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स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए प्रसंस्करण भ्रूण, Eggshell, और कवक संस्कृति

Published: August 16, 2019 doi: 10.3791/60018
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, SUNY Oswego

Summary

यहाँ, हम इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) स्कैनिंग का उपयोग कर नाजुक ऊतक नमूने इमेजिंग के लिए विस्तृत प्रसंस्करण प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। तीन अलग-अलग प्रसंस्करण विधियों, अर्थात्, हेक्सामेथिल disilazana (HMDS) रासायनिक सुखाने, सरल हवा सुखाने, और महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने क्रमशः प्रारंभिक विकास चरणों में कठोर eggshells, भ्रूण, और कवक संस्कृतियों की तैयारी के लिए वर्णित हैं।

Abstract

यद्यपि स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) व्यापक रूप से विभिन्न जैविक और गैर जैविक नमूनों के अल्ट्रा संरचनात्मक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है, विभिन्न जैविक नमूनों के प्रसंस्करण में शामिल तरीकों अद्वितीय प्रथाओं शामिल है. सभी पारंपरिक नमूनों प्रसंस्करण के लिए साहित्य में वर्णित प्रथाओं अभी भी उपयोगी अनुप्रयोगों मिल जाए, लेकिन नमूना तैयारी में सूक्ष्म परिवर्तन छवि गुणवत्ता को बदल सकते हैं, साथ ही, कलाकृतियों परिचय. इसलिए, विश्लेषण ऊतक के प्रकार के लिए विशिष्ट एक अद्वितीय नमूना तैयारी तकनीक का उपयोग करने के लिए ultrastructural संकल्प के साथ एक अच्छी गुणवत्ता की छवि प्राप्त करने के लिए आवश्यक है. इस अध्ययन का ध्यान इमेजिंग भ्रूण, कठोर eggshells, और SEM का उपयोग कवक संस्कृतियों के लिए इष्टतम नमूना तैयारी प्रोटोकॉल प्रदान करना है. निम्नलिखित अनुकूलन तीन विभिन्न नाजुक जैविक नमूने का अध्ययन के लिए अच्छे परिणाम प्राप्त करने के लिए सिफारिश की गई थी. 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड या 3% ग्लूटारैल्डिहाइड जैसे हल्के फिक्सेटिव्स का उपयोग, जिसके बाद इथेनॉल श्रृंखला के साथ निर्जलीकरण होता है, अनिवार्य है। स्लाइड संस्कृतियों द्वारा प्राप्त आगर ब्लॉक पर फफूंग mycelium agar प्लेटों से सीधे लिया संस्कृतियों की तुलना में एक बेहतर ultrastructural अखंडता पैदावार. HMDS के साथ भ्रूण के रासायनिक सुखाने महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने की तुलना में सतह तनाव कलाकृतियों शुरू करने के बिना सुखाने प्रदान करता है। HMDS संकुचन की वजह से खुर रोकता है के रूप में नमूने सुखाने के दौरान कम भंगुर हैं. हालांकि, कवक संस्कृति के लिए, महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने रासायनिक सुखाने की तुलना में स्वीकार्य छवि गुणवत्ता प्रदान करता है। Eggshells बढ़ते से पहले पूरी तरह से धोने और हवा सुखाने के अलावा कोई विशेष तैयारी कदम के साथ छवि की जा सकती है. प्रत्येक परीक्षण के साथ प्राप्त स्वीकार्य छवि गुणवत्ता के आधार पर तैयारी के तरीके मानकीकृत किए गए थे।

Introduction

स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (SEM) ultrastructural विश्लेषण और intracellular इमेजिंग पूरक प्रकाश माइक्रोस्कोपी prokaryotes, पौधों, और जानवरों के तीन आयामी रूपरेखा के लिए. एक SEM के उच्च स्थानिक संकल्प यह सबसे बहुमुखी और शक्तिशाली तकनीकों में से एक नैनोमीटर पर नमूनों की सूक्ष्मसंरचनात्मक विशेषताओं की परीक्षा के लिए उपलब्ध बनाता है. Desicated नमूनों गहन विस्तार के साथ compositional और स्थलाकृतिक संरचनाओं के लिए हल कर रहे हैं, जो कार्यात्मक संबंधों के बारे में वैध निष्कर्ष विकसित करने के लिए नींव प्रदान करता है1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9.जैविक नमूनों के SEM छवियों की व्याख्या करते समय, यह एक बड़ी चुनौती है कि प्रसंस्करण के दौरान बनाई गई हैं देशी संरचनाओं और कलाकृतियों के बीच अंतर है. एसईएम का प्रचलन सामान्यतः बहुत उच्च निर्वातों में किया जाता है ताकि नमूने10,11से उत्सर्जित प्राथमिक, द्वितीयक अथवा पश्च-अपस्थाक इलेक्ट्रॉन बीमों को प्रभावित करने वाले गैस अणुओं के किसी भी प्रकार के हस्तक्षेप से बचा जा सके . इसके अलावा, जैविक सामग्री उनके गरीब या गैर संचालन गुणों के कारण विकिरण क्षति के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं। SEM में लोड किए गए नमूनों के लिए यह आवश्यक है कि वे किसी भी जैविक संदूषक से पूरी तरह शुष्क और मुक्त हों ताकि उच्च निर्वातवातावरणमें किसी भी संभव बाहरी वातावरण को समाप्त किया जा सके. चूंकि जैविक नमूनों में ज्यादातर पानी से बने होते हैं, इसलिए यह सुनिश्चित करने के लिए अतिरिक्त तैयारी तकनीकों की आवश्यकता होती है कि देशी संरचनाओं को बनाए रखा जाए।

प्राप्त संकल्प नमूना प्रकार और उपयोग किए गए वाद्य मापदंडों के लिए विशिष्ट तैयारी विधियों के अनुकूलन पर आधारित है। इस प्रकार, सभी ऊतक प्रकार के लिए सामान्यीकृत प्रसंस्करण चरणों का उपयोग करने से बचने के लिए आवश्यक है। कुछ जैविक नमूनों को उनकी संरचना को संरक्षित करने के लिए कम कड़े प्रसंस्करण की आवश्यकता होगी, जबकि कम समय और देखभाल के लिए नमूनों के नाजुक प्रकार के लिए आवश्यक हो सकता है सुखाने कलाकृतियों की शुरूआत से बचने के लिए, इस तरह के संकुचन और पतन के रूप में. नमूना तैयारी SEM इमेजिंग में एक महत्वपूर्ण कदम है; रूपमितीय अध्ययनों के निष्कर्ष नमूना तैयारी प्रक्रिया12,13से उल्लेखनीय रूप से प्रभावित होते हैं . कई जैविक नमूनों के लिए आम तैयारी कदम निर्धारण, निर्जलीकरण और इस तरह के सोने, प्लेटिनम या पैलेडियम के रूप में एक धातु के साथ कोटिंग कर रहे हैं उनकी सतहों को परिवर्तित करने के लिए SEM विश्लेषण के लिए प्रवाहकीय हो. प्रकृति और इस्तेमाल किया कदम के संयोजन ऊतक के प्रकार के आधार पर अलग अलग होंगे, और अध्ययन के विशिष्ट लक्ष्यों. चार्ज बिल्ड-अप, वैक्यूम और इलेक्ट्रॉन बीम क्षति के प्रति संवेदनशीलता नरम नाजुक जैविक नमूनों को संसाधित करते समय समस्याएं पैदा करती है, वस्तु की मूल संरचना को बनाए रखने के लिए अतिरिक्त प्रसंस्करण चरणों की आवश्यकता होती है। ऑस्मियम टेट्रक्साइड फिक्सिंग, और निर्जलीकरण जैसे पारंपरिक तरीकों का उपयोग करने से संकुचन होता है और नाजुक ऊतकों का पतन14,15,16,17होता है . अध्ययन का उद्देश्य तैयार करने और छवि नरम नाजुक ऊतकों (जैसे, सरीसृप भ्रूण, चित्रित कछुए के अंडे, और कवक संस्कृतियों) के साथ पहले के अध्ययनों से विचारों के संयोजन के द्वारा व्युत्पन्न सुरुचिपूर्ण तरीके स्थापित करने के लिए है।

एक उपयुक्त फिक्सिंग विधि का चयन जैविक नमूनों के सूक्ष्म विश्लेषण के लिए पहला सबसे महत्वपूर्ण कदम है. किसी जीव से अलग होने के तुरंत बाद ऊतकों को ठीक करना अपघटन के कारण उनकी आकृति विज्ञान में परिवर्तन को रोकने के लिए आवश्यक है। एक प्रभावी fixative जल्दी से कोशिकाओं permeating द्वारा सेलुलर प्रक्रियाओं को समाप्त करना चाहिए और SEM17 के तहत दोनों बाद प्रसंस्करण कदम और परीक्षा का सामना करने के लिए नमूना की संरचना को स्थिर करने के लिए अपरिवर्तनीय प्रभाव को बनाए रखने , 18.यद्यपि कई रासायनिक और भौतिक निर्धारण विधियों को जाना जाता है, फिर भी रासायनिक निर्धारण का प्रयोग जैविक नमूनों के लिए अधिक सामान्यतः किया जाता है ताकि स्वविश्लेषण, putrefaction, और सुखाने के प्रभावके किसी भी सेल्यूलर परिवर्तन से बचा जा सके. साहित्य17,19,20,21 ,22,23 ,23, स्थिरीकरण में चर्चा की गई अनेक स्थिर रासायनिक योगों की चर्चा की गई है जो निराकरण द्वारा कार्य करते हैं और जैविक स्थूल अणुओं को एकत्रित करना, और जो सहसंयोजक रूप से परस्पर जोड़ने वाले स्थूल अणुओं द्वारा ठीक होते हैं। अल्कोहल का उपयोग डेनेटिंग फिक्सेटिव्स के रूप में किया जाता है जो अल्ट्रास्ट्रक्चर को बहुत खराब संरक्षित करते हैं और ज्यादातर प्रकाश माइक्रोस्कोपी के लिए उपयोग किए जाते हैं और इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म विश्लेषण के लिए अनुशंसित नहीं होते हैं। क्रॉस-लिंकिंग फिक्सेटिव्स जैसे फॉर्मेल्डिहाइड, ग्लूटारैल्डिहाइड, और ऑस्मियम टेट्रऑक्साइड ऊतकों के भीतर मैक्रो अणुओं के बीच अंतर-अणुऔर अंतरा-अणुकारी का निर्माण करते हैं, जो अल्ट्रा-संरचनाओं के उत्कृष्ट संरक्षण प्रदान करतेहैं 11 ,24,25,26. जैविक नमूने तापमान के प्रति संवेदनशील होते हैं। निर्धारण की शुरुआत में तापमान को झिल्ली प्रोटीन की पार्श्व गतिशीलता को कम करने, अंतरकोशिकीय अणुओं के प्रसार को धीमा करने, और निर्धारणकीदर को धीमा करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस होने की सिफारिश की जाती है। ऊतकों को ठीक करने के लिए आवश्यक समय काफी हद तक नमूने के आकार और उस गति पर निर्भर करता है जिस पर स्थिर विसरण और नमूना के घटकों के साथ प्रतिक्रिया करता है। पीबीएस में 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड या 3% ग्लूटारैल्डिहाइड में एक रात भर निर्धारण उनके अनुक्रमिक पीनेटिव गुणों के लिए इस अध्ययन में उपयोग किए गए नमूनों के SEM विश्लेषण के लिए पसंदीदा तरीका है, जो छोटे नाजुक नमूनों को संसाधित करने की अनुमति देता है17 , 18 , 19 , 20 , 27. ऑस्मियम टेट्रेक्साइड के साथ एक पोस्ट-फिक्सेशन चरण न केवल अपनी विषाक्त प्रकृति के कारण समाप्त हो जाता है बल्कि इस अध्ययन में विश्लेषण किए गए नमूनों के लिए छवि की गुणवत्ता में सुधार करने के लिए कोई अतिरिक्त लाभ को लागू करने के लिए भी पाया जाता है।

जैविक नमूनों में तरल पदार्थ होते हैं जो SEM ऑपरेशन में हस्तक्षेप करते हैं; इसलिए, नमूने SEM नमूना कक्ष में डालने से पहले सूखे की जरूरत है. निर्जलीकरण सुनिश्चित किया जाता है, विलायक सतह तनाव के कारण नमूनों में कलाकृतियों बनाने के बिना ऊतक से हटा दिया जाना चाहिए / SEM इमेजिंग के लिए प्रसंस्करण ऊतकों के दौरान आमतौर पर तीन अलग अलग सुखाने तरीकों का इस्तेमाल किया गया: हवा सुखाने, महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने , और फ्रीज सुखाने के नमूने28,29,30,31. कुछ अध्ययनों से पता चलता है कितीनों सुखाने के तरीकों से पशुओं के ऊतकों के नमूनों के साथ समान परिणाम प्राप्त होते हैं 28 ,29,30,31. छोटे नमूनों के लिए उपयोग किया जाने वाला एक सामान्य अभ्यास अल्कोहल और हेक्सामेथिलडिस्लैज़ान (एचएमडीएस) की सांद्रता श्रृंखला को आरोही करके रासायनिक निर्जलीकरण है, लेकिन बड़े नमूनों को एक महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने (सीपीडी) उपकरण32का उपयोग करके सूखे जाते हैं। सुखाने की प्रक्रिया के दौरान, छोटे गुहाओं में बनने वाले काफी बल जो नमूने के माध्यम से तरल/गैस अंतराफलक द्वारा पारित किए जाते हैं; इससे खोखलेसंरचनाओंका पूर्ण पतन भी हो सकता है . उपचार के कारण होने वाली किसी भी विरूपण तो नमूना के एक देशी संरचनात्मक सुविधा के रूप में गलत हो सकता है. इस प्रकार, प्रसंस्करण के लिए सामान्यीकृत घटना समाप्त किया जाना चाहिए और एक अद्वितीय सुखाने की प्रक्रिया ऊतक के प्रत्येक प्रकार के लिए मानकीकृत किया जाना चाहिए, खासकर जब नाजुक ऊतक नमूनों का विश्लेषण कर रहे हैं.

उपर्युक्त सभी प्रक्रियाओं के विभिन्न संयोजन का उपयोग करके किए गए कई परीक्षणों में, हमने उन विधियों को मानकीकृत किया है जिनका उपयोग तीन नाजुक ऊतकों के SEM विश्लेषण के लिए किया जा सकता है: सरीसृप भ्रूण, चित्रित कछुओं के एगशेल्स, और कवक संस्कृतियों। विकासात्मक जीवविज्ञानी और आकृति विज्ञानी प्रतिनिधि कशेरुकी पशुओं में भ्रूण के विकास के दौरान सामान्य और असामान्य रूपजनन का वर्णन करते हैं। जीन संकेतन पथ ों पर जांच उपन्यास संरचनाओं के रूपात्मक वर्णन पर निर्भर करती है। SEM विश्लेषण के दौरान कशेरुकी भ्रूण संरचना में किसी भी अचानक परिवर्तन से बचने के लिए, हम निर्जलीकरण के बाद रासायनिक सुखाने की सलाह देते हैं। रासायनिक सुखाने HMDS का उपयोग अपेक्षाकृत नवीनतम सुखाने विधि है और लाभ रिश्तेदार तीव्रता, उपयोग में आसानी, लागत खो दिया है, और सीमित विशेषज्ञता और उपकरण9की जरूरत शामिल है। सीपीडी एक विशिष्ट तापमान और दबाव पर नमूनों भर में सीओ2 passaging का उपयोग कर एक आमतौर पर इस्तेमाल किया सुखाने तकनीक है। हमने पहचान की है कि HMDS नरम नाजुक ऊतकों सुखाने के लिए उपयुक्त है और बड़े नमूने महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने की तुलना में संसाधित किया जा करने के लिए अनुमति देता है, जो भ्रूण ऊतकों के लिए व्यापक विरूपण का कारण बना. कवक34की आकृतिक विशेषताओं का अध्ययन करने के लिए SEM इमेजिंग के लिए नमूने तैयार करने के लिए अनेक विधियों का उपयोग किया गया है . कवक नमूनों आमतौर पर ओस्मियम tetroxide में इथेनॉल निर्जलीकरण और महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने के बाद तय कर रहे हैं, जो संतोषजनक परिणाम प्रदान कर सकते हैं, हालांकि osmium tetroxide के विषाक्त प्रभाव6,7,35 और कवक सामग्री खोने जबकि प्रसंस्करण के दौरान समाधान बदलने स्पष्ट नुकसान कर रहे हैं. निर्धारण के बिना हवा सुखाने का उपयोग कर नमूना तैयारी तकनीक भी36 अभ्यास किया गया है, लेकिन सिकुड़ और ढह संरचनाओं में परिणाम है, और इस तरह के नमूनों के अवलोकन आसानी से प्रजातियों की विशेषता है, जबकि गलत अर्थ लगाया जा सकता है। कवक हायफा तरल पदार्थ के संपर्क में अपनी अखंडता खो देता है और संरचना को बहाल करने के लिए एक भी सुखाने हासिल नहीं किया जा सकता है। इस प्रभाव के कारण, फ्रीज-ड्राइंग आमतौर पर फंगल माइसीलियम जैसे नरम ऊतकों को सुखाने के लिए प्रयोग किया जाता है। फ्रीज सुखाने साफ सामग्री के लिए अच्छी तरह से काम करता है, लेकिन किसी भी लवण या स्राव की उपस्थिति सतह विस्तार है कि केवल SEM देखने के चरण में पहचान की जाएगी अस्पष्ट होगा. हमने ग्लूटारैल्डिहाइड फिक्सिंग और क्रिटिकल पॉइंट सुखाने के साथ स्लाइड कल्चर विधि को युग्मित किया ताकि बरकरार फंगल हाइफे और बीजाणुओं के संरचनात्मक विवरण प्राप्त किए जा सकें। हालांकि सीपीडी सुखाने भ्रूण में संकुचन का कारण बना, यह अच्छी तरह से संरक्षित mycelial संरचनाओं में हुई जब glutaraldehyde निर्धारण के साथ युग्मित. अंडकोश न केवल एक सुरक्षात्मक आवरण के रूप में कार्य करके, बल्कि यांत्रिक स्थिरता, गैस और पानी के पारगम्यता, और विकासशील भ्रूण के लिए कैल्शियम आरक्षित प्रदान करके अंडप्रस पशुओं के भ्रूण के लिए प्राथमिक महत्व का है। मीठे पानी के कछुए eggshells के रूप में वर्गीकृत कर रहे हैं "rigid" उनकी संरचना के आधार पर, और उनकी उपलब्धता के कारण जीवविज्ञानियों से महत्वपूर्ण ध्यान प्राप्त हुआ है1,2,3,4 , 5 , 6 , 7 , 37 , 38.

हम किसी भी कठोर एग्शेल प्रजातियों के लिए लागू किया जा सकता है कि चित्रित कछुआ के अंडकोश और खोल झिल्ली की आसान परीक्षा के लिए सरल तरीकों का विस्तार। तैयारी के तरीके जिसके परिणामस्वरूप छवि गुणवत्ता और कम संभावित कलाकृतियों के आधार पर मूल्यांकन किया गया.

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Protocol

नोट: इस अध्ययन में प्रयुक्त चित्रित कछुआ (क्रिसेमीस पिट्टा) अंडे मई के घोंसले के मौसम के दौरान चावल क्रीक फील्ड स्टेशन, ओस्वेगो न्यूयॉर्क से न्यूयॉर्क स्टेट डिपार्टमेंट ऑफ एनवायरनमेंटल से प्राप्त अनुमति के साथ जून 2015-16 के माध्यम से एकत्र किए गए थे संरक्षण (डीईसी).

1. रासायनिक सुखाने विधि SEM के लिए भ्रूण की प्रक्रिया के लिए

  1. घोंसले के मौसम के दौरान क्षेत्र साइटों से कछुए अंडे ले लीजिए। पहले से ऊष्मायन कक्षतैयार करें, ढक्कनों के साथ प्लास्टिक के बक्से से बने (एल एक्स डब्ल्यू एक्स एच) 6.7 सेमी x 25.4 सेमी x 10.2 सेमी से भरा बिस्तर माध्यम से भरा हुआ है जो वर्मीक्यूलाइट और पीट काई (1:1 अनुपात) के नम मिश्रण के साथ तैयार किया गया है। वातन की अनुमति देने के लिए बक्से के किनारों के साथ और ढक्कन पर लगभग 0.25 सेमी के 4-6 छिद्र बनाएं।
  2. अंडे को उजागर करने के लिए घोंसले से मिट्टी को धीरे से हटा दें। ऊष्मायन के दौरान माइक्रोबियल संदूषण को नियंत्रित करने के लिए पतला आयोडीन टिंचर (1:25,000) के साथ कछुए के अंडे की सतह को साफ करें। चंगुल को एक-दूसरे से अलग रखें, चित्रित कछुए के क्लच आकार 5-9 अंडों से भिन्न हो सकते हैं और प्रति बॉक्स अधिकतम 8-9 अंडे रखें।
    नोट: ध्यान से संग्रह के दौरान अंडे संभाल, पोंछते, लेबलिंग और बक्से के अंदर रखने. स्थिति और अंडे के संरेखण के रूप में वे रखी गई थी एक ही होने की जरूरत है, किसी भी आंदोलन भ्रूण विकास को बाधित करेगा.
  3. मैन्युअल रूप से अंडे को बिस्तर में आधा दफना दें, कवर करें और बॉक्स को 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर सेट के अंदर रखें। इस अध्ययन में क्रमशः भ्रूण ीय अवस्था 12, 13 और 18 को प्राप्त करने के लिए अंडों को 10-17 दिनों के लिए इनक्यूबेट करें। निर्जलीकरण से बचने के लिए और भ्रूण के सामान्य विकास के लिए नमी के स्तर को बनाए रखने के लिए हर दूसरे दिन बिस्तर मध्यम आंशिक रूप से गीला करने के लिए आसुत पानी जोड़ें।
    नोट: इनक्यूबेशन और स्टेजिंग भ्रूण39से पहले प्रकाशित एक पूर्ण विकास तालिका के अनुसार होते हैं।
  4. पृष्ठीय अंडकोश और जर्दी झिल्ली के एक तरफ पहली कटौती करके भ्रूण को ठीक करें, नुकीली कैंची का उपयोग करके लंबे अक्ष के लिए ऊर्ध्वाधर। भ्रूण डिस्क काटने से बचने के लिए सावधानी से जर्दी में कैंची डालें। अब लंबे अक्ष के साथ अंडे के पार्श्व पक्ष में कटौती और फिर छोटे अक्ष के साथ अंडे के दूसरे पक्ष में कटौती.
  5. एसेक्त पीस को भ्रूण की ओर से संदंश के साथ खोल लें। अंडकोश के दूसरे पार्श्व की ओर काटें तथा उत्पादित पीस को फॉस्फेट बफर्ड लवण (पीबीएस 7-4) के पीएच पर रख दें।
    नोट: कछुआ अंडा अत्यधिक चिपचिपा अंडे की जर्दी से भर जाता है और भ्रूण के पृष्ठीय पक्ष एगशेल झिल्ली का पालन करता है। भ्रूण के पास अंडकोश झिल्ली पारदर्शी सफेद से एक अपारदर्शी, चॉकी सफेद करने के लिए ऊष्मायन के साथ बदलता है। यह एक को लंबी अक्ष के मध्य में भ्रूण का पता लगाने की अनुमति देता है और इसे बाहरी40,41से एक काले कैल्सीकृत स्थान के रूप में देखा जा सकता है .
  6. उन्हें एगशेल से बल का उपयोग करके अंडे की झिल्ली के साथ भ्रूण को अलग करने के लिए एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग करें। संदंश और माइक्रो-स्किस्टर का उपयोग करके अतिरिक्त भ्रूण झिल्ली निकालें। किसी भी रक्त या जर्दी को धोने के लिए भ्रूण चम्मच का उपयोग करके पेट्री डिश में ताजा पीबीएस में भ्रूण को स्थानांतरित करें।
  7. पीबीएस में 4 डिग्री सेल्सियस में या पीबीएस में 2-3% glutaraldehyde में रात भर भ्रूण को ठीक करने के लिए स्पष्ट 12-वेल प्लेटों का उपयोग करें। प्रत्येक कुएं में एक से तीन भ्रूण ों को भ्रूण के आकार के आधार पर रखें। 2-3 दिनों के लिए निर्धारण समय का विस्तार करके पुराने भ्रूणों के लिए पूर्ण घुसपैठ (नमूने सफेद दिखाई देंगे) सुनिश्चित करें। 5 मिनट प्रत्येक कुल्ला के लिए ताजा पीबीएस के साथ भ्रूण 3x कुल्ला.
    नोट: एक विलायक से दूसरे करने के लिए नमूनों को स्थानांतरित करने के लिए 12 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए पॉलिएस्टर जाल नीचे के साथ polystyrene सम्मिलित करता है का उपयोग करके भ्रूण की सतह को नुकसान पहुंचाने से बचें।
  8. आसुत पानी में इथेनॉल एकाग्रता की एक श्रृंखला का उपयोग कर निर्जलित नमूने: 30%, 50%, 70%, 80%, 95%, और 100% और प्रत्येक निर्जलीकरण समाधान में 1 एच के लिए नमूने का इलाज. पूर्ण निर्जलीकरण सुनिश्चित करने के लिए 100% इथेनॉल दो बार के साथ कदम दोहराएँ. यदि तुरंत इस्तेमाल नहीं किया, एक लंबी अवधि के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर 70% इथेनॉल में नमूने की दुकान.
  9. 100% इथेनॉल एकाग्रता के लिए हेक्सामेथिलडिस्लाज़ाना (HMDS) की एक श्रृंखला का उपयोग कर सूखे भ्रूण: 1:2, 2:1 और 100%. 20 मिनट के लिए प्रत्येक समाधान में नमूने छोड़ दो और पेट्री पकवान आंशिक रूप से इस प्रक्रिया के दौरान कवर रखें.
    नोट: HMDS अत्यधिक विषाक्त है के रूप में आवश्यक व्यक्तिगत सुरक्षा गियर के साथ धूआं हुड में HMDS शामिल सभी कदम बाहर ले.
  10. अंतिम 100% HMDS समाधान में भ्रूण छोड़ दो पूरी तरह से या आंशिक रूप से एक धूआं हुड में रात भर HMDS के वाष्पीकरण में सहायता, बढ़ते और sputter कोटिंग के लिए तैयार नमूने छोड़ने. नमूने पर बसने धूल को खत्म करने के लिए पकवान कवर.
    नोट: ऊतक पूरा सुखाने के बाद सफेद दिखाई देगा और आंशिक रूप से सूखे नमूने पीले रंग में दिखेगा, एक लंबे समय के लिए धूआं हुड में इन ऊतकों को छोड़ दें।
  11. विश्लेषण नमूने के आकार प्रति एल्यूमीनियम stubs और कार्बन चिपकने वाला टेप का आकार चुनें. एक मानक एल्यूमीनियम पिन स्टब (12.7 मिमी x 8 मिमी) डबल छड़ी कार्बन प्रवाहकीय टेप (12 मिमी) का उपयोग कर पर ध्यान से सूखे नमूनों माउंट.
  12. चार्ज प्रभाव को खत्म करने के लिए सोने की एक बहुत पतली फिल्म के साथ नमूना कोट करने के लिए sputter coater के कक्ष में घुड़सवार नमूने परिचय। सोने की प्लेट एक 35 लेकिन sputter पर 60-120 s के लिए नमूनों.
  13. सुरक्षित रूप से setscrews जकड़ना द्वारा इसी pores प्लेट करने के लिए स्टब माउंट. नमूना विनिमय उपकरण का उपयोग कर SEM के नमूना कक्ष में या बाहर नमूना धारक स्थानांतरण. 10 केवी की एक त्वरित बीम वोल्टेज और उत्सर्जन वर्तमान 10 डिग्री सेल्सियस के साथ उच्च वैक्यूम मोड में नमूने छवि।
    नोट: हमेशा दस्ताने पहनते हैं, जबकि नमूने से निपटने, नमूना धारकों, बढ़ते stubs, और हस्तांतरण उपकरण SEM प्रणाली के लिए हाथ से तेल संदूषण से बचने के लिए.
  14. ऊपर प्रक्रिया से प्राप्त नमूनों के संकल्प की तुलना करने के लिए नीचे सूचीबद्ध वैकल्पिक तकनीकों का परीक्षण करें।
    1. चरण 1.7 के बाद कमरे के तापमान पर 1 एच के लिए 1% ऑस्मियम टेत्रोक्साइड के साथ एक पोस्ट-फिक्सेशन शामिल करें।
    2. आंशिक रूप से या पूरी तरह से HMDS के तेजी से वाष्पीकरण के लिए कदम 1.10 पर HMDS हटा दें.
    3. चरण 1.8 के बाद प्रक्रिया भ्रूण महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने का उपयोग कर (सीपीडी) चरणों का पालन करके 3-3-3.4.

2. एक हवा सुखाने विधि का उपयोग कर SEM के लिए एगशेल की तैयारी

  1. 1-1-7 के चरणों में विनिर्दिष्ट भ्रूणों को ठीक करने के लिए चित्रित कछुआ (क्रिसेमीस पिक्टा) को एकत्र कीजिए और इनक्यूबेट कीजिए।
  2. चरण 2.1 में भ्रूण निर्धारण के बाद आसुत जल में एगशेल्स सहेजें। जर्दी और एल्बुमिन संदूषण को खत्म करने के लिए कम से कम 1 एच के लिए आसुत पानी में भिगोने से अंडे को अच्छी तरह से साफ करें।
  3. रात भर धूआं हुड में नाजुक एंटीस्टेटिक वाइप्स पर धोने के बाद एयर-ड्राई एगशेल्स। संख्या और चरण द्वारा लेबल स्वच्छ नमूना बोतलों में सूखे eggshells स्टोर.
  4. 1-1-1-13 चरणों में निर्दिष्ट चरणों का अनुसरण करके नमूनों को माउंट, स्पर कोट तथा छविित कीजिए।

3. SEM के लिए कवक संस्कृतियों की तैयारी के लिए महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने विधि

  1. स्लाइड संस्कृतियों की स्थापना
    1. कवक संस्कृतियों के लिए आलू डेक्सट्रोज आगर (पीडीए) मीडिया तैयार करें: एक Erlenmeyer फ्लास्क में आसुत पानी के 1 एल में पीडीए शक्ति के 39 ग्राम जोड़ें। फ्लास्क को घुमाकर अच्छी तरह मिलाएं और मीडिया को 30 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर घुमाकर अच्छी तरह मिला लें। मीडिया के समाधान को ठंडा होने दें और फिर एक बाँझ माइक्रोपिपेट का उपयोग करके एंटीबायोटिक क्लोरैम्फीनिकोल (25 ग्राम/एमएल) जोड़ें।
      नोट: नसबंदी के बाद, आगर समाधान गर्म होना चाहिए और यह जल्द ही ठोस नहीं होगा। इसे पर्याप्त रूप से ठंडा करें ताकि यह एंटीबायोटिक दवाओं को निष्क्रिय न कर सके।
    2. यह घूमता द्वारा मिक्स और प्लेटें डालना (प्रत्येक 10 सेमी पेट्री डिश के लिए मीडिया के लगभग 10-12 एमएल), ध्यान से ढेर और ठोस.
    3. एक इंच के बारे में 1/2 से 3 डिग्री 4 के बारे में agar के छोटे ब्लॉक बाहर कटौती करने के लिए एक बाँझ स्केलपेल ब्लेड का प्रयोग करें। निकालें और एक साफ ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड पर एक agar ब्लॉक जगह है।
    4. प्रदूषण को रोकने और ऊष्मायन के दौरान नमी को बनाए रखने के लिए स्लाइड को एक साफ पेट्री डिश में रखें।
    5. ऊष्मायन के बाद नाजुक विकास को बाधित किए बिना कांच की स्लाइड को हटाने के लिए प्लेट और स्लाइड के बीच सतह तनाव पैदा करने के लिए एक बाँझ टूथपिक का उपयोग करके पेट्री डिश के नीचे से स्लाइड उठाएँ।
    6. स्लाइड पर आगर ब्लॉक के प्रत्येक भाग में एक नमूना इनोकुलम से कवक को स्थानांतरित करने के लिए एक बाँझ लूप या सुई का उपयोग करें।
    7. टीका लगाने के बाद आगर ब्लॉक की सतह पर एक साफ कवरस्लिप रखें। बढ़ते कवक के लिए नमी सुनिश्चित करने के लिए स्लाइड के चारों ओर पेट्री डिश में बाँझ आसुत पानी की कुछ बूँदें जोड़ें।
    8. प्लेट को आंशिक रूप से पैराफिन फिल्म का उपयोग करके सील करें और प्लेट को उचित समय की लंबाई के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें (फुसेरियम प्रजातियों के लिए 36 से 48 एच के लिए इनक्यूबेट)।
    9. पेट्री डिश से स्लाइड निकालें और बाँझ संदंश का उपयोग कर के गार ब्लॉक से कसकर पालन कवरस्लिप को अलग करें। पीबीएस में 3% glutaraldehyde में आगर ब्लॉक को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर ठीक करें।
  2. एक इथेनॉल श्रृंखला के माध्यम से गुजर द्वारा नमूनों को निर्जलित: 10%, 25%, 50%, 75% और 90% परिवर्तन प्रति 15 मिनट के साथ. पूर्ण संतृप्ति सुनिश्चित करने के लिए 100% इथेनॉल में दो परिवर्तनों के साथ अंतिम निर्जलीकरण के लिए नमूनों को संसाधित करें 30 मिनट प्रत्येक।
  3. महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने: सीपीडी उपकरण के कक्ष में निर्जलित नमूने रखें। सील और वाल्व खोलने के द्वारा कक्ष शांत तरल सीओ2 में अनुमति देने के लिए और इथेनॉल बाहर निकलने, जब तक तरल सीओ2 पूरी तरह से कक्ष भरता है.
    1. कक्ष दाब 1000 साई से अधिक होने पर एक महत्वपूर्ण बिंदु को प्राप्त करने के लिए कक्ष को धीरे-धीरे सील और गर्म करें तथा ताप 31 डिग्री सेल्सियस से अधिक हो जाता है, ब्व्2 का द्रव एवं गैस चरण संतुलन में होता है। सतह तनाव के प्रभाव से बचने के लिए धीरे-धीरे कक्ष से सीओ2 और नमूने को गैस के रूप में निकाल दें।
  4. बढ़ते प्रदर्शन, सोने चढ़ाना और चरणों 1.11-1.13 में निर्दिष्ट चरणों का पालन करके नमूनों इमेजिंग।
  5. 1.9-1.13 चरणों का पालन करके HMDS का उपयोग करके चरण 3.2 से नमूनों को रासायनिक रूप से सुखाने के द्वारा तुलनात्मक विश्लेषण करें।

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Representative Results

चित्रा 1 चित्रित कछुए(क्रिसेमीस पिक्टा) भ्रूणों का स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफिक विश्लेषण। चित्रित कछुआ अंडे एकत्र और एक बिस्तर माध्यम पर incubated, रासायनिक सुखाने के बाद एल्यूमीनियम stubs पर घुड़सवार SEM इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया गया (चित्र 1एई). एक चरण 12 भ्रूण का एक पार्श्व दृश्य craniofacial संरचनाओं से पता चलता है; जंभिका शोहरत mandibular से परे फैली हुई है और एक अच्छी तरह से चिह्नित नाक गड्ढे medialy सीमा; पांच ग्रसनी मेहराब भी देखी गई (चित्र 1च) भ्रूण के पीछे पूंछ क्षेत्र में नवगठित सोमाइट आसानी से खंडित शरीर someites की तुलना में गणनीय हैं. फोरलिम्ब कलियों को पिछले अंग कलियों की तुलना में लंबे समय तक दिखाई देते हैं और वेंटली की तुलना में अधिक कारण होते हैं। एक केरापेस रिज की एक सुपरिभाषित वृद्धि चरण 15 भ्रूण के पूरे अंतर-लैंब फ्लेंक क्षेत्र के साथ देखी जाती है (चित्र 1छ. 18 के चरण में, चित्रित कछुए एक छोटी, feebly थूथन पेश करने के अधिकारी. निचली चोंच ऊपरी जबड़े के भीतर टिकी होती है और टर्मिनल हुक के साथ थोड़ी उलट जाती है जो ऊपरी चोंच के केंद्रीय पायदान में फिट बैठता है (चित्र 1ह) चित्रित कछुए के ऊपरी जबड़े प्रत्येक पक्ष पर एक छोटे से उभयाग्र के साथ एक मध्यस्थ यू-वी आकार का जिला टिप बनाने के लिए एक noched उपस्थिति से पता चलता है, एक छोटे से अंडे दांत ऊपरी जबड़े की नोक पर फार्म करने के लिए शुरू होता है। अंग कलियों कि पहले के चरणों के दौरान लंबे समय तक दिखाई दिया डिजिटल प्लेट अस्पष्ट रूप से संकेत के साथ चरणों 13-14 के दौरान एक चप्पू की तरह संरचना के रूप में। शीर्ष बहिर्चर्मीय रिज द्वारा सीमांकन किए गए अंग मेन्काइम को पूर्ववर्ती-पश् चीय मार्जिन के साथ देखा जाता है (चित्र 1I-J)।

चित्रा 2 SEM इमेजिंग का उपयोग कर Chrysemys पिक्टा एगशेल और खोल झिल्ली के अल्ट्रा संरचनात्मक विश्लेषण से पता चलता है। चित्रित कछुआ एगशेल्स ऊपर वर्णित के रूप में प्राप्त किए गए थे और डबल आसुत जल के साथ धोने के बाद हवा सुखाने के अधीन थे (चित्र 2ए, बी)। दो तरफा कार्बन टेप के साथ एल्यूमीनियम स्टब पर लगाए गए एगशेल्स की छवि SEM का उपयोग करके की गई थी (चित्र 2ब्) की छवि थी। खोल के एक पार्श्व दृश्य में बाह्य कैल्सियमी अंडकोश परत को आंतरिक तंतु शृंखलु झिल्ली (चित्र 2ड)को मजबूती से संलग्न करते हुए दिखाया गया है। अंडकोश की बाहरी सतह में अच्छी तरह से विशिष्ट खनिजित खोल इकाइयां होती हैं, जो समूहों में व्यवस्थित गोलाकार/गोलाकार नोड्यूल से बनी होती हैं और आसन्न खोल इकाइयों के बीच छोटे गोल अवसादों या विभिन्न आकारों के छिद्रों की सांद्रता होती है। मनाया गया (चित्र 2ई)। शैल इकाइयों के प्रत्येक समूह के नोड्यूल एक संपर्क जंक्शन, केंद्र बिंदु (चित्र 2च) पर मिलतेहैं। बाहरी सतह को शेल झिल्ली की सतह का निरीक्षण करने के लिए संदंश का उपयोग करके मैन्युअल रूप से छीला गया था। केंद्रीय प्लेक की पंक्तियाँ देखी गईं जो शेल इकाइयों और अंतर्निहित बहुस्तरीय रेशेदार झिल्ली के बीच लगाव बिंदु प्रदान करती हैं (चित्र 2ग)।

चित्र 3 SEM इमेजिंग का उपयोग करके देखी गई स्लाइड संस्कृतियों से ascomycete कवक पृथक के रूपात्मक लक्षण को दर्शाता है। स्लाइड कल्चर सेटअप की योजना स्थापित (चित्र3ए) टीका लगाने के दो दिनों के भीतर आगर ब्लॉक पर कवक विकास दर्शाता है। सफेद से क्रीम रंग का एरियल माइसीलियम के साथ तेजी से बढ़ रही कालोनियों (चित्र3बी)। एसईएम इमेजिंग महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने और आगर स्लाइस के sputter कोटिंग के बाद कवक hyphae, घुमावदार conidia, और बीजाणुओं की तरह चावल से पता चला। कोनियोफोर्स को बाद में पट हवाई हाइफे से उत्पन्न होते हुए देखा गया (चित्र 3ग) मैक्रोकोनिडिया छोटे, शाखाकृत कोनिडिओफोर्स पर उत्पादित मध्यम घुमावदार होते हैं, जिसमें छोटे, कुंद शीर्ष और अस्पष्ट रूप से पेडिसेलेट बेसल कोशिकाएं अधिकतर पटित होती हैं (चित्र 3डी)।

चित्र 4 वैकल्पिक तकनीकों का उपयोग करते हुए समान नमूनों को संसाधित करने के लिए तुलनात्मक परिणाम दर्शाता है। HMDS में चरण 15 भ्रूणों के सिर ों को डुबोने और क्रमिक वाष्पीकरण से सुखाने से अच्छी तरह से संरक्षित craniofacial संरचनाओं को दिखाने के लिए, लगभग कोई संकुचन या विरूपण HMDS से धीमी वाष्पीकरण के विस्तारित समय के साथ देखा जाता है (चित्र 4ए). ऑस्मियम टेट्रॉक्साइड के बाद भ्रूणों ने एचएमडीएस धीमी प्रक्रिया की तुलना में ऊतक के थोड़े संकुचन को छोड़कर छवि गुणवत्ता में कोई विशिष्ट अंतर नहीं दिखाया (चित्र 4ठ)। HMDS को आंशिक रूप से या पूरी तरह से तेजी से वाष्पीकरण की अनुमति देकर भ्रूण सुखाने संरचनात्मक विरूपण और संकुचन में परिणाम (चित्र 4सी), जबकि धीमी वाष्पीकरण एक इसी तरह का मंचन भ्रूण के उत्कृष्ट सतह संरचनाओं का समाधान ( चित्र 4 एक) सुखाने कलाकृतियों सीपीडी तकनीक के साथ इलाज भ्रूण में देखा गया था व्यापक संकुचन और ऊतक के विनाश के कारण (चित्र 4डी, ई) . स्लाइड संस्कृतियों से आगर स्लाइस सीपीडी की तुलना में एचएमडीएस उपचार के साथ फंगल आइसोलेट का अधूरा सुखाने दिखाते हैं (चित्रा एफ) पूर्ण सुखाने एक अच्छी तरह से सूखे, सफेद नमूना कवक hyphae और बीजाणुओं की बरकरार उच्च संकल्प संरचनात्मक सुविधाओं दिखा के साथ आगर स्लाइस के सीपीडी उपचार के साथ हासिल की है (चित्र 4जीजी'). कवक संस्कृतियों के साथ आगर ब्लॉक सिकुड़े और पीले रंग में दिखाई देते हैं जिससे उन्हें SEM इमेजिंग के लिए उपयुक्त नहीं है (चित्र 4H-H')।

Figure 1
चित्र 1 : के स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन micrographs क्रिसेमीस पिक्टा रासायनिक सुखाने से तैयार भ्रूण। (ए) क्रिसेमीस पिक्टा, राइस क्रीक फील्ड स्टेशन, ओसवेगो, एनवाई में प्रजनन के मौसम के दौरान नेस्टिंग। (बी) बाहर से अच्छी तरह से निर्मित घोंसला। (ग) सतह की मिट्टी को अंडे के जोखिम के लिए सावधानी से हटाया जाता है। (घ) बिस्तर माध्यम के साथ ऊष्मायन कक्ष में रखे अंडे। (ई) रासायनिक सुखाने के बाद एल्यूमीनियम स्टब पर बढ़ते भ्रूण, E4 sputter लेपित भ्रूण दिखा. (च) चरण 12 भ्रूण का पार्श्व दृश्य जिसमें चेहरे की संरचनाएं, अंग कलियों और सोमाइट्स को दिखाया गया है। (जी) अच्छी तरह से परिभाषित केरापेस रिज और पैडल के आकार का अंग कलियों चरण 15 में देखा जाता है। (ज) चरण 18 भ्रूण की क्रैनियोफैशियल संरचनाएं जो ऊपरी और निचले जबड़े को दर्शाती हैं, ऊपरी चोंच की नोक पर बने अंडे के छोटे दांत को नोट की जाती हैं। ((I) 13-14 के चरण में दायां फोरलिम्ब का डोर्सल व्यू और पृष्ठीय-वेंट्रल सीमा पर एईआर (जे) का एक निकट-अप दृश्य। स्केल बार: F-H, 500 डिग्री मी; मैं, 100 डिग्री, और जे, 10 डिग्री मी. कुंजी: एमबी, मिडब्रेन; एनपी, नाक गड्ढे; एमएक्सपी, जंभिका प्रमुखता; पा, ग्रसनी मेहराब; ज, दिल; फ्लेलिम्ब; एस, सोमाइट; एल, हिंद अंग, टी, पूंछ टिप; सीआर, कार्पेशियल रिज; एट, अंडे; दांत; अंडा; आंख; आंख; अंडा; आंख; अंडा; आंख; अंडा; अंडा; , निचले जबड़े; मी, मेसेनकाइम, एईआर, एपिक एक्टोडर्मल कटक. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : हवा में सूखे अंडे के सूक्ष्म विश्लेषण और चित्रित कछुए के अंडे के खोल झिल्ली. (क) भ्रूणों को ठीक करने के बाद अंडे के छिलके को यतक और एल्बुमिन को हटाने के लिए आसुत जल में अच्छी तरह से धोया जाता था। (ख) साफ एगशेल्स को कम से कम रात में हवा में सुखाया गया था। (सी) एल्यूमीनियम स्टब पर एक अंडकोश का बढ़ना। (घ) बाह्य कैल्सियमी परत और आंतरिक कवच झिल्ली को दर्शाने वाले शेल टुकड़े का रेडियल दृश्य। (ई) बाह्य कैल्सियमी परत गोलाकार खोल इकाइयों (सु) को समूहों में व्यवस्थित और इन इकाइयों के बीच में देखे गए छिद्रों को दर्शातीहै. (च) खोल इकाइयों के बीच केंद्र बिंदु (ग) दर्शाने वाले नोड्यूल का बड़ा दृश्य। (छ) कैल्सियमी परत को हटाना खोल झिल्ली की बाहरी सतह को दर्शाता है जिसमें कोश इकाइयों से टूट गए अवसाद ों को छोड़ दिया जाता है। स्केल बार: ई, 100 डिग्री मी; F, 10 डिग्री मी, और G, 20 m. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : SEM इमेजिंग के लिए कवक संस्कृति की तैयारी. (A) स्लाइड संस्कृति की स्थापना को दर्शाने के लिए योजनाबद्ध आरेख. (ख) 30 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन के दो दिनों के बाद आगर ब्लॉक पर सफेद रंग की कवक कालोनियों को देखा जाता है। (ग ) SEM छवि Fusarium सोलानीके mycelium के एक खंड दिखा , काले तारांकन sporodochia में मैक्रोकोनिडिया अंकन , एक तीर phialide की ओर इशारा करते हैं, और arrowheads microconidia की ओर निर्देशित, पैमाने बार , 10 m. (D) सेप्टेट क्लैमाइडोस्पोर की बढ़ी हुई छवि, स्केल बार 5 [m. कुंजी: ab, agar block; cs, coverslip; f, कवक संस्कृति. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 : इसी तरह के नमूनों की प्रक्रिया के लिए वैकल्पिक तकनीकों का तुलनात्मक विश्लेषण. (क) चित्रित कछुआ सिर का ललाट दृश्य एचएमडीएस (ए) के धीमी वाष्पीकरण के साथ सूख गया , ऑस्मियम टेस्ट्रॉक्साइड (बी) के साथ पोस्ट-फिक्सिंग के बाद , एचएमडीएस (सी) और सीपीडी (डी -ई) का तेजी से वाष्पीकरण होता है . osmium tetroxide का उपयोग कर एक के बाद निर्धारण कदम सहित पोस्ट-फिक्सेशन के बिना HMDS उपचार की तुलना में छवि गुणवत्ता में कोई दिखाई अंतर नहीं दिखा। विकृतियां HMDS के तेजी से वाष्पीकरण के बाद देखा जाता है, जबकि धीमी वाष्पीकरण के साथ क्रमिक सुखाने एक बेहतर सतह संरचना प्रदान करता है। संकुचन और ढह संरचनाओं के विभिन्न डिग्री सीपीडी के साथ इलाज भ्रूण में मस्तिष्क, आंखों और चेहरे की प्रमुखता के क्षेत्रों में देखा जाता है (एफ) HMDS के साथ संसाधित स्लाइड संस्कृतियों के बढ़ते (1), सीपीडी (2) और sputter लेपित सीपीडी इलाज नमूना (3) पर एल्यूमीनियम स्टब. (जी-जी') पूर्ण सुखाने के रूप में देखा बरकरार सफेद रंग का आगर टुकड़ा कवक टीका के साथ कवक mycelium और Fusarium सोलानीके बीजाणुओं के संरक्षण . (एच-एच') स्लाइड संस्कृति, संकुचन और क्षतिग्रस्त संरचनात्मक अखंडता HMDS संरक्षण तकनीक के साथ देखा की अपर्याप्त सुखाने. स्केल बार: A-E, 500 $m; जी-एच, 2 मिमी, और जी'-एच', 20 डिग्री मी. कुंजी: एट, अंडे का दांत; ओसी, मौखिक गुहा; ई, आंख; यूजे, ऊपरी जबड़े; एलजे, निचले जबड़े; काला तारांकन, बीजाणुोचिया में मैक्रोकोनिडिया; तीर, फिलिड; और arrowheads, microconidia. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

हमारे अध्ययन में, अलग निर्धारण एजेंटों, निर्जलीकरण और सुखाने के तरीकों SEM इमेजिंग के लिए तीन अलग नाजुक जैविक नमूने तैयार करने के लिए परीक्षण किया गया: भ्रूण, eggshells, और कवक संस्कृतियों. SEM आमतौर पर सतह विश्लेषण के लिए प्रयोग किया जाता है, तो fixative प्रवेश कम विषय है, लेकिन यह समझा जाना चाहिए कि खराब तय आंतरिक संरचनाओं आवक सिकुड़ या / विस्तारित निर्धारण समय भी बड़ा ऊतक के नमूने के लिए विचार किया जाना चाहिए, निर्धारण अवधि के आधार पर कुछ बार fixative समाधान की जगह. स्थिर और ऊतक के बीच सक्रिय बातचीत के कारण, कोशिकाओं के परासरणी गुण काफी बदल जाएगा. ऊतक तरल पदार्थ स्थिर को कम करेगा और इस प्रकार एक एल्डिहाइड प्रभाव समग्र osmolality के लिए योगदान के रूप में जहां तक सेल की मात्रा पर प्रभाव का संबंध है की उपेक्षा की जा सकती है. इसके अलावा, formaldehyde ऊतकों में तेजी से घुसना होगा और glutaraldehyde की तुलना में पार-लिंकर के रूप में अधिक प्रभावी है। विभिन्न प्रकार के ऊतकों को ठीक करने के लिए बफर फार्मेल्डिहाइड-ग्लूटारैल्डिहाइड मिश्रण की भी सूचना दी गई थी, हालांकि मोनोलेयर्स और सेल निलंबन पतला समाधान ों के लिए15,16को ठीक करने के लिए अधिक उपयुक्त थे। हालांकि, पतला समाधान भी hypertonic हैं, इस प्रकार एल्डिहाइड स्वयं osmotically सक्रिय नहीं हैं. नाजुक नमूने इस अध्ययन में इस्तेमाल के लिए, पीएच 7.4 पर पीबीएस फिक्सिंग एजेंटों के लिए एक वाहन के रूप में इस्तेमाल किया गया था, फॉस्फेट बफ़र्स के रूप में सबसे जैविक नमूनों की कोशिका द्रव्य ीय वातावरण के लिए और अधिक समान माना जाता है. इसके अलावा, osmolarity नमूना के लिए आवश्यक शारीरिक सीमा के भीतर होने की पहचान की है, जबकि पीबीएस फिक्सिंग एजेंट के लिए एक वाहन के रूप में कार्य कर रहा है. ऑस्मियम टेस्ट्रॉक्साइड के साथ पोस्ट-फिक्सेशन अक्सर विभिन्न जैविक नमूनों के लिए सिफारिश की जाती है16,22,42 लेकिन इस अध्ययन में इस्तेमाल सभी जैविक नमूनों के लिए समाप्त कर दिया गया है। ऑस्मिनियम टेट्रेक्साइड के बिना लिए गए नमूने कुरकुरा छवियों और ऑस्मिियम टेट्रॉक्साइड के साथ स्थिर नमूनों से अविवेच्य परिणाम प्राप्त हुए (चित्र 4क) ओस्मियम टेट्रॉक्साइड पत्ती ऊतक संरचनाओं के विरूपण का कारण बनता है और glutaraldehyde और formaldehyde मिश्रण43की तुलना में गरीब नमूना संरक्षण पैदावार, और यह सुझाव दिया गया है कि ऑस्मियम अणुओं का निर्माण की घुसपैठ को बाधित कर सकता है डीहाइड्रेटिंग एजेंट और संक्रमणकालीन एजेंट ों को सीपीडी में इस्तेमाल किया जाता है, और एचएमडीएस जैसे सॉल्वैंट्स रासायनिक सुखाने के लिए इस्तेमाल किया जाता है। प्रभाव ऊतक-विशिष्ट है और osmium tetroxide को छोड़कर नाजुक नमूनों के प्रकार के लिए छवि की गुणवत्ता पर कोई प्रभाव नहीं होगा इस अध्ययन में विश्लेषण किया. अन्य प्रकार के ऊतकों के लिए ऑस्मियम टेट्रऑक्साइड का उपयोग विस्तारित प्राथमिक निर्धारण के साथ समाप्त किया जा सकता है।

HMDS सूखे कछुए भ्रूण नमूनों अच्छी तरह से संरक्षित सतहों से पता चला, और कम विरूपण या संकुचन सीपीडी की तुलना में (चित्र4)। सीपीडी प्रक्रिया के दौरान बनाया शून्य या न्यूनतम सतह तनाव के कारण सेल आकारिकी और कलाकृतियों के उत्पादन में विरूपण के लिए मौका कम से कम। हालांकि, सीपीडी नाजुक नाजुक नमूनों के लिए एक संभावित शारीरिक खतरा पैदा कर सकता है। हमारे प्रेक्षण के अनुसार , एचएमडीएस ने44,45,46,47प्रकाशित पिछले अध्ययनों के आधार पर सूखने के कारण सतह के तनाव को कम करके समान या उच्च गुणवत्ता वाले इमेजिंग प्राप्त किए . सीपीडी उपचार की तुलना में, HMDS etched bivalves और barnacle गोले48 में उत्कृष्ट जैविक meshwork के संरचनात्मक विवरण संरक्षित और mermithid के जटिल आंतरिक संगठन के संरचनात्मक सुविधाओं के उच्च संकल्प प्रदान की सूत्रकृमि49 और कीट आंतरिक ऊतक28. एचएमडीएस तकनीक की तुलना में सीपीडी तकनीक द्वारा तैयार किए गए नमूनों पर सुखाने की प्लेट कलाकृतियों को अधिक मात्रा में देखा गया। सीपीडी तकनीक50का उपयोग करके तैयार ग्रीवा कोशिकाओं में झिल्ली ब्एलबी और गोली कलाकृतियों को बढ़ाया गया . HMDS पानी के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए हेक्सामेथिलडिसिलोक्सेन और अमोनिया का उत्पादन, दोनों जिनमें से वस्तु से वाष्पित. HMDS आमतौर पर गैस क्रोमैटोग्राफी में इस तरह के शर्करा के रूप में यौगिकों के silyl ethers बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है, एमिनो एसिड, alcohols, और कई अन्य यौगिकों. यह ज्ञात नहीं है अगर HMDS ऊतकों में इन यौगिकों में से कुछ के साथ प्रतिक्रिया करता है. HMDS प्रोटीन crosslink और सुखाने की प्रक्रिया के दौरान ऊतक कड़ा हो सकता है28, हालांकि सटीक कारण है कि HMDS भ्रूण के बेहतर संरक्षण प्रदान करता है ऊतक विशिष्टता के अलावा स्पष्ट नहीं किया जा सकता है. हमारी जांच के परिणामों के आधार पर, सीपीडी HMDS की तुलना में व्यापक संकुचन का कारण बना, और भ्रूण ऊतकों के प्रसंस्करण के लिए बहुत अधिक उपयुक्त है, विशेष रूप से जल्दी मंचन भ्रूण के लिए सतह संरचना का विश्लेषण करने के लिए. तंत्र जिसके द्वारा HMDS ऊतक सुखाने पर काम करता है स्पष्ट नहीं किया गया है, हालांकि धीमी गति से सुखाने निरपेक्ष निर्जल परिवेश में क्रमिक वाष्पीकरण के साथ पशुओं की एक उत्कृष्ट सतह संरचना प्राप्त करने के लिए एक कारण हो सकता है.

पहले से स्थापित स्लाइड संस्कृतियों से कवक कालोनियों के साथ agar ब्लॉक के छोटे टुकड़े इस अध्ययन में इस्तेमाल किया गया mycelial चटाई के मूल फुलानापन को बनाए रखने के साथ मुद्दों से बचने के लिए. कवक कालोनियों के साथ आगर टुकड़ों के सीपीडी सुखाने के परिणामस्वरूप एक धोने का प्रभाव हुआ, जबकि फिक्सेटिव, बफर, और इथेनॉल में परिवर्तन फ्रीज सुखाने के साथ कठिनाइयों पर काबू पाने के लिए एक बेहतर विकल्प पाया गया। HMDS कि सभी चरणों के भ्रूण के लिए अच्छी तरह से काम करता है कवक संस्कृतियों को हल करने में असमर्थ था, जबकि HMDS के साथ हवा सुखाने एक महत्वपूर्ण समस्या उत्पन्न: ऊपर कर्लिंग और संरचनात्मक कठोरता खोने. जबकि सीपीडी कवक संस्कृतियों के लिए अच्छी तरह से काम करता है, यह विशेष रूप से विकास में प्रारंभिक चरणों में भ्रूण को तत्काल क्षति प्रेरित, सतह पर संकुचन के कारण. कोई चार्ज या सुखाने कलाकृतियों मनाया गया जब HMDS और सीपीडी भ्रूण और कवक संस्कृतियों के लिए इस्तेमाल किया गया, क्रमशः. कछुए के अंडकोश की तरह कठोर ऊतक के लिए, इमेजिंग के लिए बढ़ते से पहले कमरे के तापमान पर धोने और हवा सुखाने के अलावा कोई विशेष प्रसंस्करण की आवश्यकता नहीं है।

तैयारी विधि के बावजूद, क्रमिक इथेनॉल ढाल कदम कलाकृतियों सुखाने के लिए क्षमता को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। प्रारंभ में, दोनों HMDS और सीपीडी नमूने के लिए निर्जलीकरण और सुखाने प्रोटोकॉल साहित्य में उपलब्ध के बाद संकुचन के साथ सतह कलाकृतियों पाया गया. मानकीकरण की एक श्रृंखला के बाद, हम निर्धारित किया है कि कलाकृतियों शराब निर्जलीकरण का परिणाम थे. निर्जलीकरण के दौरान अधिक क्रमिक इथेनॉल वृद्धि का उपयोग करके धीमी निर्जलीकरण प्रक्रिया का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, प्रत्येक पुनरावृत्ति की अवधि कवक संस्कृतियों की तुलना में भ्रूण के लिए लंबे समय तक होनी चाहिए। इसके अलावा, 100% इथेनॉल पर एक अतिरिक्त कदम पूरी वर्दी संतृप्ति सुनिश्चित की. HMDS पूरी तरह से या आंशिक रूप से हटाया जा सकता है नमूनों की हवा सुखाने की अनुमति है, लेकिन HMDS के लिए विस्तारित जोखिम और वाष्पीकरण द्वारा क्रमिक हवा सुखाने विघटन से बचने के लिए भ्रूण के लिए प्रभावी होना पाया गया (चित्र 4ए, सी) बड़ी सतह की वजह से माइक्रोबियल सेल लगाव51के लिए मनाया के रूप में तनाव . HMDS में नमूनों को विसर्जन और धीमी गति से सुखाने रात भर Daphnia प्रजातियों52 में एक उत्कृष्ट सतह संरचना का सुझाव है कि नरम नाजुक ऊतकों धीमी गति से सुखाने की प्रक्रिया से लाभ हो सकता है पता चला. भ्रूण के लिए स्वीकार्य छवि गुणवत्ता धीरे-धीरे निर्जलीकरण के बाद इथेनॉल के लिए HMDS की एकाग्रता में वृद्धि से धीमी गति से रासायनिक सुखाने के साथ प्राप्त किया जा सकता है।

सभी नमूने एक दो तरफा कार्बन टेप का उपयोग कर एल्यूमीनियम stubs पर एक प्रवाहकीय सतह प्रदान करने के लिए घुड़सवार थे, बेरंग नेल पॉलिश की एक पतली कोट भी इस्तेमाल किया जा सकता है अगर एक ही नमूना एक अलग अभिविन्यास में छवि की जरूरत है. नमूने आसानी से स्टब से हटाया जा सकता है जब नेल पॉलिश स्टब सतह पर प्रयोग किया जाता है और वैकल्पिक विमानों में नमूने स्थिति दो तरफा कार्बन टेप का उपयोग करने की तुलना में संभव है. चूंकि नमूने अचालकीय होते हैं, इसलिए चालकता बढ़ाने के लिए नमूनों पर धातु की एक पतली परत को उछालना आवश्यक है। एक सोने के लक्ष्य sputter कोटिंग के दौरान इस अध्ययन में इस्तेमाल किया गया था, और सोने-पैलेडियम भी चार्ज प्रभाव से बचने के समान परिणाम पैदावार. सही बीम वोल्टेज नमूना निर्भर है, हल्के लेपित नमूनों के लिए, 2-5 केवी पर एक क्षेत्र उत्सर्जन SEM के साथ इमेजिंग सतह संरचनाओं की एक अच्छी परिभाषा प्रदान करेगा. पर्याप्त कोटिंग के साथ ऊतकों के लिए, 5 केवी आम तौर पर अधिक बीम प्रवेश के बिना बेहतर संकेत प्रदान करता है। नमूनों कि गहराई की कमी है और अकेले सोने के साथ लेपित हैं के लिए, एक उच्च वोल्टेज पर इमेजिंग (10 केवी) सतह स्थलाकृति के बेहतर दृश्य की अनुमति दी.

SEM के लिए नाजुक ऊतकों की तैयारी विशिष्ट चुनौतियों बन गया है, और नमूना तैयारी तकनीक की एक श्रृंखला पर काबू पाने और इमेजिंग कलाकृतियों को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. भ्रूण, कठोर eggshells, और कवक संस्कृतियों: हम तीन अलग नाजुक जैविक ऊतक नमूने प्रक्रिया के लिए व्यापक तरीके प्रदान करते हैं, SEM इमेजिंग के लिए. हमारी जांच में, पहले प्रकाशित अध्ययनों से उपलब्ध लोकप्रिय तरीकों में सूक्ष्म परिवर्तन किए गए थे, और हमने प्रत्येक नाजुक ऊतक प्रकार के लिए विशिष्ट सबसे उपयुक्त निर्जलीकरण और सुखाने के तरीकों की पहचान की। इन प्रोटोकॉल समान जैविक नमूनों से स्वीकार्य SEM छवि गुणवत्ता प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है

Acknowledgments

लेखक ों यन् द्र डेनियल बाल्डासारे, सुनी ओसवेगो को पांडुलिपि पर सहायक विचार-विमर्श और टिप्पणियों के लिए धन्यवाद देना चाहेंगे। इस अध्ययन चावल क्रीक एसोसिएट अनुदान, Oswego द्वारा समर्थित किया गया था; चैलेंज अनुदान SUNY Oswego और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (एनएसएफ) PGL और JG के लिए लघु अनुदान.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Fischer Scientific S25127A for slide cultures
Aluminum pin stub Tedpella 16111 12.7 mm x 8 mm
BD Difco Dehydrated Culture Media: Potato Dextrose Agar BD 213400 DF0013-17-6 Media for isolation and cultivation of Fungi, yeast and molds
Chloramphenicol Fischer BioReagents BP904-100 Antibiotic for media
Coarse Vermiculite Greenhouse Megastore SO-VER-12 bedding medium
Clear 12- well plate Corning 07-201-589 for fixing embryo
Coverslips Fischer Scientific S17525B for slide culture
Critical Point Dryer Quorum CPD EMS850 critical point drying
Culture dishes Fischer Scientific 08 747B DISH PETRI 100X10MM 12/PK
Ethanol Fischer Scientific A406P 4 dehydration agent
Forceps- Aquarius Tweezers Tedpella 5804 style 4, length 108mm, widh x thickness 0.017 x 0.17 mm
Glutaraldehyde Fischer Scientific G151-1 fixative
Gold target for sputter coater DENTON VACUUM TAR001-0158 Gold Target, 2.375″ D X .002″
Hexamethyldisilazana Fischer Scientific C19479-5000 chemical drying agent
Kim wipes Kimtech S-8115 cleaning
Microscope slides Thermo Scientific 67-762-16 for slide culture
Microscopy Scissors Tedpella 1327 Double pointed, stainless steel, 100 mm L (3-5/8").
Micro-scissors Tedpella 1346 Vannas-type, straight, 80mm L
Moria Perforated Embryo Spoon Fine Science Tools 10370-17 Length 14.5 cm, tip diameter 20 mm, spoon depth 5 mm
Netwell Inserts Corning 0330B09 15 mm Inserts with 74 µm Mesh Size Polyester Membrane act as handy carriers during specimen processing into different solvents
Paraformaldehyde Fischer Scientific T353 500 fixative
Peat moss Walmart- Miracle Gro 551705263 bedding medium
PELCO tabs double stick carbon conductive tape Tedpella 5000 12 mm OD
Sputter coater DENTON VACUUM DESK V thin metal coating
SEM JEOL USA JEOL JSM 6610LV scanning electron scope electron microscopy

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References

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Gibbons, J., Geetha-Loganathan, P. Processing Embryo, Eggshell, and Fungal Culture for Scanning Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (150), e60018, doi:10.3791/60018 (2019).

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