Summary
Ici, nous présentons des protocoles détaillés de traitement pour l'imagerie des échantillons de tissus délicats à l'aide de la microscopie électronique à balayage (SEM). Trois méthodes de traitement différentes, à savoir, le séchage chimique du disilazana hexaméthylique (HMDS), le séchage simple à l'air et le séchage à points critiques sont décrits pour la préparation de coquilles d'œufs rigides, d'embryons à un stade de développement précoce et de cultures fongiques respectivement.
Abstract
Bien que la microscopie électronique à balayage (SEM) soit largement utilisée pour l'analyse ultra-structurale de divers échantillons biologiques et non biologiques, les méthodes impliquées dans le traitement de différents échantillons biologiques impliquent des pratiques uniques. Toutes les pratiques conventionnelles décrites dans la littérature pour le traitement des échantillons trouvent encore des applications utiles, mais des changements subtils dans la préparation de l'échantillon peuvent modifier la qualité de l'image, ainsi que, introduire des artefacts. Par conséquent, l'utilisation d'une technique unique de préparation d'échantillons spécifique au type de tissu analysé est nécessaire pour obtenir une image de bonne qualité avec une résolution ultrastructurale. L'objectif de cette étude est de fournir les protocoles optimaux de préparation de l'échantillon pour l'imagerie des embryons, des coquilles d'œufs rigides et des cultures fongiques à l'aide de SEM. Les optimisations suivantes ont été recommandées pour donner de bons résultats pour les trois différents échantillons biologiques délicats étudiés. L'utilisation de fixatifs plus doux comme le paraformaldéhyde de 4 % ou le glutaraldéhyde de 3 % suivi de la déshydratation avec la série d'éthanol est obligatoire. Le mycélium fongique sur les blocs d'agar obtenus par les cultures de diapositives donne une meilleure intégrité ultrastructurale par rapport aux cultures prises directement à partir de plaques d'agar. Le séchage chimique des embryons avec HMDS permet le séchage sans introduire d'artefacts de tension de surface par rapport au séchage à points critiques. Le SMDM empêche la fissuration causée par le rétrécissement, car les échantillons sont moins cassants pendant le séchage. Cependant, pour la culture fongique, le séchage par point critique offre une qualité d'image acceptable par rapport au séchage chimique. Les coquilles d'œufs peuvent être représentées sans étapes de préparation spéciales, sauf pour un lavage complet et un séchage à l'air avant le montage. Les méthodes de préparation ont été normalisées en fonction de la qualité d'image acceptable obtenue à chaque essai.
Introduction
L'analyse ultrastructurale de microscope électronique de balayage (SEM) et la microscopie intracellulaire de formation image complètent la lumière pour le profilage tridimensionnel des procaryotes, des usines, et des animaux. La haute résolution spatiale d'un SEM en fait l'une des techniques les plus polyvalentes et les plus puissantes disponibles pour l'examen des caractéristiques microstructurales des spécimens à l'échelle nanométrique à micromètre. Les spécimens desséchés sont résolus aux structures compositionnelles et topographiques avec le détail intense, qui fournit la base pour développer des conclusions valides au sujet des relations fonctionnelles1,2,3 , 4 ( en plus) , 5 Annonces , 6 Annonces , 7 Annonces , 8 Annonces , 9. Lors de l'interprétation des images SEM de spécimens biologiques, il est très difficile de faire la distinction entre les structures indigènes et les artefacts qui sont créés au cours du traitement. SEM est généralement exploité à des vides très élevés pour éviter toute interférence des molécules de gaz affectant les faisceaux d'électrons primaires, secondaires ou rétrodiffusés émis par l'échantillon10,11. En outre, les matériaux biologiques sont sensibles aux dommages causés par les radiations en raison de leurs propriétés pauvres ou non conductrices. Il est essentiel que les spécimens chargés dans le SEM soient complètement secs et exempts de tout contaminant organique afin d'éliminer tout dégazage possible dans un environnement à vide élevé10,11. Comme les spécimens biologiques sont principalement composés d'eau, d'autres techniques de préparation sont nécessaires pour s'assurer que les structures indigènes sont conservées.
La résolution obtenue est basée sur l'optimisation des méthodes de préparation spécifiques aux types de spécimens et aux paramètres instrumentaux utilisés. Ainsi, il est nécessaire d'éviter d'utiliser des étapes de traitement généralisées pour tous les types de tissus. Certains spécimens biologiques exigeront un traitement moins rigoureux pour préserver leur structure, tandis que plus de temps et de soins pourraient être nécessaires pour les types délicats d'échantillons afin d'éviter l'introduction d'artefacts de séchage, tels que le rétrécissement et l'effondrement. La préparation de l'échantillon est une étape critique dans l'imagerie SEM; les résultats des études morphométriques sont remarquablement influencés par les procédures de préparation des spécimens12,13. Les étapes de préparation courantes pour de nombreux échantillons biologiques sont la fixation, la déshydratation et le revêtement avec un métal comme l'or, le platine ou le palladium pour convertir leurs surfaces pour être conductrices pour l'analyse SEM. La nature et la combinaison des étapes utilisées varient selon le type de tissu et les objectifs spécifiques de l'étude. L'accumulation de charges, la sensibilité aux dommages causés par le vide et les faisceaux d'électrons posent des problèmes lors du traitement d'échantillons biologiques délicats, ce qui fait qu'il faut d'autres étapes de traitement pour conserver la structure indigène de l'objet. L'utilisation de méthodes conventionnelles telles que la fixation du tétroxide d'osmium, et la déshydratation causent le rétrécissement et l'effondrement des tissus délicats14,15,16,17. L'objectif de l'étude est d'établir des méthodologies élégantes dérivées en combinant des idées d'études antérieures avec des modifications pour préparer et imager les tissus délicats mous (p. ex. embryons de reptiles, coquille d'œuf de tortues peintes et cultures fongiques).
La sélection d'une méthode de fixation appropriée est la première étape la plus importante pour l'analyse microscopique des spécimens biologiques. La fixation des tissus immédiatement après l'isoler d'un organisme est essentielle pour empêcher l'altération de leur morphologie due à la décomposition. Un fixatif efficace devrait mettre fin aux processus cellulaires en permédiant les cellules rapidement et en maintenant l'effet de façon irréversible pour stabiliser la structure de l'échantillon pour résister à la fois aux étapes de traitement et à l'examen ultérieurs dans le cadre du SEM17 , 18. Bien que plusieurs méthodes chimiques et physiques de fixation soient connues, la fixation chimique est plus couramment utilisée pour les spécimens biologiques afin d'éviter tout changement cellulaire dû à l'autolyse, à la putréfaction et aux effets de séchage. Il existe de nombreuses formulations chimiques fixatives discutées dans la littérature17,19,20,21,22,23, fixatives qui fonctionnent par dénaturation et coagulant les macromolécules biologiques, et celles qui se fixent par macromolécules covalentes de liaison croisée. Les alcools sont utilisés comme fixatifs dénaturants qui préservent l'ultrastructure très mal et sont utilisés principalement pour la microscopie légère et non recommandés pour l'analyse microscopique des électrons. Les fixatifs croisés comme le formaldéhyde, le glutaraldéhyde et le tétroxide d'osmium créent des liaisons intermoléculaires et intramoléculaires entre les macromolécules dans les tissus, offrant une excellente préservation des ultra-structures11 ,24,25,26. Les échantillons biologiques sont sensibles à la température. Il est recommandé de réduire la mobilité latérale des protéines membranaires, de ralentir la diffusion des molécules intercellulaires et de ralentir le taux de fixation11. Le temps nécessaire à la fixation des tissus dépend en grande partie de la taille de l'échantillon et de la vitesse à laquelle le fixatif se diffuse et réagit avec les composants de l'échantillon. Une fixation de nuit dans 4% de paraformaldéhyde ou 3% de glutaraldéhyde dans pbS à 4 oC est la méthode préférée pour l'analyse SEM des spécimens utilisés dans cette étude pour leurs propriétés pénétrantes séquentielles, qui permettent de traiter de plus petits échantillons délicats17 , 18 ans, états-unis qui , 19 ans, états-unis qui , 20 Ans, états-unis , 27. Une étape post-fixation avec le tétroxide d'osmium est éliminée non seulement en raison de sa nature toxique, mais aussi en raison de sa nature toxique, mais aussi trouvé à mettre en œuvre aucun avantage supplémentaire pour améliorer la qualité de l'image pour les échantillons analysés dans cette étude.
Les échantillons biologiques contiennent des fluides qui interfèrent avec le fonctionnement du SEM; par conséquent, les échantillons doivent être séchés avant de l'insérer dans la chambre d'échantillon SEM. Une fois la déshydratation assurée, le solvant doit être retiré du tissu sans créer d'artefacts dans les spécimens en raison de la tension de surface/séchage. Trois méthodes de séchage différentes ont été couramment utilisées lors du traitement des tissus pour l'imagerie SEM: séchage à l'air, séchage point critique, et le gel des échantillons de séchage28,29,30,31. Peu d'études rapportent que les trois méthodes de séchage produisent des résultats identiques avec des échantillons de tissus animaux28,29,30,31. Une pratique générale utilisée pour les petits spécimens est la déshydratation chimique par la série de concentration ascendante de l'alcool et hexamethyldisilazane (HMDS), mais les spécimens plus grands sont séchés à l'aide d'un point critique de séchage (CPD) instrument32. Pendant le processus de séchage, des forces considérables se sont formées dans de petites cavités qui sont passées à travers le spécimen par une interface liquide/gaz; cela peut même conduire à un effondrement complet des structures creuses33. Toute déformation due au traitement pourrait alors être confondue comme une caractéristique structurale indigène du spécimen. Ainsi, le phénomène généralisé pour le traitement devrait être éliminé et un processus de séchage unique devrait être normalisé pour chaque type de tissu particulièrement quand les spécimens délicats de tissu sont analysés.
Dans plusieurs essais menés à l'aide de diverses combinaisons de tous les processus mentionnés ci-dessus, nous avons normalisé les méthodes qui peuvent être utilisées pour l'analyse SEM de trois tissus délicats: embryons de reptiles, coquilles d'œufs de tortues peintes, et les cultures fongiques. Les biologistes et les morphologues développementaux décrivent la morphogénèse normale et anormale pendant le développement d'embryons chez les animaux vertébrés représentatifs. Les recherches sur les voies de signalisation génique dépendent de la description morphologique de structures nouvelles. Pour éviter tout changement brusque dans la structure de l'embryon vertébré au cours de l'analyse SEM, nous recommandons le séchage chimique après déshydratation. Le séchage chimique à l'aide du SDM est la méthode de séchage relativement récente et les avantages comprennent une rapidité relative, une facilité d'utilisation, une perte de coûts et l'expertise et l'équipement limités nécessaires9. La DPC est une technique de séchage couramment utilisée à l'aide de colsaging CO2 à travers les spécimens à une température et une pression spécifiques. Nous avons identifié que le HMDS convient au séchage des tissus mous et délicats et permet de traiter de plus grands échantillons par rapport au séchage à points critiques, ce qui a causé une déformation importante des tissus embryonnaires. Plusieurs méthodes ont été utilisées pour préparer des échantillons pour l'imagerie SEM afin d'étudier les caractéristiques morphologiques des champignons34. Les spécimens fongiques sont généralement fixés dans le tétroxide d'osmium suivi de la déshydratation de l'éthanol et du séchage critique de point, qui peut fournir des résultats satisfaisants, bien que les effets toxiques du tétroxide d'osmium6,7,35 et la perte de matériaux fongiques tout en changeant des solutions pendant le traitement sont des inconvénients prononcés. La technique de préparation des échantillons utilisant le séchage à l'air sans fixation a également été pratiquée36, mais les résultats en structures rétrécies et effondrées, et l'observation de ces spécimens peut facilement être mal interprétée tout en caractérisant l'espèce. L'hypha fongique perd son intégrité au contact des liquides et un séchage uniforme peut ne pas être réalisé pour restaurer la structure. En raison de cet effet, le lyophilisation est couramment utilisé pour sécher les tissus mous comme le mycélium fongique. Le séchage par congélation fonctionne bien pour les matériaux propres, mais la présence de sels ou de sécrétion obscurcira les détails de surface qui ne seront identifiés qu'à l'étape d'observation de la SEM. Nous avons couplé la méthode de culture de diapositive avec la fixation de glutaraldéhyde et le séchage critique de point pour produire des détails structurels des hyphes et des spores fongiques intacts. Bien que le séchage de CPD ait causé le rétrécissement dans des embryons, il a eu comme conséquence les structures mycéliales bien préservées une fois couplées avec la fixation de glutaraldéhyde. La coquille d'œuf est d'une importance primordiale pour l'embryon d'animaux ovipares en agissant non seulement comme une couverture protectrice, mais aussi en fournissant une stabilité mécanique, la perméabilité au gaz et à l'eau, et une réserve de calcium pour l'embryon en développement. Les coquilles d'œufs de tortues d'eau douce sont classées comme « rigides » en fonction de leur structure, et en raison de leur disponibilité ont reçu une attention significative de la part des biologistes1,2,3,4 , 5 Annonces , 6 Annonces , 7 Annonces , 37 Ans, états-unis ( , 38.
Nous détaillons des méthodes simples pour l'examen facile des membranes de coquille d'oeuf et de coquille de la tortue peinte qui peuvent être appliquées à n'importe quelle espèce rigide de coquille d'oeuf. Les méthodologies de préparation ont été évaluées en fonction de la qualité de l'image résultante et de la réduction des artefacts potentiels.
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Protocol
REMARQUE : Des œufs de tortue sépareuse (Chrysemys picta) utilisés dans cette étude ont été recueillis pendant la saison de nidance de mai à juin 2015-16 à partir de la station Rice Creek Field, Oswego New York, avec la permission du Département de l'environnement de l'État de New York. Conservation (DEC).
1. Méthode de séchage chimique pour traiter les embryons pour SEM
- Recueillir les œufs de tortue s'ils proviennent des champs pendant la saison de nidification. Préparer les chambres d'incubation à l'avance, faites de boîtes en plastique avec couvercles (L x W x H) 6,7 cm x 25,4 cm x 10,2 cm remplis de milieu de literie préparé avec un mélange humide de vermiculite et de mousse de tourbe (1:1 ratio). Faire 4-6 trous d'environ 0,25 cm le long des côtés des boîtes et sur le couvercle pour permettre l'aération.
- Retirer délicatement le sol du nid pour découvrir les œufs. Essuyez la surface des œufs de tortue avec de la teinture diluée d'iode (1:25 000) pour contrôler la contamination microbienne pendant l'incubation. Placez les couvées séparées les unes des autres, la taille de la couvée de la tortue peinte peut varier de 5 à 9 œufs et placer un maximum de 8-9 œufs par boîte.
REMARQUE : Manipulez soigneusement les œufs pendant la collecte, essuyant, étiquetant et plaçant à l'intérieur des boîtes. La position et l'alignement des œufs doivent être les mêmes qu'ils ont été pondus, tout mouvement inhibera le développement des embryons. - Enterrez manuellement la moitié des œufs dans la literie, couvrez et placez la boîte à l'intérieur de l'incubateur à 30 oC. Incuber les œufs pendant 10-17 jours pour obtenir les stades embryonnaires 12, 13 et 18 utilisés respectivement dans cette étude. Ajouter de l'eau distillée pour mouiller partiellement le milieu de literie tous les deux jours afin d'éviter la déshydratation et de maintenir le niveau d'humidité pour le développement normal des embryons.
REMARQUE : L'incubation et la mise en scène des embryons sont selon un tableau complet du développement publié plus tôt39. - Fixer les embryons en faisant la première coupe sur un côté de la coquille d'œuf dorsal et la membrane jaune ensemble, verticale à l'axe long à l'aide de ciseaux pointus. Insérez soigneusement les ciseaux dans le jaune pour éviter de couper le disque embryonnaire. Maintenant, coupez le côté latéral de l'œuf le long de l'axe long, puis coupez l'autre côté de l'œuf le long de l'axe court.
- Peler l'élément excisé avec le côté embryonnaire à l'aide de forceps. Couper l'autre côté latéral de la coquille d'œuf et placer la pièce excisée en saline tamponnée en phosphate (PBS à un pH de 7,4).
REMARQUE : L'œuf de tortue est rempli de jaune d'œuf très visqueux et le côté dorsal de l'embryon adhère à la membrane de la coquille d'œuf. La membrane de coquille d'œuf près de l'embryon change avec l'incubation du blanc translucide au blanc opaque et crayeux. Cela permet de localiser l'embryon au centre de l'axe long et d'être considéré comme un endroit sombre calcifié de l'extérieur40,41. - Utilisez un stéréomicroscope pour isoler les embryons avec la membrane jaune en les épluchant de la coquille d'œuf à l'aide de forceps. Enlever les membranes extra-embryonnaires à l'aide de forceps et de micro-ciseaux. Transférer l'embryon à l'aide d'une cuillère d'embryon dans un plat Petri frais pour laver le sang ou le jaune.
- Utilisez des plaques claires de 12 puits pour fixer les embryons pendant la nuit dans 4 % de paraformaldéhyde dans le PBS à 4 oC ou dans 2 à 3 % de glutaraldéhyde dans le PBS. Placez un à trois embryons dans chaque puits en fonction de la taille des embryons. Assurer une infiltration complète (les échantillons apparaîtront en blanc) pour les embryons plus âgés en prolongeant le temps de fixation de 2 à 3 jours. Rincer les embryons 3x avec du PBS frais pendant 5 min chaque rinçament.
REMARQUE : Évitez d'endommager la surface de l'embryon en utilisant des inserts en polystyrène avec des fonds en treillis en polyester pour les plaques de 12 puits pour transférer des spécimens d'un solvant à un autre. - Déshydrater les échantillons à l'aide d'une série de concentration d'éthanol dans l'eau distillée : 30 %, 50 %, 70 %, 80 %, 95 % et 100 % et traiter les échantillons pendant 1 h dans chaque solution de déshydratation. Répétez l'étape avec 100% d'éthanol deux fois pour assurer une déshydratation complète. S'il n'est pas utilisé immédiatement, entreposez les échantillons dans 70 % d'éthanol à -20 oC pendant une plus longue période.
- Embryons secs utilisant une série de hexamethyldisilazana (HMDS) à 100% concentration d'éthanol: 1:2, 2:1 et 100%. Laisser les échantillons dans chaque solution pendant 20 min et garder le plat Petri partiellement couvert pendant le processus.
REMARQUE : Effectuez toutes les étapes impliquant des HMDS dans le capot de fumée avec l'équipement personnel nécessaire de protection car HMDS est fortement toxique. - Laissez les embryons dans la solution finale 100% HMDS recouverte entièrement ou partiellement d'une hotte de fumée pendant la nuit, ce qui facilite l'évaporation du HMDS, laissant les échantillons prêts pour le montage et le revêtement par pulvérisation. Couvrir le plat pour éliminer la poussière qui s'installe sur les échantillons.
REMARQUE : Le tissu apparaîtra blanc après le séchage complet et les échantillons partiellement séchés auront l'air de couleur jaune, laisseront ces tissus dans le capot de fumée pendant une plus longue période. - Choisissez la taille des talons d'aluminium et du ruban adhésif au carbone par taille de l'échantillon analysé. Montez soigneusement les échantillons séchés sur un talon d'épingle en aluminium standard (12,7 mm x 8 mm) à l'aide d'un ruban conducteur en carbone à double bâton (12 mm).
- Introduire des échantillons montés dans la chambre du pelage pour enrober le spécimen d'une très fine pellicule d'or pour éliminer l'effet de charge. Plaque d'or les spécimens pour 60-120 s à un crasseurs de 35 mA.
- Montez les talons jusqu'aux plaques de pore correspondantes en attachant solidement les manches. Transférer le titulaire de l'échantillon dans ou hors de la chambre d'échantillon de SEM à l'aide de l'outil d'échange d'échantillons. Imagez les échantillons en mode à vide élevé avec une tension de faisceau accélérant de 10 kV et un courant d'émission de 10 A.
REMARQUE : Portez toujours des gants pendant la manipulation d'échantillons, les porte-échantillons, les talons de montage et les outils de transfert pour éviter la contamination par la graisse des mains vers le système SEM. - Testez d'autres techniques énumérées ci-dessous pour comparer la résolution des spécimens obtenus à partir de la procédure ci-dessus.
- Inclure une post-fixation avec 1% de tétroxyde d'osmium pendant 1 h à température ambiante après l'étape 1.7.
- Retirez partiellement ou complètement le HMDS à l'étape 1.10 pour une évaporation rapide et rapide du HMDS.
- Traiter les embryons après l'étape 1.8 à l'aide du séchage à points critiques (CPD) en suivant les étapes 3.3-3.4.
2. Préparation de la coquille d'œuf pour SEM à l'aide d'une méthode de séchage à l'air
- Recueillir et incuber les œufs de tortue peinte (Chrysemys picta) pour fixer les embryons tels que spécifiés dans les étapes 1.1-1.7.
- Conservez les coquilles d'œufs dans l'eau distillée après fixation de l'embryon à l'étape 2.1. Nettoyer soigneusement les coquilles d'œufs en trempant dans de l'eau distillée pendant au moins 1 h pour éliminer la contamination par le jaune et l'albumine.
- Coquilles d'œufs séchées à l'air après avoir lavé sur des lingettes antistatiques délicates dans le capot de fumée pendant la nuit. Conservez les coquilles d'œufs séchées dans des bouteilles de spécimens propres étiquetées par nombre et par stade.
- Montez, claquez le pelage et imagez les spécimens en suivant les étapes spécifiées dans les étapes 1.11-1.13.
3. Méthode critique de séchage de point pour préparer des cultures fongiques pour SEM
- Établir des cultures de diapositives
- Préparer des supports d'agar de dextrose de pomme de terre (PDA) pour les cultures fongiques : Ajouter 39 g de puissance PDA dans 1 L d'eau distillée dans un flacon Erlenmeyer. Bien mélanger en faisant tourbillonner le flacon et autoclaver le support à 121 oC pendant 30 min. Laissez refroidir la solution multimédia, puis ajoutez l'antibiotique chloramphenicol (25 g/mL) à l'aide d'une micropipette stérile.
REMARQUE : Après la stérilisation, la solution d'agar doit être chaude et elle ne se solidifiera pas bientôt. Refroidissez-le assez pour qu'il n'inactive pas les antibiotiques. - Mélanger en tourbillonnant et verser les assiettes (environ 10-12 ml de support pour chaque plat Petri de 10 cm), empiler soigneusement et laisser solidifier.
- Utilisez une lame de scalpel stérile pour découper de petits blocs d'agar d'environ 1/2 à 3/4 de pouce. Retirez et placez un bloc d'agar sur une lame de microscope en verre propre.
- Placez la lame dans un plat Petri propre pour prévenir la contamination et préserver l'humidité pendant l'incubation.
- Soulevez la glissière du fond du plat Petri à l'aide d'un cure-dent stérile pour créer une tension de surface entre la plaque et la glissière pour enlever la glissière de verre sans perturber la croissance délicate après l'incubation.
- Utilisez une boucle stérile ou une aiguille pour transférer certains des champignons de l'inoculum du spécimen à chacun des quatre côtés du bloc d'agar sur la diapositive.
- Placez un bordereau propre sur la surface du bloc d'agar après l'inoculation. Ajouter quelques gouttes d'eau distillée stérile au plat Petri autour de la glissière pour assurer l'humidité des champignons en croissance.
- Sceller la plaque en partie à l'aide d'un film de paraffine et incuber la plaque à 30 oC pendant une durée appropriée (pour les espèces de Fusarium couvent de 36 à 48 h).
- Retirez la glissière du plat Petri et séparez le bordereau bien adhéré du bloc d'agar à l'aide de forceps stériles. Fixer les blocs d'agar dans 3% de glutaraldéhyde dans PBS pendant la nuit à 4 oC.
- Préparer des supports d'agar de dextrose de pomme de terre (PDA) pour les cultures fongiques : Ajouter 39 g de puissance PDA dans 1 L d'eau distillée dans un flacon Erlenmeyer. Bien mélanger en faisant tourbillonner le flacon et autoclaver le support à 121 oC pendant 30 min. Laissez refroidir la solution multimédia, puis ajoutez l'antibiotique chloramphenicol (25 g/mL) à l'aide d'une micropipette stérile.
- Déshydrater les échantillons en passant par une série d'éthanol : 10 %, 25 %, 50 %, 75 % et 90 % avec 15 min par changement. Traiter les échantillons pour la déshydratation finale avec deux changements dans 100% d'éthanol d'une durée de 30 minutes chacun pour assurer une saturation complète.
- Séchage des points critiques : Placez les échantillons déshydratés dans la chambre de l'appareil CPD. Sceller et refroidir la chambre en ouvrant les vannes pour permettre au LIQUIDE CO2 d'entrer et d'évacuer l'éthanol, jusqu'à ce que le LIQUIDE CO2 remplisse complètement la chambre.
- Scellez et chauffez la chambre lentement pour atteindre un point critique lorsque la pression de la chambre dépasse 1000 psi et que la température dépasse 31 oC, la phase liquide et gazeuse du CO2 est en équilibre. Égoutter lentement le CO2 de la chambre et l'échantillon sous forme de gaz pour éviter les effets de la tension de surface.
- Effectuer le montage, le placage d'or et l'imagerie des spécimens en suivant les étapes spécifiées dans les étapes 1.11-1.13.
- Effectuez une analyse comparative en séchant chimiquement les spécimens à partir de l'étape 3.2 à l'aide du SMDHm en suivant les étapes 1.9-1.13.
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Representative Results
La figure 1 montre l'analyse micrographique électronique de balayage des embryons peints de tortue (Chrysemyspicta). Des œufs de tortue peints recueillis et incubés sur un support de literie, montés sur des talons d'aluminium à la suite d'un séchage chimique, ont été utilisés pour l'imagerie SEM (figure1A-E). Une vue latérale d'un embryon de stade 12 montre les structures craniofacial ; la proéminence maxillaire s'étend au-delà du mandibulaire et limite une fosse nasale bien marquée médially ; cinq arcs pharyngés ont également été observés (figure 1F). Les somites nouvellement formées à la région postérieure de queue de l'embryon sont facilement décomptées par rapport aux somites segmentées du corps. Les bourgeons des membres antérieurs semblent plus longs que les bourgeons des membres postérieurs et les points sont plus caudains que ventrales. Une excroissance bien définie d'une crête de carapace est observée le long de toute la région du flanc inter-membres de l'embryon de stade 15 (figure1G. Au stade 18, les tortues peintes possèdent un museau court et faiblement projetable. Le bec inférieur repose dans la mâchoire supérieure et est légèrement retourné avec un crochet terminal qui s'insère dans l'encoche centrale du bec supérieur (Figure 1H). La mâchoire supérieure des tortues peintes montre un aspect encoché formant une pointe distale médiale en forme de U-V avec une petite cuspide de chaque côté, une petite dent d'œuf commence à se former à l'extrémité de la mâchoire supérieure. Les bourgeons des membres qui sont apparus plus longtemps au cours des premiers stades forment une structure en forme de pagaie au cours des étapes 13-14 avec plaque numérique vaguement indiquée. Le mesenchyme des membres délimité par la crête ectodermale apanique est vu le long des marges antérieure-postérieures (figure1I-J).
La figure 2 montre l'analyse ultra-structurale de la coquille d'œuf et de la membrane de coquille de Chrysemys picta utilisant l'imagerie SEM. Des coquilles d'œufs de tortue peintes ont été obtenues comme décrit ci-dessus et ont été soumises au séchage à l'air après le lavage avec de l'eau distillée double (figure2A,B). Des coquilles d'œufs montées sur des talons d'aluminium avec du ruban de carbone recto-verso (figure 2C) ont été représentées à l'aide de SEM. Une vue latérale de la coquille a montré la couche d'oeufs caléolorique externe attachant fermement à la membrane filamentuse intérieure de coquille (figure 2D). La surface extérieure de la coquille d'œuf se compose d'unités de coquille minéralisées bien distinguées, faites de nodules globulaires/sphériques disposés en groupes et entre les unités de coquille adjacentes une concentration de petites dépressions arrondies ou de pores de différentes tailles ont été observée (Figure 2E). Nodules de chaque groupe d'unités shell se rencontrent à une jonction de connexion, le point central (Figure 2F). La surface extérieure a été pelée manuellement à l'aide de forceps pour observer la surface de la membrane de la coquille. Des rangées de plaques centrales ont été observées qui fournissent le point d'attache entre les unités de coquillage et la membrane fibreuse multicouche sous-jacente (figure 2G).
La figure 3 montre la caractérisation morphologique de l'isolat fongique ascomycete des cultures de diapositives observée à l'aide de la formation image SEM. Schéma de configuration de culture de diapositiveétabli (figure 3A) montrant la croissance fongique sur le bloc d'agar dans les deux jours de l'inoculation. Colonies se développant rapidement avec le mycélium aérien blanc à crème (figure3B). L'imagerie de SEM suivant le séchage critique de point et le revêtement de pulvérisation des tranches d'agar ont indiqué l'hyphe fongique, les conidies courbées, et le riz comme des spores. Des conidiophores ont été vus surgissant latéralement des hyphes aériens septates (figure 3C). Les macroconidies produites sur des conidiophores plus courts et ramifiés sont modérément courbées, avec des cellules basales courtes, émoussées et indistinctement pédicillées, principalement septates (Figure 3D).
La figure 4 montre les résultats comparatifs pour le traitement de spécimens similaires à l'aide de techniques alternatives. L'immersion des têtes d'embryons de stade 15 dans le SMD Et le séchage par évaporation graduelle montrent des structures craniofaciales bien préservées, presque aucun rétrécissement ou distorsion n'est observé avec des périodes prolongées d'évaporation lente du HMDS (Figure 4A). Les embryons post-fixés avec du tétroxide d'osmium n'ont montré aucune différence distinctive dans la qualité de l'image, sauf pour un léger rétrécissement des tissus par rapport au traitement lent du HMDS (Figure 4B). Le séchage des embryons en supprimant le SMDHm partiellement ou complètement permettant une évaporation rapide entraîne une distorsion et un rétrécissement structurels (figure 4C), tandis que l'évaporation lente résolvait d'excellentes structures de surface d'un embryon pare-tui de la même façon ( Figure 4 R). Les artefacts de séchage ont été vus dans les embryons traités avec la technique de LAC causant un rétrécissement et une destruction importants des tissus (figure4D,E). Les tranches d'agar des cultures de diapositives montrent un séchage incomplet de l'isolat fongique avec le traitement HMDS par rapport à la DPC (Figure F). Le séchage complet est réalisé avec le traitement de CPD des tranches d'agar avec un spécimen blanc bien séché montrant intact sépulcre s'agite à haute résolution des hyphes et des spores fongiques (figure4G-G'). Les blocs d'agar avec des cultures fongiques semblent rétrécis et jaunes en couleur, ce qui les rend inadaptés à l'imagerie SEM (Figure 4H-H').
Figure 1 : Numérisation de micrographies électroniques de Chrysemys picta embryons préparés par séchage chimique. (A) Chrysemys picta, nidifiant pendant la saison de reproduction à Rice Creek Field Station, Oswego, NY. (B) Nid bien construit de l'extérieur. (C) Sol de surface enlevé avec soin à l'exposition des œufs pondus. (D) Oeufs placés dans la chambre d'incubation avec milieu de literie. (E) Montage d'embryons sur des talons d'aluminium après le séchage chimique, E4 montrant l'embryon enduit par sputter. (F) Vue latérale de l'embryon de stade 12 montrant les structures faciales, les bourgeons des membres et les somites. (G) On voit des bourgeons de carapace bien définis et des bourgeons de membres en forme de pagaie au stade 15. (H) Structures craniofaciales de l'embryon de stade 18 montrant la mâchoire supérieure et inférieure, notez une petite dent d'œuf formée à l'extrémité du bec supérieur. (I) Vue dorsale de l'avant-garde droit à l'étape 13-14 et une vue rapprochée de l'AER (J) à la limite dorsal-ventrale. Barres d'échelle : F-H, 500 m ; I, 100 m, et J, 10 m. Keys: mb, midbrain; np, nl pit; mxp, maxillaire prominence; pa, pharyngeal arches; h, heart; fl, forelimb; s, somite; hl, hind limb; t, tail tip; cr, carapacial ridge; et, egg tooth; oc, oral cavity; e, eye; uj, upper jaw; , mâchoire inférieure; m, mesenchyme, AER, crête ectodermale apicale. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Analyses ultrastructurales de la coquille d'œuf séchée à l'air et de la membrane de coquille des œufs de tortue peints. (A) Après avoir fixé les embryons, les coquilles d'œufs ont été lavées à fond dans de l'eau distillée pour enlever le jaune et l'albumine. (B) Les coquilles d'œufs propres ont été séchées à l'air au moins pendant la nuit. (C) Montage d'une coquille d'œuf sur des talons d'aluminium. (D) Vue radiale du fragment de coquille montrant la couche caléale externe et la membrane intérieure de coquille. (E) La couche calcareuse extérieure montre des unités globulaires de coquille (su) disposées en groupes et pores vus entre ces unités (astérisques). (F) Vue agrandie d'une nodule montrant le point central (c) entre les unités de coquillage. (G) L'enlèvement de la couche de calcareous montre la surface extérieure de la membrane de coquille avec des dépressions laissées cassées des unités de coquille. Barres d'échelle : E, 100 m ; F, 10 m et G, 20 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Préparation de la culture fongique pour l'imagerie SEM. (A) Diagramme schématique pour montrer la configuration de la culture de diapositives. (B) Colonies fongiques de couleur blanche observées sur le bloc d'agar après deux jours d'incubation à 30 oC. (C) image SEM montrant une section de mycélium de Fusarium solani, astérisques noirs marquant la macroconidia en sporodochia, une flèche pointant vers le phialide, et des pointes de flèche dirigées vers la microconidia, barre d'échelle, 10 m. (D) Image magnifiée de chlamydospores septates, barre d'échelle 5 m. Clés : ab, bloc d'agar; cs, coverslip; f, culture fongique. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Analyse comparative des techniques alternatives pour traiter des spécimens similaires. (A) Vue frontale de la tête de tortue peinte séchée avec évaporation lente de HMDS (A), après la post-fixation avec le tétroxide d'osmium (B), évaporation rapide plus rapide de HMDS (C), et CPD (D-E). L'inclusion d'une étape post-fixation utilisant du tétroxide d'osmium ne montre aucune différence visible dans la qualité de l'image par rapport au traitement HMDS sans post-fixation. Les déformations sont observées après l'évaporation rapide du HMDS, tandis que le séchage progressif avec évaporation lente fournit une meilleure structure de surface. Différents degrés de rétrécissement et de structures effondrées sont observés dans les régions du cerveau, des yeux et des proéminences faciales chez les embryons traités par CPD. (F) Montage des cultures de diapositives traitées avec HMDS (1), CPD (2) et échantillon traité par scputter CPD (3) sur talons d'aluminium. (G-G') Séchage complet vu comme tranche d'agar de couleur blanche intacte avec inoculate fongique réalisé par CPD préservant les structures de mycélium fongique et les spores de Fusarium solani. (H-H') Un séchage inadéquat de la culture des toboggans, le rétrécissement et l'intégrité structurale endommagée observés avec la technique de préservation du SMD. Barres d'échelle : A-E, 500 m ; G-H, 2 mm, et G'-H', 20 m. Keys: et, dent d'oeuf; oc, cavité buccale; e, oeil; uj, mâchoire supérieure; lj, mâchoire inférieure; astérisques noirs, macroconidia en sporodochia; flèche, phialide; et des pointes de flèche, microconidia. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Dans notre étude, différents agents de fixation, méthodes de déshydratation et de séchage ont été testés pour préparer trois différents échantillons biologiques délicats pour l'imagerie SEM : embryons, coquilles d'œufs et cultures fongiques. SEM est couramment utilisé pour l'analyse de surface, de sorte que la pénétration fixative est moins préoccupante, mais il faut comprendre que les structures internes mal fixées causeront le rétrécissement vers l'intérieur ou / et les structures de surface effondrées. Le temps de fixation prolongé devrait également être considéré pour de plus grands échantillons de tissu, remplaçant la solution fixative quelques fois selon la durée de fixation. En raison de l'interaction active entre le fixatif et le tissu, les propriétés osmotiques des cellules changeraient considérablement. Les fluides tissulaires dilueraient le fixatif et ainsi un effet d'aldéhyde contribuant à l'osmolalité globale peut être négligé en ce qui concerne les effets sur le volume cellulaire. En outre, le formaldéhyde pénétrerait plus rapidement dans les tissus et est plus efficace que le lien croisé par rapport au glutaraldéhyde. Un mélange tamponné de formaldéhyde-glutaraldéhyde a été également rapporté pour fixer une grande variété de tissus, bien que pour des monocouches et des solutions diluées de suspensions de cellules étaient plus appropriés pour fixer15,16. Cependant, les solutions diluées sont également hypertoniques, donc les aldéhydes ne sont pas eux-mêmes osmotically active. Pour les échantillons délicats utilisés dans cette étude, PBS au pH 7.4 a été utilisé comme un véhicule pour les agents de fixation, comme les tampons de phosphate sont pensés pour être plus semblables aux environnements cytoplasmiques de la plupart des échantillons biologiques. De plus, l'osmolarité est identifiée comme se situer dans la plage physiologique requise pour l'échantillon, tandis que PBS agit comme véhicule pour l'agent de fixation. La post-fixation avec le tétroxide d'osmium est souvent recommandée pour divers échantillons biologiques16,22,42 mais a été éliminée pour tous les échantillons biologiques utilisés dans cette étude. Les échantillons sans tétroxide d'osmium ont donné des images nettes et des spécimens fixés avec du tétroxide d'osmium ont donné des résultats indiscernables (figure 4A). Le tétroxide d'osmium provoque une distorsion des structures des tissus foliaires et donne une plus faible conservation des spécimens par rapport au mélange de glutaraldéhyde et de formaldéhyde43, et il a été suggéré qu'une accumulation de molécules d'osmium pourrait inhiber l'infiltration de agents déshydrateurs et agents de transition utilisés dans la DPC, et les solvants comme hmDS utilisés pour le séchage chimique. L'effet est spécifique aux tissus et l'exclusion du tétroxide d'osmium n'aura aucun effet sur la qualité de l'image pour le type de spécimens délicats analysés dans cette étude. Pour d'autres types de tissus l'utilisation du tétroxide d'osmium peut être éliminée avec la fixation primaire prolongée.
Les spécimens d'embryons de tortues séchées HMDS présentaient des surfaces bien conservées et moins de distorsion ou de rétrécissement que la DPC (figure 4). CPD minimise les risques de distorsion dans la morphologie cellulaire et la production d'artefacts en raison de la tension de surface nulle ou minimale créée au cours du processus. Cependant, la DPC peut causer un danger physique potentiel pour les échantillons fragiles délicats. Conformément à notre observation, HMDS a donné une imagerie similaire ou de meilleure qualité en minimisant la tension de surface causée par le séchage basé sur des études antérieures publiées44,45,46,47. Par rapport au traitement DEP, HMDS a conservé les détails structurels du maillage organique excellent dans les bivalves gravés et les coquilles de barnacle48 et a fourni la haute résolution des dispositifs structurels de l'organisation interne complexe de mermithid nématodes49 et les tissus internes d'insectes28. Les artefacts de la plaque de séchage ont été vus en grande quantité sur les spécimens préparés par la technique CPD par rapport à la technique HMDS. Les taches de membrane et les artefacts de granulés ont été augmentés dans les cellules cervicales préparées en utilisant la technique de CPD50. HMDS réagit avec l'eau pour produire de l'hexaméthyldisiloxane et de l'ammoniac, qui s'évaporent tous deux de l'objet. HMDS est couramment utilisé dans la chromatographie gazeuse pour créer des étherins de silyl de composés tels que les sucres, les acides aminés, les alcools, et de nombreux autres composés. On ne sait pas si HMDS réagit avec certains de ces composés dans les tissus. HMDS pourrait relier les protéines et raidir le tissu pendant le processus de séchage28, bien que la raison exacte pour laquelle HMDS fournit une meilleure préservation des embryons ne pouvait pas être expliquée, sauf pour la spécificité des tissus. Sur la base des résultats de notre recherche, CPD a causé le rétrécissement étendu comparé au HMDS, et est beaucoup plus approprié pour traiter des tissus embryonnaires, particulièrement pour analyser la structure de surface pour les embryons tôt mis en scène. Le mécanisme par lequel HMDS travaille sur le séchage des tissus n'a pas été élucidé, bien que le séchage lent avec évaporation progressive dans un environnement anhydre absolu pourrait être une raison pour obtenir une excellente structure de surface des animaux.
De petits morceaux de blocs d'agar avec des colonies fongiques de cultures de diapositives précédemment établies ont été utilisés dans cette étude pour éviter les problèmes avec le maintien de la peluche d'origine du tapis mycélial. Le séchage de la DPC des morceaux d'agar avec des colonies fongiques a eu un effet de lavage, tandis que les changements dans les fixatifs, les tampons, et l'éthanol s'est avéré être un meilleur choix surmontant les difficultés avec le séchage de congélation. Le HMDS qui fonctionne bien pour les embryons de toutes les étapes n'a pas été en mesure de résoudre les cultures fongiques, tandis que le séchage à l'air avec HMDS posait un problème important : se recroqueviller et perdre la rigidité structurelle. Bien que la DPC fonctionne bien pour les cultures fongiques, elle a induit des dommages instantanés aux embryons en particulier aux premiers stades de développement, causant un rétrécissement à la surface. Aucun factice de chargement ou de séchage n'a été observé lorsque le HMDS et le CPD ont été utilisés pour les embryons et les cultures fongiques, respectivement. Pour les tissus rigides comme la coquille d'œuf des tortues, aucun traitement spécial n'est nécessaire, sauf pour le lavage et le séchage à l'air à température ambiante avant le montage pour l'imagerie.
Indépendamment de la méthode de préparation, des étapes graduelles de gradient d'éthanol devraient être employées pour réduire le potentiel pour desartefacts de séchage. Au départ, les échantillons de SDM et de DPC présentaient des artefacts de surface dont le rétrécissement suivait les protocoles de déshydratation et de séchage disponibles dans la littérature. Après une série de normalisations, nous avons déterminé que les artefacts étaient le résultat de la déshydratation de l'alcool. Il est essentiel d'utiliser un processus de déshydratation lente en utilisant des augmentations plus graduelles de l'éthanol pendant la déshydratation. En outre, la durée de chaque itération devrait être plus longue pour les embryons par rapport aux cultures fongiques. De plus, une étape supplémentaire à 100 % d'éthanol a permis d'assurer une saturation uniforme complète. Les SMDC peuvent être enlevés complètement ou partiellement pour permettre le séchage à l'air des échantillons, mais une exposition prolongée au SMDH et un séchage graduel de l'air par évaporation se sont avérés efficaces pour les embryons afin d'éviter les perturbations (figure 4A,C) causées par une grande surface tension observée pour l'attachement des cellules microbiennes51. L'immersion de spécimens dans le SMDEt et le séchage lent pendant la nuit ont révélé une excellente structure de surface chez l'espèce Daphnia52, ce qui suggère que les tissus mous et délicats pourraient bénéficier du processus de séchage lent. La qualité d'image acceptable pour les embryons peut être obtenue avec un séchage chimique lent en augmentant progressivement la concentration de HMDS à l'éthanol après déshydratation.
Tous les échantillons ont été montés sur des talons d'aluminium à l'aide d'un ruban de carbone recto-verso pour fournir une surface conductrice, une fine couche de vernis à ongles incolore pourrait également être utilisée si le même échantillon doit être représenté dans une orientation différente. Les échantillons peuvent être facilement retirés des talons lorsque le vernis à ongles est utilisé sur la surface du talon et le positionnement des échantillons dans des plans alternatifs est possible par rapport à l'utilisation de ruban carbone recto-verso. Comme les échantillons ne sont pas supraductifs, il est nécessaire de cracher une fine couche de métal sur les échantillons pour augmenter la conductance. Une cible d'or a été utilisée dans cette étude pendant le revêtement de pulvérisation, et l'or-palladium donne également des résultats similaires évitant des effets de charge. La tension correcte du faisceau dépend de l'échantillon, pour les spécimens légèrement enduits, l'imagerie avec une émission de champ SEM à 2-5 kV fournira une bonne définition des structures de surface. Pour les tissus avec un revêtement adéquat, 5 kV fournit généralement un meilleur signal sans plus de pénétration du faisceau. Pour les spécimens qui manquent de profondeur et sont recouverts d'or seul, l'imagerie à une tension plus élevée (10 kV) a permis une meilleure visualisation de la topographie de surface.
La préparation de tissus délicats pour le SEM pose des défis particuliers, et une gamme de techniques de préparation d'échantillons peut être utilisée pour surmonter et minimiser les artefacts d'imagerie. Nous fournissons des méthodes complètes pour traiter trois différents échantillons de tissus biologiques délicats, pour l'imagerie SEM: embryons, coquilles d'œufs rigides, et les cultures fongiques. Dans notre recherche, des modifications subtiles aux méthodes populaires disponibles des études précédemment éditées ont été faites, et nous avons identifié les méthodes de déshydratation et de séchage les plus appropriées spécifiques à chaque type de tissu délicat. Ces protocoles pourraient être adaptés pour obtenir une qualité d'image SEM acceptable à partir d'échantillons biologiques similaires.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler
Acknowledgments
Les auteurs tient à remercier le Dr Daniel Baldassarre, SUNY Oswego pour les discussions et commentaires utiles sur le manuscrit. Cette étude a été appuyée par Rice Creek Associate Grants, Oswego; Challenge Grants SUNY Oswego and National Science Foundation (NSF) Small Grants to PGL and JG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Fischer Scientific | S25127A | for slide cultures |
| Aluminum pin stub | Tedpella | 16111 | 12.7 mm x 8 mm |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: Potato Dextrose Agar | BD 213400 | DF0013-17-6 | Media for isolation and cultivation of Fungi, yeast and molds |
| Chloramphenicol | Fischer BioReagents | BP904-100 | Antibiotic for media |
| Coarse Vermiculite | Greenhouse Megastore | SO-VER-12 | bedding medium |
| Clear 12- well plate | Corning | 07-201-589 | for fixing embryo |
| Coverslips | Fischer Scientific | S17525B | for slide culture |
| Critical Point Dryer | Quorum CPD | EMS850 | critical point drying |
| Culture dishes | Fischer Scientific | 08 747B | DISH PETRI 100X10MM 12/PK |
| Ethanol | Fischer Scientific | A406P 4 | dehydration agent |
| Forceps- Aquarius Tweezers | Tedpella | 5804 | style 4, length 108mm, widh x thickness 0.017 x 0.17 mm |
| Glutaraldehyde | Fischer Scientific | G151-1 | fixative |
| Gold target for sputter coater | DENTON VACUUM | TAR001-0158 | Gold Target, 2.375″ D X .002″ |
| Hexamethyldisilazana | Fischer Scientific | C19479-5000 | chemical drying agent |
| Kim wipes | Kimtech | S-8115 | cleaning |
| Microscope slides | Thermo Scientific | 67-762-16 | for slide culture |
| Microscopy Scissors | Tedpella | 1327 | Double pointed, stainless steel, 100 mm L (3-5/8"). |
| Micro-scissors | Tedpella | 1346 | Vannas-type, straight, 80mm L |
| Moria Perforated Embryo Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Length 14.5 cm, tip diameter 20 mm, spoon depth 5 mm |
| Netwell Inserts | Corning | 0330B09 | 15 mm Inserts with 74 µm Mesh Size Polyester Membrane act as handy carriers during specimen processing into different solvents |
| Paraformaldehyde | Fischer Scientific | T353 500 | fixative |
| Peat moss | Walmart- Miracle Gro | 551705263 | bedding medium |
| PELCO tabs double stick carbon conductive tape | Tedpella | 5000 | 12 mm OD |
| Sputter coater | DENTON VACUUM | DESK V | thin metal coating |
| SEM | JEOL USA | JEOL JSM 6610LV scanning electron scope | electron microscopy |
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