüleme yapıtlarının üstesinden gelmek ve en aza indirmek için bir dizi örnek hazırlama tekniği kullanılabilir. Sem görüntüleme için üç farklı hassas biyolojik doku örneğini işlemek için kapsamlı yöntemler salıyoruz: embriyolar, sert yumurta kabukları ve mantar kültürleri. Araştırmamızda, daha önce yayınlanmış çalışmalardan elde edilen popüler yöntemlerde ince değişiklikler yapıldı ve her hassas doku tipine özgü en uygun dehidratasyon ve kurutma yöntemlerini belirledik. Bu protokoller, benzer biyolojik numunelerden kabul edilebilir SEM görüntü kalitesi elde etmek için uyarlanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar Dr Daniel Baldassarre, SUNY Oswego yararlı tartışmalar ve el yazması üzerinde yorum için teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Rice Creek Associate Grants, Oswego tarafından desteklenmiştir; Challenge Grants SUNY Oswego ve Ulusal Bilim Vakfı (NSF) PGL ve JG için Küçük Hibeler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Fischer Scientific | S25127A | for slide cultures |
| Aluminum pin stub | Tedpella | 16111 | 12.7 mm x 8 mm |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: Potato Dextrose Agar | BD 213400 | DF0013-17-6 | Media for isolation and cultivation of Fungi, yeast and molds |
| Chloramphenicol | Fischer BioReagents | BP904-100 | Antibiotic for media |
| Coarse Vermiculite | Greenhouse Megastore | SO-VER-12 | bedding medium |
| Clear 12- well plate | Corning | 07-201-589 | for fixing embryo |
| Coverslips | Fischer Scientific | S17525B | for slide culture |
| Critical Point Dryer | Quorum CPD | EMS850 | critical point drying |
| Culture dishes | Fischer Scientific | 08 747B | DISH PETRI 100X10MM 12/PK |
| Ethanol | Fischer Scientific | A406P 4 | dehydration agent |
| Forceps- Aquarius Tweezers | Tedpella | 5804 | style 4, length 108mm, widh x thickness 0.017 x 0.17 mm |
| Glutaraldehyde | Fischer Scientific | G151-1 | fixative |
| Gold target for sputter coater | DENTON VACUUM | TAR001-0158 | Gold Target, 2.375″ D X .002″ |
| Hexamethyldisilazana | Fischer Scientific | C19479-5000 | chemical drying agent |
| Kim wipes | Kimtech | S-8115 | cleaning |
| Microscope slides | Thermo Scientific | 67-762-16 | for slide culture |
| Microscopy Scissors | Tedpella | 1327 | Double pointed, stainless steel, 100 mm L (3-5/8"). |
| Micro-scissors | Tedpella | 1346 | Vannas-type, straight, 80mm L |
| Moria Perforated Embryo Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Length 14.5 cm, tip diameter 20 mm, spoon depth 5 mm |
| Netwell Inserts | Corning | 0330B09 | 15 mm Inserts with 74 µm Mesh Size Polyester Membrane act as handy carriers during specimen processing into different solvents |
| Paraformaldehyde | Fischer Scientific | T353 500 | fixative |
| Peat moss | Walmart- Miracle Gro | 551705263 | bedding medium |
| PELCO tabs double stick carbon conductive tape | Tedpella | 5000 | 12 mm OD |
| Sputter coater | DENTON VACUUM | DESK V | thin metal coating |
| SEM | JEOL USA | JEOL JSM 6610LV scanning electron scope | electron microscopy |
References
- Packard, M. J. Ultrastructural Morphology of the Shell and Shell Membrane of Eggs of Common Snapping Turtles (Chelydra serpentina). Journal of Morphology. 165 (2), 187-204 (1980).
- Solomon, S. E., Watt, J. M. The structure of the eggshell of the leatherback turtle (Dermochelys coriacea). Animal Technology. 36 (1), 19-27 (1985).
- Sahoo, G., Mohapatra, B. K., Sahoo, R. K., Mohanty-Hejmadi, P. Ultrastructure and Characteristics of Eggshells of the Olive Ridley Turtle (Lepidochelys olivacea) from Gahirmatha, India. Acta Anatomica. 156, 261-267 (1996).
- Mitrus, S. The calcareous layer eggshell of the turtle Emys Orbicularis: Ultrastructure and composition. Italian Journal of Zoology. 70 (1), 13-16 (2003).
- Chang, Y., Chen, P. Y. Hierarchical structure and mechanical properties of snake (Naja atra) and turtle (Ocadia sinensis) eggshells. Acta Biomaterialia. 31, 33-49 (2016).
- Samson, R. A., Stalpers, J. A., Verkerke, W. A simplified technique to prepare fungal specimens for scanning electron microscopy. Cytobios. 24, 7-11 (1979).
- Kaminskyj, S. G. W., Dahms, T. E. S. High spatial resolution surface imaging and analysis of fungal cells using SEM and AFM. Micron. 39, 349-361 (2008).
- Wisse, E., et al. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World Journal of Gastroenterology. 16 (23), 2851-2866 (2010).
- Braet, F., De Zanger, R., Wisse, E. Drying cells for SEM, AFM and TEM by hexamethyldisilazane: a study on hepatic endothelial cells. Journal of Microscopy. 186 (1), 84-87 (1997).
- Echlin, P. Handbook of Sample Preparation for Scanning Electron Microscopy and X-Ray Microanalysis. , UK: Springer. (2009).
- Bell, P. B., Safiejko-Mroczka, B. Preparing whole mounts of biological specimens for imaging macromolecular structures by light and electron microscopy. International Journal of Imaging System Technology. 8 (3), 225-239 (1997).
- Bahr, G. F., Bloom, G., Friberg, U. Volume changes of tissues in physiological fluids during fixation in osmium tetroxide or formaldehyde and during subsequent treatment. Experimental Cell Research. 12 (2), 342-355 (1957).
- Baker, J. R. Principles of biological microtechnique; a study of fixation and dyeing. , Wiley. London Methuen; New York. (1958).
- Glauert, A. M. Practical methods in electron microscopy. Journal of Microscopy. 3, 5-65 (1974).
- Hayst, M. A. Biological Applications. Principles and techniques of electron microscopy, 4th ed. , Cambridge University Press. 13-105 (1970).
- Pathan, A. K., Bond, J., Gaskin, R. E. Sample preparation for SEM of plant surfaces. Materials Today. 12 (1), 32-43 (2010).
- Hayat, M. A. Electron microscopy: Biological applications. 4th ed. , Cambridge University Press. New York. (2000).
- Hayat, M. A. Fixation for electron microscopy. , Academic Press. New York. (1981).
- Karnovsky, M. J. A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolarity for use in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 27, 137-138 (1965).
- McDowell, E. M., Trump, B. F. Histologic fixatives suitable for diagnostic light and electron microscopy. Archives Pathology and Laboratory Medicine. 100, 405 (1976).
- Wisse, E., et al. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World Journal of Gastroenterology. 16 (23), 2851-2866 (2010).
- Fischer, E. R., Hnasen, B. T., Nair, V., Hoyt, F. H., Dorward, D. W. Scanning Electron Microscopy. Current Protocols in Microbiology. , Unit2B.2 (2012).
- Magalhaes, M., et al. Embryonic development of the Giant South American River Turtle, Podocnemis expansa (Testudines: Podocnemididae). Zoomorphology. 136 (4), 523-537 (2017).
- Hopwood, D. Fixatives and fixation: a review. The Histochemistry Journal. 1 (4), 323-360 (1969).
- Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde fixation. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 33 (8), 845-853 (1985).
- Bell, P. B., Rundquist, I., Svensson, I., Collins, V. P. Formaldehyde sensitivity of a GFAP epitope, removed by extraction of the cytoskeleton with high salt. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 35 (12), 1375-1380 (1987).
- Hayat, M. A. Glutaraldehyde: Role in electron microscopy. Micron and Microscopica Acta. 17 (2), 115-135 (1986).
- Nation, J. L. A new method using hexamethyldisilazane for preparation of soft insect tissues for scanning electron microscope. Stain Technology. 58 (6), 347-351 (1983).
- Bray, D. F., Bagu, J., Koegler, P. Comparison of hexamethyldisilazane (HMDS), Peldri II, and critical point drying methods for scanning electron microscopy of biological specimens. Microscopy Research Technique. 26 (6), 489-495 (1993).
- Barre, C., O'Neil, D., Bricelj, V. M. Preparation of large bivalve specimens for scanning electron microscopy using Hexamethyldisilazane (HMDS). Journal of Shellfish Research. 25 (2), 639-641 (2006).
- Lee, J. T. Y., Chow, K. L. SEM sample preparation for cells on 3D scaffolds by freeze-drying and HMDS. SCANNING. 33, 1-14 (2011).
- Araujo, J. C., et al. Comparison of hexamethyldisilazane and critical point drying treatments for SEM analysis of anaerobic biofilms and granular sludge. Journal of Electron Microscopy. 52, 429-433 (2003).
- Boyde, A., Bailey, E., Jones, S. J., Tamarin, A. Dimensional changes during specimen preparation for scanning electron microscopy. SEM/IITRI. 10, 507-518 (1977).
- Read, N. D., Porter, R., Beckett, A. A comparison of preparative techniques for the examination of the external morphology of fungal material with the scanning electron microscope. Canadian Journal of Botany. 61 (8), 2059-2078 (1983).
- Melo, I. S., Faull, J. L. Scanning electron microscopy of conidia of Thichoderma stromaticum, a biocontrol agent of witches broom disease of cocoa. Brazilian Journal of Microbiology. 35, 330-332 (2004).
- Pathan, A. K., Bond, J., Gaskin, R. E. Sample preparation for scanning electron microscope of plant surfaces- Horses for courses. Micron. 39, 1049-1061 (2008).
- Packard, G. C., Taigen, T. L., Packard, M. J., Boardman, T. J. Water relations of pliable-shelled eggs of common snapping turtle (Chelydra serpentine). Canadian Journal of Zoology. 58, 1404-1411 (1979).
- Packard, M. J., Packard, G. C., Boardman, T. J. Structure of eggshells and water relations of reptilian eggs. Herpetologica. 38, 136-155 (1982).
- Cordero, G. A., Janzen, F. J. An Enhanced Developmental Staging Table for the Pianted Turtle, Chrysemys picta (Testudines: Emydidae). Journal of Morphology. 275, 442-455 (2014).
- Yntema, C. L. Procurement and use of turtle embryos for experimental procedures. The Anatomical Record. 149, 577-586 (1964).
- Matsubara, Y., Kuroiwa, A., Suzuki, T. Efficient harvesting methods for early-stage snake and turtle embryos. Development Growth Differentiation. 58, 241-249 (2016).
- Moran, P., Coats, B. Biological Sample Preparation for SEM Imaging of Porcine Retina. Microscopy Today. , 10-12 (2012).
- Bray, D. F., Bagu, J., Koegler, P. Comparison of hexamethyldisilazane (HMDS), Peldri II, and critical point drying methods for scanning electron microscopy of biological specimens. Microscopy Research Technique. 26, 489-495 (1993).
- Botes, L., Price, B., Waldron, M., Pitcher, G. C. A simple and rapid Scanning Electron Microscope preparative technique for delicate "Gymnodinioid" Dinoflagellates. Microscopy Research Technique. 59, 128-130 (2002).
- Dekker, N. P., Lammel, C. J., Brooks, G. F. Scanning Electron Microscopy of piliated Neisseria gonorrhoeae processed with hexamethyldisilazane. Journal of Electron Microscopy. 19, 461-467 (1991).
- Fratesi, S., Lynch, F. L., Kirkland, B. L., Brown, L. R. Effects of SEM preparation techniques on the appearance of bacteria and biofilms in the Carter Sandstone. Journal of Sedimentary Research. 74, 858-867 (2004).
- Jung, S. W., Joo, H. M., Park, J. S., Lee, J. H. Development of a rapid and effective method for preparing delicate dinoflagellates for scanning electron microscopy. Journal of Applied Phycology. 22, 313-317 (2010).
- Bernd, S., Bentley, D. Use of HMDS (hexamethyldisilazane) to dry organic microstructures in etched bivalve mollusk and barnacle shells. Nautilus -Greenville then Sanibel. 116, 25-31 (2002).
- Bowen, W. R., Hemann, C. C., Johnson, A. A., Good, B. H. Mermithid Nematodes: SEM Observations Comparing Hexamethyldisilazane and Critical Point Drying Methods. Journal of the Arkansas Academy of Science. 44, Article 6 (1990).
- Jusman, J., Ng, S. C., Osman, N. A. A. Investigation of CPD and HMDS Sample Preparation Techniques for Cervical Cells in Devloping Computer-Aided Screening System Based on FE-SEM/EDX. The Scientific World Journal. 289817, 1-11 (2014).
- Hazrin-Chong, N. H., Manefield, M. An alternative SEM drying method using hexamethyldisilazane (HMDS) for microbial cell attachment studies on sub-bituminous coal. Journal of Microbiological Methods. 90, 96-99 (2012).
- Laforsch, C., Tollrian, R. A new preparation technique of daphnids for Scanning Electron Microscopy using hexamethyldisilazane. Arch Hydrobiology. 149 (4), 587-596 (2000).
