Summary
Hier presenteren we gedetailleerde verwerkingsprotocollen voor Imaging delicate weefselmonsters met behulp van scanning elektronenmicroscopie (SEM). Drie verschillende verwerkingsmethoden, namelijk hexamethyl disilazana (HMDS) chemisch drogen, eenvoudige lucht drogen en het drogen van kritische punten worden beschreven voor het bereiden van stijve eierschalen, embryo's in vroege ontwikkelingsstadia en schimmel culturen respectievelijk.
Abstract
Hoewel Scanning elektronenmicroscopie (SEM) op grote schaal wordt gebruikt voor de ultra-structurele analyse van verschillende biologische en niet-biologische monsters, omvatten de methoden die betrokken zijn bij de verwerking van verschillende biologische monsters unieke praktijken. Alle conventionele praktijken beschreven in de literatuur voor het verwerken van monsters nog steeds nuttige toepassingen, maar subtiele veranderingen in de monstervoorbereiding kunnen de beeldkwaliteit veranderen, evenals, introduceren artefacten. Daarom is het gebruik van een unieke monster voorbereidings techniek specifiek voor het type weefsel geanalyseerd nodig om een beeld van goede kwaliteit te verkrijgen met een ultrastructurele resolutie. De focus van deze studie is het bieden van de optimale monster voorbereidings protocollen voorbeeld vormende embryo's, stijve eierschalen en schimmel culturen met SEM. De volgende optimalisaties werden aanbevolen om goede resultaten te opleveren voor de drie verschillende onderzochte delicate biologische monsters. Het gebruik van mildere Fixatieven zoals 4% Paraformaldehyde of 3% Glutaaraldehyde gevolgd door uitdroging met ethanol serie is verplicht. Schimmel mycelium op agar-blokken verkregen door diaculturen levert een betere ultrastructurele integriteit op in vergelijking met culturen die rechtstreeks uit agar-platen worden genomen. Chemisch drogen van embryo's met HMDS zorgt voor droging zonder oppervlaktespanning artefacten te introduceren in vergelijking met kritische punt droging. HMDS voorkomt barsten veroorzaakt door krimp omdat monsters minder broos zijn tijdens het drogen. Voor de schimmel cultuur zorgt het drogen van kritische punten echter voor een acceptabele beeldkwaliteit in vergelijking met chemisch drogen. Eierschalen kunnen worden afgebeeld zonder speciale voorbereidingsstappen, behalve voor grondig wassen en drogen van de lucht voorafgaand aan de montage. Voorbereidings methodieken werden gestandaardiseerd op basis van aanvaardbare beeldkwaliteit verkregen bij elke proef.
Introduction
Scanning elektronen microscoop (SEM) ultrastructurele analyse en intracellulaire Imaging supplement Lichtmicroscopie voor driedimensionale profilering van prokaryoten, planten en dieren. De hoge ruimtelijke resolutie van een SEM maakt het een van de meest veelzijdige en krachtige technieken die beschikbaar zijn voor het onderzoeken van microstructurele kenmerken van specimens op de nanometer tot micrometer schaal. Gedroogde specimens worden herleid tot samenstellings-en topografische structuren met intense Details, die de basis vormen voor het ontwikkelen van geldige conclusies over functionele relaties1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9. bij het INTERPRETEREN van SEM-afbeeldingen van biologische specimens, is het een grote uitdaging om onderscheid te maken tussen inheemse structuren en de artefacten die tijdens de verwerking worden gemaakt. SEM wordt over het algemeen gebruikt bij zeer hoge stofzuigers om interferentie te voorkomen van gasmoleculen die de primaire, secundaire of backverstrooide elektronenstralen van het monster10,11aantasten. Ook zijn biologische materialen vatbaar voor stralings schade door hun slechte of niet-geleidende eigenschappen. Het is van essentieel belang dat de in het SEM geladen specimens volledig droog zijn en vrij zijn van organische verontreinigingen om eventuele Uitgassen in een hoge vacuüm omgeving van10,11te elimineren. Aangezien biologische specimens meestal uit water bestaan, zijn er aanvullende preparatieve technieken nodig om ervoor te zorgen dat de inheemse structuren behouden blijven.
De verkregen resolutie is gebaseerd op het optimaliseren van bereidingsmethoden specifiek voor specimen types en instrumentale parameters gebruikt. Dus, is het noodzakelijk om te voorkomen dat het gebruik van gegeneraliseerde verwerkingsstappen voor alle weefsel typen. Sommige biologische specimens vereisen minder strenge verwerking om hun structuur te behouden, terwijl er meer tijd en zorg nodig kan zijn voor delicate soorten monsters om de invoering van droog artefacten, zoals krimp en ineenstorting, te voorkomen. Monstervoorbereiding is een cruciale stap in SEM-beeldvorming; de bevindingen van Morfometrische studies zijn opmerkelijk beïnvloed door preparaat bereidings procedures12,13. Veelgebruikte voorbereidingsstappen voor veel biologische monsters zijn fixatie, uitdroging en coating met een metaal zoals goud, platina of Palladium om hun oppervlakken te converteren naar geleidende voor SEM-analyse. De aard en combinatie van de gebruikte stappen zal variëren afhankelijk van het type van het weefsel, en de specifieke doelstellingen van de studie. De opbouw van de lading, gevoeligheid voor vacuüm-en elektronenstraal schade vormen problemen bij het verwerken van zachte delicate biologische monsters, wat extra verwerkingsstappen vereist om de inheemse structuur van het object te behouden. Met behulp van conventionele methoden zoals osmium tetroxide Fixing, en uitdroging veroorzaken krimp en de ineenstorting van delicate weefsels14,15,16,17. Het doel van de studie is het opzetten van elegante methodologieën die zijn afgeleid door het combineren van ideeën uit eerdere studies met aanpassingen om zachte delicate weefsels voor te bereiden en te maken (bijv. reptielen embryo's, eierschalen van geschilderde schildpadden en schimmel culturen).
Selectie van een geschikte bevestigingsmethode is de eerste belangrijkste stap voor microscopische analyse van biologische specimens. Het is essentieel om de weefsels onmiddellijk na het isoleren van een organisme te fixeren om veranderingen in hun morfologie als gevolg van ontleding te voorkomen. Een effectieve fixatie moet cellulaire processen beëindigen door de cellen snel te doordringen en het effect onomkeerbaar te houden om de structuur van het monster te stabiliseren om zowel de volgende verwerkingsstappen te weerstaan als het onderzoek onder de SEM17 , 18. Hoewel verschillende chemische en fysische fixatie methoden bekend zijn, wordt chemische fixatie vaker gebruikt voor biologische specimens om cellulaire veranderingen als gevolg van autolyse, putrefactie en droog effecten te voorkomen. Er zijn talrijke fixatieve chemische formuleringen besproken in de literatuur17,19,20,21,22,23, fixeermiddelen die werken door denaturering en stolling van biologische macromoleculen, en die die repareren door covalent cross-linking macromoleculen. Alcoholen worden gebruikt als denaturerende fixeermiddelen die ultra structuur zeer slecht behouden en worden meestal gebruikt voor lichte microscopie en niet aanbevolen voor elektronen microscopische analyse. Kruislings verbindende Fixatieven zoals formaldehyde, glutaraldehyde en osmium tetroxide creëren intermoleculaire en intramoleculaire crosslinking tussen macromoleculen binnen de weefsels, wat een uitstekend behoud van ultra-structuren oplevert11 ,24,25,26. Biologische monsters zijn gevoelig voor temperatuur. De temperatuur aan het begin van de fixatie wordt aanbevolen om 4 °C te zijn om de laterale mobiliteit van membraan proteïnen te verminderen, om de diffusie van intercellulaire moleculen te vertragen en om de snelheid van fixatie te vertragen11. De tijd die nodig is voor de vaststelling van weefsels hangt grotendeels af van de grootte van het monster en de snelheid waarmee de fixatie diffitert en reageert met de componenten van het preparaat. Een overnachting fixatie in 4% Paraformaldehyde of 3% Glutaaraldehyde in PBS bij 4 °C is de voorkeursmethode voor SEM-analyse van specimens die in deze studie worden gebruikt voor hun sequentiële penetratieve eigenschappen, waardoor kleinere delicate monsters kunnen worden verwerkt17 , 18 , 19 , 20 , 27. een post-fixatie stap met osmium tetroxide wordt niet alleen geëlimineerd vanwege zijn toxische aard, maar heeft ook tot gevolg dat er geen bijkomend voordeel wordt toegepast om de beeldkwaliteit te verbeteren voor de monsters die in deze studie worden geanalyseerd.
Biologische monsters bevatten vloeistoffen die interfereren met de SEM-werking; Vandaar dat de monsters moeten worden gedroogd voordat ze in de SEM-monsterkamer worden ingevoegd. Zodra uitdroging is verzekerd, moet het oplosmiddel uit het weefsel worden verwijderd zonder artefacten in de specimens te maken vanwege de oppervlaktespanning/droging. Drie verschillende droog methoden werden vaak gebruikt tijdens het verwerken van weefsels voor SEM-beeldvorming: luchtdroging, het drogen van kritische punten en vriesdrogen monsters28,29,30,31. Weinig studies rapporteren alle drie droog methoden die identieke resultaten produceren met dierlijk weefselmonsters28,29,30,31. Een algemene praktijk die voor kleinere specimens wordt gebruikt, zijn chemische uitdroging door oplopende concentratie Series alcohol en Hexamethyldisilazaan (HMD'S), maar grotere specimens worden gedroogd met behulp van een kritisch punt drogen (CPD) instrument32. Tijdens het droogproces worden aanzienlijke krachten gevormd in kleine holten die door een vloeistof/gasinterface door het preparaat worden doorgegeven; Dit kan zelfs leiden tot een volledige ineenstorting van de holle structuren33. Elke vervorming die optreedt als gevolg van de behandeling kan dan worden verward als een native structureel kenmerk van het preparaat. Zo moet het gegeneraliseerde fenomeen voor de verwerking worden geëlimineerd en moet een uniek droogproces worden gestandaardiseerd voor elk type weefsel, vooral wanneer delicate weefselmonsters worden geanalyseerd.
In verschillende proeven uitgevoerd met behulp van verschillende combinaties van alle bovengenoemde processen, we gestandaardiseerd de methoden die kunnen worden gebruikt voor SEM analyse van drie delicate weefsels: reptielen embryo's, eierschalen van geschilderde schildpadden, en schimmel culturen. Ontwikkelingsbiologen en morfologen beschrijven normale en abnormale morfogenese tijdens de ontwikkeling van embryo's bij representatieve gewervelde dieren. Onderzoeken naar gensignalerings trajecten hangen af van de morfologische beschrijving van nieuwe structuren. Om een abrupte verandering in de gewervelde embryo structuur te voorkomen tijdens SEM-analyse, raden we aan chemisch drogen na uitdroging. Chemisch drogen met HMDS is de relatief nieuwste droogmethode en de voordelen zijn relatieve snelheid, gebruiksgemak, verloren kosten en de beperkte expertise en uitrusting die nodig is9. CPD is een veelgebruikte droogtechniek met behulp van afdraaien co2 over de specimens bij een specifieke temperatuur en druk. We identificeerden dat HMDS geschikt is voor het drogen van zachte delicate weefsels en maakt het mogelijk grotere monsters te verwerken in vergelijking met kritische punt droging, wat een uitgebreide vervorming van embryonale weefsels veroorzaakte. Er zijn verschillende methoden gebruikt om monsters voor SEM-beeldvorming voor te bereiden om de morfologische kenmerken van schimmels34te bestuderen. Schimmel preparaten worden vaak vastgesteld in osmium tetroxide, gevolgd door ethanol uitdroging en kritische punt droging, wat bevredigende resultaten kan opleveren, hoewel de toxische effecten van osmium tetroxide6,7,35 en het verliezen van schimmel materialen terwijl het veranderen van oplossingen tijdens de verwerking zijn uitgesproken nadelen. De monster bereidingstechniek met behulp van lucht drogen zonder fixatie is ook beoefend36 maar resulteert in gekrompen en ingeklapte structuren, en observatie van dergelijke specimens kan gemakkelijk worden geïnterpreteerd terwijl het karakteriseren van de soort. Schimmel hypha verliest zijn integriteit in contact met vloeistoffen en een gelijkmatige droging kan niet worden bereikt om de structuur te herstellen. Als gevolg van dit effect, vriesdrogen wordt vaak gebruikt voor het drogen van zachte weefsels zoals schimmel mycelium. Vriesdrogen werkt goed voor schone materialen, maar de aanwezigheid van zouten of secretie zal het oppervlak detail dat alleen in de SEM-kijk fase zal worden geïdentificeerd, verhullen. We koppelden de Slide Culture Method met Glutaaraldehyde bevestiging en kritische punt droging om structurele details van intacte schimmel schimmeldraden en sporen te geven. Hoewel het drogen van CPD veroorzaakt krimp in embryo's, resulteerde het in goed bewaard gebleven myceliële structuren in combinatie met Glutaaraldehyde fixatie. De eierschaal is van primair belang voor het embryo van ovipareuze dieren door niet alleen als beschermende bekleding te fungeren, maar ook mechanische stabiliteit, permeabiliteit aan gas en water, en een calcium reserve voor het zich ontwikkelende embryo te bieden. Zoet waterschildpad eierschalen worden geclassificeerd als "rigide" op basis van hun structuur, en vanwege hun beschikbaarheid hebben aanzienlijke aandacht gekregen van biologen1,2,3,4 , 5 , 6 , 7 , 37 , 38.
We detail eenvoudige methoden voor eenvoudig onderzoek van de eierschaal en shell membranen van geschilderde schildpad die kan worden toegepast op elke stijve eierschaal soorten. Voorbereidings methoden werden geëvalueerd op basis van de resulterende beeldkwaliteit en verminderde potentiële artefacten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: geschilderde schildpad (Chrysemys picta) eieren gebruikt in deze studie werden verzameld tijdens het broedseizoen van mei tot en met 2015-16 juni van Rice Creek Field Station, Oswego New York met toestemming verkregen van de New York staat ministerie van milieu Instandhouding (DEC).
1. chemische droogmethode voor het verwerken van embryo's voor SEM
- Verzamel schildpadeieren van veld plaatsen tijdens het broedseizoen. Maak de incubatie kamers vooraf klaar, gemaakt van plastic dozen met deksels (L x b x H) 6,7 cm x 25,4 cm x 10,2 cm gevuld met strooisel medium, bereid met een vochtig mengsel van vermiculiet en turf mos (1:1 verhouding). Maak 4-6 gaten van ongeveer 0,25 cm langs de zijkanten van de dozen en op het deksel om beluchting mogelijk te maken.
- Verwijder voorzichtig de aarde van het nest om de eieren te onthullen. Veeg het oppervlak van schildpadeieren met verdunde jodium tinctuur (1:25000) om microbiële besmetting te beheersen tijdens de incubatie. Plaats de klauwen gescheiden van elkaar, koppelings grootte van geschilderde schildpad kan variëren van 5-9 eieren en plaats een maximum van 8-9 eieren per doos.
Let op: zorgvuldig omgaan met de eieren tijdens het verzamelen, vegen, labelen en plaatsen in de dozen. De positie en de uitlijning van de eieren moeten dezelfde zijn als ze werden gelegd, elke beweging zal de embryonale ontwikkeling remmen. - Leg de eieren met de helft in het strooisel, dek af en plaats de doos in de incubator op 30 °C. Incuberen de eieren gedurende 10-17 dagen om de embryonale stadia 12, 13 en 18 te verkrijgen die in dit onderzoek zijn gebruikt. Voeg om de andere dag gedestilleerd water toe om het strooisel medium deels nat te maken om uitdroging te voorkomen en het vochtgehalte voor de normale ontwikkeling van de embryo's te handhaven.
Opmerking: incubatie-en faserings embryo's zijn volgens een volledige ontwikkelings tabel die eerder is gepubliceerd39. - Bevestig de embryo's door de eerste snede aan de ene kant van de rugeier en het dooier membraan samen te maken, verticaal naar de lange as met een puntige schaar. Steek de schaar voorzichtig in de dooier om te voorkomen dat de embryonale schijf wordt snijden. Snijd nu de laterale zijde van de Egg langs de lange as en snijd vervolgens de andere kant van de Egg langs de korte as.
- Pel het uitgesneden stuk met de embryo zijde omhoog met behulp van een tang. Snijd de andere laterale zijde van de eierschaal en plaats het uitgesneden stuk in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS bij een pH van 7,4).
Let op: het schildpad ei is gevuld met zeer viskeuze eigeel en de rugzijde van het embryo houdt zich aan het eierschaal membraan. Het eierschaal membraan in de buurt van het embryo verandert met de incubatie van doorschijnend wit tot een ondoorzichtig, krijtachtig wit. Dit maakt het mogelijk om het embryo te lokaliseren in het midden van de lange as en te worden gezien als een donkere verkalkte vlek van de buitenkant40,41. - Gebruik een stereomicroscoop om de embryo's samen met het dooiermembraan te isoleren door ze uit de eierschaal te schillen met behulp van een tang. Verwijder extra-embryonale membranen met behulp van een tang en een micro-schaar. Breng het embryo met behulp van een embryo lepel naar verse PBS in een Petri schaaltje om een bloed of dooier te wassen.
- Gebruik duidelijke 12-well platen om de embryo's 's nachts op te lossen in 4% Paraformaldehyde in PBS bij 4 °C of in 2-3% Glutaaraldehyde in PBS. Plaats één tot drie embryo's in elke put, afhankelijk van de grootte van de embryo's. Zorg voor een volledige infiltratie (monsters zullen wit verschijnen) voor oudere embryo's door verlenging van de fixatietijd gedurende 2-3 dagen. Spoel embryo's 3x met verse PBS gedurende 5 min. elke spoeling.
Opmerking: Vermijd beschadiging van het oppervlak van het embryo door gebruik te maken van polystyreen wisselplaten met polyester gaas bodems voor 12-well platen om specimens van het ene oplosmiddel naar het andere over te brengen. - Dehydraat monsters met een reeks ethanol concentratie in gedistilleerd water: 30%, 50%, 70%, 80%, 95% en 100% en behandel monsters voor 1 uur in elke dehydratie oplossing. Herhaal de stap met 100% ethanol tweemaal om volledige uitdroging te garanderen. Als het niet onmiddellijk wordt gebruikt, bewaar monsters in 70% ethanol bij-20 °C gedurende een langere periode.
- Droge embryo's met een reeks hexamethyldisilazana (HMDS) tot 100% ethanol concentratie: 1:2, 2:1 en 100%. Laat de monsters gedurende 20 minuten in elke oplossing liggen en houd de Petri schaal gedeeltelijk bedekt tijdens het proces.
Opmerking: Voer alle stappen met betrekking tot hmdd's in de rook afzuigkap uit met de nodige persoonlijke beschermingsmiddelen, aangezien HMDS zeer giftig is. - Laat de embryo's in de uiteindelijke 100% HMDS-oplossing volledig of gedeeltelijk in een rook afzuigkap vallen, 's nachts in de verdamping van HMDS, waardoor monsters klaar zijn voor montage en sputteren coating. Dek de schaal af om stof te elimineren die over de monsters komt.
Opmerking: het weefsel zal wit verschijnen na het volledig drogen en gedeeltelijk gedroogde monsters zullen er geel uitzien in kleur, laat deze weefsels in de rook afzuigkap voor een langere tijd. - Kies de grootte van aluminium en Carbon plakband per grootte van het geanalyseerde monster. Monteer de gedroogde monsters zorgvuldig op een standaard aluminium PIN stub (12,7 mm x 8 mm) met behulp van dubbele stok Carbon geleidende tape (12 mm).
- Introduceer gemonteerde monsters in de kamer van de sputteren coater om het specimen met een zeer dunne film goud te Coat om het laad effect te elimineren. Gouden plaat de specimens voor 60-120 s bij een 35 mA sputter.
- Bevestig de boktor aan de bijbehorende poriën platen door de schroeven stevig aan te bevestigen. Breng de monsterhouder in of uit de bemonsterings kamer van SEM met behulp van het monster uitwisselings gereedschap. Beeld de monsters in hoge vacuümstand met een versnelde bundel spanning van 10 kV en emissie stroom 10 μA.
Let op: Draag altijd handschoenen tijdens het hanteren van samples, samplehouders, montage materiaal en overdrachts gereedschappen om vetvervuiling van handen naar het SEM-systeem te voorkomen. - Test alternatieve technieken die hieronder worden opgesomd om de resolutie te vergelijken van specimens die van de bovenstaande procedure zijn verkregen.
- Een post-fixatie met 1% osmium tetroxide voor 1 uur bij kamertemperatuur na stap 1,7 opnemen.
- Gedeeltelijk of volledig verwijderen van de HMDS bij stap 1,10 voor snelle snelle verdamping van hmd's.
- Verwerk embryo's na stap 1,8 met behulp van kritische punt droging (CPD) door stappen 3.3-3.4 te volgen.
2. bereiding van de eierschaal voor SEM met behulp van een luchtdroog methode
- Verzamel en broed de geschilderde schildpad (Chrysemys picta) eieren om de embryo's op te lossen zoals aangegeven in de stappen 1.1-1.7.
- Bewaar eierschalen in gedistilleerd water na embryo fixatie in stap 2,1. Reinig de eierschalen grondig door gedurende ten minste 1 uur in gedistilleerd water te weken om de verontreiniging van dooier en albumine te elimineren.
- Lucht-droge eierschalen na het wassen op delicate Antistatische doekjes in de rook afzuigkap 's nachts. Bewaar gedroogde eierschalen in schone specimen flessen gelabeld op nummer en podium.
- Monteer, sputteren vacht en afbeelding de specimens door de stappen te volgen die zijn gespecificeerd in stappen 1.11-1.13.
3. drogings methode met kritische punt voor de bereiding van schimmel culturen voor SEM
- Diaculturen instellen
- Prepareren van aardappeldextrose agar (PDA) media voor schimmel culturen: Voeg 39 g PDA-vermogen toe in 1 L gedestilleerd water in een erlenmeyer kolf. Meng goed door de kolf te zwengelen en de media gedurende 30 minuten op 121 °C te autoclaven. laat de media oplossing afkoelen en voeg vervolgens het antibioticum chlooramfenicol (25 μg/mL) toe met een steriele micro pipet.
Opmerking: na sterilisatie moet de agar-oplossing heet zijn en zal deze niet snel stollen. Koel het voldoende af zodat het de antibiotica niet zal inactiveren. - Meng het door wervelende en giet platen (ongeveer 10-12 mL van de media voor elke 10 cm Petri schaaltje), voorzichtig stapelen en laten stollen.
- Gebruik een steriel scalpel blad om kleine blokken agar te knippen van 1/2 tot 3/4 van een inch. Verwijder en plaats een agar-blok op een schone glazen Microscoop-dia.
- Plaats de glijbaan in een schone Petri schaal om verontreiniging te voorkomen en vocht te bewaren tijdens de incubatie.
- Verhoog de glijbaan van de bodem van de Petri schaal met behulp van een steriele tandenstoker om de oppervlaktespanning tussen de plaat en de glijbaan te creëren om de glazen glijbaan te verwijderen zonder de delicate groei na incubatie te verstoren.
- Gebruik een steriele lus of een naald om enkele schimmels van het preparaat-entmateriaal over te brengen naar elk van de vier zijden van het agar-blok op de glijbaan.
- Plaats een schone dekslip op het oppervlak van het agar-blok na de inoculatie. Voeg een paar druppels steriel gedestilleerd water toe aan de Petri schaal rond de glijbaan om vocht te verzekeren voor de groeiende schimmels.
- Sluit de plaat gedeeltelijk af met behulp van paraffine folie en inbroed de plaat op 30 °C gedurende een passende tijdsduur (voor Fusarium -soorten die voor 36 tot 48 uur worden geïnininend).
- Verwijder de glijbaan van de Petri schaal en scheid de strak vastgehouden dekslip van het agar-blok met een steriele Tang. Bevestig de agar-blokken in 3% Glutaaraldehyde in PBS 's nachts bij 4 °C.
- Prepareren van aardappeldextrose agar (PDA) media voor schimmel culturen: Voeg 39 g PDA-vermogen toe in 1 L gedestilleerd water in een erlenmeyer kolf. Meng goed door de kolf te zwengelen en de media gedurende 30 minuten op 121 °C te autoclaven. laat de media oplossing afkoelen en voeg vervolgens het antibioticum chlooramfenicol (25 μg/mL) toe met een steriele micro pipet.
- Dehydraat de monsters door een ethanol serie te passeren: 10%, 25%, 50%, 75% en 90% met 15 min per verandering. Verwerk de monsters voor de uiteindelijke uitdroging met twee veranderingen in 100% ethanol van 30 minuten per stuk om volledige verzadiging te garanderen.
- Drogen van kritische punten: plaats gedehydrateerde monsters in de kamer van het CPD-apparaat. Seal en koel de kamer door het openen van de kleppen om vloeistof CO2 in en ventilatie ethanol uit, totdat vloeistof co2 volledig vult de kamer.
- Seal en verwarm de kamer langzaam om een kritisch punt te bereiken wanneer de druk van de kamer hoger is dan 1000 psi en de temperatuur hoger is dan 31 °C, is de vloeibare en gasfase van CO2 in evenwicht. Giet langzaam de CO2 uit de kamer en het monster als gas om effecten van oppervlaktespanning te voorkomen.
- Voer montage, goud plating en beeldvorming uit op de specimens door de stappen te volgen die zijn gespecificeerd in stappen 1.11-1.13.
- Voer vergelijkende analyse uit door de specimens chemisch te drogen van stap 3,2 met behulp van HMDS door stappen 1.9-1.13 te volgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 Toon scanning elektronen micrografische analyse van geschilderde schildpad (Chrysemys picta) embryo's. Geschilderde schildpadeieren verzameld en geïnineerd op een strooisel medium, gemonteerd op aluminiumfolie na chemisch drogen werden gebruikt voor SEM-beeldvorming (Figuur 1a-E). Een zijaanzicht van een fase 12 embryo toont de craniofaciale structuren; maxillaire prominentie strekt zich verder uit dan de mandibulaire en beperkt een goed gemarkeerde neus kuil mediaal; Er werden ook vijf pharyngeale bogen waargenomen (Figuur 1F). Nieuw gevormde somieten in de achterste staart streek van het embryo zijn gemakkelijk te aftelbare in vergelijking met de gesegmenteerde lichaam somieten. Forelimb knoppen lijken langer in vergelijking met Hind ledemaat knoppen en punten meer caudally dan ventraal. Een goed gedefinieerde uitgroei van een carapasrug wordt gezien langs de gehele flank van het gebied tussen de ledematen van de stage 15 embryo (Figuur 1G. In het stadium 18 bezitten geschilderde schildpadden een korte, zwak projecterende snuit. De onderste snavel rust binnen de bovenkaak en is lichtjes opgedraaid met een klemhaak die past in de centrale inkeping van de bovenste snavel (Figuur 1H). De bovenkaak van de geschilderde schildpadden toont een gekerfd uiterlijk vormen een mediale U-V vormige distale tip met een kleine cusp aan elke kant, een kleine Eier tand begint te vormen op het puntje van de bovenkaak. De knoppen van de ledematen die in eerdere stadia langer leken, vormen een peddel achtige structuur tijdens etappes 13-14 met een digitale plaat die vaag is aangegeven. Ledemaat mesenchym afgebakend door de apicale ectodermale nok wordt gezien langs de anterieure-posterieure marges (Figuur 1I-J).
Figuur 2 toont een ultra-structurele analyse van Chrysemys picta eierschaal en shell membraan met behulp van SEM Imaging. Geschilderde schildpad eierschalen werden verkregen zoals hierboven beschreven en werden onderworpen aan lucht drogen na het wassen met dubbel gedestilleerd water (Figuur 2A, B). Op aluminium geplaatste eierschalen met dubbelzijdige Carbon tape (Figuur 2C) werden met behulp van SEM gefotografeerd. Een zijaanzicht van de schelp toonde de buitenste kalkhoudende eierschaal laag stevig aan de binnenste filamenteuze shell membraan (Figuur 2D). Het buitenoppervlak van de eierschaal bestaat uit goed onderscheiden gemineraliseerde schaaleenheden, gemaakt van bolvormige/sferische knobbeltjes die in groepen zijn gerangschikt en tussen aangrenzende schelp eenheden een concentratie van kleine afgeronde depressies of poriën van verschillende groottes werden waargenomen (Figuur 2E). Knobbeltjes uit elke groep van schelp eenheden ontmoeten elkaar bij een verbindingsknooppunt, het middelpunt (Figuur 2F). Het buitenste oppervlak werd handmatig geschild met behulp van de tang om het oppervlak van het omhulsel membraan te observeren. Er werden rijen van centrale plaques gezien die het bevestigingspunt tussen de ketel eenheden en het onderliggende meerlaagse vezelvlies membraan (Figuur 2G) verschaft.
Figuur 3 toont de morfologische karakterisering van Ascomycota fungale isolaat uit diaculturen waargenomen met behulp van SEM-beeldvorming. Schema van de ingestelde dia-cultuur (Figuur 3A) die de schimmelgroei op het agar-blok vertoont binnen twee dagen na de inoculatie. Kolonies die snel groeien met witte tot crèmekleurige antenne mycelium (Figuur 3B). SEM-beeldvorming na kritisch punt drogen en sputteren coating van agar plakjes bleek schimmel Hyphae, gebogen conidia, en rijst zoals sporen. Conidiophores werden gezien lateraal van de septate Aerial schimmeldraden (Figuur 3C). Macroconidia geproduceerd op kortere, vertakte conidioforen zijn matig gebogen, met korte, stompe apicale en onderscheid pediellate basale cellen meestal septaat (Figuur 3D).
Figuur 4 toont de vergelijkende resultaten voor de verwerking van soortgelijke specimens met gebruikmaking van alternatieve technieken. Het onderdompelen van hoofden van de fase 15 embryo's in HMDS en drogen door geleidelijke verdamping Toon goed bewaarde craniofaciale structuren, bijna geen krimp of vervorming wordt gezien met langere tijd van langzame verdamping van HMDS (Figuur 4A). Embryo's post-Fixed met osmium tetroxide toonde geen onderscheidbare verschil in beeldkwaliteit, behalve voor lichte krimp van weefsel in vergelijking met HMDS langzame verwerking (Figuur 4B). Het drogen van embryo's door hmds gedeeltelijk of volledig te verwijderen, waardoor snelle verdamping resulteert in structurele vervorming en krimp (Figuur 4C), terwijl langzame verdamping uitstekende Oppervlaktestructuren van een op dezelfde wijze geënsceneerde embryo heeft opgelost ( Figuur 4 A). de droog artefacten werden gezien in de embryo's die behandeld werden met de CPD-techniek en veroorzaakten uitgebreide krimp en vernietiging van weefsel (Figuur 4D, E). Agar-plakjes uit diaculturen vertonen onvolledige droging van schimmel isolaat met HMDS-behandeling in vergelijking met CPD (Figuur F). Volledige droging wordt bereikt met een CPD-behandeling van agar-plakjes met een goed gedroogd, wit preparaat dat intact hoge-resolutie structurele kenmerken van schimmel schimmeldraden en sporen vertoont (Figuur 4G-g '). Agar-blokken met schimmel culturen lijken gekrompen en geel van kleur waardoor ze niet geschikt zijn voor SEM-beeldvorming (Figuur 4H-h ').
Figuur 1 : Scannen van elektronen micrografen van Chrysemys picta embryo's bereid door chemisch drogen. (A) Chrysemys picta, nesten tijdens het broedseizoen bij Rice Creek Field Station, OSWEGO, NY. B) een goed geconstrueerd nest van buitenaf. C) de voor de blootstelling van de eieren gelegde oppervlakte-grond wordt met zorg afgevoerd. D) in de incubatie kamer geplaatste eieren met een strooisel medium. E) de montage van embryo's op een aluminium houder na het drogen van de chemische stof, E4 waaruit het embryo met sputteren coating blijkt. F) laterale weergave van het embryo van fase 12 met gezichtsstructuren, knoppen van de ledematen en somites. G) goed gedefinieerde carapax Ridge en peddelvormige ledematen zijn te zien in fase 15. H) craniofaciale structuren van stadium 18 embryo met boven-en onderkaak, Let op een kleine Eier tand gevormd aan de punt van de bovenste snavel. I) rugzicht van de rechterrand in fase 13-14 en een close-UPBEELD van Aer (J) op de dorsale-ventrale grens. Schaal stangen: F-H, 500 μm; I, 100 μm en J, 10 μm. toetsen: MB, midbrain; NP, nasale pit; MXP, maxillaire prominentie; PA, pharyngeale bogen; h, hart; FL, forelimb; s, somite; HL, achterlijf; t, staart Tip; CR, carapaciale Ridge; et, eier tand; OC, mondholte; e, oog; uj, bovenkaak; LJ , onderkaak; m, Mesenchyme, AER, apicale ectodermale NOK. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : Ultrastructurele analyses van de Luchtgedroogde eierschaal en de shell membraan van geschilderde schildpadeieren. A) na de vaststelling van de embryo's werden de eierschalen grondig gewassen in gedestilleerd water om dooier en albumine te verwijderen. B) schone eierschalen werden ten minste eenmaal in de lucht gedroogd. C) bevestiging van een eierschaal op aluminium. D) radiale weergave van het shell fragment met de buitenste kalkhoudende laag en het binnenste schil membraan. E) de buitenste kalkhoudende laag toont bolvormige schaaleenheden (su) gerangschikt in groepen en poriën die tussen deze eenheden worden gezien (asterisken). F) vergrote weergave van een knobbel die het middelpunt (c) weergeeft tussen de ketel eenheden. G) verwijdering van kalkhoudende laag toont het buitenoppervlak van het shell membraan met depressies die gebroken zijn van de ketel eenheden. Schaal stangen: E, 100 μm; F, 10 μm, en G, 20 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : Schimmel kweek voor SEM Imaging voorbereiden. (A) schematisch diagram om de instellingen van de diacultuur weer te geven. B) witte, gekleurde schimmel kolonies die na twee dagen incubatie op 30 °c op het agar-blok zijn waargenomen. C) SEM-afbeelding met een deel van mycelium van Fusarium solani, zwarte sterretjes die de macroconidia markeren in sporodochia, een pijl naar phialide en pijl punten gericht op microconidia, schaalbalk, 10 μm.D) vergrote afbeelding van septaat Chlamydosporen, schaalbalk 5 μm. toetsen: AB, agar blok; CS, coverslip; f, schimmel cultuur. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4 : Vergelijkende analyse van alternatieve technieken om soortgelijke specimens te verwerken. A) frontale weergave van geschilderde schildpad hoofd gedroogd met langzame verdamping van Hmd's (A), na vaststelling na bevestiging met osmium Tetroxide (B), snelle snellere verdamping van HMDS (C) en CPD (D-E). Met inbegrip van een post-fixatie stap met behulp van osmium tetroxide vertonen geen zichtbaar verschil in beeldkwaliteit in vergelijking met HMDS behandeling zonder post-fixatie. Vervormingen worden gezien na snelle verdamping van HMDU, terwijl geleidelijk drogen met langzame verdamping een betere oppervlaktestructuur biedt. Verschillende gradaties van krimp en ingeklapte structuren worden gezien in de hersengebieden, ogen en gelaats prominenties in met CPD behandelde embryo's.F) de montage van diaculturen die zijn verwerkt met hmd's (1), CPD (2) en met sputteren gecoat CPD-behandeld specimen (3) op aluminium. (g-g ') Volledige droging gezien als intact wit gekleurde agar Slice met schimmel inoculeren bereikt door CPD behoud structuren van schimmel mycelium en sporen van Fusarium solani. (h-h ') Onvoldoende drogen van de Slide cultuur, krimp en beschadigde structurele integriteit gezien met HMDS conserverings techniek. Schaal stangen: A-E, 500 μm; G-H, 2 mm, en G'-H ', 20 μm. toetsen: et, eier tand; OC, mondholte; e, oog; uj, bovenkaak; LJ, onderkaak; zwarte asterisken, macroconidia in sporodochia; pijl, phialide; en pijlpunten, microconidia. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In onze studie werden verschillende fixatie middelen, uitdroging en droog methoden getest om drie verschillende delicate biologische monsters voor SEM-beeldvorming te bereiden: embryo's, eierschalen en schimmel culturen. SEM wordt vaak gebruikt voor oppervlakte analyse, dus fixatieve penetratie is minder van kracht, maar het moet duidelijk zijn dat slecht vaste interne structuren tot in-en inklapende Oppervlaktestructuren zullen leiden. Verlengde fixatietijd moet ook worden overwogen voor grotere weefselmonsters, waarbij de fixatieve oplossing enkele malen wordt vervangen, afhankelijk van de fixatie duur. Door de actieve interactie tussen het fixeermiddel en het weefsel, zou de osmotische eigenschappen van cellen aanzienlijk veranderen. Weefsel vloeistoffen zou het fixeermiddel verdunnen en dus een aldehyde-effect dat bijdraagt aan de algehele osmolaliteit kan worden verwaarloosd wat betreft effecten op het celvolume. Ook zou formaldehyde sneller doordringen in de weefsels en effectiever als de cross-linker in vergelijking met glutaraldehyde. Een gebufferd formaldehyde-glutaraldehyde mengsel werd ook gerapporteerd voor de vaststelling van een breed scala aan weefsels, hoewel voor monolagen en celsuspensies verdunde oplossingen meer geschikt waren voor de vaststelling van15,16. De verdunde oplossingen zijn echter ook hypertonisch, dus de aldehyden zijn zelf niet osmotisch actief. Voor delicate monsters gebruikt in deze studie, PBS bij pH 7,4 werd gebruikt als een voertuig voor de bevestigingsmiddelen, als fosfaat buffers worden verondersteld te zijn meer vergelijkbaar met de cytoplasmische omgevingen van de meeste biologische monsters. Verder wordt de osmolariteit geïdentificeerd binnen het fysiologische bereik dat nodig is voor het monster, terwijl PBS fungeert als een voertuig voor de bevestigingsmiddel. Post-fixatie met osmium tetroxide wordt vaak aanbevolen voor verschillende biologische monsters16,22,42 maar is geëlimineerd voor alle biologische monsters die in deze studie worden gebruikt. Monsters zonder osmium tetroxide leverden scherpe beelden op en preparaten die met osmium tetroxide zijn bevestigd, leverden niet te onderscheiden resultaten op (Figuur 4A). Osmium tetroxide veroorzaakt vervorming van blad weefselstructuren en levert slechtere specimen conservering in vergelijking met Glutaaraldehyde en formaldehyde mengsel43, en er is gesuggereerd dat een ophoping van osmium moleculen infiltratie van dehydrerende middelen en overgangs agenten die worden gebruikt in CPD, en de oplosmiddelen zoals HMDS gebruikt voor chemisch drogen. Het effect is weefselspecifiek en exclusief osmium tetroxide zal geen effect hebben op de beeldkwaliteit voor het type delicate specimens geanalyseerd in deze studie. Voor andere soorten weefsels gebruik van osmium tetroxide kan worden geëlimineerd met uitgebreide primaire fixatie.
HMDS gedroogde schildpad embryo monsters toonden goed bewaarde oppervlakken en minder vervorming of krimp in vergelijking met CPD (Figuur 4). CPD minimaliseert de kans op vervorming in celmorfologie en artefacten productie als gevolg van de nul of minimale oppervlaktespanning die tijdens het proces wordt gecreëerd. CPD kan echter een potentieel fysiek gevaar voor delicate breekbare monsters veroorzaken. In lijn met onze observatie, leverde hmds een vergelijkbare of hogere kwaliteit beeldvorming door het minimaliseren van de oppervlaktespanning veroorzaakt door drogen op basis van eerdere studies gepubliceerd44,45,46,47. Vergeleken met de behandeling met CPD, bewaarde hmds structurele details van het organische gevlochten uitstekend in geëtste bikleppen en Barnacle shells48 en voorzag het in een hoge resolutie van de structurele kenmerken van de complexe interne organisatie van mermithid nematoden49 en insect interne weefsels28. De droog plaat artefacten werden in grote hoeveelheden gezien op de specimens die door de CPD-techniek werden bereid in vergelijking met de HMDS-techniek. De membraan weefsel en pellet artefacten werden verhoogd in cervicale cellen bereid met behulp van CPD-techniek50. HMDS reageert met water om hexamethyldisiloxaan en ammoniak te produceren, die beide van het object verdampen. HMDS wordt vaak gebruikt in gaschromatografie om silyl ethers van verbindingen zoals suikers, aminozuren, alcoholen en tal van andere verbindingen te creëren. Het is niet bekend of HMDS met sommige van deze verbindingen in weefsels reageert. HMDS kan eiwitten dwars linken en het weefsel verstijven tijdens het droogproces28, hoewel de precieze reden dat hmd's een beter behoud van embryo's bieden, niet kan worden verklaard, behalve voor weefsel specificiteit. Op basis van de resultaten van ons onderzoek veroorzaakte CPD een extensieve krimp in vergelijking met HMDN en is het veel geschikter om embryonale weefsels te verwerken, vooral om de oppervlaktestructuur voor vroege geënsceneerde embryo's te analyseren. Het mechanisme waarmee HMDS werkt aan het drogen van weefsels is niet opgehelderd, hoewel langzaam drogen met geleidelijke verdamping in absolute watervrije omgeving een reden kan zijn om een uitstekende oppervlaktestructuur van de dieren te verkrijgen.
In deze studie werden kleine stukjes agar-blokken met schimmel kolonies uit eerder vastgestelde diaculturen gebruikt om problemen met het behoud van de oorspronkelijke luchtige van de mycelium mat te voorkomen. CPD-droging van agar-stukken met schimmel kolonies resulteerde in een waseffect, terwijl veranderingen in de Fixatieven, buffers en ethanol een betere keuze bleken te zijn om de moeilijkheden met vriesdrogen te overwinnen. HMDS die goed werkt voor embryo's van alle stadia was niet in staat om schimmel culturen op te lossen, terwijl het drogen van de lucht met HMDS een significant probleem vormde: het opkrullen en het verliezen van de structurele stijfheid. Hoewel CPD goed werkt voor schimmel culturen, veroorzaakte het onmiddellijke schade aan embryo's, vooral in de vroege stadia van de ontwikkeling, waardoor krimp op het oppervlak ontstaat. Er werden geen oplaad-of droog artefacten waargenomen wanneer respectievelijk HMDS en CPD werden gebruikt voor embryo's en schimmel culturen. Voor stijf weefsel zoals eierschaal van schildpadden is geen speciale verwerking vereist, behalve voor het wassen en drogen van de lucht bij kamertemperatuur voorafgaand aan de montage voorbeeld vorming.
Ongeacht de bereidingswijze, moeten geleidelijke ethanol gradiënt stappen worden gebruikt om de kans op het drogen van artefacten te verminderen. Aanvankelijk bleken zowel HMDS-als CPD-monsters oppervlakte artefacten te hebben met krimp na de in de literatuur beschikbare dehydratie-en droog protocollen. Na een reeks standaardiseringen bepaalden we dat de artefacten het gevolg waren van de uitdroging van alcohol. Het is van cruciaal belang om een langzame dehydratie te gebruiken met meer geleidelijke ethanol stijgingen tijdens uitdroging. Ook moet de duur van elke iteratie langer zijn voor embryo's in vergelijking met schimmel culturen. Bovendien zorgde een extra stap op 100% ethanol voor volledige gelijkmatige verzadiging. HMDS kan volledig of gedeeltelijk worden verwijderd om luchtdroging van monsters mogelijk te maken, maar uitgebreide blootstelling aan hmdn en geleidelijke luchtdroging door verdamping bleken effectief te zijn voor embryo's om verstoring te voorkomen (Figuur 4A, C) veroorzaakt door grote oppervlakte spanning zoals waargenomen voor microbiële celbijlage51. Het onderdompelen van specimens in HMD'S en langzaam drogen van de nacht onthulde een uitstekende oppervlaktestructuur bij Daphnia-soorten52 , wat suggereert dat zachte delicate weefsels kunnen profiteren van het langzame droogproces. Een acceptabele beeldkwaliteit voor embryo's kan worden verkregen met langzaam chemisch drogen door de concentratie van HMDA geleidelijk te verhogen naar ethanol na uitdroging.
Alle monsters werden gemonteerd op aluminium met behulp van een dubbelzijdige Carbon tape om een geleidend oppervlak te bieden, een dun laagje kleurloze nagellak kan ook worden gebruikt als hetzelfde monster in een andere richting moet worden afgebeeld. Monsters kunnen gemakkelijk van de boktor worden verwijderd wanneer nagellak op het oppervlak van de stub wordt gebruikt en de monsters in alternatieve vlakken worden gepositioneerd, is mogelijk in vergelijking met het gebruik van dubbelzijdige Carbon tape. Omdat de monsters niet geleidend zijn, is het noodzakelijk om een dunne laag metaal op de monsters te sputten om de geleiding te verhogen. Een gouden doelwit werd gebruikt in deze studie tijdens sputteren coating, en Gold-Palladium levert ook vergelijkbare resultaten voor het vermijden van laad effecten. De juiste stralings spanning is monster afhankelijk, voor licht gecoate specimens zal beeldvorming met een veld emissie SEM bij 2-5 kV een goede definitie van Oppervlaktestructuren opleveren. Voor weefsels met adequate coating biedt 5 kV over het algemeen een beter signaal zonder meer straal penetratie. Voor specimens die weinig diepte hebben en alleen met goud zijn bekleed, is bij beeldvorming bij een hogere spanning (10 kV) een betere visualisatie van oppervlaktetopografie toegestaan.
Voorbereiding van delicate weefsels voor SEM vormt onderscheidende uitdagingen, en een reeks van monster voorbereidings technieken kunnen worden gebruikt om te overwinnen en minimaliseren van Imaging artefacten. We bieden uitgebreide methoden om drie verschillende delicate biologische weefselmonsters te verwerken, voor SEM-beeldvorming: embryo's, stijve eierschalen en schimmel culturen. In ons onderzoek werden subtiele wijzigingen aangebracht in populaire methoden die beschikbaar waren in eerder gepubliceerde studies, en we identificeerden de meest geschikte uitdroging en droog methoden die specifiek zijn voor elk delicaat weefseltype. Deze protocollen kunnen worden aangepast om acceptabele SEM-beeldkwaliteit te verkrijgen van soortgelijke biologische monsters.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen
Acknowledgments
De auteurs willen graag Dr. Daniel BALDASSARRE, SUNY Oswego bedanken voor de nuttige discussies en opmerkingen over het manuscript. Deze studie werd gesteund door Rice Creek Associate Grants, Oswego; Challenge verleent SUNY Oswego en National Science Foundation (NSF) kleine subsidies aan PGL en JG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Fischer Scientific | S25127A | for slide cultures |
| Aluminum pin stub | Tedpella | 16111 | 12.7 mm x 8 mm |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: Potato Dextrose Agar | BD 213400 | DF0013-17-6 | Media for isolation and cultivation of Fungi, yeast and molds |
| Chloramphenicol | Fischer BioReagents | BP904-100 | Antibiotic for media |
| Coarse Vermiculite | Greenhouse Megastore | SO-VER-12 | bedding medium |
| Clear 12- well plate | Corning | 07-201-589 | for fixing embryo |
| Coverslips | Fischer Scientific | S17525B | for slide culture |
| Critical Point Dryer | Quorum CPD | EMS850 | critical point drying |
| Culture dishes | Fischer Scientific | 08 747B | DISH PETRI 100X10MM 12/PK |
| Ethanol | Fischer Scientific | A406P 4 | dehydration agent |
| Forceps- Aquarius Tweezers | Tedpella | 5804 | style 4, length 108mm, widh x thickness 0.017 x 0.17 mm |
| Glutaraldehyde | Fischer Scientific | G151-1 | fixative |
| Gold target for sputter coater | DENTON VACUUM | TAR001-0158 | Gold Target, 2.375″ D X .002″ |
| Hexamethyldisilazana | Fischer Scientific | C19479-5000 | chemical drying agent |
| Kim wipes | Kimtech | S-8115 | cleaning |
| Microscope slides | Thermo Scientific | 67-762-16 | for slide culture |
| Microscopy Scissors | Tedpella | 1327 | Double pointed, stainless steel, 100 mm L (3-5/8"). |
| Micro-scissors | Tedpella | 1346 | Vannas-type, straight, 80mm L |
| Moria Perforated Embryo Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Length 14.5 cm, tip diameter 20 mm, spoon depth 5 mm |
| Netwell Inserts | Corning | 0330B09 | 15 mm Inserts with 74 µm Mesh Size Polyester Membrane act as handy carriers during specimen processing into different solvents |
| Paraformaldehyde | Fischer Scientific | T353 500 | fixative |
| Peat moss | Walmart- Miracle Gro | 551705263 | bedding medium |
| PELCO tabs double stick carbon conductive tape | Tedpella | 5000 | 12 mm OD |
| Sputter coater | DENTON VACUUM | DESK V | thin metal coating |
| SEM | JEOL USA | JEOL JSM 6610LV scanning electron scope | electron microscopy |
References
- Packard, M. J. Ultrastructural Morphology of the Shell and Shell Membrane of Eggs of Common Snapping Turtles (Chelydra serpentina). Journal of Morphology. 165 (2), 187-204 (1980).
- Solomon, S. E., Watt, J. M. The structure of the eggshell of the leatherback turtle (Dermochelys coriacea). Animal Technology. 36 (1), 19-27 (1985).
- Sahoo, G., Mohapatra, B. K., Sahoo, R. K., Mohanty-Hejmadi, P. Ultrastructure and Characteristics of Eggshells of the Olive Ridley Turtle (Lepidochelys olivacea) from Gahirmatha, India. Acta Anatomica. 156, 261-267 (1996).
- Mitrus, S. The calcareous layer eggshell of the turtle Emys Orbicularis: Ultrastructure and composition. Italian Journal of Zoology. 70 (1), 13-16 (2003).
- Chang, Y., Chen, P. Y. Hierarchical structure and mechanical properties of snake (Naja atra) and turtle (Ocadia sinensis) eggshells. Acta Biomaterialia. 31, 33-49 (2016).
- Samson, R. A., Stalpers, J. A., Verkerke, W. A simplified technique to prepare fungal specimens for scanning electron microscopy. Cytobios. 24, 7-11 (1979).
- Kaminskyj, S. G. W., Dahms, T. E. S. High spatial resolution surface imaging and analysis of fungal cells using SEM and AFM. Micron. 39, 349-361 (2008).
- Wisse, E., et al. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World Journal of Gastroenterology. 16 (23), 2851-2866 (2010).
- Braet, F., De Zanger, R., Wisse, E. Drying cells for SEM, AFM and TEM by hexamethyldisilazane: a study on hepatic endothelial cells. Journal of Microscopy. 186 (1), 84-87 (1997).
- Echlin, P. Handbook of Sample Preparation for Scanning Electron Microscopy and X-Ray Microanalysis. , UK: Springer. (2009).
- Bell, P. B., Safiejko-Mroczka, B. Preparing whole mounts of biological specimens for imaging macromolecular structures by light and electron microscopy. International Journal of Imaging System Technology. 8 (3), 225-239 (1997).
- Bahr, G. F., Bloom, G., Friberg, U. Volume changes of tissues in physiological fluids during fixation in osmium tetroxide or formaldehyde and during subsequent treatment. Experimental Cell Research. 12 (2), 342-355 (1957).
- Baker, J. R. Principles of biological microtechnique; a study of fixation and dyeing. , Wiley. London Methuen; New York. (1958).
- Glauert, A. M. Practical methods in electron microscopy. Journal of Microscopy. 3, 5-65 (1974).
- Hayst, M. A. Biological Applications. Principles and techniques of electron microscopy, 4th ed. , Cambridge University Press. 13-105 (1970).
- Pathan, A. K., Bond, J., Gaskin, R. E. Sample preparation for SEM of plant surfaces. Materials Today. 12 (1), 32-43 (2010).
- Hayat, M. A. Electron microscopy: Biological applications. 4th ed. , Cambridge University Press. New York. (2000).
- Hayat, M. A. Fixation for electron microscopy. , Academic Press. New York. (1981).
- Karnovsky, M. J. A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolarity for use in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 27, 137-138 (1965).
- McDowell, E. M., Trump, B. F. Histologic fixatives suitable for diagnostic light and electron microscopy. Archives Pathology and Laboratory Medicine. 100, 405 (1976).
- Wisse, E., et al. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World Journal of Gastroenterology. 16 (23), 2851-2866 (2010).
- Fischer, E. R., Hnasen, B. T., Nair, V., Hoyt, F. H., Dorward, D. W. Scanning Electron Microscopy. Current Protocols in Microbiology. , Unit2B.2 (2012).
- Magalhaes, M., et al. Embryonic development of the Giant South American River Turtle, Podocnemis expansa (Testudines: Podocnemididae). Zoomorphology. 136 (4), 523-537 (2017).
- Hopwood, D. Fixatives and fixation: a review. The Histochemistry Journal. 1 (4), 323-360 (1969).
- Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde fixation. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 33 (8), 845-853 (1985).
- Bell, P. B., Rundquist, I., Svensson, I., Collins, V. P. Formaldehyde sensitivity of a GFAP epitope, removed by extraction of the cytoskeleton with high salt. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 35 (12), 1375-1380 (1987).
- Hayat, M. A. Glutaraldehyde: Role in electron microscopy. Micron and Microscopica Acta. 17 (2), 115-135 (1986).
- Nation, J. L. A new method using hexamethyldisilazane for preparation of soft insect tissues for scanning electron microscope. Stain Technology. 58 (6), 347-351 (1983).
- Bray, D. F., Bagu, J., Koegler, P. Comparison of hexamethyldisilazane (HMDS), Peldri II, and critical point drying methods for scanning electron microscopy of biological specimens. Microscopy Research Technique. 26 (6), 489-495 (1993).
- Barre, C., O'Neil, D., Bricelj, V. M. Preparation of large bivalve specimens for scanning electron microscopy using Hexamethyldisilazane (HMDS). Journal of Shellfish Research. 25 (2), 639-641 (2006).
- Lee, J. T. Y., Chow, K. L. SEM sample preparation for cells on 3D scaffolds by freeze-drying and HMDS. SCANNING. 33, 1-14 (2011).
- Araujo, J. C., et al. Comparison of hexamethyldisilazane and critical point drying treatments for SEM analysis of anaerobic biofilms and granular sludge. Journal of Electron Microscopy. 52, 429-433 (2003).
- Boyde, A., Bailey, E., Jones, S. J., Tamarin, A. Dimensional changes during specimen preparation for scanning electron microscopy. SEM/IITRI. 10, 507-518 (1977).
- Read, N. D., Porter, R., Beckett, A. A comparison of preparative techniques for the examination of the external morphology of fungal material with the scanning electron microscope. Canadian Journal of Botany. 61 (8), 2059-2078 (1983).
- Melo, I. S., Faull, J. L. Scanning electron microscopy of conidia of Thichoderma stromaticum, a biocontrol agent of witches broom disease of cocoa. Brazilian Journal of Microbiology. 35, 330-332 (2004).
- Pathan, A. K., Bond, J., Gaskin, R. E. Sample preparation for scanning electron microscope of plant surfaces- Horses for courses. Micron. 39, 1049-1061 (2008).
- Packard, G. C., Taigen, T. L., Packard, M. J., Boardman, T. J. Water relations of pliable-shelled eggs of common snapping turtle (Chelydra serpentine). Canadian Journal of Zoology. 58, 1404-1411 (1979).
- Packard, M. J., Packard, G. C., Boardman, T. J. Structure of eggshells and water relations of reptilian eggs. Herpetologica. 38, 136-155 (1982).
- Cordero, G. A., Janzen, F. J. An Enhanced Developmental Staging Table for the Pianted Turtle, Chrysemys picta (Testudines: Emydidae). Journal of Morphology. 275, 442-455 (2014).
- Yntema, C. L. Procurement and use of turtle embryos for experimental procedures. The Anatomical Record. 149, 577-586 (1964).
- Matsubara, Y., Kuroiwa, A., Suzuki, T. Efficient harvesting methods for early-stage snake and turtle embryos. Development Growth Differentiation. 58, 241-249 (2016).
- Moran, P., Coats, B. Biological Sample Preparation for SEM Imaging of Porcine Retina. Microscopy Today. , 10-12 (2012).
- Bray, D. F., Bagu, J., Koegler, P. Comparison of hexamethyldisilazane (HMDS), Peldri II, and critical point drying methods for scanning electron microscopy of biological specimens. Microscopy Research Technique. 26, 489-495 (1993).
- Botes, L., Price, B., Waldron, M., Pitcher, G. C. A simple and rapid Scanning Electron Microscope preparative technique for delicate "Gymnodinioid" Dinoflagellates. Microscopy Research Technique. 59, 128-130 (2002).
- Dekker, N. P., Lammel, C. J., Brooks, G. F. Scanning Electron Microscopy of piliated Neisseria gonorrhoeae processed with hexamethyldisilazane. Journal of Electron Microscopy. 19, 461-467 (1991).
- Fratesi, S., Lynch, F. L., Kirkland, B. L., Brown, L. R. Effects of SEM preparation techniques on the appearance of bacteria and biofilms in the Carter Sandstone. Journal of Sedimentary Research. 74, 858-867 (2004).
- Jung, S. W., Joo, H. M., Park, J. S., Lee, J. H. Development of a rapid and effective method for preparing delicate dinoflagellates for scanning electron microscopy. Journal of Applied Phycology. 22, 313-317 (2010).
- Bernd, S., Bentley, D. Use of HMDS (hexamethyldisilazane) to dry organic microstructures in etched bivalve mollusk and barnacle shells. Nautilus -Greenville then Sanibel. 116, 25-31 (2002).
- Bowen, W. R., Hemann, C. C., Johnson, A. A., Good, B. H. Mermithid Nematodes: SEM Observations Comparing Hexamethyldisilazane and Critical Point Drying Methods. Journal of the Arkansas Academy of Science. 44, Article 6 (1990).
- Jusman, J., Ng, S. C., Osman, N. A. A. Investigation of CPD and HMDS Sample Preparation Techniques for Cervical Cells in Devloping Computer-Aided Screening System Based on FE-SEM/EDX. The Scientific World Journal. 289817, 1-11 (2014).
- Hazrin-Chong, N. H., Manefield, M. An alternative SEM drying method using hexamethyldisilazane (HMDS) for microbial cell attachment studies on sub-bituminous coal. Journal of Microbiological Methods. 90, 96-99 (2012).
- Laforsch, C., Tollrian, R. A new preparation technique of daphnids for Scanning Electron Microscopy using hexamethyldisilazane. Arch Hydrobiology. 149 (4), 587-596 (2000).
