Summary
ここでは、走査電子顕微鏡(SEM)を用いて繊細な組織サンプルをイメージングするための詳細な処理プロトコルを紹介する。すなわち、ヘキサメチル・ジシラザナ(HMDS)化学乾燥、単純な空気乾燥、および臨界点乾燥の3つの異なる処理方法が、硬質卵殻、初期発達段階における胚、および真菌培養物をそれぞれ調製するために記載されている。
Abstract
走査型電子顕微鏡(SEM)は、様々な生物学的および非生物学的サンプルの超構造解析に広く使用されていますが、異なる生物学的サンプルの処理に関与する方法には独自の手法が含まれます。サンプルを処理するための文献に記載されているすべての従来の慣行は、まだ有用なアプリケーションを見つけるが、サンプル準備の微妙な変更は、画像の品質を変更することができますだけでなく、アーティファクトを導入します。したがって、分析された組織の種類に特有のユニークなサンプル調製技術を使用して、超構造分解能を持つ良好な品質の画像を得るために必要とされる。本研究の焦点は、SEMを用いて胚、硬質卵殻、真菌培養物をイメージングするための最適なサンプル調製プロトコルを提供することにある。以下の最適化は、研究された3つの異なる繊細な生物学的サンプルに対して良好な結果を得るために推奨された。4%パラホルムアルデヒドまたは3%グルタルアルデヒドのような穏やかな固定剤の使用に続いて、エタノールシリーズで脱水が必須です。スライド培養物によって得られた寒天ブロック上の真菌菌糸体は、寒天プレートから直接採取された培養物と比較して、より優れた超構造性を生み出します。HMDSを使用した胚の化学乾燥は、臨界点乾燥と比較して表面張力アーティファクトを導入することなく乾燥を提供します。HMDSは、サンプルが乾燥中に脆くならないため、収縮によるひび割れを防ぎます。しかし、真菌培養の場合、クリティカルポイント乾燥は化学乾燥に比べて許容可能な画質を提供します。卵殻は取付け前に徹底的な洗浄および空気乾燥を除いて特別な準備ステップなしでイメージすることができる。調製方法論は、各試験で得られた許容可能な画質に基づいて標準化された。
Introduction
走査型電子顕微鏡(SEM)超構造解析および細胞内イメージングサプリメントは、原核生物、植物、動物の3次元プロファイリングのための光顕微鏡を補完する。SEMの高い空間分解能は、ナノメートルからマイクロメートルスケールの標本の微細構造特性の検査に利用できる最も汎用性の高い強力な技術の1つになります。乾燥した標本は、機能的関係1、2、3に関する有効な結論を開発するための基礎を提供する強烈な詳細を持つ組成および地形構造に解決される,4,5,6,7,8,9.生物標本のSEM画像を解釈する場合、処理中に作成された天然構造とアーティファクトを区別することは大きな課題です。SEMは、一般に、試料10、11から放出される一次、二次または逆散乱電子ビームに影響を与えるガス分子からの干渉を避けるために、非常に高い真空で作動する。また、生物材料は、その不十分または非伝導性による放射線損傷の影響を受けやすい。SEMに積み込まれた試料は、完全に乾燥し、任意の有機汚染物質を含まないことが不可欠です10,11.生物標本は主に水で構成されているので、ネイティブ構造が保持されるように追加の準備技術が必要です。
得られる分解能は、利用される試料の種類および器械の変数に特有の調製方法を最適化することに基づいている。したがって、すべての組織タイプに対して一般化された処理ステップを使用することを避ける必要がある。一部の生物標本は、構造を維持するためにより厳格な処理を必要とし、収縮や崩壊などの乾燥アーティファクトの導入を避けるために、繊細な種類のサンプルにはより多くの時間と注意が必要になる場合があります。サンプル調製は、SEMイメージングにおける重要なステップです。形態学的研究の所見は、検体調製手順12,13によって著しく影響を受ける。多くの生物学的サンプルの一般的な調製工程は、表面をSEM分析用に導電性に変換するために、金、白金、パラジウムなどの金属を用いて固定、脱水、コーティングを行います。使用されるステップの性質と組み合わせは、組織の種類、および研究の具体的な目標によって異なります。電荷の蓄積、真空および電子ビーム損傷に対する感度は、柔らかい繊細な生物学的サンプルを処理する際に問題を引き起こす、物体のネイティブ構造を保持するために追加の処理ステップを必要とする。四酸化オスミウム固定などの従来の方法を使用して、脱水は収縮および繊細な組織の崩壊を引き起こす14,15,16,17.この研究の目的は、以前の研究からのアイデアと、柔らかい繊細な組織(爬虫類の胚、塗装されたカメの卵殻、真菌培養物)を準備し、画像化するための修正と組み合わせることによって導き出されたエレガントな方法論を確立することです。
適切な固定方法の選択は、生物標本の顕微鏡分析のための最初の最も重要なステップです。分解による形態の変化を防ぐためには、生物から分離した直後に組織を固定することが不可欠です。効果的な固定剤は、細胞を迅速に浸透させ、その後の処理ステップとSEM17の下での検査の両方に耐えるためにサンプルの構造を安定させるために不可逆的に効果を維持することによって細胞プロセスを終了する必要があります,18.いくつかの化学的および物理的な固定方法が知られているが、化学的固定は、自己解動、腐敗、および乾燥効果による細胞変化を避けるために、生物標本のためにより一般的に使用される。文献17、19、20、21、22、23、変性によって働く固定剤で議論される多数の固定化学製剤があり、生体高分子を凝固させ、高分子を共生して固定するもの。アルコールは、超構造を非常に不十分に保存する変性固定剤として使用され、主に光顕微鏡検査に使用され、電子顕微鏡分析には推奨されません。ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、四酸化オスミウムなどの架橋固定剤は、組織内の高分子間に分子間および分子内架橋を作成し、超構造の優れた保存を提供する11 ,24,25,26.生物学的サンプルは温度に敏感です。固定の開始時の温度は、膜タンパク質の横移動性を低下させ、細胞間分子の拡散を遅くし、固定11の速度を遅くするために4°Cであることが推奨される。組織の固定に必要な時間は、サンプルのサイズと固定性が拡散し、試料の成分と反応する速度に大きく依存します。4°CでPBSで4%パラホルムアルデヒドまたは3%グルタルアルデヒドの一晩固定は、より小さな繊細なサンプルを処理することを可能にする順次浸透特性のために本研究で使用される標本のSEM分析のための好ましい方法です17,18歳,19歳,20歳,27.四酸化オスミウムとのポスト固定ステップは、その有毒性のためだけでなく、この研究で分析されたサンプルの画質を向上させる追加の利点を実装しないことが判明しました。
生物学的サンプルには、SEM操作を妨げる流体が含まれています。したがって、サンプルは、SEMサンプルチャンバに挿入する前に乾燥する必要があります。脱水が確実に行われるようになると、表面張力/乾燥のために試料にアーティファクトを作り出さずに溶媒を組織から除去する必要があります。SEMイメージングの処理組織の間に3つの異なる乾燥方法が一般的に使用されました:空気乾燥、臨界点乾燥、および凍結乾燥サンプル28、29、30、31。いくつかの研究は、動物組織サンプル28、29、30、31と同じ結果を生成するすべての3つの乾燥方法を報告します。より小さい標本に用いられる一般的な慣行は、アルコールおよびヘキサメチルジラザン(HMDS)の濃度シリーズを上昇させることによって化学的脱水であるが、より大きい標本は臨界点乾燥(CPD)器械32を使用して乾燥される。乾燥プロセス中に、液体/ガス界面によって試料を通過する小さな空洞で形成されるかなりの力;これは、中空構造33の完全な崩壊につながる可能性さえあります.処理によって発生する変形は、その後、試料のネイティブ構造特徴と誤解される可能性があります。したがって、処理のための一般化された現象を排除し、特に繊細な組織標本を分析する場合は、組織の種類ごとに独自の乾燥プロセスを標準化する必要があります。
上記のすべてのプロセスの様々な組み合わせを用いて行われたいくつかの試験では、爬虫類胚、塗装カメの卵殻、真菌培養の3つの繊細な組織のSEM分析に使用できる方法を標準化しました。発達生物学者と形態学者は、代表的な脊椎動物における胚発生時の正常および異常な形態形成について説明する。遺伝子シグナル伝達経路の調査は、新しい構造の形態学的記述に依存する。SEM解析中に脊椎動物の胚構造が急激に変化するのを防ぐために、脱水後の化学乾燥をお勧めします。HMDSを使用した化学乾燥は比較的新しい乾燥方法であり、相対的な速さ、使いやすさ、コストの損失、および必要な限られた専門知識と機器が含まれます9。CPDは、特定の温度および圧力で試料全体に通過CO2を使用して一般的に使用される乾燥技術です。我々は、HMDSが柔らかい繊細な組織を乾燥するのに適しており、胚組織に広範な変形を引き起こした臨界点乾燥と比較して、より大きなサンプルを処理することを可能にすることを同定した。真菌34の形態学的特性を研究するためにSEMイメージングのためのサンプルを調造するためにいくつかの方法が使用されている。真菌標本は一般的に四酸化オスミウムで固定され、エタノール脱水と臨界点乾燥が続き、満足のいく結果をもたらす可能性があるが、四酸化オスミウム6、7、35の毒性作用は満足のいく結果をもたらす可能性がある。処理中に溶液を変更しながら真菌材料を失うことは顕著な欠点です。固定せずに空気乾燥を用いた試料調製技術も36回実施されていますが、構造の縮小や崩壊が起き、種を特徴付けながら、このような試料の観察が誤解されやすい。真菌性ハイファは液体と接触してその完全性を失い、さらに乾燥は構造を復元するために達成されない場合があります。この効果のために、凍結乾燥は、真菌菌糸体のような軟部組織を乾燥させるために一般的に使用されます。凍結乾燥はきれいな材料のためにうまく機能しますが、塩や分泌物の存在は、SEMの視聴段階でのみ識別される表面の詳細を不明瞭にします。スライド培養法をグルタルアルデヒド固定と臨界点乾燥と結合し、無傷の真菌性菌性菌および胞子の構造的詳細を得た。CPD乾燥は胚の収縮を引き起こしたが、グルタルアルデヒド固定と相まって、よく保存された菌構造をもたらした。卵殻は、保護カバーとして機能するだけでなく、機械的安定性、ガスと水への透過性、および発達する胚のためのカルシウム予備を提供することによって、卵性動物の胚にとって最も重要です。淡水カメの卵殻は、その構造に基づいて「硬質」に分類され、その利用可能性のために生物学者1、2、3、4から大きな注目を集めています。,5,6,7,37歳,38.
私たちは、任意の硬質卵殻種に適用することができる塗装カメの卵殻と殻膜の簡単な検査のための簡単な方法を詳述します。作成方法は、結果として得られる画質と潜在的なアーティファクトの減少に基づいて評価されました。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
注:この研究で使用されるペイントカメ(クリーセミースピクタ)卵は、ニューヨーク州環境省の許可を得て、ライスクリークフィールドステーション、オズウィーゴニューヨークから2015-6月のネスティングシーズン中に収集されました保全(DEC)。
1. SEM用胚を処理する化学乾燥法
- ネストシーズン中にフィールドサイトからカメの卵を収集します。蓋付きプラスチック製の箱(L x W x H)6.7cm x 25.4 cm x 10.2 cmで作られたインキュベーション室を事前に準備し、バーミキュライトと泥炭苔(1:1比)の湿った混合物で調製した寝具媒体で満たされています。箱の側面に沿って約0.25センチメートルの4-6穴を作り、通気を可能にするために蓋に。
- 卵を明らかにするために巣から穏やかに土壌を削除します。希釈ヨウ素チンキ(1:25,000)でカメの卵の表面を拭き取り、インキュベーション中の微生物汚染を制御します。お互いに別々にクラッチを配置し、塗装されたカメのクラッチサイズは5〜9卵から異なる場合があり、箱ごとに最大8〜9個の卵を置きます。
注:収集、拭き取り、ラベル付け、箱内への配置中に卵を慎重に取り扱ってください。卵の位置と位置合わせは、彼らが置かれたのと同じである必要があり、任意の動きは胚の発達を阻害します。 - 手動で卵の半分を寝具に埋め、カバーし、30°Cに設定されたインキュベーター内に箱を置きます。卵を10〜17日間インキュベートし、この研究でそれぞれ使用される胚期12、13、および18を得る。脱水を避け、胚の正常な発達のための水分レベルを維持するために、1日おきに寝具媒体を部分的に濡らすために蒸留水を追加します。
注:インキュベーションおよびステージング胚は、以前に発表された完全な発達表に従っている39. - 先の尖ったはさみを使って、後卵殻と黄身膜の片側を一緒に、長い軸に垂直に切り取って、胚を固定します。胚性ディスクを切断しないように、はさみを慎重に卵黄に挿入します。今、長い軸に沿って卵の側面をカットし、短い軸に沿って卵の反対側をカットします。
- 鉗子を使用して胚側を上に切り取った部分を開きます。卵殻のもう一方の側面を切り取り、切除した部分をリン酸緩衝生理食(PBSは7.4のpHで)に置きます。
注:カメの卵は、非常に粘性の卵黄で満たされ、胚の後部側は卵殻膜に付着します。胚の近くの卵殻膜は、半透明の白から不透明なチョーク状の白へのインキュベーションに伴って変化する。これにより、長い軸の中心に胚を見つけ、外側40、41から暗い石灰化スポットとして見ることができます。 - 立体顕微鏡を使用して、鉗子を使用して卵殻から胚を剥離することにより、卵膜と一緒に胚を分離します。鉗子とマイクロハサミを使用して胚外膜を取り除きます。胚スプーンを使って胚をペトリ皿の新鮮なPBSに移し、血液や黄身を洗浄する。
- 明確な12ウェルプレートを使用して、4°CでPBSまたはPBSで2-3%グルタルアルデヒドで4%パラホルムアルデヒドで一晩胚を固定します。胚の大きさに応じて、各ウェルに1~3個の胚を配置します。2~3日間の固定時間を延長することにより、古い胚の完全な浸潤(サンプルは白く見える)を確認してください。胚を3倍にすすいで、新鮮なPBSで5分間すすいで下します。
注:12ウェルプレート用のポリエステルメッシュボトムを備えたポリスチレンインサートを使用して、1つの溶媒から別の溶媒に標本を移すことによって、胚の表面を損傷しないようにしてください。 - 蒸留水中の一連のエタノール濃度を用いてサンプルを脱水:30%、50%、70%、80%、95%、100%、100%、各脱水液で1時間のサンプルを処理します。完全な脱水を確実にするために、100%エタノールでステップを2回繰り返します。直ちに使用しない場合は、検体を-20°Cで70%エタノールで長期間保存してください。
- 一連のヘキサメチルジラザナ(HMDS)を用いた乾燥胚(HMDS)から100%エタノール濃度:1:2、2:1および100%。各溶液のサンプルを20分間放置し、プロセス中にペトリ皿を部分的に覆ったままにしておきます。
注:HMDSは非常に有毒であるとして必要な個人的な保護装置とヒュームフードにHMDSを含むすべてのステップを実行します。 - 最終的な100%HMDS溶液中の胚を完全または部分的にHMDSの蒸発を助けるヒュームフードで完全または部分的に覆われたままにし、サンプルを取り付け、スパッタコーティングの準備を残します。皿を覆い、サンプルの上にほこりが落ち着くのを防ぎます。
注:組織は完全な乾燥後に白く表示され、部分的に乾燥したサンプルは、より長い時間のためにヒュームフードにこれらの組織を残し、色で黄色に見えます。 - 分析したサンプルのサイズごとにアルミニウムスタブとカーボン粘着テープのサイズを選択します。ダブルスティックカーボン導電テープ(12mm)を使用して、標準的なアルミピンスタブ(12.7 mm x 8 mm)に乾燥したサンプルを慎重に取り付けます。
- スパッタコーターのチャンバーに取り付けられたサンプルを導入し、電荷効果を排除するために、金の非常に薄いフィルムで標本をコーティングします。金板は35 mAスパッタで60〜120sの試料を出す。
- セットの組み立てをしっかりと固定して、対応する細孔プレートにスタブを取り付けます。サンプル交換ツールを使用して、サンプルホルダーをSEMのサンプルチャンバに出入りします。10 kVの加速ビーム電圧と発光電流10μAで高真空モードでサンプルを画像化します。
注:サンプル、サンプルホルダー、取り付けスタブ、および転送ツールを取り扱う場合は、必ず手袋を着用し、手からSEMシステムへのグリース汚染を避けてください。 - 以下に示す代替技術を試験して、上記の手順から得られた試料の分解能を比較する。
- ステップ1.7の後に室温で1時間の1%の四酸化オスミウムを持つ後固定を含める。
- HMDSの急速な蒸発のためにステップ1.10でHMDSを部分的または完全に取り外します。
- ステップ3.3-3.4に従って、クリティカルポイント乾燥(CPD)を使用してステップ1.8後に胚を処理します。
2. 空気乾燥法を用いたSEM用卵殻の準備
- 手順1.1-1.7で指定されているように胚を固定するために、塗装されたカメ(クリーセミースピクタ)の卵を収集し、インキュベートします。
- ステップ2.1の胚の固定後に蒸留水で卵殻を保存します。卵殻を少なくとも1時間蒸留水に浸して卵殻を完全にきれいにし、黄身とアルブミンの汚染を排除します。
- 一晩ヒュームフードで繊細な帯電防止ワイプで洗浄した後の空気乾燥卵殻。乾燥した卵殻は、数とステージでラベル付けされたきれいな標本ボトルに保管してください。
- ステップ1.11-1.13で指定されたステップに従って標本をマウントし、スパッタコートおよびイメージします。
3. SEM用真菌培養物を準備するための重要な点乾燥方法
- スライド カルチャの確立
- 真菌培養のためのジャガイモデキストロース寒天(PDA)培地を準備する:エルレンマイヤーフラスコで蒸留水の1LにPDA電力の39グラムを追加します。フラスコをよく混ぜて、メディアを121°Cで30分間オートクレーブし、培地液を冷却し、無菌マイクロピペットを使用して抗生物質クロラムフェニコール(25μg/mL)を加えます。
注:殺菌後、寒天溶液は熱くする必要があり、すぐに固化しません。抗生物質が不活性化しないように十分に冷却してください。 - それを旋回して混ぜ、プレート(10cmペトリ皿ごとに約10〜12mLのメディア)を注ぎ、慎重に積み重ねて固めさせます。
- 無菌のメスブレードを使用して、1インチの約1/2から3/4の寒天の小さなブロックを切り取ります。寒天ブロックを取り外し、きれいなガラス顕微鏡スライドの上に置きます。
- 汚れを防ぎ、インキュベーション中の水分を保つために、スライドをきれいなペトリ皿に入れます。
- 無菌のつまようじを使用してペトリ皿の底からスライドを上げ、プレートとスライドの間に表面張力を作成し、インキュベーション後の繊細な成長を妨げることなくガラススライドを取り除きます。
- 滅菌ループまたは針を使用して、試料の接種からスライド上の寒天ブロックの4つの側面のそれぞれに真菌の一部を移します。
- 接種後の寒天ブロックの表面にきれいなカバースリップを置きます。成長する真菌のための水分を確保するために、スライドの周りのペトリ皿に滅菌蒸留水の数滴を追加します。
- パラフィンフィルムを使用してプレートを部分的にシールし、適切な時間の長さのために30°Cでプレートをインキュベートします(フザリウム種のインキュベートの場合は36〜48時間)。
- ペトリ皿からスライドを取り外し、無菌鉗子を使用して寒天ブロックからしっかりと付着したカバースリップを分離します。4°Cで一晩PBSで3%グルタルアルデヒドで寒天ブロックを固定します。
- 真菌培養のためのジャガイモデキストロース寒天(PDA)培地を準備する:エルレンマイヤーフラスコで蒸留水の1LにPDA電力の39グラムを追加します。フラスコをよく混ぜて、メディアを121°Cで30分間オートクレーブし、培地液を冷却し、無菌マイクロピペットを使用して抗生物質クロラムフェニコール(25μg/mL)を加えます。
- エタノールシリーズを通過してサンプルを脱水する:10%、25%、50%、75%および90%、変化あたり15分。完全な飽和を確保するために、それぞれ30分間続く100%エタノールの2つの変化で最終的な脱水のためのサンプルを処理します。
- 臨界点乾燥:CPD装置のチャンバに脱水サンプルを配置します。液体CO2が完全にチャンバーを満たすまで、液体CO2を可能にし、エタノールを排出できるようにバルブを開けてチャンバをシールして冷却します。
- チャンバ圧力が1000psiを超え、温度が31°Cを超えると、CO2の液体および気体相が平衡状態にある場合、チャンバをゆっくりとシールして加熱します。表面張力の影響を避けるために、チャンバとサンプルからCO2をガスとしてゆっくりと排出します。
- ステップ1.11-1.13で指定された手順に従って、試料の取り付け、金めっき、およびイメージングを実行します。
- ステップ1.9-1.13に従ってHMDSを用いてステップ3.2から試料を化学的に乾燥して比較分析を行います。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
図1は、塗装されたカメ(クリーセミースピクタ)胚の走査電子微量解析を示す。塗装されたカメの卵を寝具媒体上に集め、インキュベートし、化学乾燥後のアルミニウムスタブに取り付け、SEMイメージングに用いた(図1A-E)。ステージ12胚の横図は頭蓋骨の構造を示す;上顎の顕著さは顎骨を越えて広がり、よく印が付いている鼻のピットを媒的に制限する;5つの咽頭アーチも観察された(図1F)。胚の後尾領域で新たに形成されたソミテは、セグメント化された体のソミトと比較して容易にカウント可能である。前肢の芽は、後肢の芽に比べて長く見え、心室よりもより大胆にポイントします。カラペース尾根の明確に定義された成長は、ステージ15胚の四肢間側部領域全体に沿って見られる(図1G.ステージ18では、塗装されたカメは短く、熱く投影されたスナットを持っています。下のくちばしは上顎の内側に位置し、上のくちばしの中央のノッチに収まる端子フックでわずかに上向きになります(図1H)。塗装されたカメの上顎は、両側に小さなカスプを持つ中間U-V形の遠位先端を形成するノッチ状の外観を示し、小さな卵歯が上顎の先端に形成し始める。初期の段階で長く現れた四肢芽は、ステージ13-14の間にパドル状の構造を形成し、デジタルプレートが漠然と示されている。頂点の外皮尾根によって区切られた四肢間葉は、前部後縁に沿って見られる(図1I-J)。
図2は、SEMイメージングを用いてクライセミースピクタ卵殻およびシェル膜の超構造解析を示す。塗装されたカメの卵殻は、上述のように得られ、二重蒸留水で洗浄した後に空気乾燥を行った(図2A,B)。両面カーボンテープ(図2C)を用いてアルミスタブに取り付けられた卵殻をSEMを用いて画像化した。シェルの横図では、内側の糸状シェル膜にしっかりと付着した外気性卵殻層を示した(図2D)。卵殻の外面は、よく区別されたミネラル化されたシェル単位で構成され、グループに配置された球状/球状結節で構成され、隣接するシェル単位の間に小さな丸みを帯びたくぼみや毛穴の濃度が様々なサイズであった観察された(図2E)。シェルユニットの各グループからの結節は、接続ジャンクション、中心点(図2F)で接する。外面は鉗子を用いて手動で剥離し、シェル膜の表面を観察した。シェルユニットと基礎となる多層線維膜との間の接続点を提供する中央プラークの列が見られた(図2G)。
図3は、SEMイメージングを用いて観察されたスライド培養物からアスコマイセテ真菌分離物の形態学的特徴付けを示す。スライド培養セットアップのスキームが確立された(図3A)接種後2日以内に寒天ブロック上の真菌増殖を示す。コロニーは、クリーム色の空中菌糸体に白で急速に成長しています (図 3B).寒天スライスの臨界点乾燥およびスパッタコーティングに続くSEMイメージングは、真菌性ハイファー、湾曲したコニジア、および胞子のような米を明らかにした。コニディオフォアは、隔離された空中ハイファーから横に生じる(図3C)。より短く、分岐したコニオフォアで産生されるマクロコニジアは、短く、鈍い頂点と明確にペディセル酸基底細胞を主に失液で、適度に湾曲している(図3D)。
図4は、代替技術を用いて同様の検体を処理するための比較結果を示す。HMDSにステージ15胚の頭部を浸漬し、徐々に蒸発して乾燥すると、よく保存された頭蓋骨構造を示し、HMDSからのゆっくりとした蒸発の延長時間で収縮または歪みはほとんど見られない(図4A)。四酸化オスミウムで固定後の胚は、HMDSの遅い処理と比較して組織のわずかな収縮を除いて、画質に顕著な差を示さなかった(図4B)。HMDSを部分的または完全に除去して胚を乾燥させることで、構造的な歪みと収縮をもたらす(図4C)が、低速蒸発は同様に段階的な胚の優れた表面構造を解決した(図 4A.乾燥アーティファクトは、広範囲の収縮および組織破壊を引き起こすCPD技術で処理された胚で見られた(図4D,E)。スライド培養物からの寒天スライスは、CPDと比較してHMDS処理を用いた真菌単離物の不完全な乾燥を示す(図F)。完全な乾燥は、真菌性ハイファーおよび胞子の無傷の高解像度構造特徴を示す、よく乾燥した白色標本を有する寒天スライスのCPD処理によって達成される(図4G-G')。真菌培養を持つ寒天ブロックは、SEMイメージングには適さない色で縮小し、黄色に見える(図4H-H')。
図 1: 電子顕微鏡写真のスキャンクリーセミース・ピクタ化学乾燥によって調製された胚。(A)クライセミーズピクタ,ライスクリークフィールドステーションで繁殖シーズン中にネスト, オスウィーゴ, ニューヨーク州.(B) 外からよく構築された巣。(C) 産卵した卵を露出するように注意して表面土を除去する。(D)卵を寝具媒体でインキュベーション室に入れた。(E)化学乾燥後のアルミニウムスタブに胚を取り付け、E4はスパッタ被覆胚を示す。(F)顔の構造、四肢芽およびソミテを示すステージ12胚の横図。(G)よく定義されたカラペース尾根とパドル状の四肢芽がステージ15で見られる。(H)上顎及び下顎を示すステージ18胚の頭蓋骨構造は、上くちばしの先端に形成された小さな卵歯に注意する。(I) ステージ 13-14 における右前肢の背部図と、背部腹部境界における AER (J) のクローズアップビュー。スケールバー: F-H, 500 μm;I, 100 μm, J, 10 μmキー: mb, 中脳; np, 鼻腔; mxp, 上顎顕著; pa, 咽頭アーチ; h, ハート; fl, 前肢; s, ソマイト; hl, 後肢; t, 尾の先端; cr, カラパシカルリッジ;,下顎;m, 間葉, AER, 頂点外皮尾根.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2:空気乾燥卵殻と塗装されたカメの卵の殻膜の超構造解析。(A) 胚を固定した後、卵殻を蒸留水で十分に洗浄し、黄身とアルブミンを除去した。(B)きれいな卵殻は、少なくとも一晩空気乾燥した。(C) 卵殻をアルミスタブに取り付ける。(D)外気孔層および内殻膜を示すシェル断片の放射状図。(E) 外側の気灰層は、これらの単位の間に見られるグループおよび細孔に配置された球状シェル単位(su)を示す(アスタリスク)。(F) シェル単位間の中心点 (c) を示す結節の拡大図。(G)気灰層の除去は、シェル単位から壊れたくぼみでシェル膜の外表面を示す。スケールバー: E, 100 μm;F,10 μm,G, 20 μm.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: SEMイメージングのための真菌培養物の準備。(A) スライド カルチャの設定を示すスケマティックダイアグラム。(B) 30°Cでのインキュベーションの2日後に寒天ブロックに見られる白色の真菌コロニー。(C)フザリウム・ソラニの菌糸体の一部を示すSEM画像、スポロドキアでマクロコニジアを示す黒いアスタリスク、フィアリドを指す矢印、マイクロコニジアに向かう矢印、スケールバー、10 μm.(D) 中隔クラミドスポアの拡大画像, スケールバー 5 μm.キーズ: ab, 寒天ブロック; cs, カバースリップ; f, 真菌培養.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4:同様の標本を処理するための代替技術の比較分析。(A) HMDS(A)のゆっくりとした蒸発で乾燥した塗装されたカメ頭部の正面図(A)、四酸化オスミウム(B)でのポスト固定後、HMDS(C)およびCPD(D-E)の急速な高速蒸発。四酸化オスミウムを用いて固定後工程を含めると、固定後のHMDS処理と比較して画質に目に見える違いは見えません。変形はHMDSの高速蒸発後に見られ、ゆっくりとした蒸発で徐々に乾燥すると、より良い表面構造が提供されます。収縮と崩壊した構造の異なる程度は、CPDで処理された胚の脳、目および顔の顕著な領域で見られる(F)HMDS(1)、CPD(2)およびスパッタコーティングされたCPD処理標本(3)で処理されたスライド培養物の取り付けアルミニウムスタブ。(G-G')真菌性菌糸体およびフザリウムソラニの胞子の構造を保存することによって達成される真菌接種を伴う無傷の白色寒天スライスとして見られる完全な乾燥。(H-H'HMDS保存技術で見られるスライド培養物の不十分な乾燥、収縮および損傷した構造的完全性。スケールバー: A-E, 500 μm;G-H, 2 mm, G'-H', 20 μmキー: et, 卵歯; oc, 口腔; e, 眼; uj, 上顎; lj, 下顎;黒いアスタリスク、スポロドキアのマクロコニジア;矢印,フィアルド;と矢印、マイクロコニジア。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
我々の研究では、異なる固定剤、脱水および乾燥方法を試験し、胚、卵殻、真菌培養物の3つの異なる繊細な生物学的サンプルを調べた。SEM は一般的にサーフェス解析に使用されるので、固定浸透はあまり関係ありませんが、固定性の低い内部構造は内側の縮小や崩壊の表面構造を引き起こすことを理解する必要があります。延長された固定時間はまた、固定期間に応じて数回固定溶液を置き換え、より大きな組織サンプルのために考慮されるべきである。固定性と組織との間の活発な相互作用のために、細胞の浸透特性は大幅に変化します。組織液は固定性を希釈し、したがって、全体的な浸透性に寄与するアルデヒド効果は、細胞量に及ぼす影響に関する限り無視することができる。また、ホルムアルデヒドは組織に速く浸透し、グルタルアルデヒドと比較してクロスリンカーとしてより効果的です。バッファーホルムアルデヒド-グルタルアルデヒド混合物は、多種多様な組織を固定するために報告されたが、単層および細胞懸濁液の希釈液は15、16を固定するのにより適していた。しかし、希釈された溶液も高張性であり、したがって、アルデヒド自体は浸透性活性ではない。この研究で使用される繊細なサンプルについては、リン酸バッファーがほとんどの生物学的サンプルの細胞質環境に類似していると考えられているため、pH 7.4のPBSを固定剤の車両として使用しました。また、PBSが固定剤の車両として作用している間に、浸透度は試料に必要な生理学的範囲内であることが同定される。四酸化オスミウムとのポスト固定は、多くの場合、様々な生物学的試料16、22、42に推奨されるが、この研究で使用されるすべての生物学的試料のために排除されている。四酸化オスミウムを含まないサンプルは、鮮明な画像および四酸化オスミムで固定された標本を得たが、区別できない結果をもたらした(図4A)。四酸化オスミウムは葉組織構造の歪みを引き起こし、グルタルアルデヒドおよびホルムアルデヒド混合物43に比べてより貧弱な標本保存をもたらし、オスミウム分子の蓄積が浸透を阻害する可能性が示唆されている。CPDで使用される脱水剤および遷移剤、および化学乾燥に使用されるHMDSのような溶媒。この効果は組織特異的であり、四酸化オスミウムを除いては、本研究で分析された繊細な標本の種類に対する画質に影響を与えない。他のタイプの組織のために四酸化オスミウムの使用は、拡張された一次固定で排除されてもよい。
HMDS乾燥カメ胚標本は、よく保存された表面を示し、CPDと比較して歪みや収縮が少ない(図4)。CPDは、プロセス中に作成されたゼロまたは最小限の表面張力による細胞形態およびアーティファクト生産の歪みの可能性を最小限に抑えます。しかし、CPDは繊細な壊れやすいサンプルに物理的な危険を引き起こす可能性があります。我々の観察に沿って、HMDSは、44、45、46、47に発表された以前の研究に基づいて乾燥に起因する表面張力を最小限に抑えることによって、同様またはより高品質のイメージングを得た。CPD処理と比較して、HMDSはエッチングされた二枚貝およびバーナクルシェル48で有機メッシュワークの構造詳細を優しく保存し、メルミシドの複雑な内部組織の構造特徴の高分解能を提供した線虫49と昆虫内部組織28.乾燥板のアーティファクトは、HMDS技術と比較してCPD技術によって調製された試料に大量に見られました。膜ブレブおよびペレットアーティファクトは、CPD技術50を用いて調製した頸部細胞において増加した。HMDSは水と反応してヘキサメチルシロキサンとアンモニアを生成し、どちらも物体から蒸発します。HMDSは、糖、アミノ酸、アルコール、および他の多くの化合物などの化合物のシリルエーテルを作成するためにガスクロマトグラフィーで一般的に使用されます。HMDS が組織内のこれらの化合物の一部と反応するかどうかは不明です。.HMDSは、タンパク質を架リンクし、乾燥プロセス28の間に組織を硬化させる可能性があるが、HMDSが胚のより良い保存を提供する正確な理由は、組織特異性を除いて説明できなかった。我々の調査の結果に基づいて、CPDはHMDSと比較して広範な収縮を引き起こし、特に初期の胚の表面構造を分析するために、胚組織の処理にはるかに適している。HMDSが組織乾燥に作用するメカニズムは解明されていないが、絶対無水環境での徐々な蒸発によるゆっくりとした乾燥は、動物の優れた表面構造を得る理由となり得る。
以前に確立されたスライド培養物からの真菌コロニーを持つ寒天ブロックの小片は、骨髄マットの元のふわふわを維持する問題を回避するために、この研究で使用されました。真菌コロニーを有する寒天片のCPD乾燥は洗浄効果をもたらし、固定剤、バッファー、エタノールの変化は凍結乾燥の困難を克服するより良い選択であることがわかった。すべての段階の胚に適したHMDSは真菌培養を解決することができず、HMDSによる空気乾燥は、カールアップと構造剛性の損失という重大な問題を提起しました。CPDは真菌培養に適していますが、特に発達の初期段階で胚に即座に損傷を与え、表面の収縮を引き起こしました。HMDSとCPDが胚および真菌培養物にそれぞれ使用された場合、充電または乾燥アーティファクトは観察されなかった。カメの卵殻のような硬い組織の場合、イメージング用に取り付ける前に室温で洗浄および空気乾燥を除いて、特別な処理は必要ありません。
調製方法にかかわらず、徐々にエタノール勾配ステップを使用して、アーティファクトを乾燥させる可能性を低減する必要があります。当初、HMDSサンプルとCPDサンプルの両方に、文献で入手可能な脱水および乾燥プロトコルに続く収縮を伴う表面アーティファクトが見つかりました。一連の標準化の後、我々はアーティファクトがアルコール脱水の結果であると判断した。脱水中に、より緩やかなエタノール増加を使用して、遅い脱水プロセスを使用することが重要です。また、各反復の持続時間は、真菌培養と比較して胚の持続時間を長くする必要があります。また、100%エタノールでの追加工程により、完全な均一な飽和を確保した。HMDSはサンプルの空気乾燥を可能にするために完全または部分的に除去することができるが、HMDSへの長期暴露と蒸発による徐々な空気乾燥は、大きな表面によって引き起こされる混乱を避けるために胚に有効であることが判明した(図4A,C)。微生物細胞取り付け51に対して観察される緊張。HMDSに浸漬し、一晩の遅い乾燥は、柔らかい繊細な組織が遅い乾燥プロセスの恩恵を受けることができることを示唆するダフニア種52の優れた表面構造を明らかにしました。胚に対して許容可能な画質は、脱水後にHMDSの濃度を徐々にエタノールに増加させることにより、ゆっくりとした化学乾燥で得ることができる。
すべてのサンプルは、導電性の表面を提供するために両面カーボンテープを使用してアルミニウムスタブに取り付けられ、同じサンプルを異なる向きで画像化する必要がある場合は、無色のマニキュアの薄いコートを使用することもできます。スタブ表面にマニキュアを使用し、両面カーボンテープを使用する場合に比べてサンプルを代替平面に配置する場合、サンプルはスタブから簡単に除去できます。サンプルは非導電性なので、導電性を高めるためにサンプルに金属の薄い層をスパッタする必要があります。この研究では、スパッタコーティング中に金ターゲットが使用され、金パラジウムも充電効果を回避する同様の結果をもたらします。正しいビーム電圧はサンプル依存であり、軽く被覆された標本のために、2-5 kVの界面放出SEMによるイメージ投射は表面構造のよい定義を提供する。十分なコーティングを有する組織のために、5 kVは一般的により多くのビーム浸透なしでよりよい信号を提供する。深さが不足し、金だけでコーティングされた標本の場合、より高い電圧(10 kV)でのイメージングにより、表面地形のより良い可視化が可能になりました。
SEMのための繊細な組織の準備は独特の挑戦を提起し、サンプルの準備の技術の範囲はイメージ投射のアーティファクトを克服し、最小にするために使用することができる。私たちは、胚、硬い卵殻、真菌培養の3つの異なる繊細な生体組織サンプルを処理する包括的な方法を提供します。我々の調査では、以前に発表された研究から入手可能な一般的な方法に微妙な変更が行われ、我々は、各繊細な組織タイプに固有の最も適切な脱水および乾燥方法を同定した。これらのプロトコルは、同様の生物学的サンプルから許容されるSEM画像品質を得るために適応させることができる。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は開示するものが何もない
Acknowledgments
著者たちは、原稿に関する有益な議論とコメントのために、ダニエル・バルダッサール博士、SUNY Oswego博士に感謝したいと思います。この研究はライスクリークアソシエイトグラント、オスウィーゴによってサポートされました。チャレンジは、SunYオスウィーゴと国立科学財団(NSF)PGLとJGに小額助成金を付与します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Fischer Scientific | S25127A | for slide cultures |
| Aluminum pin stub | Tedpella | 16111 | 12.7 mm x 8 mm |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: Potato Dextrose Agar | BD 213400 | DF0013-17-6 | Media for isolation and cultivation of Fungi, yeast and molds |
| Chloramphenicol | Fischer BioReagents | BP904-100 | Antibiotic for media |
| Coarse Vermiculite | Greenhouse Megastore | SO-VER-12 | bedding medium |
| Clear 12- well plate | Corning | 07-201-589 | for fixing embryo |
| Coverslips | Fischer Scientific | S17525B | for slide culture |
| Critical Point Dryer | Quorum CPD | EMS850 | critical point drying |
| Culture dishes | Fischer Scientific | 08 747B | DISH PETRI 100X10MM 12/PK |
| Ethanol | Fischer Scientific | A406P 4 | dehydration agent |
| Forceps- Aquarius Tweezers | Tedpella | 5804 | style 4, length 108mm, widh x thickness 0.017 x 0.17 mm |
| Glutaraldehyde | Fischer Scientific | G151-1 | fixative |
| Gold target for sputter coater | DENTON VACUUM | TAR001-0158 | Gold Target, 2.375″ D X .002″ |
| Hexamethyldisilazana | Fischer Scientific | C19479-5000 | chemical drying agent |
| Kim wipes | Kimtech | S-8115 | cleaning |
| Microscope slides | Thermo Scientific | 67-762-16 | for slide culture |
| Microscopy Scissors | Tedpella | 1327 | Double pointed, stainless steel, 100 mm L (3-5/8"). |
| Micro-scissors | Tedpella | 1346 | Vannas-type, straight, 80mm L |
| Moria Perforated Embryo Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Length 14.5 cm, tip diameter 20 mm, spoon depth 5 mm |
| Netwell Inserts | Corning | 0330B09 | 15 mm Inserts with 74 µm Mesh Size Polyester Membrane act as handy carriers during specimen processing into different solvents |
| Paraformaldehyde | Fischer Scientific | T353 500 | fixative |
| Peat moss | Walmart- Miracle Gro | 551705263 | bedding medium |
| PELCO tabs double stick carbon conductive tape | Tedpella | 5000 | 12 mm OD |
| Sputter coater | DENTON VACUUM | DESK V | thin metal coating |
| SEM | JEOL USA | JEOL JSM 6610LV scanning electron scope | electron microscopy |
References
- Packard, M. J. Ultrastructural Morphology of the Shell and Shell Membrane of Eggs of Common Snapping Turtles (Chelydra serpentina). Journal of Morphology. 165 (2), 187-204 (1980).
- Solomon, S. E., Watt, J. M. The structure of the eggshell of the leatherback turtle (Dermochelys coriacea). Animal Technology. 36 (1), 19-27 (1985).
- Sahoo, G., Mohapatra, B. K., Sahoo, R. K., Mohanty-Hejmadi, P. Ultrastructure and Characteristics of Eggshells of the Olive Ridley Turtle (Lepidochelys olivacea) from Gahirmatha, India. Acta Anatomica. 156, 261-267 (1996).
- Mitrus, S. The calcareous layer eggshell of the turtle Emys Orbicularis: Ultrastructure and composition. Italian Journal of Zoology. 70 (1), 13-16 (2003).
- Chang, Y., Chen, P. Y. Hierarchical structure and mechanical properties of snake (Naja atra) and turtle (Ocadia sinensis) eggshells. Acta Biomaterialia. 31, 33-49 (2016).
- Samson, R. A., Stalpers, J. A., Verkerke, W. A simplified technique to prepare fungal specimens for scanning electron microscopy. Cytobios. 24, 7-11 (1979).
- Kaminskyj, S. G. W., Dahms, T. E. S. High spatial resolution surface imaging and analysis of fungal cells using SEM and AFM. Micron. 39, 349-361 (2008).
- Wisse, E., et al. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World Journal of Gastroenterology. 16 (23), 2851-2866 (2010).
- Braet, F., De Zanger, R., Wisse, E. Drying cells for SEM, AFM and TEM by hexamethyldisilazane: a study on hepatic endothelial cells. Journal of Microscopy. 186 (1), 84-87 (1997).
- Echlin, P. Handbook of Sample Preparation for Scanning Electron Microscopy and X-Ray Microanalysis. , UK: Springer. (2009).
- Bell, P. B., Safiejko-Mroczka, B. Preparing whole mounts of biological specimens for imaging macromolecular structures by light and electron microscopy. International Journal of Imaging System Technology. 8 (3), 225-239 (1997).
- Bahr, G. F., Bloom, G., Friberg, U. Volume changes of tissues in physiological fluids during fixation in osmium tetroxide or formaldehyde and during subsequent treatment. Experimental Cell Research. 12 (2), 342-355 (1957).
- Baker, J. R. Principles of biological microtechnique; a study of fixation and dyeing. , Wiley. London Methuen; New York. (1958).
- Glauert, A. M. Practical methods in electron microscopy. Journal of Microscopy. 3, 5-65 (1974).
- Hayst, M. A. Biological Applications. Principles and techniques of electron microscopy, 4th ed. , Cambridge University Press. 13-105 (1970).
- Pathan, A. K., Bond, J., Gaskin, R. E. Sample preparation for SEM of plant surfaces. Materials Today. 12 (1), 32-43 (2010).
- Hayat, M. A. Electron microscopy: Biological applications. 4th ed. , Cambridge University Press. New York. (2000).
- Hayat, M. A. Fixation for electron microscopy. , Academic Press. New York. (1981).
- Karnovsky, M. J. A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolarity for use in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 27, 137-138 (1965).
- McDowell, E. M., Trump, B. F. Histologic fixatives suitable for diagnostic light and electron microscopy. Archives Pathology and Laboratory Medicine. 100, 405 (1976).
- Wisse, E., et al. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World Journal of Gastroenterology. 16 (23), 2851-2866 (2010).
- Fischer, E. R., Hnasen, B. T., Nair, V., Hoyt, F. H., Dorward, D. W. Scanning Electron Microscopy. Current Protocols in Microbiology. , Unit2B.2 (2012).
- Magalhaes, M., et al. Embryonic development of the Giant South American River Turtle, Podocnemis expansa (Testudines: Podocnemididae). Zoomorphology. 136 (4), 523-537 (2017).
- Hopwood, D. Fixatives and fixation: a review. The Histochemistry Journal. 1 (4), 323-360 (1969).
- Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde fixation. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 33 (8), 845-853 (1985).
- Bell, P. B., Rundquist, I., Svensson, I., Collins, V. P. Formaldehyde sensitivity of a GFAP epitope, removed by extraction of the cytoskeleton with high salt. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 35 (12), 1375-1380 (1987).
- Hayat, M. A. Glutaraldehyde: Role in electron microscopy. Micron and Microscopica Acta. 17 (2), 115-135 (1986).
- Nation, J. L. A new method using hexamethyldisilazane for preparation of soft insect tissues for scanning electron microscope. Stain Technology. 58 (6), 347-351 (1983).
- Bray, D. F., Bagu, J., Koegler, P. Comparison of hexamethyldisilazane (HMDS), Peldri II, and critical point drying methods for scanning electron microscopy of biological specimens. Microscopy Research Technique. 26 (6), 489-495 (1993).
- Barre, C., O'Neil, D., Bricelj, V. M. Preparation of large bivalve specimens for scanning electron microscopy using Hexamethyldisilazane (HMDS). Journal of Shellfish Research. 25 (2), 639-641 (2006).
- Lee, J. T. Y., Chow, K. L. SEM sample preparation for cells on 3D scaffolds by freeze-drying and HMDS. SCANNING. 33, 1-14 (2011).
- Araujo, J. C., et al. Comparison of hexamethyldisilazane and critical point drying treatments for SEM analysis of anaerobic biofilms and granular sludge. Journal of Electron Microscopy. 52, 429-433 (2003).
- Boyde, A., Bailey, E., Jones, S. J., Tamarin, A. Dimensional changes during specimen preparation for scanning electron microscopy. SEM/IITRI. 10, 507-518 (1977).
- Read, N. D., Porter, R., Beckett, A. A comparison of preparative techniques for the examination of the external morphology of fungal material with the scanning electron microscope. Canadian Journal of Botany. 61 (8), 2059-2078 (1983).
- Melo, I. S., Faull, J. L. Scanning electron microscopy of conidia of Thichoderma stromaticum, a biocontrol agent of witches broom disease of cocoa. Brazilian Journal of Microbiology. 35, 330-332 (2004).
- Pathan, A. K., Bond, J., Gaskin, R. E. Sample preparation for scanning electron microscope of plant surfaces- Horses for courses. Micron. 39, 1049-1061 (2008).
- Packard, G. C., Taigen, T. L., Packard, M. J., Boardman, T. J. Water relations of pliable-shelled eggs of common snapping turtle (Chelydra serpentine). Canadian Journal of Zoology. 58, 1404-1411 (1979).
- Packard, M. J., Packard, G. C., Boardman, T. J. Structure of eggshells and water relations of reptilian eggs. Herpetologica. 38, 136-155 (1982).
- Cordero, G. A., Janzen, F. J. An Enhanced Developmental Staging Table for the Pianted Turtle, Chrysemys picta (Testudines: Emydidae). Journal of Morphology. 275, 442-455 (2014).
- Yntema, C. L. Procurement and use of turtle embryos for experimental procedures. The Anatomical Record. 149, 577-586 (1964).
- Matsubara, Y., Kuroiwa, A., Suzuki, T. Efficient harvesting methods for early-stage snake and turtle embryos. Development Growth Differentiation. 58, 241-249 (2016).
- Moran, P., Coats, B. Biological Sample Preparation for SEM Imaging of Porcine Retina. Microscopy Today. , 10-12 (2012).
- Bray, D. F., Bagu, J., Koegler, P. Comparison of hexamethyldisilazane (HMDS), Peldri II, and critical point drying methods for scanning electron microscopy of biological specimens. Microscopy Research Technique. 26, 489-495 (1993).
- Botes, L., Price, B., Waldron, M., Pitcher, G. C. A simple and rapid Scanning Electron Microscope preparative technique for delicate "Gymnodinioid" Dinoflagellates. Microscopy Research Technique. 59, 128-130 (2002).
- Dekker, N. P., Lammel, C. J., Brooks, G. F. Scanning Electron Microscopy of piliated Neisseria gonorrhoeae processed with hexamethyldisilazane. Journal of Electron Microscopy. 19, 461-467 (1991).
- Fratesi, S., Lynch, F. L., Kirkland, B. L., Brown, L. R. Effects of SEM preparation techniques on the appearance of bacteria and biofilms in the Carter Sandstone. Journal of Sedimentary Research. 74, 858-867 (2004).
- Jung, S. W., Joo, H. M., Park, J. S., Lee, J. H. Development of a rapid and effective method for preparing delicate dinoflagellates for scanning electron microscopy. Journal of Applied Phycology. 22, 313-317 (2010).
- Bernd, S., Bentley, D. Use of HMDS (hexamethyldisilazane) to dry organic microstructures in etched bivalve mollusk and barnacle shells. Nautilus -Greenville then Sanibel. 116, 25-31 (2002).
- Bowen, W. R., Hemann, C. C., Johnson, A. A., Good, B. H. Mermithid Nematodes: SEM Observations Comparing Hexamethyldisilazane and Critical Point Drying Methods. Journal of the Arkansas Academy of Science. 44, Article 6 (1990).
- Jusman, J., Ng, S. C., Osman, N. A. A. Investigation of CPD and HMDS Sample Preparation Techniques for Cervical Cells in Devloping Computer-Aided Screening System Based on FE-SEM/EDX. The Scientific World Journal. 289817, 1-11 (2014).
- Hazrin-Chong, N. H., Manefield, M. An alternative SEM drying method using hexamethyldisilazane (HMDS) for microbial cell attachment studies on sub-bituminous coal. Journal of Microbiological Methods. 90, 96-99 (2012).
- Laforsch, C., Tollrian, R. A new preparation technique of daphnids for Scanning Electron Microscopy using hexamethyldisilazane. Arch Hydrobiology. 149 (4), 587-596 (2000).
