Summary
Qui presentiamo protocolli di elaborazione dettagliati per l'imaging di campioni di tessuti delicati utilizzando la microscopia elettronica a scansione (SEM). Per la preparazione di gusci d'uovo rigidi, embrioni nelle fasi iniziali dello sviluppo, l'essiccazione dell'aria semplice e l'essiccazione a punti critici, sono descritti per la preparazione di gusci d'uovo rigidi, embrioni nelle fasi iniziali dello sviluppo e colture fungine.
Abstract
Sebbene la microscopia elettronica a scansione (SEM) sia ampiamente utilizzata per l'analisi ultrastrutturale di vari campioni biologici e non biologici, i metodi coinvolti nell'elaborazione di diversi campioni biologici coinvolgono pratiche uniche. Tutte le pratiche convenzionali descritte nella letteratura per l'elaborazione dei campioni trovano ancora applicazioni utili, ma sottili cambiamenti nella preparazione dei campioni possono alterare la qualità dell'immagine, così come, introdurre artefatti. Pertanto, l'utilizzo di una tecnica di preparazione campione unica specifica per il tipo di tessuto analizzato è necessario per ottenere un'immagine di buona qualità con risoluzione ultrastrutturale. L'obiettivo di questo studio è fornire i protocolli ottimali di preparazione del campione per l'imaging di embrioni, gusci d'uovo rigidi e colture fungine utilizzando SEM. Le seguenti ottimizzazioni sono state raccomandate per produrre buoni risultati per i tre diversi delicati campioni biologici studiati. L'uso di fissativi più lievi come 4% paraformaldeide o 3% glutaraldeide seguita da disidratazione con serie di etanolo è obbligatorio. Il micelio fungino sui blocchi di agar ottenuti dalle colture di scorrimento produce una migliore integrità ultrastrutturale rispetto alle colture prese direttamente dalle piastre di agar. L'essiccazione chimica degli embrioni con HMDS fornisce l'essiccazione senza introdurre artefatti di tensione superficiale rispetto all'essiccazione a punti critici. HMDS previene la fessurazione causata dal restringimento poiché i campioni sono meno fragili durante l'essiccazione. Tuttavia, per la coltura fungina, l'essiccazione a punti critici fornisce una qualità dell'immagine accettabile rispetto all'essiccazione chimica. I gusci d'uovo possono essere immagini senza particolari passaggi di preparazione, ad eccezione del lavaggio completo e dell'essiccazione dell'aria prima del montaggio. Le metodologie di preparazione sono state standardizzate in base alla qualità accettabile dell'immagine ottenuta con ogni prova.
Introduction
L'analisi ultrastrutturale del microscopio elettronico a scansione (SEM) e l'imaging intracellulare completano la microscopia luminosa per la profilazione tridimensionale di procadioti, piante e animali. L'elevata risoluzione spaziale di un SEM lo rende una delle tecniche più versatili e potenti disponibili per l'esame delle caratteristiche microstrutturali dei campioni su scala nanometrica a micrometro. Gli esemplari desicizzati sono deferiti a strutture compositive e topografiche con intensi dettagli, che forniscono le basi per lo sviluppo di valide conclusioni sulle relazioni funzionali1,2,3 , 4 DEL psu' , 5 Del numero 3( , 6 È possibile: , 7 (in questo stato , 8 (IN vio , 9. Quando si interpretano immagini SEM di campioni biologici, è una grande sfida distinguere tra le strutture native e gli artefatti creati durante la lavorazione. SeM è generalmente azionato a vuoto molto elevato per evitare interferenze da molecole di gas che interessano i fasci di elettroni primari, secondari o backscattered emessi dal campione10,11. Inoltre, i materiali biologici sono soggetti a danni da radiazioni a causa delle loro proprietà scarse o non conduttrici. È essenziale che gli esemplari caricati nel SEM siano completamente asciutti e privi di contaminanti organici per eliminare ogni possibile outgassing in un ambiente ad alto vuoto10,11. Poiché gli esemplari biologici sono per lo più composti da acqua, sono necessarie tecniche di preparativa aggiuntive per garantire che le strutture native siano mantenute.
La risoluzione ottenuta si basa sull'ottimizzazione dei metodi di preparazione specifici per i tipi di campioni e i parametri strumentali utilizzati. Pertanto, è necessario evitare l'utilizzo di passaggi di elaborazione generalizzati per tutti i tipi di tessuto. Alcuni campioni biologici richiederanno una lavorazione meno rigorosa per preservare la loro struttura, mentre potrebbero essere necessari più tempo e cura per i tipi delicati di campioni per evitare l'introduzione di manufatti di essiccazione, come il restringimento e il collasso. La preparazione del campione è un passaggio critico nell'imaging SEM; i risultati degli studi morfometrici sono notevolmente influenzati dalle procedure di preparazione dei campioni12,13. Le misure di preparazione comuni per molti campioni biologici sono fissazione, disidratazione e rivestimento con un metallo come oro, platino o palladio per convertire le loro superfici in conduttivo per l'analisi SEM. La natura e la combinazione dei passi utilizzati variano a seconda del tipo di tessuto e degli obiettivi specifici dello studio. L'accumulo di carica, la sensibilità al danno del vuoto e del fascio di elettroni pongono problemi durante l'elaborazione di campioni biologici delicati morbidi, che richiedono ulteriori fasi di lavorazione per mantenere la struttura nativa dell'oggetto. L'utilizzo di metodi convenzionali come il fissaggio del tetrossido di osmio e la disidratazione causano restringimento e il collasso di tessuti delicati14,15,16,17. Lo scopo dello studio è quello di stabilire metodologie eleganti derivate combinando idee da studi precedenti con modifiche per preparare e immagini tessuti delicati morbidi (ad esempio, embrioni di rettili, guscio d'uovo di tartarughe dipinte e colture fungine).
La scelta di un metodo di fissaggio adatto è il primo passo più importante per l'analisi microscopica di campioni biologici. Fissare i tessuti immediatamente dopo l'isolamento da un organismo è essenziale per prevenire l'alterazione nella loro morfologia a causa della decomposizione. Un efficace fissativo dovrebbe terminare i processi cellulari permeando rapidamente le cellule e mantenendo l'effetto in modo irreversibile per stabilizzare la struttura del campione per resistere a entrambe le fasi di elaborazione successive e l'esame ai sensi del SEM17 , 18.Sebbene siano noti diversi metodi di fissaggio chimici e fisici, la fissazione chimica è più comunemente utilizzata per i campioni biologici per evitare qualsiasi cambiamento cellulare dovuto all'autolisi, alla putrefazione e agli effetti di essiccazione. Ci sono numerose formulazioni chimiche fissative discusse nella letteratura17,19,20,21,22,23, fissativi che funzionano denatura e coagulando macromolecole biologiche, e quelle che si fissano covalentmente incrociando macromolecole. Gli alcoli sono utilizzati come fissativi didenazione che conservano l'ultrastruttura molto scarsa e sono utilizzati principalmente per la microscopia leggera e non raccomandati per l'analisi microscopica elettronica. I fissativi come la formaldeide, la glutaraldeide e il tetrossido di osmio creano un incrocio intermolecolare e intramolecolare tra macromolecole all'interno dei tessuti, fornendo un'eccellente conservazione delle ultrastrutture11 ,24,25,26. I campioni biologici sono sensibili alla temperatura. La temperatura all'inizio della fissazione è raccomandata per essere di 4 gradi centigradi per ridurre la mobilità laterale delle proteine della membrana, per rallentare la diffusione delle molecole intercellulari e rallentare il tasso di fissazione11. Il tempo necessario per fissare i tessuti dipende in gran parte dalle dimensioni del campione e dalla velocità con cui il fissativo diffonde e reagisce con i componenti del campione. Una fissazione notturna in paraformaldeide del 4% o 3% di glutaraldeide in PBS a 4 gradi centigradi è il metodo preferito per l'analisi SEM dei campioni utilizzati in questo studio per le loro proprietà penetranti sequenziali, che consentono l'elaborazione di campioni delicati più piccoli17 , 18 mi lato , 19 del 12 , 20 anni , 27. Una fase post-fissazione con tetrossido di osmio viene eliminata non solo a causa della sua natura tossica, ma anche per non implementare alcun vantaggio aggiuntivo per migliorare la qualità dell'immagine per i campioni analizzati in questo studio.
I campioni biologici contengono fluidi che interferiscono con l'operazione SEM; quindi, i campioni devono essere essiccati prima di inserirlo nella camera campione SEM. Una volta garantita la disidratazione, il solvente deve essere rimosso dal tessuto senza creare artefatti nei campioni a causa della tensione/essiccazione superficiale. Sono stati comunemente utilizzati tre diversi metodi di essiccazione durante la lavorazione dei tessuti per l'imaging SEM: essiccazione dell'aria, essiccazione a punti critici e congelamento dei campioni di essiccazione28,29,30,31. Pochi studi riportano tutti e tre i metodi di essiccazione producendo risultati identici con campioni di tessuto animale28,29,30,31. Una pratica generale utilizzata per i campioni più piccoli è la disidratazione chimica mediante la concentrazione crescente di serie di alcol e hexamethyldisilazane (HMDS), ma i campioni più grandi vengono essiccati utilizzando uno strumento di essiccazione a punti critici (CPD)32. Durante il processo di essiccazione, notevoli forze formate in piccole cavità che vengono passate attraverso il campione da un'interfaccia liquido/gas; questo può anche portare ad un crollo completo delle strutture cave33. Qualsiasi deformazione dovuta al trattamento potrebbe quindi essere scambiata come caratteristica strutturale nativa del campione. Pertanto, il fenomeno generalizzato per la lavorazione dovrebbe essere eliminato e un processo di essiccazione unico dovrebbe essere standardizzato per ogni tipo di tessuto, soprattutto quando vengono analizzati campioni di tessuto delicati.
In diversi studi condotti utilizzando varie combinazioni di tutti i processi di cui sopra, abbiamo standardizzato i metodi che possono essere utilizzati per l'analisi SEM di tre tessuti delicati: embrioni di rettili, gusci d'uovo di tartarughe dipinte e colture fungine. I biologi e i morfologi dello sviluppo descrivono la morfogenesi normale e anormale durante lo sviluppo dell'embrione in animali vertebrati rappresentativi. Le indagini sulle vie di segnalazione genica dipendono dalla descrizione morfologica di nuove strutture. Per evitare bruschi cambiamenti nella struttura dell'embrione dei vertebrati durante l'analisi SEM, si consiglia l'essiccazione chimica dopo la disidratazione. L'essiccazione chimica con HMDS è il metodo di essiccazione relativamente più recente e i vantaggi includono la relativa rapidità, la facilità d'uso, la perdita dei costi e la limitata competenza e le attrezzature necessarie9. Il CPD è una tecnica di essiccazione comunemente utilizzata che utilizza il passaggio di CO2 attraverso i campioni a una temperatura e pressione specifiche. Abbiamo identificato che hmDS è adatto per l'essiccazione di tessuti delicati molli e consente di elaborare campioni più grandi rispetto all'essiccazione a punti critici, che ha causato un'estesa deformazione ai tessuti embrionali. Sono stati utilizzati diversi metodi per preparare campioni per l'imaging SEM per studiare le caratteristiche morfologiche dei funghi34 . Gli esemplari fungini sono comunemente fissati nel tetrossido di osmio seguito da disidratazione dell'etanolo e essiccazione a punti critici, che può fornire risultati soddisfacenti, anche se gli effetti tossici del tetrossido di osmio6,7,35 e perdere materiali fungini mentre si cambiano le soluzioni durante la lavorazione sono svantaggi pronunciati. Anche la tecnica di preparazione dei campioni che utilizza l'essiccazione ad aria senza fissazione è stata praticata36, ma si traduce in strutture rimpicciolite e collassate, e l'osservazione di tali campioni può essere facilmente interpretata erroneamente mentre caratterizza la specie. L'hypha fungina perde la sua integrità a contatto con i liquidi e un'essiccazione uniforme potrebbe non essere raggiunta per ripristinare la struttura. A causa di questo effetto, l'essiccazione automatica è comunemente usata per asciugare tessuti molli come il micelio fungino. L'essiccazione congelante funziona bene per i materiali puliti, ma la presenza di sali o secrezioni oscurerà i dettagli superficiali che saranno identificati solo nella fase di visualizzazione SEM. Abbiamo accoppiato il metodo di coltura slide con il fissaggio della glutaraldeide e l'essiccazione dei punti critici per produrre dettagli strutturali di hyphae e spore fungine intatte. Anche se l'essiccazione da CPD ha causato restringimento negli embrioni, ha portato a strutture miceliali ben conservate quando accoppiato con fissazione della glutaraldeide. Il guscio d'uovo è di primaria importanza per l'embrione di animali ovipari non solo agendo come copertura protettiva, ma fornendo anche stabilità meccanica, permeabilità al gas e all'acqua e una riserva di calcio per l'embrione in via di sviluppo. I gusci delle uova di tartaruga d'acqua dolce sono classificati come "rigidi" in base alla loro struttura, e grazie alla loro disponibilità hanno ricevuto un'attenzione significativa dai biologi1,2,3,4 , 5 Del numero 3( , 6 È possibile: , 7 (in questo stato , 37 Mi lasa' di , 38.
Dettagliamo metodi semplici per un facile esame delle membrane di guscio e guscio di tartaruga dipinta che può essere applicato a qualsiasi specie rigida di guscio d'uovo. Le metodologie di preparazione sono state valutate in base alla qualità dell'immagine risultante e alla riduzione dei potenziali artefatti.
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Protocol
NOTA: le uova di tartaruga dipinta (Chrysemys picta) utilizzate in questo studio sono state raccolte durante la stagione di nidificazione da maggio a giugno 2015-16 dalla Rice Creek Field Station, Oswego New York con il permesso ottenuto dal Dipartimento ambientale dello Stato di New York Conservazione (DEC).
1. Metodo di essiccazione chimica per la lavorazione degli embrioni per SEM
- Raccogli le uova di tartaruga dai campi durante la stagione della nidificazione. Preparare in anticipo le camere di incubazione, fatte di scatole di plastica con coperchi (L x W x H) 6,7 cm x 25,4 cm x 10,2 cm riempite con mezzo da letto preparato con una miscela umida di vermiculite e muschio di torba (rapporto 1:1). Fare 4-6 fori di circa 0,25 cm lungo i lati delle scatole e sul coperchio per consentire l'aerazione.
- Rimuovere delicatamente il terreno dal nido per scoprire le uova. Pulire la superficie delle uova di tartaruga con tintura di iodio diluita (1:25.000) per controllare la contaminazione microbica durante l'incubazione. Posizionare le frizioni separate l'una dall'altra, la dimensione della covata della tartaruga dipinta può variare da 5-9 uova e posizionare un massimo di 8-9 uova per scatola.
NOTA: Maneggiare con cura le uova durante la raccolta, la pulizia, l'etichettatura e il posizionamento all'interno delle scatole. La posizione e l'allineamento delle uova devono essere le stesse della deposizione, qualsiasi movimento inibirà lo sviluppo dell'embrione. - Seppellire manualmente le uova metà nella biancheria da letto, coprire e posizionare la scatola all'interno dell'incubatrice impostata a 30 gradi centigradi. Incubare le uova per 10-17 giorni per ottenere gli stadi embrionali 12, 13 e 18 rispettivamente utilizzati in questo studio. Aggiungere acqua distillata per bagnare parzialmente il mezzo da letto ogni due giorni per evitare la disidratazione e mantenere il livello di umidità per il normale sviluppo degli embrioni.
NOTA: L'incubazione e la messa in scena di embrioni sono secondo una tabella completa dello sviluppo pubblicata all'iniziodel 39. - Fissare gli embrioni facendo il primo taglio su un lato del guscio d'uovo dorsale e la membrana del tuorlo insieme, verticale verso l'asse lungo utilizzando forbici appuntite. Inserire accuratamente le forbici nel tuorlo per evitare di tagliare il disco embrionale. Ora tagliare il lato laterale dell'uovo lungo l'asse lungo e poi tagliare l'altro lato dell'uovo lungo l'asse corto.
- Sbucciare il pezzo espulso con il lato embrionale verso l'alto con le cime. Tagliare l'altro lato laterale del guscio d'uovo e mettere il pezzo assocciato in salina tamponata da fosfato (PBS a un pH di 7.4).
NOTA: L'uovo di tartaruga è riempito con tuorlo d'uovo altamente viscoso e il lato dorsale dell'embrione aderisce alla membrana del guscio d'uovo. La membrana a guscio d'uovo vicino all'embrione cambia con l'incubazione dal bianco traslucido a un bianco opaco e gessoso. Questo permette di individuare l'embrione al centro del lungo asse ed essere visto come un punto tematico scuro dall'esterno40,41. - Utilizzare uno stereoscopio per isolare gli embrioni insieme alla membrana del tuorlo sbucciandoli dal guscio d'uovo usando pinze. Rimuovere le membrane extraembrionali utilizzando pinze e microforsa. Trasferire l'embrione con un cucchiaio embrionale in PBS fresco in una teglia Petri per lavare qualsiasi sangue o tuorlo.
- Utilizzare lastre chiare di 12 pozze per fissare gli embrioni durante la notte nel 4% di paraformaldeide in PBS a 4 gradi centigradi o in 2-3% di glutaraldeide in PBS. Mettere da uno a tre embrioni in ogni pozzo a seconda delle dimensioni degli embrioni. Assicurarsi che l'infiltrazione completa (i campioni appaiano bianchi) per gli embrioni più vecchi estendendo il tempo di fissazione per 2-3 giorni. Risciacquare gli embrioni 3x con PBS fresco per 5 min ogni risciacquo.
NOTA: Evitare di danneggiare la superficie dell'embrione utilizzando inserti in polistirolo con fondi a rete in poliestere per piastre 12 pozzetto per trasferire campioni da un solvente all'altro. - Campioni didisidrati utilizzando una serie di concentrazione di etanolo nell'acqua distillata: 30%, 50%, 70%, 80%, 95% e 100% e trattare i campioni per 1 h in ogni soluzione di disidratazione. Ripetere il passaggio con il 100% di etanolo due volte per garantire la completa disidratazione. Se non utilizzati immediatamente, conservare i campioni nel 70% di etanolo a -20 gradi centigradi per un periodo più lungo.
- Embrioni secchi con una serie di hexamethyldisizana (HMDS) al 100% di concentrazione di etanolo: 1:2, 2:1 e 100%. Lasciare i campioni in ogni soluzione per 20 min e tenere il piatto Petri parzialmente coperto durante il processo.
NOTA: Eseguire tutte le fasi che coinvolgono HMDS in cofano fumi con l'attrezzatura di protezione personale necessaria come HMDS è altamente tossico. - Lasciare gli embrioni nell'ultima soluzione HMDS al 100% coperti completamente o parzialmente in una cappa di fumi durante la notte con conseguente evaporazione dell'HMDS, lasciando i campioni pronti per il montaggio e il rivestimento sputter. Coprire il piatto per eliminare la polvere che si deposita sui campioni.
NOTA: Il tessuto apparirà bianco dopo l'essiccazione completa e campioni parzialmente essiccati sembrerà di colore giallo, lasciare questi tessuti nella cappa fuma per un tempo più lungo. - Scegli la dimensione di mozziconi di alluminio e nastro adesivo in carbonio per dimensione del campione analizzato. Montare i campioni secchi con attenzione su uno stub standard per spillo in alluminio (12,7 mm x 8 mm) utilizzando nastro conduttivo in carbonio a doppio bastone (12 mm).
- Introdurre i campioni montati nella camera del rivestimento sputter per rivestire il campione con una sottile pellicola d'oro per eliminare l'effetto di carica. Gli esemplari d'oro per 60-120 s a uno sputter 35 mA.
- Montare gli stub su piastre di pori corrispondenti fissando saldamente i settivi. Trasferire il supporto del campione all'esterno o all'esterno della camera campione di SEM utilizzando lo strumento di scambio del campione. Immagini dei campioni in modalità ad alto vuoto con una tensione del fascio di accelerazione di 10 kV e corrente di emissione di 10 A.
NOTA: Indossare sempre i guanti durante la movimentazione di campioni, supporti, supporti di montaggio e strumenti di trasferimento per evitare la contaminazione da grasso dalle mani al sistema SEM. - Testare tecniche alternative elencate di seguito per confrontare la risoluzione dei campioni ottenuti dalla procedura precedente.
- Includere un post-fissaggio con 1% di tetrossido di osmio per 1 h a temperatura ambiente dopo il passaggio 1.7.
- Rimuovere parzialmente o completamente l'HMDS al punto 1.10 per una rapida evaporazione rapida dell'HMDS.
- Elaborare gli embrioni dopo il passaggio 1.8 utilizzando la essiccazione a punti critico (CPD) seguendo i passaggi 3.3-3.4.
2. Preparazione del guscio d'uovo per SEM utilizzando un metodo di essiccazione dell'aria
- Raccogliere e incubare le uova della tartaruga dipinta (Chrysemys picta) per fissare gli embrioni come specificato nei passaggi 1.1-1.7.
- Salvare i gusci d'uovo nell'acqua distillata dopo la fissazione dell'embrione al punto 2.1. Pulire accuratamente i gusci d'uovo immergendosi in acqua distillata per almeno 1 h per eliminare la contaminazione da tuorlo e albumina.
- Gusci d'uovo asciutti dopo il lavaggio su delicate salviette antistatiche nella cappa fumi durante la notte. Conservare i gusci d'uovo secchi in bottiglie di provino pulite etichettate per numero e stadio.
- Montare, sputter cappotto e immaginare i campioni seguendo i passaggi specificati nei passaggi 1.11-1.13.
3. Metodo di essiccazione dei punti critici per la preparazione delle colture fungine per SEM
- Stabilire le impostazioni cultura delle diapositive
- Preparare i supporti di agar (PDA) di patate per le colture fungine: aggiungere 39 g di potenza PDA in 1 L di acqua distillata in una fiaschetta di Erlenmeyer. Mescolare bene ruotando il flacone e autoclamare il supporto a 121 gradi centigradi per 30 min.
NOTA: Dopo la sterilizzazione, la soluzione agar dovrebbe essere calda e non si solidificherà presto. Raffreddare abbastanza in modo che non inattivi gli antibiotici. - Mescolare vorticoso e versare piastre (circa 10-12 mL di supporti per ogni piatto Petri 10 cm), impilare con cura e lasciare solidificare.
- Utilizzare una lama del bisturi sterile per tagliare piccoli blocchi di agar circa 1/2 a 3/4 di pollice. Rimuovere e posizionare un blocco di agar su un vetrino in vetro pulito.
- Mettere il vetrino in una piastra Petri pulita per evitare la contaminazione e preservare l'umidità durante l'incubazione.
- Sollevare il vetrino dal fondo della piastra Petri utilizzando uno stuzzicadenti sterile per creare tensione superficiale tra la piastra e lo scivolo per rimuovere il vetrino di vetro senza interrompere la delicata crescita dopo l'incubazione.
- Utilizzare un anello sterile o un ago per trasferire alcuni dei funghi dall'inoculum del campione a ciascuno dei quattro lati del blocco di agar sul vetrino.
- Posizionare un coperchio pulito sulla superficie del blocco di agar dopo l'inoculazione. Aggiungere qualche goccia di acqua distillata sterile al piatto Petri intorno al vetrino per garantire l'umidità per i funghi in crescita.
- Sigillare parzialmente la piastra utilizzando la pellicola di paraffina e incubare la piastra a 30 gradi centigradi per un periodo di tempo adeguato (per le specie di Fusarium incubare per 36 a 48 h).
- Togliere il vetrino dalla parabola Petri e separare lo coverslip strettamente aderente dal blocco di agar utilizzando pinze sterili. Fissare i blocchi di agar in 3% glutaraldeide in PBS durante la notte a 4 gradi centigradi.
- Preparare i supporti di agar (PDA) di patate per le colture fungine: aggiungere 39 g di potenza PDA in 1 L di acqua distillata in una fiaschetta di Erlenmeyer. Mescolare bene ruotando il flacone e autoclamare il supporto a 121 gradi centigradi per 30 min.
- Disidratare i campioni passando attraverso una serie di etanolo: 10%, 25%, 50%, 75% e 90% con 15 min per variazione. Elaborare i campioni per la disidratazione finale con due modifiche nel 100% di etanolo della durata di 30 minuti ciascuno per garantire la completa saturazione.
- Essiccazione a punti critici: posizionare campioni disidratati nella camera dell'apparecchio CPD. Sigillare e raffreddare la camera aprendo le valvole per consentire il CO2 liquido e l'etanolo di sfiato fuori, fino a quando il CO2 liquido non riempie completamente la camera.
- Sigillare e riscaldare lentamente la camera per raggiungere un punto critico quando la pressione della camera supera i 1000 psi e la temperatura supera i 31 gradi centigradi, la fase liquida e gas di CO2 è in equilibrio. Scolare lentamente il CO2 dalla camera e il campione come gas per evitare effetti di tensione superficiale.
- Eseguite il montaggio, la placcatura dorata e l'imaging dei campioni seguendo i seguenti passaggi specificati nei passaggi 1.11-1.13.
- Eseguire l'analisi comparativa asciugandoi chimicamente i campioni dal passaggio 3.2 utilizzando HMDS seguendo i passaggi 1.9-1.13.
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Representative Results
La figura 1 mostra l'analisi micrografica elettronica a scansione degli embrioni della tartaruga dipinta (Chrysemys picta). Per l'imaging SEM sono state utilizzate uova di tartaruga verniciate raccolte e incubate su un supporto da letto, montate su mozziconi di alluminio a seguito di essiccazione chimica (Figura 1A-E). Una vista laterale di un embrione di fase 12 mostra le strutture craniofacciali; la prominenza mascellare si estende oltre il mandibolare e limita mediamente una fossa nasale ben marcata; sono stati osservati anche cinque archi fingeri (Figura 1F). Le somitidi di nuova formazione nella regione posteriore della coda dell'embrione sono facilmente numerabili rispetto alle somitie del corpo segmentate. Le gemme degli arti anteriori appaiono più lunghe rispetto alle gemme degli arti posteriori e ai punti più caudalmente che a vendicalmente. Una conseguenza ben definita di una cresta carapace si osserva lungo l'intera regione di fianco inter-arti dell'embrione dello stadio 15 (Figura 1G. Al 18sta stadio, le tartarughe dipinte possiedono un muso corto e debolmente sporche. Il becco inferiore poggia all'interno della mascella superiore ed è leggermente capovolto con un gancio terminale che si inserisce nella tacca centrale del becco superiore (Figura 1H). La mascella superiore delle tartarughe dipinte mostra un aspetto denesco formando una punta distale mediale a forma di U-V con una piccola cuspide su ogni lato, un piccolo dente d'uovo inizia a formarsi sulla punta della mascella superiore. Le gemme degli arti che apparivano più lunghe durante le fasi precedenti formano una struttura simile a una pagaia durante le fasi 13-14 con la piastra digitale vagamente indicata. L'arto mesenchyme delimitata dalla cresta ectodermica apicale è visto lungo i margini anteriori-posteriori (Figura 1I-J).
La Figura 2 mostra l'analisi ultrastrutturale di Chrysemys picta eggshell e shell membrana utilizzando l'imaging SEM. I gusci di uova di tartaruga dipinte sono stati ottenuti come descritto sopra e sono stati sottoposti ad essiccazione dell'aria dopo il lavaggio con doppia acqua distillata (Figura 2A,B). I gusci di uovo montati su stub in alluminio con nastro di carbonio a doppio lato (Figura 2C) sono stati ripresi utilizzando SEM. Una vista laterale del guscio mostrava uno strato di guscio d'uovo calcareo esterno saldamente collegato alla membrana del guscio filamentoso interna (Figura 2D). La superficie esterna del guscio d'uovo è costituita da unità di conchiglie mineralizzate ben distinte, fatte di noduli globulari/sferici disposti in gruppi e tra unità di guscio adiacenti una concentrazione di piccole depressioni arrotondate o pori di varie dimensioni sono stati osservati (Figura 2E). I noduli di ogni gruppo di unità di shell si incontrano in corrispondenza di una giunzione di connessione, il punto centrale (Figura 2F). La superficie esterna è stata sbucciata manualmente usando pinze per osservare la superficie della membrana del guscio. Sono state viste file di placche centrali che forniscono il punto di attacco tra le unità di guscio e la membrana fibrosa multistrato sottostante (Figura 2G).
La figura 3 mostra la caratterizzazione morfologica dell'isolamento fungino ascomycete dalle colture di diapositive osservate utilizzando l'imaging SEM. Schema di impostazione della coltura di diapositiva stabilito (Figura 3A) che mostra la crescita fungina sul blocco di agar entro due giorni dall'inoculazione. Colonie che crescono rapidamente con micelio aereo dal bianco al color crema (Figura 3B). L'imaging SEM in seguito all'essiccazione a punti critici e al rivestimento sputter delle fette di agar ha rivelato ife fungine, conidia curva e riso come spore. I conidiofori sono stati visti derivare lateralmente dalle ifae aeree settate (Figura 3C). Le macroconidia prodotte su conidiofori più corti e ramificati sono moderatamente curvi, con celle basali corte e smussate per lo più si septate (Figura 3D).
La figura 4 mostra i risultati comparativi per l'elaborazione di campioni simili utilizzando tecniche alternative. Le teste immerse negli embrioni di stadio 15 nell'HMDS e l'essiccazione mediante evaporazione graduale mostrano strutture craniofacciali ben conservate, quasi nessun restringimento o distorsione si vede con tempi prolungati di lenta evaporazione da HMDS (Figura4A). Gli embrioni post-fissati con tetrossido di osmio non hanno mostrato differenze distinguibili nella qualità dell'immagine, ad eccezione del leggero restringimento dei tessuti rispetto all'elaborazione lenta dell'HMDS (Figura 4B). L'essiccazione degli embrioni rimuovendo parzialmente o completamente l'HMDS, consentendo una rapida evaporazione, provoca distorsioni strutturali e restringimenti (Figura 4C),mentre l'evaporazione lenta ha risolto eccellenti strutture superficiali di un embrione allo stesso stadio ( Figura 4 R). I manufatti di essiccazione sono stati osservati negli embrioni trattati con la tecnica CPD causando un ampio restringimento e distruzione del tessuto (Figura 4D,E). Le fette di agar delle colture di diapositive mostrano l'essiccazione incompleta dell'isolamento fungino con trattamento HMDS rispetto alla CPD (Figura F). L'essiccazione completa si ottiene con il trattamento CPD di fette di agar con un esemplare bianco ben essiccato che mostra caratteristiche strutturali intatte ad alta risoluzione di ife fungine e spore (Figura 4G-G'). I blocchi di agar con colture fungine appaiono di colore rimpicciolita e giallo, rendendoli non adatti per l'imaging SEM (Figura 4H-H').
Figura 1 : Scansione di micrografie elettroniche di Crisi picta embrioni preparati mediante essiccazione chimica. (A) Crisi picta, nidificazione durante la stagione riproduttiva a Rice Creek Field Station, Oswego, NY. (B) Nido ben costruito dall'esterno. (C) Terreno superficiale rimosso con cura all'esposizione delle uova deposte. (D) Uova inserite nella camera di incubazione con mezzo da letto. (E) Montaggio di embrioni su stub di alluminio a seguito di essiccazione chimica, E4 che mostra l'embrione rivestito sputter. (F) Vista laterale dell'embrione di stadio 12 che mostra le strutture facciali, le gemme degli arti e le somiti. (G) La cresta carapace ben definita e le gemme degli arti a forma di pagaia sono visibili allo stadio 15. (H) Strutture craniofacciali dell'embrione di stadio 18 che mostra la mascella superiore e inferiore, notare un piccolo dente d'uovo formato sulla punta del becco superiore. (I) Vista dorsale dell'arto anteriore destro allo stadio 13-14 e vista ravvicinata di AER (J) al confine dorsale-ventrale. Barre della scala: F-H, 500 m; Io, 100 m, e J, 10 chiavi: mb, midbrain; np, fossa nasale; mxp, prominenza mascellare; pa, archi inannami; h; cuore; fl, arti anteriori; s; somite; hl; zampa; punta di coda; cr; cresta carapaciale; et, dente d'uovo; oc, cavità orale; , mascella inferiore; m, mesenchyme, AER, cresta ectodermica apicale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Analisi ultrastrutturali del guscio d'uovo essiccato all'aria e della membrana del guscio delle uova di tartaruga dipinte. (A) Dopo aver fissato gli embrioni, i gusci d'uovo sono stati lavati accuratamente in acqua distillata per rimuovere il tuorlo e l'albumina. (B) I gusci d'uovo puliti sono stati essiccati all'aria almeno da un giorno all'altro. (C) Montaggio di un guscio d'uovo su mozziconi di alluminio. (D) Vista radiale del frammento del guscio che mostra lo strato calcareo esterno e la membrana interna del guscio. (E) Il livello calcareo esterno mostra unità di guscio globulari (su) disposte in gruppi e pori osservati tra queste unità (asterischi). (F) Vista ingrandita di un nodulo che mostra il punto centrale (c) tra le unità di guscio. (G) La rimozione dello strato calcareo mostra la superficie esterna della membrana del guscio con depressioni lasciate spezzate dalle unità di guscio. Barre della scala: E, 100 m; F, 10 m, e G, 20 m. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Preparazione della coltura fungina per l'imaging SEM. (A) Schema per mostrare l'impostazione delle impostazioni cultura delle diapositive. (B) Colonie fungine di colore bianco viste sul blocco di agar dopo due giorni di incubazione a 30 gradi centigradi. (C) Immagine SEM che mostra una sezione di micelio di Fusarium solani, asterischi neri che segnano la macroconidia in sporodochia, una freccia che punta a fialadica, e punte di freccia dirette verso microconidia, barra di scala, 10 m. (D) Immagine ingrandita di clamidi a settate, barra della scala 5 tasti: ab, blocco di agar; cs, coverslip; f, coltura fungina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : analisi comparativa di tecniche alternative per la elaborazione di campioni simili. (A) Vista frontale della testa di tartaruga dipinta essiccata con lenta evaporazione dell'HMDS (A), dopo il post-fissaggio con teossido di osmio (B), rapida evaporazione più rapida dell'HMDS (C) e CPD (D-E). L'inclusione di una fase di post-fissazione con tetrossido di osmio non mostra alcuna differenza visibile nella qualità dell'immagine rispetto al trattamento HMDS senza post-fissazione. Le deformazioni si osservano dopo la rapida evaporazione dell'HMDS, mentre l'essiccazione graduale con evaporazione lenta fornisce una migliore struttura superficiale. Diversi gradi di restringimento e strutture collassate si osservano nelle regioni del cervello, degli occhi e delle prominenze facciali negli embrioni trattati con CPD. (F) Montaggio di colture di diapositive elaborate con HMDS (1), CPD (2) e sputter rivestito cpD estratto campione (3) su stub di alluminio. (G-G') Asciugatura completa vista come fiaetta di agar di colore bianco intatta con inoculato fungino raggiunto dalla CPD preservando strutture di micelio fungino e spore di Fusarium solani. (H-H') Asciugatura inadeguata della coltura degli scivoli, restringimento e integrità strutturale danneggiata osservata con la tecnica di conservazione HMDS. Barre della scala: A-E, 500 m; G-H, 2 mm, e G'-H', 20 m. Chiavi: et, dente d'uovo; oc, cavità orale; e, occhio; uj, mascella superiore; lj, mascella inferiore; asterischi neri, macroconidia in sporodochia; freccia, fialadi; e punte di freccia, microconidia. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Nel nostro studio, diversi agenti di fissazione, metodi di disidratazione e essiccazione sono stati testati per preparare tre diversi campioni biologici delicati per l'imaging SEM: embrioni, gusci di uova e colture fungine. SeM è comunemente usato per l'analisi della superficie, quindi la penetrazione fissativa è meno preoccupante, ma bisogna capire che strutture interne scarsamente fissate causeranno restringimento verso l'interno o/e strutture superficiali collassate. Il tempo di fissazione prolungato deve essere considerato anche per i campioni di tessuto più grandi, sostituendo la soluzione fissativa un paio di volte a seconda della durata della fissazione. A causa dell'interazione attiva tra il fissativo e il tessuto, le proprietà osmotiche delle cellule cambierebbero considerevolmente. I fluidi tissutali diluirebbero il fissativo e quindi un effetto di aldeide che contribuisce all'osmolalità complessiva può essere trascurato per quanto riguarda gli effetti sul volume delle cellule. Inoltre, la formaldeide penetrerebbe più velocemente nei tessuti ed è più efficace come il linker incrociato rispetto alla glutaraldeide. Una miscela di formaldeide e glutaraldeide tamponata è stata anche segnalata per fissare un'ampia varietà di tessuti, anche se per monostrati e sospensioni cellulari diluite le soluzioni erano più adatte per fissare15,16. Tuttavia, le soluzioni diluite sono anche ipertoniche, quindi le aldeidi non sono loro osmoticamente attivi. Per i campioni delicati utilizzati in questo studio, PBS a pH 7.4 è stato utilizzato come veicolo per gli agenti di fissaggio, poiché i buffer di fosfato sono pensati per essere più simili agli ambienti citoplasmici della maggior parte dei campioni biologici. Inoltre, l'osmolarità è identificata per essere all'interno della portata fisiologica richiesta per il campione, mentre PBS agisce come un veicolo per l'agente di fissaggio. La post-fissazione con tetrossido di osmio è spesso raccomandata per vari campioni biologici16,22,42 ma è stata eliminata per tutti i campioni biologici utilizzati in questo studio. I campioni senza tetrossido di osmio hanno prodotto immagini nitide e campioni fissati con tetrossido di osmio hanno prodotto risultati indistinguibili (Figura 4A). Il tetrossido di Osmium causa la distorsione delle strutture dei tessuti fogliari e produce una conservazione più scarsa dei campioni rispetto alla miscela di glutardideide e formaldeide43, ed è stato suggerito che un accumulo di molecole di osmio potrebbe inibire l'infiltrazione di agenti disidratanti e agenti transitori utilizzati nella CPD, e i solventi come HMDS utilizzati per l'essiccazione chimica. L'effetto è specifico del tessuto ed escluso il tetrossido di osmio non avrà alcun effetto sulla qualità dell'immagine per il tipo di campioni delicati analizzati in questo studio. Per altri tipi di tessuti l'uso di tetrossido di osmio può essere eliminato con fissazione primaria estesa.
I campioni di embrioni di tartaruga essiccata HMDS hanno mostrato superfici ben conservate e meno distorsioni o restringimenti rispetto alla CPD (Figura 4). CPD riduce al minimo la possibilità di distorsione nella morfologia cellulare e nella produzione di artefatti a causa della tensione superficiale zero o minima creata durante il processo. Tuttavia, la CPD può causare un potenziale pericolo fisico per campioni delicati e fragili. In linea con la nostra osservazione, HMDS ha prodotto immagini simili o superiori riducendo al minimo la tensione superficiale causata dall'essiccazione sulla base di studi precedenti pubblicati44,45,46,47. Rispetto al trattamento con CPD, l'HMDS ha preservato i dettagli strutturali della rete organica in bivalves e gusci di cirripedi48 e ha fornito un'alta risoluzione delle caratteristiche strutturali della complessa organizzazione interna del mermithid nematodi49 e tessuti interni di insetti28. I manufatti della piastra di essiccazione sono stati osservati in grandi quantità sui campioni preparati con la tecnica CPD rispetto alla tecnica HMDS. I bleb della membrana e i manufatti del pellet sono stati aumentati nelle cellule cervicali preparate utilizzando la tecnica CPD50. HMDS reagisce con l'acqua per produrre hexamethyldiloxane e ammoniaca, entrambi evaporati dall'oggetto. HMDS è comunemente usato nella cromatografia a gas per creare etere silyl di composti come zuccheri, aminoacidi, alcoli, e numerosi altri composti. Non è noto se HMDS reagisce con alcuni di questi composti nei tessuti. L'HMDS potrebbe incrociare le proteine e irrigidire il tessuto durante il processo di essiccazione28, anche se l'esatto motivo per cui l'HMDS fornisce una migliore conservazione degli embrioni non potrebbe essere spiegato se non per la specificità dei tessuti. Sulla base dei risultati della nostra indagine, la CPD ha causato un ampio restringimento rispetto all'HMDS ed è molto più adatta per l'elaborazione di tessuti embrionali, in particolare per analizzare la struttura superficiale per gli embrioni in fase iniziale. Il meccanismo con cui HMDS lavora sull'essiccazione dei tessuti non è stato chiarito, anche se l'essiccazione lenta con evaporazione graduale in ambienti anidrosi assoluti potrebbe essere un motivo per ottenere un'eccellente struttura superficiale degli animali.
Piccoli pezzi di blocchi di agar con colonie fungine provenienti da colture di diapositive stabilite in precedenza sono stati utilizzati in questo studio per evitare problemi con il mantenimento della morbidezza originale del tappetino miceliale. L'essiccazione da CPD di pezzi di agar con colonie fungine ha provocato un effetto di lavaggio, mentre i cambiamenti nei fissativi, nei buffer e nell'etanolo sono risultati essere una scelta migliore per superare le difficoltà con l'essiccazione congelante. L'HMDS che funziona bene per gli embrioni di tutte le fasi non è stato in grado di risolvere le colture fungine, mentre l'essiccazione dell'aria con HMDS ha rappresentato un problema significativo: rannicchiarsi e perdere la rigidità strutturale. Mentre la CPD funziona bene per le colture fungine, ha indotto danni istantanei agli embrioni soprattutto nelle prime fasi dello sviluppo, causando restringimento sulla superficie. Non sono stati osservati artefatti di carica o essiccazione quando HMDS e CPD sono stati utilizzati rispettivamente per embrioni e colture fungine. Per i tessuti rigidi come il guscio d'uovo delle tartarughe, non è necessaria alcuna lavorazione speciale, fatta eccezione per il lavaggio e l'essiccazione dell'aria a temperatura ambiente prima del montaggio per l'imaging.
Indipendentemente dal metodo di preparazione, i passaggi graduali del gradiente di etanolo devono essere utilizzati per ridurre il potenziale di essiccazione artefatti. Inizialmente, sia i campioni HMDS che CPD sono risultati avere artefatti di superficie con restringimento dopo i protocolli di disidratazione e essiccazione disponibili nella letteratura. Dopo una serie di standardizzazioni, abbiamo determinato che gli artefatti erano il risultato della disidratazione alcolica. È fondamentale utilizzare un processo di disidratazione lento utilizzando aumenti di etanolo più graduali durante la disidratazione. Inoltre, la durata di ogni iterazione dovrebbe essere più lunga per gli embrioni rispetto alle colture fungine. Inoltre, un ulteriore passo al 100% di etanolo ha garantito una saturazione uniforme completa. L'HMDS può essere rimosso completamente o parzialmente per consentire l'essiccazione dell'aria dei campioni, ma l'esposizione prolungata all'HMDS e l'essiccazione graduale dell'aria mediante evaporazione sono risultate efficaci per gli embrioni per evitare interruzioni (Figura4A,C)causate da grandi superfici tensione osservata per l'allegato delle cellule microbiche51. Gli esemplari immersi nell'HMDS e l'essiccazione lenta durante la notte hanno rivelato un'eccellente struttura superficiale nelle specie Diphnia52, suggerendo che i tessuti delicati morbidi potrebbero beneficiare del lento processo di essiccazione. La qualità dell'immagine accettabile per gli embrioni può essere ottenuta con un'essiccazione chimica lenta aumentando gradualmente la concentrazione di HMDS a etanolo dopo la disidratazione.
Tutti i campioni sono stati montati su stub in alluminio utilizzando un nastro di carbonio a due lati per fornire una superficie conduttiva, un sottile strato di smalto incolore potrebbe essere utilizzato anche se lo stesso campione deve essere immagine in un orientamento diverso. I campioni possono essere facilmente rimossi dai mozziconi quando lo smalto viene utilizzato sulla superficie dello stub e il posizionamento dei campioni in piani alternativi è possibile rispetto all'utilizzo di nastro di carbonio fronte/retro. Poiché i campioni non sono conduttivi, è necessario sputare un sottile strato di metallo sui campioni per aumentare la conduttanza. Un obiettivo oro è stato utilizzato in questo studio durante il rivestimento sputter, e oro-palladio produce anche risultati simili evitando effetti di ricarica. La corretta tensione del fascio dipende dal campione, per i campioni leggermente rivestiti, l'imaging con un SEM a 2-5 kV fornirà una buona definizione delle strutture superficiali. Per i tessuti con un rivestimento adeguato, 5 kV generalmente fornisce un segnale migliore senza una maggiore penetrazione del fascio. Per gli esemplari che non hanno profondità e sono rivestiti con l'oro da solo, l'imaging ad una tensione più elevata (10 kV) ha permesso una migliore visualizzazione della topografia della superficie.
La preparazione di tessuti delicati per SEM pone sfide distintive e una serie di tecniche di preparazione dei campioni può essere utilizzata per superare e ridurre al minimo gli artefatti di imaging. Forniamo metodi completi per elaborare tre diversi campioni di tessuti biologici delicati, per l'imaging SEM: embrioni, gusci rigidi di uova e colture fungine. Nella nostra indagine, sono state apportate sottili modifiche ai metodi popolari disponibili da studi pubblicati in precedenza, e abbiamo identificato i metodi di disidratazione e asciugatura più appropriati specifici per ogni tipo di tessuto delicato. Questi protocolli potrebbero essere adattati per ottenere una qualità accettabile dell'immagine SEM da campioni biologici simili.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Daniel Baldassarre, SUNY Oswego per le discussioni e i commenti utili sul manoscritto. Questo studio è stato sostenuto da Rice Creek Associate Grants, Oswego; Sfida concede SUNY Oswego e National Science Foundation (NSF) Small Grants a PGL e JG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Fischer Scientific | S25127A | for slide cultures |
| Aluminum pin stub | Tedpella | 16111 | 12.7 mm x 8 mm |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: Potato Dextrose Agar | BD 213400 | DF0013-17-6 | Media for isolation and cultivation of Fungi, yeast and molds |
| Chloramphenicol | Fischer BioReagents | BP904-100 | Antibiotic for media |
| Coarse Vermiculite | Greenhouse Megastore | SO-VER-12 | bedding medium |
| Clear 12- well plate | Corning | 07-201-589 | for fixing embryo |
| Coverslips | Fischer Scientific | S17525B | for slide culture |
| Critical Point Dryer | Quorum CPD | EMS850 | critical point drying |
| Culture dishes | Fischer Scientific | 08 747B | DISH PETRI 100X10MM 12/PK |
| Ethanol | Fischer Scientific | A406P 4 | dehydration agent |
| Forceps- Aquarius Tweezers | Tedpella | 5804 | style 4, length 108mm, widh x thickness 0.017 x 0.17 mm |
| Glutaraldehyde | Fischer Scientific | G151-1 | fixative |
| Gold target for sputter coater | DENTON VACUUM | TAR001-0158 | Gold Target, 2.375″ D X .002″ |
| Hexamethyldisilazana | Fischer Scientific | C19479-5000 | chemical drying agent |
| Kim wipes | Kimtech | S-8115 | cleaning |
| Microscope slides | Thermo Scientific | 67-762-16 | for slide culture |
| Microscopy Scissors | Tedpella | 1327 | Double pointed, stainless steel, 100 mm L (3-5/8"). |
| Micro-scissors | Tedpella | 1346 | Vannas-type, straight, 80mm L |
| Moria Perforated Embryo Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Length 14.5 cm, tip diameter 20 mm, spoon depth 5 mm |
| Netwell Inserts | Corning | 0330B09 | 15 mm Inserts with 74 µm Mesh Size Polyester Membrane act as handy carriers during specimen processing into different solvents |
| Paraformaldehyde | Fischer Scientific | T353 500 | fixative |
| Peat moss | Walmart- Miracle Gro | 551705263 | bedding medium |
| PELCO tabs double stick carbon conductive tape | Tedpella | 5000 | 12 mm OD |
| Sputter coater | DENTON VACUUM | DESK V | thin metal coating |
| SEM | JEOL USA | JEOL JSM 6610LV scanning electron scope | electron microscopy |
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