Summary
هنا، نقدم بروتوكولات معالجة مفصلة لتصوير عينات الأنسجة الحساسة باستخدام الفحص المجهري الإلكتروني (SEM). وهناك ثلاث طرق معالجة مختلفة، وهي التجفيف الكيميائي لسداسي ميثيل ديسيلازانا (HMDS)، وتجفيف الهواء البسيط، وتجفيف النقاط الحرجة، ووصفها لإعداد قشر البيض الصلب، والأجنة في مراحل النمو المبكرة، والثقافات الفطرية على التوالي.
Abstract
وعلى الرغم من أن الفحص المجهري للإلكترون (SEM) يستخدم على نطاق واسع لإجراء تحليل هيكلي فائق لمختلف العينات البيولوجية وغير البيولوجية، فإن الأساليب التي تنطوي عليها معالجة العينات البيولوجية المختلفة تنطوي على ممارسات فريدة من نوعها. جميع الممارسات التقليدية الموصوفة في المؤلفات لمعالجة العينات لا تزال تجد تطبيقات مفيدة، ولكن التغييرات الدقيقة في إعداد العينة يمكن أن تغير جودة الصورة، وكذلك، إدخال القطع الأثرية. وبالتالي، فإن استخدام تقنية إعداد عينة فريدة من نوعها محددة لنوع الأنسجة التي تم تحليلها مطلوب للحصول على صورة ذات نوعية جيدة مع دقة فائقة الهيكلية. تركز هذه الدراسة على توفير بروتوكولات إعداد العينات المثلى لتصوير الأجنة، والأصداف البيض الصلبة، والثقافات الفطرية باستخدام SEM. وقد أوصي تُوصِّل التحسينات التالية لتحقيق نتائج جيدة للعينات البيولوجية الحساسة الثلاث المختلفة التي تمت دراستها. استخدام المثبتات أكثر اعتدالا مثل 4٪ بارافورمالدهايد أو 3٪ الجلوتالالديهايد تليها الجفاف مع سلسلة الإيثانول إلزامي. الميسليوم الفطري على كتل أجار التي تم الحصول عليها من قبل الثقافات الشريحة تسفر عن سلامة أفضل فائقة الهيكلية بالمقارنة مع الثقافات التي اتخذت مباشرة من لوحات أجار. التجفيف الكيميائي للأجنة مع HMDS يوفر التجفيف دون إدخال القطع الأثرية التوتر السطحي مقارنة مع التجفيف نقطة حرجة. HMDS يمنع تكسير الناجمة عن انكماش كما عينات أقل هشاشة أثناء التجفيف. ومع ذلك، للثقافة الفطرية، التجفيف نقطة حرجة يوفر جودة صورة مقبولة بالمقارنة مع التجفيف الكيميائي. يمكن تصوير قشر البيض مع عدم وجود خطوات إعداد خاصة باستثناء الغسيل الدقيق وتجفيف الهواء قبل التركيب. وتم توحيد منهجيات الإعداد على أساس جودة الصورة المقبولة التي تم الحصول عليها مع كل تجربة.
Introduction
المسح المجهر الإلكتروني (SEM) التحليل الهيكلي الفائق والتصوير داخل الخلايا تكملة المجهرية الخفيفة لتوصيف ثلاثي الأبعاد من prokaryotes والنباتات والحيوانات. الاستبانة المكانية العالية لSEM يجعلها واحدة من أكثر التقنيات تنوعا وقوة المتاحة لفحص الخصائص الميكروالهيكلية للعينات في مقياس نانومتر إلى مقياس ميكرومتر. يتم حل العينات المجففة إلى الهياكل التركيبية والطوبوغرافية مع التفاصيل المكثفة، والتيتوفر الأساس لوضع استنتاجات صحيحة حول العلاقات الوظيفية 1،2،3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9.عند تفسير الصور SEM من العينات البيولوجية، فإنه من التحدي الكبير للتمييز بين الهياكل الأصلية والقطع الأثرية التي يتم إنشاؤها أثناء المعالجة. يتم تشغيل SEM عموما في فراغات عالية جدا لتجنب أي تدخل من جزيئات الغاز التي تؤثر على الحزم الإلكترونية الأولية أو الثانوية أو المتناثرة من العينة10،11. كما أن المواد البيولوجية معرضة للتلف الإشعاعي بسبب خصائصها السيئة أو غير المنضوية. فمن الضروري للعينات المحملة في SEM أن تكون جافة تماما وخالية من أي ملوثات عضوية للقضاء على أي outgassing ممكن في بيئة فراغ عالية10،11. وبما أن العينات البيولوجية تتألف في معظمها من الماء، فإن هناك حاجة إلى تقنيات وقائية إضافية لضمان الاحتفاظ بالهياكل الأصلية.
ويستند القرار الذي تم الحصول عليه إلى تحسين أساليب الإعداد الخاصة بأنواع العينات والمعلمات الآلية المستخدمة. وبالتالي، فمن الضروري تجنب استخدام خطوات المعالجة المعممة لجميع أنواع الأنسجة. وستحتاج بعض العينات البيولوجية إلى معالجة أقل صرامة للحفاظ على هيكلها، في حين قد يلزم مزيد من الوقت والرعاية لأنواع دقيقة من العينات لتجنب إدخال قطع التجفيف، مثل الانكماش والانهيار. إعداد العينة هو خطوة حاسمة في التصوير SEM; نتائج الدراسات المورفومترية تتأثر بشكل ملحوظ بإجراءات إعداد العينات12،13. خطوات التحضير الشائعة للعديد من العينات البيولوجية هي التثبيت والجفاف والطلاء مع معدن مثل الذهب أو البلاتين أو البلاديوم لتحويل أسطحها لتكون موصلة لتحليل SEM. وتختلف طبيعة الخطوات المستخدمة ومزيجها حسب نوع الأنسجة والأهداف المحددة للدراسة. زيادة تهمة، والحساسية للفراغ والضرر شعاع الإلكترون تشكل مشاكل عند معالجة عينات البيولوجية الحساسة لينة، مما يتطلب خطوات معالجة إضافية للحفاظ على الهيكل الأصلي للكائن. استخدام الأساليب التقليدية مثل تحديد تتروكسيد أوزميوم، والجفاف يسبب انكماش وانهيار الأنسجة الحساسة14،15،16،17. والهدف من الدراسة هو وضع منهجيات أنيقة مستمدة من الجمع بين الأفكار من الدراسات السابقة مع التعديلات لإعداد وصورة الأنسجة الحساسة الناعمة (على سبيل المثال، أجنة الزواحف، قشر البيض من السلاحف المطلية، والثقافات الفطرية).
اختيار طريقة تحديد مناسبة هي الخطوة الأولى الأكثر أهمية للتحليل المجهري للعينات البيولوجية. إصلاح الأنسجة مباشرة بعد عزل من كائن حي أمر ضروري لمنع التغيير في مورفولوجيا بسبب التحلل. يجب على المثبت الفعال إنهاء العمليات الخلوية عن طريق permeating الخلايا بسرعة والحفاظ على تأثير لا رجعة فيه لتحقيق الاستقرار في هيكل العينة لتحمل كل من خطوات المعالجة اللاحقة والفحص تحت SEM17 , 18.على الرغم من أن العديد من أساليب التثبيت الكيميائي والفيزيائي معروفة، والتثبيت الكيميائي هو أكثر شيوعا للعينات البيولوجية لتجنب أي تغييرات الخلوية بسبب الانهاليس التلقائي، وتعفن، وآثار التجفيف. هناك العديد من التركيبات الكيميائية المثبتة التي نوقشت في الأدب17،19،20،21،22،23،المثبتات التي تعمل عن طريق denaturing و تخثر الجزيئات البيولوجية، وتلك التي تصلح من خلال الجزيئات الكبيرة عبر التشابك بشكل مشترك. وتستخدم المشروبات الكحولية كالمثبتات denaturing التي تحافظ على البنية الفائقة سيئة جدا وتستخدم في الغالب للميكروسكوب الخفيفة ولا ينصح لتحليل مجهري الإلكترون. المثبتات عبر ربط مثل الفورمالديهايد، الجلوتارهايد، وأوستروكسيد الأوميوم خلق الترابط بين الجزيئية وداخل الجزيئية بين الجزيئات الكبيرة داخل الأنسجة، وتوفير الحفاظ ممتازة من الهياكل الفائقة11 ،24،25،26. العينات البيولوجية حساسة لدرجة الحرارة. ينصح درجة الحرارة في بداية التثبيت أن تكون 4 درجة مئوية للحد من الحركة الجانبية للبروتينات الغشاء، لإبطاء انتشار الجزيئات بين الخلايا، وإبطاء معدل التثبيت11. الوقت اللازم لإصلاح الأنسجة يعتمد إلى حد كبير على حجم العينة والسرعة التي ينتشر المثبت ويتفاعل مع مكونات العينة. تثبيت بين عشية وضحاها في 4٪ paraformaldehyde أو 3٪ الجلوتالالديهايد في PBS في 4 درجة مئوية هو الأسلوب المفضل لتحليل SEM من العينات المستخدمة في هذه الدراسة لخصائصها اختراقية متسلسلة، والتي تسمح عينات حساسة أصغر ليتم معالجتها17 , 18 سنة , 19 سنة , 20 , 27-وزيدت خطوة ما بعد التثبيت مع تتزاز الأوميوم ليس فقط بسبب طبيعته السامة ولكن أيضاً تبين أنه لا يطبق أي ميزة إضافية لتحسين جودة الصورة للعينات التي تم تحليلها في هذه الدراسة.
تحتوي العينات البيولوجية على سوائل تتداخل مع عملية SEM؛ وبالتالي، فإن العينات تحتاج إلى أن تجفف قبل إدراجه في غرفة عينة SEM. بمجرد ضمان الجفاف، يجب إزالة المذيب من الأنسجة دون إنشاء القطع الأثرية في العينات بسبب التوتر السطحي / التجفيف. وكانت هناك ثلاث طرق تجفيف مختلفة تستخدم عادة أثناء معالجة الأنسجة لتصوير SEM: تجفيف الهواء، وتجفيف نقطة حرجة، وتجميد عينات التجفيف28،29،30،31. عدد قليل من الدراسات تقرير جميع أساليب التجفيف الثلاثة التي تنتج نتائج متطابقة مع عينات الأنسجة الحيوانية28،29،30،31. ومن الممارسات العامة المستخدمة في العينات الصغيرة الجفاف الكيميائي عن طريق سلسلة تركيز تصاعدية من الكحول وسداسي ميثيل الديسيلازان (HMDS)، ولكن يتم تجفيف عينات أكبر باستخدام أداة تجفيف نقطة حرجة (CPD)32. خلال عملية التجفيف، شكلت قوى كبيرة في تجاويف صغيرة التي يتم تمريرها من خلال العينة عن طريق واجهة السائل / الغاز؛ هذا يمكن أن يؤدي حتى إلى انهيار كامل للهياكل جوفاء33. ويمكن عندئذ أن يخطئ أي تشوه يحدث بسبب العلاج كسمة هيكلية أصلية للعينة. وبالتالي، ينبغي القضاء على الظاهرة المعممة للمعالجة، وينبغي توحيد عملية تجفيف فريدة من نوعها لكل نوع من الأنسجة خاصة عندما يتم تحليل عينات الأنسجة الحساسة.
في العديد من التجارب التي أجريت باستخدام مزيج مختلف من جميع العمليات المذكورة أعلاه، قمنا بتوحيد الأساليب التي يمكن استخدامها لتحليل SEM لثلاثة أنسجة حساسة: أجنة الزواحف، وقذائف البيض من السلاحف المرسومة، والثقافات الفطرية. يصف علماء الأحياء التنموية وعلماء المورفولوجيا التكوين الطبيعي وغير الطبيعي أثناء نمو الأجنة في الحيوانات الفقارية التمثيلية. تعتمد التحقيقات في مسارات الإشارات الجينية على الوصف المورفولوجي للهياكل الجديدة. لتجنب أي تغيير مفاجئ في بنية الأجنة الفقارية أثناء تحليل SEM، نوصي بالتجفيف الكيميائي بعد الجفاف. التجفيف الكيميائي باستخدام HMDS هو أحدث طريقة تجفيف نسبيا وتشمل المزايا السرعة النسبية، وسهولةالاستخدام، وفقدان التكلفة، والخبرة المحدودة والمعدات اللازمة 9. CPD هو تقنية التجفيف شائعة الاستخدام باستخدام تمرير ثاني أكسيد الكربون2 عبر العينات في درجة حرارة والضغط محددة. لقد حددنا أن HMDS مناسب لتجفيف الأنسجة الحساسة الناعمة ويسمح بمعالجة عينات أكبر مقارنة بتجفيف النقاط الحرجة، مما تسبب في تشوه واسع النطاق للأنسجة الجنينية. وقد استخدمت عدة طرق لإعداد عينات لتصوير SEM لدراسة الخصائص المورفولوجية للفطريات34. يتم إصلاح العينات الفطرية عادة في تتزاز أوزميوم تليها جفاف الإيثانول وتجفيف نقطة حرجة، والتي قد توفر نتائج مرضية، على الرغم من أن الآثار السامة لأكسيد الأوساميوم6و7و35 وفقدان المواد الفطرية أثناء تغيير الحلول أثناء المعالجة هي عيوب واضحة. كما تم ممارسة تقنية إعداد العينات باستخدام تجفيف الهواء دون تثبيت36 ولكن النتائج في هياكل تقلصت ومطوية، ومراقبة مثل هذه العينات يمكن بسهولة أن يساء تفسيرها مع تميز الأنواع. الهيفا الفطرية يفقد سلامتها في الاتصال مع السوائل وحتى التجفيف قد لا يتحقق لاستعادة الهيكل. ونتيجة لهذا الغرض، يستخدم تجميد التجفيف عادة لتجفيف الأنسجة الرخوة مثل الميسليوم الفطري. تجميد التجفيف يعمل بشكل جيد للمواد النظيفة ولكن وجود أي أملاح أو إفراز سوف تحجب التفاصيل السطحية التي سيتم تحديدها فقط في مرحلة مشاهدة SEM. نحن جنبا إلى جنب مع طريقة ثقافة الشريحة مع إصلاح الجلوتارهايد والتجفيف نقطة حرجة لإنتاج التفاصيل الهيكلية من الهيبهاي الفطرية سليمة والجراثيم. على الرغم من أن تجفيف CPD تسبب انكماش في الأجنة، أدى إلى هياكل مسيليال الحفاظ عليها بشكل جيد عندما يقترن تثبيت الجلوتالالديهايد. قشر البيض هو من الأهمية بمكان لجنين الحيوانات oviparous ليس فقط من خلال العمل كغطاء وقائي ولكن أيضا توفير الاستقرار الميكانيكي، نفاذية للغاز والماء، واحتياطي الكالسيوم للجنين النامية. وتصنف قشرة بيض السلاحف في المياه العذبة على أنها "جامدة" علىأساس هيكلها، ونظرا لتوافرها قد تلقت اهتماما كبيرا من علماء الأحياء 1،2،3،4 , 5 , 6 , 7 , 37 , 38.
نحن بالتفصيل طرق بسيطة لسهولة فحص قشر البيض وأغشية قذيفة من السلاحف المطلية التي يمكن تطبيقها على أي أنواع قشر البيض جامدة. وتم تقييم منهجيات الإعداد على أساس جودة الصورة الناتجة عن ذلك وانخفاض القطع الأثرية المحتملة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: تم جمع السلاحف المطلية(Chrysemys picta)البيض المستخدمة في هذه الدراسة خلال موسم التعشيش من مايو حتى يونيو 2015-16 من محطة رايس كريك الميدانية، أوغويغو نيويورك بإذن تم الحصول عليها من وزارة البيئة في ولاية نيويورك الحفظ (DEC).
1. طريقة التجفيف الكيميائي لمعالجة الأجنة لSEM
- جمع بيض السلاحف من المواقع الميدانية خلال موسم التعشيش. إعداد غرف الحضانة مقدما، مصنوعة من صناديق بلاستيكية مع أغطية (L × W × H) 6.7 سم × 25.4 سم × 10.2 سم مليئة الفراش المتوسطة أعدت مع خليط رطب من الفيرميكوليت والخث الطحلب (1:1 نسبة). جعل 4-6 ثقوب من حوالي 0.25 سم على طول جانبي الصناديق وعلى الغطاء للسماح بـ aeration.
- إزالة التربة بلطف من العش للكشف عن البيض. مسح سطح بيض السلاحف مع صبغة اليود المخففة (1:25,000) للسيطرة على التلوث الميكروبي أثناء الحضانة. وضع براثن منفصلة عن بعضها البعض، قد يختلف حجم مخلب من السلاحف رسمت من 5-9 البيض ووضع الحد الأقصى من 8-9 البيض لكل مربع.
ملاحظة: التعامل بعناية مع البيض أثناء جمع، مسح، وضع العلامات ووضع داخل مربعات. موقف ومحاذاة البيض يجب أن تكون هي نفسها كما وضعت، أي حركة سوف تمنع نمو الأجنة. - دفن يدويا نصف البيض في الفراش، وتغطية ووضع مربع داخل الحاضنة تعيين في 30 درجة مئوية. حضانة البيض لمدة 10-17 يوما للحصول على المراحل الجنينية 12 و 13 و 18 على التوالي المستخدمة في هذه الدراسة. إضافة الماء المقطر لبلل جزئيا الفراش المتوسطة كل يوم لتجنب الجفاف والحفاظ على مستوى الرطوبة للتنمية الطبيعية للأجنة.
ملاحظة: الحضانة والأجنة المرحلية هي وفقا لجدول النمو الكامل نشرت في وقت سابق39. - إصلاح الأجنة عن طريق جعل أول قطع على جانب واحد من قشر البيض الظهري وغشاء صفار البيض معا، عمودي إلى محور طويل باستخدام مقص مدبب. أدخل المقص في صفار البيض بعناية لتجنب قطع القرص الجنيني. الآن قطع الجانب الجانبي من البيض على طول المحور الطويل ومن ثم قطع الجانب الآخر من البيض على طول المحور القصير.
- قشر فتح قطعة مقتطعة مع جانب الجنين حتى باستخدام ملقط. قطع الجانب الجانبي الآخر من قشر البيض ووضع قطعة مقتطعة في الفوسفات المخزنة المالحة (PBS في الحموضة من 7.4).
ملاحظة: يتم تعبئة بيضة السلاحف مع صفار البيض لزجة للغاية والجانب الظهري من الجنين يلتزم غشاء قشر البيض. يتغير غشاء قشر البيض بالقرب من الجنين مع الحضانة من الأبيض الشفاف إلى الأبيض الطباشيري غير الشفاف. وهذا يسمح للمرء بتحديد موقع الجنين في وسط المحور الطويل وينظر إليه على أنه بقعة مكلسة داكنة من الخارج40،41. - استخدام مجهر مجسم لعزل الأجنة جنبا إلى جنب مع غشاء صفار البيض عن طريق تقشير لهم من قشر البيض باستخدام ملقط. إزالة الأغشية خارج الجنين باستخدام ملقط ومقص صغير. نقل الجنين باستخدام ملعقة جنين إلى PBS الطازجة في طبق بيتري لغسل أي دم أو صفار.
- استخدام لوحات واضحة 12 جيدا لإصلاح الأجنة بين عشية وضحاها في 4٪ بارافورمالدهايد في PBS في 4 درجة مئوية أو في 2-3٪ الجلوتارهايد في PBS. ضع واحد إلى ثلاثة أجنة في كل بئر اعتمادا على حجم الأجنة. تأكد من التسلل الكامل (ستظهر العينات باللون الأبيض) للأجنة القديمة من خلال تمديد فترة التثبيت لمدة 2-3 أيام. شطف الأجنة 3X مع PBS الطازجة لمدة 5 دقائق كل شطف.
ملاحظة: تجنب إتلاف سطح الجنين باستخدام إدراج البوليسترمع قيعان شبكة البوليستر للوحات 12 جيدا لنقل العينات من مذيب واحد إلى آخر. - عينات الجفاف باستخدام سلسلة من تركيز الإيثانول في الماء المقطر: 30٪، 50٪، 70٪، 80٪، 95٪، و 100٪ وعلاج العينات لمدة ساعة واحدة في كل محلول الجفاف. كرر الخطوة مع الإيثانول 100٪ مرتين لضمان الجفاف الكامل. إذا لم تستخدم على الفور، وتخزين عينات في الإيثانول 70٪ في -20 درجة مئوية لفترة أطول.
- الأجنة الجافة باستخدام سلسلة من سداسي ميثيل ديسيلازانا (HMDS) إلى 100٪ تركيز الإيثانول: 1:2، 2:1 و 100٪. ترك العينات في كل حل لمدة 20 دقيقة والحفاظ على طبق بيتري مغطاة جزئيا خلال هذه العملية.
ملاحظة: تنفيذ جميع الخطوات التي تنطوي على HMDS في غطاء محرك السيارة الدخان مع معدات الحماية الشخصية اللازمة كما HMDS هو سام للغاية. - ترك الأجنة في الحل النهائي 100٪ HMDS مغطاة كليا أو جزئيا في غطاء الدخان بين عشية وضحاها مما يساعد في تبخر HMDS، وترك العينات جاهزة لتركيب وطلاء التأتأة. يُغطّى الطبق لإزالة الغبار الذي يستقر فوق العينات.
ملاحظة: سوف تظهر الأنسجة البيضاء بعد التجفيف الكامل والعينات المجففة جزئيا سوف تبدو صفراء في اللون، وترك هذه الأنسجة في غطاء محرك السيارة الدخان لفترة أطول. - اختيار حجم كعب الألومنيوم والكربون شريط لاصق لكل حجم العينة تحليلها. قم بتركيب العينات المجففة بعناية على كعب دبوس الألومنيوم القياسي (12.7 مم × 8 مم) باستخدام شريط موصل كربوني مزدوج العصا (12 مم).
- إدخال عينات شنت في غرفة المغطي تلعثم لمعطف العينة مع فيلم رقيقة جدا من الذهب للقضاء على تأثير تهمة. لوحة ذهبية العينات ل60-120 s في 35 mA التأتأة.
- جبل كعب إلى لوحات المسام المقابلة عن طريق ربط بأمان setscrews. نقل حامل العينة إلى أو خارج غرفة عينة SEM باستخدام أداة تبادل العينة. صورة العينات في وضع فراغ عالية مع الجهد شعاع تسارع من 10 كيلوفولت والانبعاثات الحالية 10 درجة مئوية.
ملاحظة: دائما ارتداء القفازات أثناء التعامل مع العينات، وأصحاب العينات، وكعب تصاعد، وأدوات نقل لتجنب تلوث الشحوم من اليدين إلى نظام SEM. - اختبار التقنيات البديلة المذكورة أدناه لمقارنة دقة العينات التي تم الحصول عليها من الإجراء أعلاه.
- وتشمل مرحلة ما بعد التثبيت مع 1٪ تتزاز أوزميوم لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة بعد الخطوة 1.7.
- إزالة جزئيا أو كليا HMDS في الخطوة 1.10 للتبخر السريع من HMDS.
- معالجة الأجنة بعد الخطوة 1.8 باستخدام التجفيف النقطة الحرجة (CPD) باتباع الخطوات 3.3-3.4.
2. إعداد قشر البيض لSEM باستخدام طريقة تجفيف الهواء
- جمع واحتضان السلاحف المطلية(Chrysemys picta)البيض لإصلاح الأجنة كما هو محدد في الخطوات 1.1-1.7.
- حفظ قشر البيض في الماء المقطر بعد تثبيت الجنين في الخطوة 2.1. تنظيف قشر البيض جيدا عن طريق نقع في الماء المقطر لمدة ساعة واحدة على الأقل للقضاء على الصفار والتلوث الزلال.
- قشر البيض الجاف للهواء بعد غسلمناديل الاستاتيكيه الحساسة في غطاء الدخان بين عشية وضحاها. تخزين قشر البيض المجفف في زجاجات عينة نظيفة وصفت من قبل عدد والمرحلة.
- جبل، معطف التأتأة وصورة العينات باتباع الخطوات المحددة في الخطوات 1.11-1.13.
3. طريقة التجفيف نقطة حرجة لإعداد الثقافات الفطرية لSEM
- إنشاء ثقافات الشرائح
- إعداد البطاطا سكر العنب أجار (المساعد الشخصي الرقمي) وسائل الإعلام للثقافات الفطرية: إضافة 39 غرام من قوة المساعد الشخصي الرقمي في 1 لتر من الماء المقطر في قارورة Erlenmeyer. مزيج جيدا عن طريق دوامة قارورة والأوتوكلاف وسائل الإعلام في 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
ملاحظة: بعد التعقيم، يجب أن يكون حل أجار الساخنة وأنها لن تترسخ قريبا. تبريده بما فيه الكفاية بحيث لا تعطيل المضادات الحيوية. - مزجها من قبل دوامة وصب لوحات (ما يقرب من 10-12 مل من وسائل الإعلام لكل طبق بيتري 10 سم)، كومة بعناية والسماح ترسيخ.
- استخدام شفرة مشرط معقمة لقطع كتل صغيرة من أجار حوالي 1/2 إلى 3/4 بوصة. إزالة ووضع كتلة أجار على شريحة المجهر الزجاج نظيفة.
- ضع الشريحة في طبق بيتري نظيف لمنع التلوث والحفاظ على الرطوبة أثناء الحضانة.
- رفع الشريحة من الجزء السفلي من طبق بيتري باستخدام مسواك معقمة لخلق التوتر السطحي بين لوحة والشريحة لإزالة الشريحة الزجاجية دون تعطيل النمو الدقيق بعد الحضانة.
- استخدام حلقة معقمة أو إبرة لنقل بعض الفطريات من إينوكولوم العينة إلى كل من الجوانب الأربعة من كتلة أجار على الشريحة.
- ضع غطاء نظيف على سطح كتلة أجار بعد التلقيح. إضافة بضع قطرات من الماء المقطر المعقمة إلى طبق بيتري حول الشريحة لضمان الرطوبة للفطريات المتنامية.
- ختم لوحة جزئيا باستخدام فيلم البارافين واحتضان لوحة في 30 درجة مئوية لمدة مناسبة من الزمن (لحضانة الأنواع Fusarium لمدة 36 إلى 48 ساعة).
- إزالة الشريحة من طبق بيتري وفصل غطاء التمسك بإحكام من كتلة أجار باستخدام ملقط معقمة. إصلاح كتل أجار في 3٪ الجلوتالالدهايد في PBS بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
- إعداد البطاطا سكر العنب أجار (المساعد الشخصي الرقمي) وسائل الإعلام للثقافات الفطرية: إضافة 39 غرام من قوة المساعد الشخصي الرقمي في 1 لتر من الماء المقطر في قارورة Erlenmeyer. مزيج جيدا عن طريق دوامة قارورة والأوتوكلاف وسائل الإعلام في 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- تجفيف العينات عن طريق تمرير من خلال سلسلة الإيثانول: 10٪، 25٪، 50٪، 75٪ و 90٪ مع 15 دقيقة لكل تغيير. معالجة العينات للجفاف النهائي مع تغييرين في الإيثانول 100٪ تستمر 30 دقيقة لكل منهما لضمان التشبع الكامل.
- التجفيف النقطة الحرجة: وضع عينات المجففة في غرفة جهاز CPD. ختم وتبريد الغرفة عن طريق فتح الصمامات للسماح السائل CO2 في وتنفيس الإيثانول بها، حتى السائل CO2 يملأ تماما الغرفة.
- ختم وتسخين الغرفة ببطء لتحقيق نقطة حرجة عندما يتجاوز ضغط الغرفة 1000 رطل لكل بوصة مربعة وتتجاوز درجة الحرارة 31 درجة مئوية، ومرحلة السائل والغاز منثاني أكسيد الكربون في التوازن. استنزاف ببطء CO2 من الغرفة والعينة كغاز لتجنب آثار التوتر السطحي.
- تنفيذ التركيب وطلاء الذهب وتصوير العينات باتباع الخطوات المحددة في الخطوات 1.11-1.13.
- إجراء تحليل مقارن عن طريق تجفيف العينات كيميائيا من الخطوة 3.2 باستخدام HMDS باتباع الخطوات 1.9-1.13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويبين الشكل 1 التحليل المجهري للإلكترون للسلحفاة المطلية (Chrysemyspicta) الأجنة. تم استخدام بيض السلاحف المطلية التي تم جمعها واحتضانها على وسط الفراش، التي شنت على كعب الألومنيوم بعد التجفيف الكيميائي لتصوير SEM (الشكل1A-E). تظهر الرؤية الجانبية للجنين في المرحلة 12 هياكل الوجه القحفي. تمتد البروز الفكية إلى ما وراء الفك السفلي وتحد من حفرة أنفية ملحوظة بشكل جيد. كما لوحظت خمسة أقواس البلعوم (الشكل1F). somites شكلت حديثا في منطقة الذيل الخلفي للجنين يمكن عدها بسهولة بالمقارنة مع somites الجسم مجزأة. تظهر براعم الأطراف الخلفية لفترة أطول مقارنة ببراعم الأطراف الخلفية ونقاط أكثر من التهوية. وينظر إلى نمو واضح المعالم من التلال carapace على طول المنطقة بأكملها بين الأطراف الجناح من المرحلة 15 الجنين (الشكل1G. في المرحلة 18، تمتلك السلاحف المطلية حالة قصيرة، توقع بضعف. تقع المنقار السفلي داخل الفك العلوي وانقلبت قليلا مع هوك المحطة الطرفية التي تناسبها في الشق المركزي من المنقار العلوي (الشكل1H). يظهر الفك العلوي للسلاحف المطلية مظهرًا مُحقًا يُشكّل طرفًا جانبيًا على شكل حرف U-V مع قبّة صغيرة على كل جانب، ويبدأ سن البيض الصغير في التشكل عند طرف الفك العلوي. براعم الأطراف التي ظهرت لفترة أطول خلال المراحل السابقة تشكل هيكل اشبه بالتجديف خلال المراحل 13-14 مع لوحة رقمية يشار إليها بشكل غامض. وينظر إلى mesenchyme الأطراف التي تم رسمها من قبل التلال ectodermal apical على طول الهوامش الأمامية الخلفية (الشكل 1I-J).
ويبين الشكل 2 التحليل الهيكلي للغاية لقشر البيض بيكتا وغشاء القشرة باستخدام التصوير SEM. تم الحصول على قشر بيض السلاحف المطلية كما هو موضح أعلاه وتعرضت لتجفيف الهواء بعد الغسيل بالماء المقطر المزدوج (الشكل2A،B). تم تصوير قشر البيض المثبتة على كعب الألومنيوم مع شريط الكربون على الوجهين (الشكل2C)باستخدام SEM. وأظهرت وجهة نظر جانبية من قذيفة طبقة قشر البيض الكلسي الخارجي تعلق بقوة إلى غشاء قذيفة خيوط ية الداخلية (الشكل2D). يتكون السطح الخارجي لقشرالبيض من وحدات قذيفة معدنية متميزة، مصنوعة من عقيدات كروية/كروية مرتبة في مجموعات وبين وحدات القشرة المجاورة كان تركيز المنخفضات المستديرة الصغيرة أو المسام من مختلف الأحجام لاحظ(الشكل 2هاء). العقيدات من كل مجموعة من وحدات قذيفة يجتمع عند تقاطع اتصال، نقطة الوسط (الشكل2F). تم تقشير السطح الخارجي يدويًا باستخدام ملقط لمراقبة سطح غشاء القشرة. وشوهدت صفوف من لويحات مركزية التي توفر نقطة المرفق بين وحدات قذيفة والغشاء الليفي الكامنة متعددة الطبقات (الشكل2G).
ويبين الشكل 3 التوصيف المورفولوجي لعزل الفطريات من ثقافات الشرائح التي لوحظت باستخدام التصوير SEM. وضع مخطط لإعداد ثقافة الشريحة (الشكل3أ)يظهر النمو الفطري على كتلة أجار في غضون يومين من التلقيح. المستعمرات تنمو بسرعة مع الأبيض إلى كريم الملونة ميسليوم الجوي (الشكل3B). كشف التصوير SEM بعد التجفيف نقطة حرجة وطلاء التأتأة من شرائح أجار الهيبهاي الفطرية، conidia منحنية، والأرز مثل الجراثيم. وقد شوهد Conidiophores الناشئة أفقيا من الهيبهاي الجوي الحاجز (الشكل3C). Macroconidia المنتجة على أقصر، وconidiophores المتفرعة منحنية بشكل معتدل، مع قصيرة، حادة apical وغير واضح pedicellate الخلايا القاعدية في الغالب الحاجز (الشكل3D).
ويبين الشكل 4 النتائج المقارنة لتجهيز العينات المماثلة باستخدام تقنيات بديلة. غمر رؤساء المرحلة 15 الأجنة في HMDS والتجفيف عن طريق التبخر التدريجي تظهر هياكل الجمجمة والوجه المحفوظة جيدا، وينظر تقريبا أي انكماش أو تشويه مع أوقات طويلة من التبخر البطيء من HMDS (الشكل4A). ولم تظهر الأجنة بعد الثابتة مع تتزاز أوزميوم أي فرق ملحوظ في جودة الصورة باستثناء انكماش طفيف في الأنسجة مقارنة بالمعالجة البطيئة لـ HMDS (الشكل4B). تجفيف الأجنة عن طريق إزالة HMDS جزئيا أو كليا مما يسمح بالتبخر السريع يؤدي إلى تشويه الهيكلية والانكماش (الشكل4C)،في حين أن التبخر البطيء حل الهياكل السطحية ممتازة من الجنين على غرار ( الشكل 4 A).وشوهدت القطع الأثرية التجفيف في الأجنة المعالجة مع تقنية CPD مما تسبب انكماش واسعة وتدمير الأنسجة (الشكل4D,E). شرائح أجار من الثقافات الشريحة تظهر التجفيف غير الكامل للعزل الفطري مع العلاج HMDS مقارنة مع CPD (الشكلF). يتم تحقيق التجفيف الكامل مع العلاج CPD من شرائح أجار مع عينة بيضاء المجففة جيدا تظهر الميزات الهيكلية عالية الدقة سليمة من الهيبهاي الفطرية والجراثيم (الشكل4G-G'). كتل أجار مع الثقافات الفطرية تظهر تقلصت والأصفر في اللون مما يجعلها غير مناسبة لتصوير SEM (الشكل4H-H').
الشكل 1 المسح الضوئي للميكروغرافيا الإلكترونية: كريسيمابيك الأجنة التي تعدها التجفيف الكيميائي. (أ) Chrysemys picta، التعشيش خلال موسم التكاثر في محطة رايس كريك الميدانية، أوغويغو، نيويورك. (B) عش جيد البناء من الخارج. (C) إزالة التربة السطحية مع الحرص على التعرض البيض وضعت. (د) البيض وضعت في غرفة الحضانة مع الفراش المتوسطة. (E) تصاعد الأجنة على كعب الألومنيوم بعد التجفيف الكيميائي، E4 تظهر الجنين المغلفة التأتأة. (F) عرض جانبي للجنين المرحلة 12 تظهر هياكل الوجه، براعم الأطراف وsomites. (ز) ينظر إلى التلال الكارابيس محددة جيدا وبراعم الأطراف على شكل مجداف في المرحلة 15. (H) هياكل الجمجمة والوجه من المرحلة 18 الجنين تظهر الفك العلوي والسفلي، لاحظ سن بيضة صغيرة شكلت في طرف منقار العلوي. (I) منظر دورسال للأطراف اليمنى في المرحلة 13-14 ونظرة عن قرب من AER (J) عند الحدود الظهرية البطنية. قضبان الحجم: F-H، 500 ميكرومتر؛ I, 100 μm, and J, 10 μm. Keys: mb, midbrain; np, nasal pit; mxp, maxillary prominence; pa, pharyngeal arches; h, heart; fl, forelimb; s, somite; hl, hind limb; t, tail tip; cr, carapacial ridge; et, egg tooth; oc, cavity, e, eye; uj, upper jaw; lj ، الفك السفلي؛ م، mesenchyme، AER، الحافة ectodermal apical. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 التحليلات الهيكلية جدا ً لقشرة البيض المجففة في الهواء وغشاء قشرة بيض السلاحف المطلية. (أ) بعد إصلاح الأجنة، تم غسل قشر البيض جيدا في الماء المقطر لإزالة صفار البيض والزلال. (ب) كانت قشر البيض نظيفة المجففة الهواء على الأقل بين عشية وضحاها. (C) تركيب قشرة البيض على كعب الألومنيوم. (د) عرض شعاعي لشظية قذيفة تظهر طبقة الكلسي الخارجي وغشاء قذيفة الداخلية. (هـ)الطبقة الكلسية الخارجية يظهر وحدات قذيفة كروية (سو) مرتبة في مجموعات والمسام ينظر في بين هذه الوحدات (العلامات النجمية). (F) عرض مكبر للعقيدات التي تظهر نقطة الوسط (ج) بين وحدات قذيفة. (G) إزالة طبقة الكلسي يظهر السطح الخارجي لغشاء قذيفة مع الاكتئاب اليسار مكسورة من وحدات قذيفة. قضبان الحجم: E، 100 درجة مئوية؛ F, 10 μm, and G, 20 μ. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 إعداد الثقافة الفطرية لتصوير SEM. (أ) رسم تخطيطي لإظهار إعداد ثقافة الشريحة. (ب) المستعمرات الفطرية الملونة البيضاء ينظر على كتلة أجار بعد يومين من الحضانة في 30 درجة مئوية. (C) صورة SEM تظهر قسما من mycelium من Fusarium solani، العلامات النجمية السوداء بمناسبة ماكروكونيديا في sporodochia ، وهو سهم يشير إلى phialide ، ورؤوس الأسهم الموجهة نحو microconidia ، شريط مقياس ، 10 ميكرومتر (د) صورة مكبرة من الحاجز الكلاميديا ، شريط مقياس 5 ميكرومتر مفاتيح : أب ، كتلة أجار ؛ CS ، غطاء؛ و ، و ، و الثقافة الفطرية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4 تحليل مقارن للتقنيات البديلة لمعالجة عينات مماثلة. (أ) رؤية أمامية من رأس السلاحف المطلية المجففة مع التبخر البطيء من HMDS (A)، بعد تحديد بعد مع تتكسيد الأوميوم (B)، أسرع التبخر السريع من HMDS (C)، وCPD(D-E). بما في ذلك خطوة ما بعد التثبيت باستخدام تتكسيد الأوسميوم لا تظهر أي فرق واضح في جودة الصورة مقارنة مع العلاج HMDS دون تثبيت. وينظر إلى التشوهات بعد التبخر السريع من HMDS، في حين أن التجفيف التدريجي مع التبخر البطيء يوفر بنية سطح أفضل. وينظر إلى درجات مختلفة من الانكماش والهياكل المنهارة في مناطق الدماغ والعينين وبروزالوجه في الأجنة المعالجة مع CPD. (F) تصاعد الثقافات الشريحة معالجتها مع HMDS (1)، CPD (2) والصنبور المغلفة CPD علاج عينة (3) على الألومنيوم كعب. (G-G') التجفيف الكامل ينظر إليها على أنها سليمة شريحة أجار بيضاء اللون مع تلقيح الفطرية التي حققتها CPD الحفاظ على هياكل الفطرية وجراثيم Fusarium solani. (H-H') عدم كفاية تجفيف ثقافة الشرائح والانكماش والسلامة الهيكلية التالفة التي ينظر إليها مع تقنية الحفاظ على HMDS. قضبان مقياس: A-E، 500 ميكرومتر؛ G-H, 2 mm, and G'-H', 20 μm. Keys: et, egg tooth; oc, oral cavity; e, eye; uj, upper jaw; lj, lower jaw; العلامات النجمية السوداء ، ماكروكونيديا في سبوروديشيا . السهم ، phialide ، و ورؤوس الأسهم ، microconidia. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في دراستنا، تم اختبار عوامل التثبيت المختلفة، وطرق الجفاف والتجفيف لإعداد ثلاث عينات بيولوجية حساسة مختلفة لتصوير SEM: الأجنة، قشر البيض، والثقافات الفطرية. يستخدم SEM عادة لتحليل السطح، لذلك الاختراق المثبت هو أقل فيما يتعلق، ولكن يجب أن يكون مفهوما أن الهياكل الداخلية الثابتة سيئة سوف يسبب تقلص الداخل و / و/وانهيارات الهياكل السطحية. وينبغي أيضا النظر في تمديد وقت التثبيت لعينات الأنسجة أكبر، واستبدال الحل المثبت عدة مرات اعتمادا على مدة التثبيت. بسبب التفاعل النشط بين المثبت والأنسجة ، فإن الخصائص التناضحية للخلايا تتغير إلى حد كبير. سوائل الأنسجة من شأنها أن تضعف المثبتوبية وبالتالي تأثير الألدهيد المساهمة في التناضح الكلي يمكن إهمالها بقدر ما يتعلق الأمر الآثار على حجم الخلية. أيضا، فإن الفورمالديهايد تخترق أسرع في الأنسجة وأكثر فعالية كما عبر linker بالمقارنة مع الجلوتالدهايد. كما تم الإبلاغ عن خليط الفورمالديهايد الجلوتارهايد العازل لتحديد مجموعة واسعة من الأنسجة، على الرغم من أن الحلول المخففة وتعليق الخلايا كانت أكثر ملاءمة لتحديد15،16. ومع ذلك، فإن الحلول المخففة هي أيضا فرط التوتر، وبالتالي فإن الألدهيدات ليست نفسها نشطة osmotically. بالنسبة للعينات الدقيقة المستخدمة في هذه الدراسة، تم استخدام PBS في pH 7.4 كوسيلة لعوامل التثبيت، حيث يعتقد أن مخازن الفوسفات أكثر تشابهاً مع البيئات السيتوبلازمية لمعظم العينات البيولوجية. وعلاوة على ذلك، يتم تحديد التناضح ضمن النطاق الفسيولوجي المطلوب للعينة في حين أن PBS تعمل كوسيلة لوكيل التثبيت. وغالبا ما ينصح بعد التثبيت مع تتكسيد الأوسميوم لمختلف العينات البيولوجية16،22،42 ولكن تم القضاء عليها لجميع العينات البيولوجية المستخدمة في هذه الدراسة. وقد أسفرت العينات التي لم تُنتج عن أكسيد الأوميوم عن صور وعينات واضحة مثبتة بأكسيد الأوسميوم أسفرت عن نتائج لا يمكن تمييزها (الشكل4ألف). أوزميوم تيتراكسيد يسبب تشويه هياكل الأنسجة الورقية وتسفر عن حفظ عينة أفقر بالمقارنة مع الجلوتارلديهايد وخليط الفورمالديهايد43، وقد اقترح أن تراكم جزيئات الأوساميوم يمكن أن تمنع تسلل عوامل الجفاف والعوامل الانتقالية المستخدمة في CPD، والمذيبات مثل HMDS المستخدمة لتجفيف المواد الكيميائية. التأثير هو الأنسجة الخاصة واستبعاد تتكسيد الأوسميوم لن يكون لها أي تأثير على جودة الصورة لنوع العينات الحساسة التي تم تحليلها في هذه الدراسة. لأنواع أخرى من الأنسجة يمكن القضاء على استخدام تزاز أوزميوم مع التثبيت الأولي الموسع.
وأظهرت عينات الأجنة السلاحف المجففة HMDS الأسطح المحفوظة جيدا،وأقل تشويه أو انكماش بالمقارنة مع CPD (الشكل 4). CPD يقلل من فرصة لتشويه في مورفولوجيا الخلية وإنتاج القطع الأثرية بسبب التوتر السطحي صفر أو الحد الأدنى التي تم إنشاؤها خلال العملية. ومع ذلك، يمكن أن يسبب CPD خطرًا ماديًا محتملًا للعينات الهشة الحساسة. تمشيا مع ملاحظتنا، أنتجت HMDS التصوير مماثلة أو أعلى جودة من خلال تقليل التوتر السطحي الناجم عن التجفيف استنادا إلى الدراسات السابقة المنشورة44،45،46،47. بالمقارنة مع العلاج CPD، حفظ HMDS التفاصيل الهيكلية للشبكة العضوية بشكل ممتاز في الصمامات المحفورة وقذائف الحظيرة48 وقدمت دقة عالية من السمات الهيكلية للتنظيم الداخلي المعقد من mermithid الديدان الخيطية49 والحشرات الأنسجة الداخلية28. وشوهدت القطع الأثرية للوحة التجفيف بكميات كبيرة على العينات التي أعدتها تقنية CPD بالمقارنة مع تقنية HMDS. تم زيادة الأغشية والقطع الأثرية بيليه في خلايا عنق الرحم التي أعدت باستخدام تقنية CPD50. يتفاعل HMDS مع الماء لإنتاج سداسي ميثيل الديسيلوكسان والأمونيا، وكلاهما يتبخر من الجسم. يستخدم HMDS عادة في الكروماتوغرافيا الغاز لخلق الأثيرات السيليل من المركبات مثل السكريات والأحماض الأمينية والكحول، والعديد من المركبات الأخرى. ومن غير المعروف ما إذا كان HMDS يتفاعل مع بعض هذه المركبات في الأنسجة. HMDS قد عبر البروتينات وتصلب الأنسجة خلال عملية التجفيف28، على الرغم من أن السبب الدقيق أن HMDS يوفر حفظ أفضل للأجنة لا يمكن تفسيرها باستثناء خصوصية الأنسجة. استناداً إلى نتائج تحقيقنا، تسبب CPD انكماش واسع النطاق بالمقارنة مع HMDS، وهو أكثر ملاءمة لمعالجة الأنسجة الجنينية، وخاصة لتحليل البنية السطحية للأجنة التي تم تنظيمها في وقت مبكر. لم يتم توضيح الآلية التي تعمل بها HMDS على تجفيف الأنسجة، على الرغم من أن التجفيف البطيء مع التبخر التدريجي في محيط لامائية مطلقة يمكن أن يكون سببا للحصول على بنية سطحية ممتازة للالحيوانات.
وقد استخدمت قطع صغيرة من كتل أجار مع المستعمرات الفطرية من الثقافات الشريحة التي أنشئت سابقا في هذه الدراسة لتجنب القضايا مع الحفاظ على رقيق الأصلي من حصيرة mycelial. التجفيف CPD من قطع أجار مع المستعمرات الفطرية أدى إلى تأثير الغسيل، في حين تم العثور على التغييرات في المثبتات، والمخازن المؤقتة، والإيثانول ليكون خيارا أفضل التغلب على الصعوبات مع تجميد التجفيف. لم تتمكن HMDS التي تعمل بشكل جيد بالنسبة للأجنة من جميع المراحل من حل الثقافات الفطرية، في حين أن تجفيف الهواء مع HMDS طرح مشكلة كبيرة: الشباك وفقدان الصلابة الهيكلية. في حين أن CPD يعمل بشكل جيد للثقافات الفطرية، فإنه تسبب في أضرار فورية للأجنة وخاصة في المراحل المبكرة من التنمية، مما تسبب في انكماش على السطح. ولم يلاحظ أي شحن أو تجفيف للقطع الأثرية عندما استخدمت HMDS وCPD للأجنة والثقافات الفطرية، على التوالي. بالنسبة للأنسجة الصلبة مثل قشر ة البيض من السلاحف، لا يلزم معالجة خاصة باستثناء الغسيل وتجفيف الهواء في درجة حرارة الغرفة قبل تصاعد للتصوير.
بغض النظر عن طريقة التحضير، ينبغي استخدام خطوات تدرج الإيثانول التدريجي للحد من إمكانية تجفيف القطع الأثرية. في البداية، تم العثور على كل من عينات HMDS وCPD أن لديها القطع الأثرية السطحية مع انكماش بعد الجفاف وبروتوكولات التجفيف المتاحة في الأدب. بعد سلسلة من التوحيد، قررنا أن القطع الأثرية كانت نتيجة لجفاف الكحول. من المهم استخدام عملية جفاف بطيئة باستخدام زيادات الإيثانول أكثر تدرجًا أثناء الجفاف. أيضا، يجب أن تكون مدة كل تكرار أطول للأجنة مقارنة بالثقافات الفطرية. وعلاوة على ذلك، فإن خطوة إضافية في الإيثانول 100٪ ضمان تشبع موحد كامل. يمكن إزالة HMDS كلياً أو جزئياً للسماح بتجفيف الهواء من العينات، ولكن تم العثور على التعرض الموسع لHMDS والتجفيف التدريجي للهواء عن طريق التبخر لتكون فعالة للأجنة لتجنب التعطيل (الشكل4A،C) الناجمة عن سطح كبير التوتر كما لوحظ لتعلق الخلايا الميكروبية51. غمر العينات في HMDS والتجفيف البطيء بين عشية وضحاها كشفت عن بنية سطح ممتازة في أنواع Daphnia52 مما يشير إلى أن الأنسجة الحساسة لينة يمكن أن تستفيد من عملية التجفيف البطيء. يمكن الحصول على جودة صورة مقبولة للأجنة مع التجفيف الكيميائي البطيء عن طريق زيادة تركيز HMDS تدريجيا إلى الإيثانول بعد الجفاف.
وقد شنت جميع العينات على كعب الألومنيوم باستخدام شريط الكربون على الوجهين لتوفير سطح موصل، ويمكن أيضا أن تستخدم معطف رقيقة من طلاء الأظافر عديم اللون إذا كان نفس العينة تحتاج إلى أن تكون صورة في اتجاه مختلف. يمكن إزالة العينات بسهولة من كعب الروتين عند استخدام طلاء الأظافر على سطح كعب وتحديد المواقع العينات في طائرات بديلة ممكن بالمقارنة مع استخدام الشريط الكربوني على الوجهين. كما العينات غير موصلة، فمن الضروري أن يبصقطبقة رقيقة من المعدن على العينات لزيادة التوصيل. تم استخدام هدف الذهب في هذه الدراسة أثناء طلاء التأتأة، وجولد البلاديوم أيضا ينتج نتائج مماثلة تجنب آثار الشحن. الجهد شعاع الصحيح يعتمد على عينة، للعينات المغلفة بخفة، والتصوير مع SEM الانبعاثات الميدانية في 2-5 كيلوفولت سوف توفر تعريفجيد للهياكل السطحية. للأنسجة مع طلاء كاف، 5 كيلو فولت عموما يوفر إشارة أفضل دون مزيد من اختراق شعاع. بالنسبة للعينات التي تفتقر إلى العمق والمغلفة بالذهب وحده، سمح التصوير في الجهد العالي (10 كيلوفولت) بتصور أفضل للطوبوغرافيا السطحية.
إعداد الأنسجة الحساسة لSEM يطرح تحديات مميزة، ويمكن استخدام مجموعة من تقنيات إعداد العينات للتغلب على وتقليل القطع الأثرية التصوير. نحن نقدم طرق شاملة لمعالجة ثلاث عينات مختلفة من الأنسجة البيولوجية الحساسة، لتصوير SEM: الأجنة، قشر البيض جامدة، والثقافات الفطرية. في تحقيقنا، تم إجراء تعديلات خفية على الأساليب الشعبية المتاحة من الدراسات المنشورة سابقا، وحددنا أساليب الجفاف والتجفيف الأكثر ملاءمة الخاصة بكل نوع من الأنسجة الحساسة. ويمكن تكييف هذه البروتوكولات للحصول على جودة صورة SEM مقبولة من عينات بيولوجية مماثلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
أصحاب البلاغ ليس لديهم ما يكشفون عنه
Acknowledgments
ويود المؤلفون أن يشكروا الدكتور دانيال بالداسار، سوني أوسووغو على المناقشات والتعليقات المفيدة على المخطوطة. وقد حظيت هذه الدراسة بدعم من منح رايس كريك المنتسبة، أوغويغو؛ منح التحدي سوني أوسويوغو والمؤسسة الوطنية للعلوم (NSF) المنح الصغيرة إلى PGL وJG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Fischer Scientific | S25127A | for slide cultures |
| Aluminum pin stub | Tedpella | 16111 | 12.7 mm x 8 mm |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: Potato Dextrose Agar | BD 213400 | DF0013-17-6 | Media for isolation and cultivation of Fungi, yeast and molds |
| Chloramphenicol | Fischer BioReagents | BP904-100 | Antibiotic for media |
| Coarse Vermiculite | Greenhouse Megastore | SO-VER-12 | bedding medium |
| Clear 12- well plate | Corning | 07-201-589 | for fixing embryo |
| Coverslips | Fischer Scientific | S17525B | for slide culture |
| Critical Point Dryer | Quorum CPD | EMS850 | critical point drying |
| Culture dishes | Fischer Scientific | 08 747B | DISH PETRI 100X10MM 12/PK |
| Ethanol | Fischer Scientific | A406P 4 | dehydration agent |
| Forceps- Aquarius Tweezers | Tedpella | 5804 | style 4, length 108mm, widh x thickness 0.017 x 0.17 mm |
| Glutaraldehyde | Fischer Scientific | G151-1 | fixative |
| Gold target for sputter coater | DENTON VACUUM | TAR001-0158 | Gold Target, 2.375″ D X .002″ |
| Hexamethyldisilazana | Fischer Scientific | C19479-5000 | chemical drying agent |
| Kim wipes | Kimtech | S-8115 | cleaning |
| Microscope slides | Thermo Scientific | 67-762-16 | for slide culture |
| Microscopy Scissors | Tedpella | 1327 | Double pointed, stainless steel, 100 mm L (3-5/8"). |
| Micro-scissors | Tedpella | 1346 | Vannas-type, straight, 80mm L |
| Moria Perforated Embryo Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Length 14.5 cm, tip diameter 20 mm, spoon depth 5 mm |
| Netwell Inserts | Corning | 0330B09 | 15 mm Inserts with 74 µm Mesh Size Polyester Membrane act as handy carriers during specimen processing into different solvents |
| Paraformaldehyde | Fischer Scientific | T353 500 | fixative |
| Peat moss | Walmart- Miracle Gro | 551705263 | bedding medium |
| PELCO tabs double stick carbon conductive tape | Tedpella | 5000 | 12 mm OD |
| Sputter coater | DENTON VACUUM | DESK V | thin metal coating |
| SEM | JEOL USA | JEOL JSM 6610LV scanning electron scope | electron microscopy |
References
- Packard, M. J. Ultrastructural Morphology of the Shell and Shell Membrane of Eggs of Common Snapping Turtles (Chelydra serpentina). Journal of Morphology. 165 (2), 187-204 (1980).
- Solomon, S. E., Watt, J. M. The structure of the eggshell of the leatherback turtle (Dermochelys coriacea). Animal Technology. 36 (1), 19-27 (1985).
- Sahoo, G., Mohapatra, B. K., Sahoo, R. K., Mohanty-Hejmadi, P. Ultrastructure and Characteristics of Eggshells of the Olive Ridley Turtle (Lepidochelys olivacea) from Gahirmatha, India. Acta Anatomica. 156, 261-267 (1996).
- Mitrus, S. The calcareous layer eggshell of the turtle Emys Orbicularis: Ultrastructure and composition. Italian Journal of Zoology. 70 (1), 13-16 (2003).
- Chang, Y., Chen, P. Y. Hierarchical structure and mechanical properties of snake (Naja atra) and turtle (Ocadia sinensis) eggshells. Acta Biomaterialia. 31, 33-49 (2016).
- Samson, R. A., Stalpers, J. A., Verkerke, W. A simplified technique to prepare fungal specimens for scanning electron microscopy. Cytobios. 24, 7-11 (1979).
- Kaminskyj, S. G. W., Dahms, T. E. S. High spatial resolution surface imaging and analysis of fungal cells using SEM and AFM. Micron. 39, 349-361 (2008).
- Wisse, E., et al. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World Journal of Gastroenterology. 16 (23), 2851-2866 (2010).
- Braet, F., De Zanger, R., Wisse, E. Drying cells for SEM, AFM and TEM by hexamethyldisilazane: a study on hepatic endothelial cells. Journal of Microscopy. 186 (1), 84-87 (1997).
- Echlin, P. Handbook of Sample Preparation for Scanning Electron Microscopy and X-Ray Microanalysis. , UK: Springer. (2009).
- Bell, P. B., Safiejko-Mroczka, B. Preparing whole mounts of biological specimens for imaging macromolecular structures by light and electron microscopy. International Journal of Imaging System Technology. 8 (3), 225-239 (1997).
- Bahr, G. F., Bloom, G., Friberg, U. Volume changes of tissues in physiological fluids during fixation in osmium tetroxide or formaldehyde and during subsequent treatment. Experimental Cell Research. 12 (2), 342-355 (1957).
- Baker, J. R. Principles of biological microtechnique; a study of fixation and dyeing. , Wiley. London Methuen; New York. (1958).
- Glauert, A. M. Practical methods in electron microscopy. Journal of Microscopy. 3, 5-65 (1974).
- Hayst, M. A. Biological Applications. Principles and techniques of electron microscopy, 4th ed. , Cambridge University Press. 13-105 (1970).
- Pathan, A. K., Bond, J., Gaskin, R. E. Sample preparation for SEM of plant surfaces. Materials Today. 12 (1), 32-43 (2010).
- Hayat, M. A. Electron microscopy: Biological applications. 4th ed. , Cambridge University Press. New York. (2000).
- Hayat, M. A. Fixation for electron microscopy. , Academic Press. New York. (1981).
- Karnovsky, M. J. A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolarity for use in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 27, 137-138 (1965).
- McDowell, E. M., Trump, B. F. Histologic fixatives suitable for diagnostic light and electron microscopy. Archives Pathology and Laboratory Medicine. 100, 405 (1976).
- Wisse, E., et al. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World Journal of Gastroenterology. 16 (23), 2851-2866 (2010).
- Fischer, E. R., Hnasen, B. T., Nair, V., Hoyt, F. H., Dorward, D. W. Scanning Electron Microscopy. Current Protocols in Microbiology. , Unit2B.2 (2012).
- Magalhaes, M., et al. Embryonic development of the Giant South American River Turtle, Podocnemis expansa (Testudines: Podocnemididae). Zoomorphology. 136 (4), 523-537 (2017).
- Hopwood, D. Fixatives and fixation: a review. The Histochemistry Journal. 1 (4), 323-360 (1969).
- Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde fixation. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 33 (8), 845-853 (1985).
- Bell, P. B., Rundquist, I., Svensson, I., Collins, V. P. Formaldehyde sensitivity of a GFAP epitope, removed by extraction of the cytoskeleton with high salt. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 35 (12), 1375-1380 (1987).
- Hayat, M. A. Glutaraldehyde: Role in electron microscopy. Micron and Microscopica Acta. 17 (2), 115-135 (1986).
- Nation, J. L. A new method using hexamethyldisilazane for preparation of soft insect tissues for scanning electron microscope. Stain Technology. 58 (6), 347-351 (1983).
- Bray, D. F., Bagu, J., Koegler, P. Comparison of hexamethyldisilazane (HMDS), Peldri II, and critical point drying methods for scanning electron microscopy of biological specimens. Microscopy Research Technique. 26 (6), 489-495 (1993).
- Barre, C., O'Neil, D., Bricelj, V. M. Preparation of large bivalve specimens for scanning electron microscopy using Hexamethyldisilazane (HMDS). Journal of Shellfish Research. 25 (2), 639-641 (2006).
- Lee, J. T. Y., Chow, K. L. SEM sample preparation for cells on 3D scaffolds by freeze-drying and HMDS. SCANNING. 33, 1-14 (2011).
- Araujo, J. C., et al. Comparison of hexamethyldisilazane and critical point drying treatments for SEM analysis of anaerobic biofilms and granular sludge. Journal of Electron Microscopy. 52, 429-433 (2003).
- Boyde, A., Bailey, E., Jones, S. J., Tamarin, A. Dimensional changes during specimen preparation for scanning electron microscopy. SEM/IITRI. 10, 507-518 (1977).
- Read, N. D., Porter, R., Beckett, A. A comparison of preparative techniques for the examination of the external morphology of fungal material with the scanning electron microscope. Canadian Journal of Botany. 61 (8), 2059-2078 (1983).
- Melo, I. S., Faull, J. L. Scanning electron microscopy of conidia of Thichoderma stromaticum, a biocontrol agent of witches broom disease of cocoa. Brazilian Journal of Microbiology. 35, 330-332 (2004).
- Pathan, A. K., Bond, J., Gaskin, R. E. Sample preparation for scanning electron microscope of plant surfaces- Horses for courses. Micron. 39, 1049-1061 (2008).
- Packard, G. C., Taigen, T. L., Packard, M. J., Boardman, T. J. Water relations of pliable-shelled eggs of common snapping turtle (Chelydra serpentine). Canadian Journal of Zoology. 58, 1404-1411 (1979).
- Packard, M. J., Packard, G. C., Boardman, T. J. Structure of eggshells and water relations of reptilian eggs. Herpetologica. 38, 136-155 (1982).
- Cordero, G. A., Janzen, F. J. An Enhanced Developmental Staging Table for the Pianted Turtle, Chrysemys picta (Testudines: Emydidae). Journal of Morphology. 275, 442-455 (2014).
- Yntema, C. L. Procurement and use of turtle embryos for experimental procedures. The Anatomical Record. 149, 577-586 (1964).
- Matsubara, Y., Kuroiwa, A., Suzuki, T. Efficient harvesting methods for early-stage snake and turtle embryos. Development Growth Differentiation. 58, 241-249 (2016).
- Moran, P., Coats, B. Biological Sample Preparation for SEM Imaging of Porcine Retina. Microscopy Today. , 10-12 (2012).
- Bray, D. F., Bagu, J., Koegler, P. Comparison of hexamethyldisilazane (HMDS), Peldri II, and critical point drying methods for scanning electron microscopy of biological specimens. Microscopy Research Technique. 26, 489-495 (1993).
- Botes, L., Price, B., Waldron, M., Pitcher, G. C. A simple and rapid Scanning Electron Microscope preparative technique for delicate "Gymnodinioid" Dinoflagellates. Microscopy Research Technique. 59, 128-130 (2002).
- Dekker, N. P., Lammel, C. J., Brooks, G. F. Scanning Electron Microscopy of piliated Neisseria gonorrhoeae processed with hexamethyldisilazane. Journal of Electron Microscopy. 19, 461-467 (1991).
- Fratesi, S., Lynch, F. L., Kirkland, B. L., Brown, L. R. Effects of SEM preparation techniques on the appearance of bacteria and biofilms in the Carter Sandstone. Journal of Sedimentary Research. 74, 858-867 (2004).
- Jung, S. W., Joo, H. M., Park, J. S., Lee, J. H. Development of a rapid and effective method for preparing delicate dinoflagellates for scanning electron microscopy. Journal of Applied Phycology. 22, 313-317 (2010).
- Bernd, S., Bentley, D. Use of HMDS (hexamethyldisilazane) to dry organic microstructures in etched bivalve mollusk and barnacle shells. Nautilus -Greenville then Sanibel. 116, 25-31 (2002).
- Bowen, W. R., Hemann, C. C., Johnson, A. A., Good, B. H. Mermithid Nematodes: SEM Observations Comparing Hexamethyldisilazane and Critical Point Drying Methods. Journal of the Arkansas Academy of Science. 44, Article 6 (1990).
- Jusman, J., Ng, S. C., Osman, N. A. A. Investigation of CPD and HMDS Sample Preparation Techniques for Cervical Cells in Devloping Computer-Aided Screening System Based on FE-SEM/EDX. The Scientific World Journal. 289817, 1-11 (2014).
- Hazrin-Chong, N. H., Manefield, M. An alternative SEM drying method using hexamethyldisilazane (HMDS) for microbial cell attachment studies on sub-bituminous coal. Journal of Microbiological Methods. 90, 96-99 (2012).
- Laforsch, C., Tollrian, R. A new preparation technique of daphnids for Scanning Electron Microscopy using hexamethyldisilazane. Arch Hydrobiology. 149 (4), 587-596 (2000).
