Summary
Hier stellen wir detaillierte Verarbeitungsprotokolle für die Abbildung empfindlicher Gewebeproben mittels Rasterelektronenmikroskopie (SEM) vor. Drei verschiedene Verarbeitungsmethoden, nämlich Hexamethyl disilazana (HMDS) chemische Trocknung, einfache Lufttrocknung und kritische Punkttrocknung werden für die Herstellung von starren Eierschalen, Embryonen in frühen Entwicklungsstadien und Pilzkulturen beschrieben.
Abstract
Obwohl die Rasterelektronenmikroskopie (SEM) häufig für die ultrastrukturelle Analyse verschiedener biologischer und nichtbiologischer Proben eingesetzt wird, sind Methoden, die an der Verarbeitung verschiedener biologischer Proben beteiligt sind, mit einzigartigen Praktiken verbunden. Alle in der Literatur beschriebenen konventionellen Verfahren zur Verarbeitung von Proben finden immer noch nützliche Anwendungen, aber subtile Änderungen in der Probenvorbereitung können die Bildqualität verändern und Artefakte einführen. Daher ist die Verwendung einer einzigartigen Probenvorbereitungstechnik, die speziell auf die Art des analysierten Gewebes zugeschnitten ist, erforderlich, um ein qualitativ hochwertiges Bild mit ultrastruktureller Auflösung zu erhalten. Der Schwerpunkt dieser Studie liegt auf der Bereitstellung optimaler Probenvorbereitungsprotokolle für bildgebende Embryonen, starre Eierschalen und Pilzkulturen mit SEM. Die folgenden Optimierungen wurden empfohlen, um gute Ergebnisse für die drei verschiedenen untersuchten empfindlichen biologischen Proben zu erzielen. Die Verwendung von milderen Fixativen wie 4% Paraformaldehyd oder 3% Glutaraldehyd gefolgt von Dehydrierung mit Ethanol-Serie ist obligatorisch. Pilzmyzel auf Agarblöcken, die durch Gleitkulturen gewonnen werden, ergibt eine bessere ultrastrukturelle Integrität im Vergleich zu Kulturen, die direkt aus Agarplatten stammen. Die chemische Trocknung von Embryonen mit HMDS sorgt für das Trocknen ohne Oberflächenspannung im Vergleich zur kritischen Punkttrocknung. HMDS verhindert Risse durch Schrumpfung, da Proben beim Trocknen weniger spröde sind. Für die Pilzkultur bietet die kritische Punkttrocknung jedoch eine akzeptable Bildqualität im Vergleich zur chemischen Trocknung. Eierschalen können ohne spezielle Vorbereitungsschritte mit Ausnahme einer gründlichen Waschung und Lufttrocknung vor der Montage abgebildet werden. Die Vorbereitungsmethoden wurden auf der Grundlage einer akzeptablen Bildqualität standardisiert, die bei jeder Studie ermittelt wurde.
Introduction
Rasterelektronenmikroskop (SEM) Ultrastrukturanalyse und intrazelluläre Bildgebung ergänzen die Lichtmikroskopie zur dreidimensionalen Profilierung von Prokaryoten, Pflanzen und Tieren. Die hohe räumliche Auflösung eines SEM macht es zu einer der vielseitigsten und leistungsstärksten Techniken, die für die Untersuchung mikrostruktureller Eigenschaften von Proben im Nanometer-Mikrometer-Skala zur Verfügung stehen. Ausgetrocknete Exemplare werden zu kompositorischen und topographischen Strukturen mit intensiven Details aufgelöst, was die Grundlage für die Entwicklung gültiger Schlussfolgerungen über funktionelle Beziehungen1,2,3 bildet. , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9.Bei der Interpretation von SEM-Bildern biologischer Proben ist es eine große Herausforderung, zwischen einheimischen Strukturen und den Artefakten zu unterscheiden, die während der Verarbeitung entstehen. SEM wird in der Regel mit sehr hohen Vakuums betrieben, um Interferenzen durch Gasmoleküle zu vermeiden, die die primären, sekundären oder zurückgestreuten Elektronenstrahlen der Probe10,11beeinflussen. Außerdem sind biologische Materialien aufgrund ihrer schlechten oder nicht leitenden Eigenschaften anfällig für Strahlungsschäden. Es ist wichtig, dass die in das SEM geladenen Proben vollständig trocken und frei von organischen Verunreinigungen sind, um mögliche Ausgasungen in einer Hochvakuumumgebung zu vermeiden10,11. Da biologische Proben meist aus Wasser bestehen, sind zusätzliche Präparative Techniken erforderlich, um sicherzustellen, dass die einheimischen Strukturen erhalten bleiben.
Die erhaltene Auflösung basiert auf der Optimierung von Vorbereitungsmethoden, die für Probentypen und verwendete Instrumentparameter spezifisch sind. Daher ist es notwendig, die Verwendung von generalisierten Verarbeitungsschritten für alle Gewebetypen zu vermeiden. Einige biologische Proben benötigen eine weniger strenge Verarbeitung, um ihre Struktur zu erhalten, während für empfindliche Probentypen möglicherweise mehr Zeit und Sorgfalt erforderlich sind, um das Einbringen von Trocknungsartefakten wie Schrumpfung und Kollaps zu vermeiden. Die Probenvorbereitung ist ein wichtiger Schritt in der SEM-Bildgebung; die Ergebnisse morphometrischer Studien werden durch Probenvorbereitungsverfahren12,13bemerkenswert beeinflusst. Häufige Vorbereitungsschritte für viele biologische Proben sind Fixierung, Dehydrierung und Beschichtung mit einem Metall wie Gold, Platin oder Palladium, um ihre Oberflächen leitfähig für die SEM-Analyse umzuwandeln. Die Art und Kombination der verwendeten Schritte hängt von der Art des Gewebes und den spezifischen Zielen der Studie ab. Ladungsaufbau, Empfindlichkeit gegenüber Vakuum- und Elektronenstrahlschäden stellen Probleme bei der Verarbeitung weicher empfindlicher biologischer Proben dar, was zusätzliche Verarbeitungsschritte erforderlich macht, um die native Struktur des Objekts beizubehalten. Mit konventionellen Methoden wie Osmiumtetroxid-Fixierung, und Dehydrierung verursachen Schrumpfung und den Zusammenbruch von empfindlichen Geweben14,15,16,17. Ziel der Studie ist es, elegante Methoden zu etablieren, die durch die Kombination von Ideen aus früheren Studien mit Modifikationen zur Herstellung und Abbildung von weichen empfindlichen Geweben (z. B. Reptilienembryonen, Eierschalen von bemalten Schildkröten und Pilzkulturen) abgeleitet werden.
Die Auswahl eines geeigneten Befestigungsverfahrens ist der erste wichtigste Schritt für die mikroskopische Analyse biologischer Proben. Die Fixierung des Gewebes unmittelbar nach der Isolierung von einem Organismus ist wichtig, um Veränderungen in ihrer Morphologie durch Zersetzung zu verhindern. Ein wirksames Fixierungsmittel sollte zelluläre Prozesse beenden, indem es die Zellen schnell durchdringt und die Wirkung irreversibel beibehält, um die Struktur der Probe zu stabilisieren, um sowohl nachfolgenden Verarbeitungsschritten als auch einer Untersuchung unter dem SEM17 standzuhalten. , 18. Obwohl mehrere chemische und physikalische Fixierungsmethoden bekannt sind, wird chemische Fixierung häufiger für biologische Proben verwendet, um zelluläre Veränderungen aufgrund von Autolyse-, Verwesungs- und Trocknungseffekten zu vermeiden. Es gibt zahlreiche fixative chemische Formulierungen in der Literatur diskutiert17,19,20,21,22,23, Fixative, die durch Denaturierung und koagierende biologische Makromoleküle und solche, die durch kovalent vernetzung von Makromolekülen fixieren. Alkohole werden als denaturierende Fixative verwendet, die die Ultrastruktur sehr schlecht erhalten und hauptsächlich für die Lichtmikroskopie verwendet werden und nicht für elektronenmikroskopische Analysen empfohlen werden. Vernetzung von Fixativen wie Formaldehyd, Glutaraldehyd und Osmiumtetroxid erzeugen eine intermolekulare und intramolekulare Vernetzung zwischen Makromolekülen innerhalb des Gewebes und bieten eine hervorragende Konservierung von Ultrastrukturen11 ,24,25,26. Biologische Proben sind temperaturempfindlich. Die Temperatur zu Beginn der Fixierung wird empfohlen, 4 °C zu sein, um die laterale Mobilität von Membranproteinen zu reduzieren, die Diffusion interzellulärer Moleküle zu verlangsamen und die Fixierungsrate zu verlangsamen11. Die für die Behebung des Gewebes benötigte Zeit hängt weitgehend von der Größe der Probe und der Geschwindigkeit ab, mit der das Fixierungsmittel mit den Komponenten der Probe diffundiert und reagiert. Eine nächtliche Fixierung in 4% Paraformaldehyd oder 3% Glutaraldehyd in PBS bei 4 °C ist die bevorzugte Methode für die SEM-Analyse von Proben, die in dieser Studie für ihre sequenziellen penetrativen Eigenschaften verwendet werden, die die Verarbeitung kleinerer empfindlicher Proben ermöglichen17 , 18 , 19 , 20 , 27. Ein Post-Fixierungsschritt mit Osmiumtetroxid wird nicht nur aufgrund seiner toxischen Natur eliminiert, sondern auch festgestellt, dass er keinen zusätzlichen Vorteil zur Verbesserung der Bildqualität für die in dieser Studie analysierten Proben implementiert.
Biologische Proben enthalten Flüssigkeiten, die den SEM-Betrieb stören; Daher müssen die Proben getrocknet werden, bevor sie in die SEM-Probenkammer eingesetzt werden. Sobald die Austrocknung gewährleistet ist, muss das Lösungsmittel aus dem Gewebe entfernt werden, ohne aufgrund der Oberflächenspannung/-trocknung Artefakte in die Proben zu erzeugen. Drei verschiedene Trocknungsmethoden wurden häufig bei der Verarbeitung von Geweben für die SEM-Bildgebung verwendet: Lufttrocknung, kritische Punkttrocknung und Gefriertrocknungsproben28,29,30,31. Wenige Studien berichten von allen drei Trocknungsmethoden, die identische Ergebnisse mit tierischen Gewebeproben28,29,30,31ergeben. Eine allgemeine Praxis, die für kleinere Proben verwendet wird, ist die chemische Dehydrierung durch aufsteigende Konzentrationsreihen von Alkohol und Hexamethyldisilazan (HMDS), aber größere Proben werden mit einem kritischen Punkttrocknungsgerät (CPD)32getrocknet. Während des Trocknungsprozesses bilden sich erhebliche Kräfte in kleinen Hohlräumen, die durch eine Flüssigkeits-/Gasschnittstelle durch die Probe geleitet werden; dies kann sogar zu einem vollständigen Zusammenbruch der Hohlkonstruktionenführen 33. Jede Verformung, die durch die Behandlung auftritt, könnte dann als natives strukturelles Merkmal der Probe verwechselt werden. So sollte das generalisierte Phänomen für die Verarbeitung eliminiert und ein einzigartiger Trocknungsprozess für jeden Gewebetyp standardisiert werden, insbesondere wenn empfindliche Gewebeproben analysiert werden.
In mehreren Versuchen, die mit verschiedenen Kombinationen aller oben genannten Verfahren durchgeführt wurden, standardisierten wir die Methoden, die für die SEM-Analyse von drei empfindlichen Geweben verwendet werden können: Reptilienembryonen, Eierschalen von bemalten Schildkröten und Pilzkulturen. Entwicklungsbiologen und Morphologen beschreiben normale und abnorme Morphogenese während der Embryoentwicklung bei repräsentativen Wirbeltieren. Untersuchungen zu Gensignalwegen hängen von der morphologischen Beschreibung neuartiger Strukturen ab. Um eine abrupte Veränderung der Wirbeltier-Embryostruktur während der SEM-Analyse zu vermeiden, empfehlen wir eine chemische Trocknung nach Austrocknung. Chemische Trocknung mit HMDS ist die relativ neueste Trocknungsmethode und die Vorteile sind relative Schnelligkeit, Benutzerfreundlichkeit, Kostenverluste und das begrenzte Know-how und die benötigte Ausrüstung9. CPD ist eine häufig verwendete Trocknungstechnik, bei der CO2 bei einer bestimmten Temperatur und einem bestimmten Druck über die Proben hinweg gesteuert wird. Wir haben festgestellt, dass HMDS zum Trocknen von weichen empfindlichen Geweben geeignet ist und die Verarbeitung größerer Proben im Vergleich zur kritischen Punkttrocknung ermöglicht, die eine umfangreiche Verformung embryonaler Gewebe verursachte. Mehrere Methoden wurden verwendet, um Proben für SEM-Bildgebung vorzubereiten, um die morphologischen Eigenschaften von Pilzen zu untersuchen34. Pilzproben werden häufig in Osmiumtetroxid, gefolgt von Ethanoldehydrierung und kritischer Punkttrocknung, fixiert, was zufriedenstellende Ergebnisse liefern kann, obwohl die toxischen Wirkungen von Osmiumtetroxid6,7,35 und der Verlust von Pilzmaterialien beim Wechsel von Lösungen während der Verarbeitung sind ausgesprochene Nachteile. Die Probenvorbereitungstechnik mit Lufttrocknung ohne Fixierung wurde ebenfalls36 praktiziert, führt aber zu geschrumpften und zusammengebrochenen Strukturen, und die Beobachtung solcher Proben kann leicht falsch interpretiert werden, während die Art charakterisiert wird. Pilz-Hypha verliert seine Integrität in Kontakt mit Flüssigkeiten und eine gleichmäßige Trocknung kann nicht erreicht werden, um die Struktur wiederherzustellen. Aufgrund dieses Effekts wird die Gefriertrocknung häufig zum Trocknen von Weichgeweben wie Pilzmyzel verwendet. Gefriertrocknung funktioniert gut für saubere Materialien, aber das Vorhandensein von Salzen oder Sekretion wird Oberflächendetails verdecken, die nur auf der SEM-Betrachtungsphase identifiziert werden. Wir haben die Gleitkulturmethode mit Glutaraldehyd-Fixierung und kritischer Punkttrocknung gekoppelt, um strukturelle Details intakter Pilzhyphen und Sporen zu ergeben. Obwohl die CPD-Trocknung schrumpfe in Embryonen, führte sie in Verbindung mit der Glutaraldehyd-Fixierung zu gut erhaltenen myzelialen Strukturen. Die Eierschale ist von primärer Bedeutung für den Embryo von eiförmigen Tieren, da sie nicht nur als Schutzhülle fungiert, sondern auch mechanische Stabilität, Durchlässigkeit für Gas und Wasser und eine Kalziumreserve für den sich entwickelnden Embryo bietet. Süßwasserschildkröten-Eierschalen werden aufgrund ihrer Struktur als "starr" eingestuft und aufgrund ihrer Verfügbarkeit von Biologenmitgroßer Aufmerksamkeit 1,2,3,4 , 5 , 6 , 7 , 37 , 38.
Wir beschreiben einfache Methoden zur einfachen Untersuchung von Eierschalen- und Schalenmembranen von lackierten Schildkröten, die auf jede starre Eierschalenart angewendet werden können. Die Methoden der Vorbereitung wurden anhand der resultierenden Bildqualität und reduzierten potenziellen Artefakten bewertet.
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Protocol
HINWEIS: Bemalte Schildkröten -Chrysemys picta) Eier, die in dieser Studie verwendet wurden, wurden während der Brutzeit von Mai bis Juni 2015-16 von der Rice Creek Field Station, Oswego New York mit Genehmigung des New York State Department of Environmental gesammelt Konservierung (DEC).
1. Chemische Trocknungsmethode zur Verarbeitung von Embryonen für SEM
- Sammeln Sie Schildkröteneier von Feldstandorten während der Brutzeit. Bereiten Sie die Inkubationskammern im Voraus vor, aus Kunststoffboxen mit Deckeln (L x B x H) 6,7 cm x 25,4 cm x 10,2 cm gefüllt mit Einstreumedium, das mit einer feuchten Mischung aus Vermiculit und Torfmoos (1:1 Verhältnis) zubereitet wird. Machen Sie 4-6 Löcher von ca. 0,25 cm entlang der Seiten der Boxen und auf dem Deckel, um belüftung zu ermöglichen.
- Entfernen Sie vorsichtig den Boden aus dem Nest, um die Eier zu entdecken. Wischen Sie die Oberfläche von Schildkröteneiern mit verdünnter Jodtinktur (1:25.000), um die mikrobielle Kontamination während der Inkubation zu kontrollieren. Legen Sie die Kupplungen getrennt voneinander, Kupplungsgröße der bemalten Schildkröte kann von 5-9 Eier variieren und legen Sie maximal 8-9 Eier pro Box.
HINWEIS: Behandeln Sie die Eier während der Entnahme, des Wischens, Beschriftens und Platzierens in den Boxen sorgfältig. Position und Ausrichtung der Eier müssen die gleiche sein, wie sie gelegt wurden, jede Bewegung wird die Embryoentwicklung hemmen. - Die Eier zur Hälfte in die Bettwäsche legen, abdecken und die Box in den Inkubator legen, der bei 30 °C eingestellt ist. Inkubieren Sie die Eier für 10-17 Tage, um die embryonalen Stadien 12, 13 und 18 zu erhalten, die in dieser Studie verwendet werden. Fügen Sie destilliertes Wasser hinzu, um das Einstreumedium jeden zweiten Tag teilweise zu befeuchten, um Austrocknung zu vermeiden und den Feuchtigkeitsgehalt für die normale Entwicklung der Embryonen aufrechtzuerhalten.
HINWEIS: Inkubations- und Inszenierungsembryonen sind nach einer vollständigen Entwicklungstabelle, die früher veröffentlicht wurde39. - Fixieren Sie die Embryonen, indem Sie den ersten Schnitt auf einer Seite der dorsalen Eierschale und der Dottermembran zusammen, vertikal zur langen Achse mit spitzer Schere machen. Legen Sie die Schere vorsichtig in das Eigelb ein, um das Schneiden der embryonalen Scheibe zu vermeiden. Schneiden Sie nun die seitliche Seite des Eis entlang der langen Achse und schneiden Sie dann die andere Seite des Eis entlang der kurzen Achse.
- Das ausgeschnittene Stück mit der Embryoseite mit Zangen nach oben schälen. Schneiden Sie die andere Seitenseite der Eierschale und legen Sie das ausgeschnittene Stück in Phosphatgepufferte Kochung (PBS bei einem pH-Wert von 7,4).
HINWEIS: Das Schildkrötenei wird mit hochviskosem Eigelb gefüllt und die Dorsalseite des Embryos haftet an der Eierschalenmembran. Die Eierschalenmembran in der Nähe des Embryos ändert sich mit der Inkubation von transluzentem Weiß zu einem undurchsichtigen, kalkweißen Weiß. Dies ermöglicht es, den Embryo in der Mitte der langen Achse zu lokalisieren und als dunkel verkalkter Fleck von außen40,41gesehen werden. - Verwenden Sie ein Stereomikroskop, um die Embryonen zusammen mit der Dottermembran zu isolieren, indem Sie sie mit Zangen von der Eierschale abziehen. Entfernen Sie extraembryonale Membranen mit Zangen und Mikroscheren. Übertragen Sie den Embryo mit einem Embryolöffel auf frische PBS in einer Petrischale, um Blut oder Eigelb zu waschen.
- Verwenden Sie klare 12-Well-Platten, um die Embryonen über Nacht in 4% Paraformaldehyd in PBS bei 4 °C oder in 2-3% Glutaraldehyd in PBS zu fixieren. Legen Sie je nach Größe der Embryonen jeweils ein bis drei Embryonen in jeden Brunnen. Stellen Sie sicher, dass die vollständige Infiltration (Proben erscheinen weiß) für ältere Embryonen durch Verlängerung der Fixierungszeit um 2-3 Tage. Embryonen 3x mit frischem PBS für 5 min pro Spülung spülen.
HINWEIS: Vermeiden Sie es, die Oberfläche des Embryos zu beschädigen, indem Sie Polystyroleinsätze mit Polyester-Mesh-Böden für 12-Well-Platten verwenden, um Proben von einem Lösungsmittel auf ein anderes zu übertragen. - Dehydrieren Sie Proben mit einer Reihe von Ethanolkonzentrationen in destilliertem Wasser: 30%, 50%, 70%, 80%, 95% und 100% und behandeln Sie Proben für 1 h in jeder Dehydrationslösung. Wiederholen Sie den Schritt mit 100% Ethanol zweimal, um eine vollständige Austrocknung zu gewährleisten. Bei nicht sofortverwendeter Verwendung Proben länger in 70% Ethanol bei -20 °C lagern.
- Trockene Embryonen mit einer Reihe von Hexamethyldisilazana (HMDS) bis 100% Ethanolkonzentration: 1:2, 2:1 und 100%. Lassen Sie die Proben in jeder Lösung für 20 min und halten Sie die Petrischale teilweise während des Prozesses bedeckt.
HINWEIS: Führen Sie alle Schritte mit HMDS in Dunstabzugshaube mit notwendiger persönlicher Schutzausrüstung durch, da HMDS hochgiftig ist. - Lassen Sie die Embryonen in der endgültigen 100% HMDS-Lösung ganz oder teilweise in einer Dunstabzugshaube über Nacht abgedeckt und helfen Sie bei der Verdunstung von HMDS, sodass die Proben für die Montage und Sputterbeschichtung bereit bleiben. Bedecken Sie die Schale, um Staub absetzen über die Proben zu beseitigen.
HINWEIS: Das Gewebe erscheint weiß nach der vollständigen Trocknung und teilweise getrocknete Proben werden gelb in der Farbe aussehen, lassen Sie diese Gewebe in der Dunstabzugshaube für eine längere Zeit. - Wählen Sie die Größe von Aluminium-Stubs und Carbon-Klebeband pro Größe der analysierten Probe. Montieren Sie die getrockneten Proben sorgfältig auf einem Standard-Aluminium-Stift-Stub (12,7 mm x 8 mm) mit Doppelstab-Carbon-Leitband (12 mm).
- Führen Sie montierte Proben in die Kammer des Sputterlackturms ein, um die Probe mit einem sehr dünnen Goldfilm zu beschichten, um den Ladungseffekt zu vermeiden. Vergolden Sie die Proben für 60-120 s bei einem 35 mA Spututter.
- Montieren Sie die Stummel an entsprechenden Porenplatten, indem Sie die Stellschrauben sicher befestigen. Übertragen Sie den Probenhalter mit dem Probenaustauschwerkzeug in oder aus der Probenkammer von SEM. Stellen Sie die Proben im Hochvakuummodus mit einer Beschleunigungsstrahlspannung von 10 kV und Emissionsstrom 10 A ab.
HINWEIS: Tragen Sie beim Umgang mit Proben, Probenhaltern, Befestigungsstabern und Transferwerkzeugen immer Handschuhe, um Fettkontaminationen von den Händen auf das SEM-System zu vermeiden. - Testen Sie die unten aufgeführten alternativen Verfahren, um die Auflösung der Proben zu vergleichen, die aus dem oben genannten Verfahren gewonnen wurden.
- Fügen Sie eine Post-Fixierung mit 1% Osmiumtetroxid für 1 h bei Raumtemperatur nach Schritt 1.7 ein.
- Teilweise oder vollständig entfernen Sie die HMDS bei Schritt 1.10 für eine schnelle schnelle Verdunstung von HMDS.
- Verarbeiten Sie Embryonen nach Schritt 1.8 unter Verwendung der kritischen Punkttrocknung (CPD) unter Befolgen der Schritte 3.3-3.4.
2. Vorbereitung der Eierschale für SEM nach einem Lufttrocknungsverfahren
- Sammeln und bebrüten Sie die bemalten Schildkröten -Chrysemys picta) Eier, um die Embryonen gemäß den Schritten 1.1-1.7 zu fixieren.
- Eierschalen in destilliertem Wasser nach Embryofixierung in Schritt 2.1 speichern. Reinigen Sie die Eierschalen gründlich, indem Sie destilliertes Wasser mindestens 1 h einweichen, um Die Kontamination von Dotter und Albumin zu beseitigen.
- Lufttrockene Eierschalen nach dem Waschen auf empfindlichen antistatischen Tüchern in der Dunstabzugshaube über Nacht. Getrocknete Eierschalen in sauberen Probenflaschen aufbewahren, die nach Anzahl und Stufe gekennzeichnet sind.
- Montieren, Sputtern und Abbilden der Proben durch folgende Schritte in den Schritten 1.11-1.13.
3. Kritische Punkttrocknungsmethode zur Herstellung von Pilzkulturen für SEM
- Gleitkulturen etablieren
- Kartoffeldextrose-Agar-Medien (PDA) für Pilzkulturen vorbereiten: 39 g PDA-Leistung in 1 L destilliertes Wasser in einem Erlenmeyerkolben hinzufügen. Mischen Sie das Medium gut, indem Sie den Kolben und den Autoklaven bei 121 °C 30 min. 30 min lang die Medienlösung abkühlen lassen und dann das Antibiotikum Chloramphenicol (25 g/ml) mit einer sterilen Mikropipette hinzufügen.
HINWEIS: Nach der Sterilisation sollte die Agarlösung heiß sein und nicht bald erstarren. Kühlen Sie es so, dass es die Antibiotika nicht inaktiviert. - Mischen Sie es durch Wirbeln und gießen Teller (ca. 10-12 ml Medien pro 10 cm Petrischale), sorgfältig stapeln und erstarren lassen.
- Verwenden Sie eine sterile Skalpellklinge, um kleine Agarblöcke etwa 1/2 bis 3/4 Zoll auszuschneiden. Entfernen Sie einen Agarblock und legen Sie ihn auf ein sauberes Glasmikroskop.
- Legen Sie die Rutsche in eine saubere Petrischale, um Verunreinigungen zu vermeiden und Feuchtigkeit während der Inkubation zu erhalten.
- Heben Sie den Schlitten vom Boden der Petrischale mit einem sterilen Zahnstocher an, um Oberflächenspannungen zwischen der Platte und dem Schlitten zu erzeugen, um den Glasschlitten zu entfernen, ohne das empfindliche Wachstum nach der Inkubation zu stören.
- Verwenden Sie eine sterile Schleife oder eine Nadel, um einige der Pilze von der Probe inoculum auf jede der vier Seiten des Agarblocks auf der Rutsche zu übertragen.
- Legen Sie nach der Impfung einen sauberen Deckelrutsch auf die Oberfläche des Agarblocks. Fügen Sie ein paar Tropfen steriles destilliertes Wasser in die Petrischale um die Rutsche, um Feuchtigkeit für die wachsenden Pilze zu gewährleisten.
- Versiegeln Sie die Platte teilweise mit Paraffinfolie und inkubieren Sie die Platte bei 30 °C für eine angemessene Zeit (für Fusarium-Arten inkubieren für 36 bis 48 h).
- Entfernen Sie die Rutsche von der Petrischale und trennen Sie den fest verklebtedeckel vom Agarblock mit steriler Zange. Fixieren Sie die Agarblöcke in 3% Glutaraldehyd in PBS über Nacht bei 4 °C.
- Kartoffeldextrose-Agar-Medien (PDA) für Pilzkulturen vorbereiten: 39 g PDA-Leistung in 1 L destilliertes Wasser in einem Erlenmeyerkolben hinzufügen. Mischen Sie das Medium gut, indem Sie den Kolben und den Autoklaven bei 121 °C 30 min. 30 min lang die Medienlösung abkühlen lassen und dann das Antibiotikum Chloramphenicol (25 g/ml) mit einer sterilen Mikropipette hinzufügen.
- Dehydrieren Sie die Proben, indem Sie eine Ethanol-Serie durchlaufen: 10%, 25%, 50%, 75% und 90% mit 15 min pro Änderung. Verarbeiten Sie die Proben für die endgültige Austrocknung mit zwei Veränderungen in 100% Ethanol, die jeweils 30 Minuten dauern, um eine vollständige Sättigung zu gewährleisten.
- Kritische Punkttrocknung: Dehydrierte Proben in die Kammer des CPD-Geräts legen. Versiegeln und kühlen Sie die Kammer, indem Sie die Ventile öffnen, um flüssiges CO2 ein- und auslüften zu lassen, bis flüssiges CO2 die Kammer vollständig füllt.
- Versiegeln und erwärmen Sie die Kammer langsam, um einen kritischen Punkt zu erreichen, wenn der Kammerdruck 1000 psi überschreitet und die Temperatur 31 °C überschreitet, die Flüssigkeits- und Gasphase vonCO2 ist im Gleichgewicht. Entleeren Sie das CO2 langsam aus der Kammer und der Probe als Gas, um Auswirkungen der Oberflächenspannung zu vermeiden.
- Führen Sie die Montage, Vergoldung und Abbildung der Proben durch folgende Schritte gemäß den Schritten 1.11-1.13 durch.
- Führen Sie eine vergleichende Analyse durch chemische Trocknung der Proben aus Schritt 3.2 mit HMDS durch die folgenden Schritte 1.9-1.13 durch.
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Representative Results
Abbildung 1 zeigt die rasterelektronenmikrografische Analyse von gemalten Schildkrötenembryonen (Chrysemys picta). Bemalte Schildkröteneier, die auf einem Einstreumedium gesammelt und inkubiert wurden, die nach der chemischen Trocknung auf Aluminiumstummeln montiert waren, wurden für die SEM-Bildgebung verwendet (Abbildung 1A-E). Eine seitliche Ansicht eines Embryos der Stufe 12 zeigt die craniofacial Strukturen; die Oberkieferprominenz erstreckt sich über die Unterkiefer und begrenzt eine gut markierte Nasengrube medial; Fünf Pharyngealbögen wurden ebenfalls beobachtet (Abbildung 1F). Neu gebildete Soden im hinteren Schwanzbereich des Embryos sind im Vergleich zu den segmentierten Körpern leicht zählbar. Vorderblässen erscheinen länger im Vergleich zu hinteren Gliedmaßenknospen und weisen eher kauender als ventral. Ein klar definiertes Auswachsen eines Karagrückens ist entlang des gesamten flankierenden Bereichs des Embryos der Stufe 15 zu sehen (Abbildung1G. In Der 18. Stufe besitzen bemalte Schildkröten eine kurze, schwach projizierte Schnis. Der untere Schnabel ruht im Oberkiefer und wird leicht umgedreht mit einem Klemmhaken, der in die mittelförmige Kerbe des oberen Schnabels passt (Abbildung 1H). Der Oberkiefer der bemalten Schildkröten zeigt ein eingekerbtes Aussehen, das eine mediale U-V-förmige distale Spitze mit einer kleinen Spitze auf jeder Seite bildet, ein winziger Eizahn beginnt sich an der Spitze des Oberkiefers zu bilden. Limb-Knospen, die in früheren Stadien länger erschienen, bilden in den Stadien 13-14 eine paddelartige Struktur mit vage angedeuteter digitaler Platte. Limb mesenchym, abgegrenzt durch den apikalen ekodermalen Grat, ist entlang der vorderen-hinteren Ränder zu sehen (Abbildung 1I-J).
Abbildung 2 zeigt die ultrastrukturelle Analyse von Chrysemys picta Eierschale und Schalenmembran mittels SEM-Bildgebung. Bemalte Schildkröten-Eierschalen wurden wie oben beschrieben erhalten und nach dem Waschen mit doppelt destilliertem Wasser einer Lufttrocknung unterzogen (Abbildung2A,B). Eggshells, die auf Aluminiumstummeln mit doppelseitigem Carbonband montiert sind (Abbildung 2C) wurden mit SEM abgebildet. Eine seitliche Ansicht der Schale zeigte eine äußere kalkhaltige Eierschalenschicht, die fest an der inneren fadenförmigen Schalenmembran befestigt war (Abbildung 2D). Die Außenfläche der Eierschale besteht aus gut ausartenmineralisierten mineralisierten Schaleneinheiten, die aus kugelförmigen/kugelförmigen Knötchen bestehen, die in Gruppen angeordnet sind und zwischen benachbarten Schaleneinheiten eine Konzentration von kleinen abgerundeten Vertiefungen oder Poren unterschiedlicher Größe beobachtet (Abbildung 2E). Knötchen aus jeder Gruppe von Schaleneinheiten treffen sich an einer Verbindungskreuzung, dem Mittelpunkt (Abbildung 2F). Die äußere Oberfläche wurde manuell mit Zangen geschält, um die Oberfläche der Schalenmembran zu beobachten. Es wurden Reihen von zentralen Plaques gesehen, die den Befestigungspunkt zwischen den Schaleneinheiten und der darunter liegenden mehrschichtigen Fasermembran liefern (Abbildung 2G).
Abbildung 3 zeigt die morphologische Charakterisierung von Ascomycete-Pilzisolaten aus Diakulturen, die mit SEM-Bildgebung beobachtet wurden. Schema der Diakultur-Setup eingerichtet (Abbildung 3A) zeigt Pilzwachstum auf dem Agar-Block innerhalb von zwei Tagen nach der Impfung. Kolonien wachsen schnell mit weißem bis cremefarbenem Luftmyzel (Abbildung 3B). SEM-Bildgebung nach kritischer Punkttrocknung und Sputterbeschichtung von Agarscheiben zeigte Pilzhyphen, gekrümmte Konidien und Reis wie Sporen. Konidiphore wurden seitlich aus dem Septat-Lufthyphae (Abbildung 3C) gesehen. Macroconidia, die auf kürzeren, verzweigten Konidiophoren hergestellt werden, sind mäßig gekrümmt, mit kurzen, stumpfen apikalen und undeutlich pedicellaten Basalzellen meist septat (Abbildung 3D).
Abbildung 4 zeigt die Vergleichsergebnisse für die Verarbeitung ähnlicher Proben mit alternativen Verfahren. Eintauchen köpfe der Stufe 15 Embryonen in HMDS und Trocknen durch allmähliche Verdunstung zeigen gut erhaltene craniofacial Strukturen, fast keine Schrumpfung oder Verzerrung ist mit längeren Zeiten der langsamen Verdunstung von HMDS zu sehen (Abbildung 4A). Embryonen nach der Fixierung mit Osmiumtetroxid zeigten keinen unterschiedsreichen Unterschied in der Bildqualität, außer bei einer leichten Schrumpfung des Gewebes im Vergleich zu HMDS-Langsamverarbeitung (Abbildung 4B). Das Trocknen von Embryonen durch vollständiges Entfernen von HMDS führt zu strukturellen Verzerrungen und Schrumpfungen (Abbildung 4C), während die langsame Verdunstung hervorragende Oberflächenstrukturen eines ähnlich inszenierten Embryos ( Abbildung 4 A). Die Trocknungsartefakte wurden in den embryonen gesehen, die mit der CPD-Technik behandelt wurden und eine ausgedehnte Schrumpfung und Zerstörung des Gewebes verursachten (Abbildung 4D,E). Agar-Scheiben aus Diakulturen zeigen eine unvollständige Trocknung von Pilzisolaten mit HMDS-Behandlung im Vergleich zu CPD (Abbildung F). Die vollständige Trocknung wird durch DIE CPD-Behandlung von Agarscheiben mit einer gut getrockneten, weißen Probe erreicht, die intakte, hochauflösende Strukturmerkmale von Pilzhyphen und Sporen aufweist (Abbildung 4G-G'). Agar-Blöcke mit Pilzkulturen erscheinen geschrumpft und gelb in der Farbe, so dass sie nicht für SEM-Bildgebung geeignet sind (Abbildung 4H-H').
Abbildung 1 : Rasterelektronenmikroskopie von Chrysemys picta Embryonen, die durch chemische Trocknung hergestellt werden. (A) Chrysemys picta, Nistplatz während der Brutzeit an der Rice Creek Field Station, Oswego, NY. (B) Gut gebautes Nest von außen. (C) Oberflächenerde mit Sorgfalt entfernt, um die eiergelegten Eier zu belichten. (D) Eier in die Brutkammer mit Einstreumedium gelegt. (E) Montage von Embryonen auf Aluminiumstummeln nach chemischer Trocknung, E4 zeigt den sputternbeschichteten Embryo. (F) Seitenansicht des Embryos der Stufe 12 mit Gesichtsstrukturen, Gliedmaßenknospen und Soden. (G) Gut definierte Karagrücken und paddelförmige Gliedmaßenknospen sind in Stufe 15 zu sehen. (H) Craniofacial Strukturen der Stufe 18 Embryo zeigt Ober- und Unterkiefer, beachten Sie einen kleinen Eizahn an der Spitze des oberen Schnabels gebildet. (I) Dorsale Ansicht des rechten Vorderbeins in Stufe 13-14 und eine Nahaufnahme von AER (J) an der dorsal-ventralen Grenze. Skalenstäbe: F-H, 500 m; I, 100 m, und J, 10 m. Schlüssel: mb, midbrain; np, nasal pit; mxp, maxillary prominence; pa, pharyngeal arches; h, heart; fl, forelimb; s, soe; hl, hind limb; t, tail tip; cr, carapacial ridge; et, egg tooth; oc, oral cavity; e, eye; , Unterkiefer; m, Mesenchym, AER, apikaler ekodermaler Grat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2 : Ultrastrukturelle Analysen der luftgetrockneten Eierschale und der Schalenmembran von bemalten Schildkröteneiern. (A) Nach der Fixierung der Embryonen wurden Eierschalen gründlich in destilliertem Wasser gewaschen, um Dotter und Albumin zu entfernen. (B) Saubere Eierschalen wurden mindestens über Nacht luftgetrocknet. (C) Montage einer Eierschale auf Aluminiumstummel. (D) Radialansicht des Schalenfragments mit äußerer Kalkschicht und innenschalenmembran. (E) Äußere Kalkschicht zeigt Kugelschaleneinheiten (su) in Gruppen angeordnet und Poren zwischen diesen Einheiten gesehen (Sternchen). (F) Vergrößerte Ansicht eines Knöts, der den Mittelpunkt (c) zwischen den Schaleneinheiten anzeigt. (G) Die Entfernung der Kalkschicht zeigt die außene Oberfläche der Schalenmembran mit Vertiefungen, die von Schaleneinheiten gebrochen wurden. Skalenstäbe: E, 100 m; F, 10 m und G, 20 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3 : Vorbereitung der Pilzkultur für die SEM-Bildgebung. (A) Schematisches Diagramm, um die Einrichtung der Folienkultur anzuzeigen. (B) Weiß gefärbte Pilzkolonien, die nach zwei Tagen Inkubation bei 30°C auf dem Agarblock zu sehen sind. (C) SEM-Bild zeigt einen Abschnitt von Myzel von Fusarium solani, schwarze Sternchen, die die Makrokonidie in Sporodochien markieren, einen Pfeil, der auf Phialide zeigt, und Pfeilspitzen, die auf Mikrokonidie, Skalenleiste, 10 m (D) Vergrößertes Bild von Septat-Chlamydosporen, Skala bar 5 m. Tasten: ab, Agarblock; cs, coverslip; f, Pilzkultur. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4 : Vergleichende Analyse alternativer Verfahren zur Verarbeitung ähnlicher Proben. (A) Frontalansicht des lackierten Schildkrötenkopfes, getrocknet mit langsamer Verdunstung von HMDS (A), nach Nachfixierung mit Osmiumtetroxid (B), schnellerer Verdunstung von HMDS (C) und CPD (D-E). Einschließlich eines Post-Fixierungsschritts mit Osmiumtetroxid zeigen keine sichtbaren Unterschiede in der Bildqualität im Vergleich zur HMDS-Behandlung ohne Post-Fixierung. Verformungen sind nach der schnellen Verdunstung von HMDS zu beobachten, während eine allmähliche Trocknung mit langsamer Verdunstung für eine bessere Oberflächenstruktur sorgt. Unterschiedliche Schrumpfungsgrade und zusammengebrochene Strukturen sind in den Regionen Gehirn, Augen und Gesichtsprominenz in Embryonen zu beobachten, die mit CPD behandelt werden. (F) Montage von Diakulturen, die mit HMDS (1), CPD (2) und sputterbeschichteter CPD-behandelter Probe (3) auf Aluminium-Stubs. (G-G') Vollständige Trocknung als intakte weiß gefärbte Agarscheibe mit Pilz-Inokulat erreicht durch CPD Erhaltung Strukturen von Pilz myzelund enden von Fusarium solani. (H-H') Unzureichende Trocknung der Rutschkultur, Schrumpfung und beschädigte strukturelle Integrität mit HMDS Konservierungstechnik gesehen. Skalenstäbe: A-E, 500 m; G-H, 2 mm, und G'-H', 20 m. Tasten: et, Eizahn; oc, Mundhöhle; e, Auge; uj, Oberkiefer; lj, Unterkiefer; schwarze Sternchen, Makrokonidie in Sporodochia; Pfeil, Phialide; Pfeilspitzen, Mikrokonidie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
In unserer Studie wurden verschiedene Fixierungsmittel, Dehydrierungs- und Trocknungsmethoden getestet, um drei verschiedene empfindliche biologische Proben für die SEM-Bildgebung vorzubereiten: Embryonen, Eierschalen und Pilzkulturen. SEM wird häufig für die Oberflächenanalyse verwendet, so dass die fixative Penetration weniger besorgniserregend ist, aber es muss verstanden werden, dass schlecht fixierte interne Strukturen nach innen schrumpfende oder/und kollabierte Oberflächenstrukturen verursachen. Erweiterte Fixierungszeit sollte auch für größere Gewebeproben in Betracht gezogen werden, die fixative Lösung ein paar Mal in Abhängigkeit von der Fixierungsdauer ersetzen. Durch die aktive Wechselwirkung zwischen fixativem und gewebeweise würden sich die osmotischen Eigenschaften der Zellen erheblich verändern. Gewebeflüssigkeiten würden das Fixierungsmittel verdünnen und somit kann ein Aldehydeffekt, der zur Gesamtosmolalität beiträgt, hinsichtlich der Auswirkungen auf das Zellvolumen vernachlässigt werden. Auch Formaldehyd würde schneller in Gewebe eindringen und ist effektiver als der Crosslinker im Vergleich zu Glutaraldehyd. Ein gepuffertes Formaldehyd-Glutaraldehyd-Gemisch wurde auch zur Fixierung einer Vielzahl von Geweben berichtet, obwohl für Monolayer und Zellsuspensionen verdünnte Lösungen besser für die Fixierung15,16geeignet waren. Die verdünnten Lösungen sind aber auch hypertonisch, so dass die Aldehyde selbst nicht osmoaktiv sind. Für empfindliche Proben, die in dieser Studie verwendet wurden, wurde PBS bei pH 7,4 als Vehikel für die Fixiermittel verwendet, da Phosphatpuffer den zytoplasmatischen Umgebungen der meisten biologischen Proben ähnlicher sein dürften. Darüber hinaus wird festgestellt, dass die Osmolarität innerhalb des für die Probe erforderlichen physiologischen Bereichs liegt, während PBS als Vehikel für das Fixiermittel fungiert. Die Nachfixierung mit Osmiumtetroxid wird oft für verschiedene biologische Probenempfohlen 16,22,42, wurde aber für alle biologischen Proben, die in dieser Studie verwendet wurden, eliminiert. Proben ohne Osmiumtetroxid lieferten gestochen scharfe Bilder und Proben, die mit Osmiumtetroxid fixiert waren, lieferten nicht unterscheidbare Ergebnisse (Abbildung 4A). Osmiumtetroxid verursacht Verzerrungen von Blattgewebestrukturen und führt zu einer schlechteren Probenkonservierung im Vergleich zu Glutaraldehyd und Formaldehyd-Gemisch43, und es wurde vorgeschlagen, dass eine Ansammlung von Osmiummolekülen die Infiltration von Dehydrierungsmittel und Übergangsstoffe, die in CPD verwendet werden, und die Lösungsmittel wie HMDS, die für die chemische Trocknung verwendet werden. Der Effekt ist gewebespezifisch und ohne Osmiumtetroxid hat keinen Einfluss auf die Bildqualität für die Art der in dieser Studie analysierten empfindlichen Proben. Bei anderen Gewebearten kann die Verwendung von Osmiumtetroxid mit erweiterter primärer Fixierung eliminiert werden.
HMDS getrocknete Schildkröten-Embryoproben zeigten gut erhaltene Oberflächen und weniger Verzerrung oder Schrumpfung im Vergleich zu CPD (Abbildung 4). CPD minimiert die Wahrscheinlichkeit von Verzerrungen in der Zellmorphologie und der Produktion von Artefakten aufgrund der während des Prozesses erzeugten Null- oder minimalen Oberflächenspannung. CPD kann jedoch eine potenzielle physikalische Gefahr für empfindliche zerbrechliche Proben verursachen. Im Einklang mit unserer Beobachtung lieferte HMDS eine ähnliche oder höherwertige Bildgebung durch Minimierung der Durchtrocknung verursachten Oberflächenspannung auf der Grundlage früherer Studien, die44,45,46,47veröffentlicht wurden. Im Vergleich zur CPD-Behandlung bewahrte HMDS strukturelle Details des organischen Netzes hervorragend in geätzten Muscheln und Stachelschalen48 und lieferte eine hohe Auflösung der strukturellen Merkmale der komplexen internen Organisation von Mermithid Nematoden49 und Insektengewebe28. Die Trockenplattenartefakte wurden auf den von der CPD-Technik hergestellten Proben im Vergleich zur HMDS-Technik in großen Mengen gesehen. Die Membranblöte und Pelletartefakte wurden in Gebärmutterhalszellen erhöht, die mit CPD-Technik50hergestellt wurden. HMDS reagiert mit Wasser, um Hexamethyldisiloxan und Ammoniak zu produzieren, die beide aus dem Objekt verdampfen. HMDS wird häufig in der Gaschromatographie verwendet, um Silylether von Verbindungen wie Zucker, Aminosäuren, Alkohole und zahlreiche andere Verbindungen zu erzeugen. Es ist nicht bekannt, ob HMDS mit einigen dieser Verbindungen in Geweben reagiert. HMDS könnte Proteine vernetzen und das Gewebe während des Trocknungsprozesses versteifen28, obwohl der genaue Grund, warum HMDS eine bessere Konservierung von Embryonen bietet, außer der Gewebespezifität nicht erklärt werden konnte. Basierend auf den Ergebnissen unserer Untersuchung verursachte CPD eine erhebliche Schrumpfung im Vergleich zu HMDS und eignet sich viel besser für die Verarbeitung embryonaler Gewebe, insbesondere zur Analyse der Oberflächenstruktur für früh inszenierte Embryonen. Der Mechanismus, mit dem HMDS an der Gewebetrocknung arbeitet, wurde nicht aufgeklärt, obwohl eine langsame Trocknung mit allmählicher Verdunstung in absolut wasserfreier Umgebung ein Grund für eine hervorragende Oberflächenstruktur der Tiere sein könnte.
Kleine Stücke von Agarblöcken mit Pilzkolonien aus zuvor etablierten Diakulturen wurden in dieser Studie verwendet, um Probleme mit der Aufrechterhaltung der ursprünglichen Flauschigkeit der Myzelmatte zu vermeiden. Die CPD-Trocknung von Agarstücken mit Pilzkolonien führte zu einem Wascheffekt, während Änderungen der Fixierungen, Puffer und Ethanol eine bessere Wahl waren, um die Schwierigkeiten bei der Gefriertrocknung zu überwinden. HMDS, das gut für Embryonen aller Stadien funktioniert, war nicht in der Lage, Pilzkulturen zu lösen, während die Lufttrocknung mit HMDS ein erhebliches Problem darstellte: Sich zu krümmen und die strukturelle Steifigkeit zu verlieren. Während CPD gut für Pilzkulturen funktioniert, induzierte es sofortige Schäden an Embryonen vor allem in frühen Stadien der Entwicklung, was schrumpfung an der Oberfläche. Bei der Verwendung von HMDS und CPD für Embryonen bzw. Pilzkulturen wurden keine Auflade- bzw. Trocknungsartefakte beobachtet. Für starres Gewebe wie Die Eierschale von Schildkröten ist keine spezielle Verarbeitung erforderlich, außer zum Waschen und Trocknen der Luft bei Raumtemperatur vor der Montage für die Bildgebung.
Unabhängig von der Herstellungsmethode sollten schrittweise Ethanolgradientenschritte verwendet werden, um das Potenzial zum Trocknen von Artefakten zu reduzieren. Zunächst wurden sowohl HMDS- als auch CPD-Proben gefunden, die Oberflächenartefakte mit Schrumpfung nach den in der Literatur verfügbaren Dehydrierungs- und Trocknungsprotokollen enthalten. Nach einer Reihe von Standardisierungen stellten wir fest, dass die Artefakte das Ergebnis der Alkoholdehydrierung waren. Es ist wichtig, einen langsamen Dehydrierungsprozess mit mehr allmählichen Ethanol erhöht während der Dehydrierung zu verwenden. Außerdem sollte die Dauer jeder Iteration für Embryonen länger sein als für Pilzkulturen. Darüber hinaus sorgte ein zusätzlicher Schritt bei 100% Ethanol für eine vollständige gleichmäßige Sättigung. HMDS kann ganz oder teilweise entfernt werden, um die Lufttrocknung von Proben zu ermöglichen, aber eine längere Exposition gegenüber HMDS und eine allmähliche Lufttrocknung durch Verdampfung erwiesen sich als wirksam für Embryonen, um Störungen zu vermeiden (Abbildung 4A,C), die durch große Oberflächen verursacht wurden. Spannung, wie sie bei der mikrobiellen Zellanhaftung beobachtet wurde51. Eintauchende Proben in HMDS und langsame Trocknung über Nacht ergaben eine ausgezeichnete Oberflächenstruktur in Daphnia-Arten52, was darauf hindeutet, dass weiche empfindliche Gewebe von dem langsamen Trocknungsprozess profitieren könnten. Eine akzeptable Bildqualität für Embryonen kann bei langsamer chemischer Trocknung erreicht werden, indem die Konzentration von HMDS auf Ethanol nach Austrocknung schrittweise erhöht wird.
Alle Proben wurden mit einem doppelseitigen Carbonband auf Aluminiumstummeln montiert, um eine leitfähige Oberfläche zu schaffen, eine dünne Schicht farblosen Nagellacks könnte auch verwendet werden, wenn die gleiche Probe in einer anderen Ausrichtung abgebildet werden muss. Proben können leicht aus den Stuben entfernt werden, wenn Nagellack auf der Stuboberfläche verwendet wird und die Positionierung der Proben in alternativen Ebenen im Vergleich zur Verwendung von doppelseitigem Carbonband möglich ist. Da die Proben nicht leitfähig sind, ist es notwendig, eine dünne Metallschicht auf die Proben zu sputtern, um die Leitfähigkeit zu erhöhen. Ein Goldziel wurde in dieser Studie während der Sputterbeschichtung verwendet, und Gold-Palladium liefert ebenfalls ähnliche Ergebnisse, um Ladeeffekte zu vermeiden. Die richtige Strahlspannung ist stichprobenabhängig, bei leicht beschichteten Proben sorgt die Bildgebung mit einer Feldemission SEM bei 2-5 kV für eine gute Definition von Oberflächenstrukturen. Für Gewebe mit ausreichender Beschichtung bietet 5 kV in der Regel ein besseres Signal ohne mehr Strahldurchdringung. Bei Proben, die keine Tiefe haben und allein mit Gold beschichtet sind, ermöglichte die Bildgebung mit einer höheren Spannung (10 kV) eine bessere Visualisierung der Oberflächentopographie.
Die Vorbereitung empfindlicher Gewebe für SEM stellt besondere Herausforderungen dar, und eine Reihe von Probenvorbereitungstechniken kann verwendet werden, um bildgebende Artefakte zu überwinden und zu minimieren. Wir bieten umfassende Methoden zur Verarbeitung von drei verschiedenen empfindlichen biologischen Gewebeproben für die SEM-Bildgebung: Embryonen, starre Eierschalen und Pilzkulturen. In unserer Untersuchung wurden subtile Änderungen an populären Methoden vorgenommen, die aus zuvor veröffentlichten Studien verfügbar waren, und wir identifizierten die am besten geeigneten Dehydrierungs- und Trocknungsmethoden, die für jeden empfindlichen Gewebetyp spezifisch sind. Diese Protokolle könnten angepasst werden, um eine akzeptable SEM-Bildqualität aus ähnlichen biologischen Proben zu erhalten.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten
Acknowledgments
Die Autoren danken Dr. Daniel Baldassarre, SUNY Oswego für hilfreiche Diskussionen und Kommentare zum Manuskript. Diese Studie wurde von Rice Creek Associate Grants, Oswego, unterstützt; Challenge Grants SUNY Oswego and National Science Foundation (NSF) Small Grants to PGL and JG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Fischer Scientific | S25127A | for slide cultures |
| Aluminum pin stub | Tedpella | 16111 | 12.7 mm x 8 mm |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: Potato Dextrose Agar | BD 213400 | DF0013-17-6 | Media for isolation and cultivation of Fungi, yeast and molds |
| Chloramphenicol | Fischer BioReagents | BP904-100 | Antibiotic for media |
| Coarse Vermiculite | Greenhouse Megastore | SO-VER-12 | bedding medium |
| Clear 12- well plate | Corning | 07-201-589 | for fixing embryo |
| Coverslips | Fischer Scientific | S17525B | for slide culture |
| Critical Point Dryer | Quorum CPD | EMS850 | critical point drying |
| Culture dishes | Fischer Scientific | 08 747B | DISH PETRI 100X10MM 12/PK |
| Ethanol | Fischer Scientific | A406P 4 | dehydration agent |
| Forceps- Aquarius Tweezers | Tedpella | 5804 | style 4, length 108mm, widh x thickness 0.017 x 0.17 mm |
| Glutaraldehyde | Fischer Scientific | G151-1 | fixative |
| Gold target for sputter coater | DENTON VACUUM | TAR001-0158 | Gold Target, 2.375″ D X .002″ |
| Hexamethyldisilazana | Fischer Scientific | C19479-5000 | chemical drying agent |
| Kim wipes | Kimtech | S-8115 | cleaning |
| Microscope slides | Thermo Scientific | 67-762-16 | for slide culture |
| Microscopy Scissors | Tedpella | 1327 | Double pointed, stainless steel, 100 mm L (3-5/8"). |
| Micro-scissors | Tedpella | 1346 | Vannas-type, straight, 80mm L |
| Moria Perforated Embryo Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Length 14.5 cm, tip diameter 20 mm, spoon depth 5 mm |
| Netwell Inserts | Corning | 0330B09 | 15 mm Inserts with 74 µm Mesh Size Polyester Membrane act as handy carriers during specimen processing into different solvents |
| Paraformaldehyde | Fischer Scientific | T353 500 | fixative |
| Peat moss | Walmart- Miracle Gro | 551705263 | bedding medium |
| PELCO tabs double stick carbon conductive tape | Tedpella | 5000 | 12 mm OD |
| Sputter coater | DENTON VACUUM | DESK V | thin metal coating |
| SEM | JEOL USA | JEOL JSM 6610LV scanning electron scope | electron microscopy |
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