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Processamento de embriões, casca de ovo e cultura fúngica para microscopia eletrônica de varredura

Published: August 16, 2019 doi: 10.3791/60018

Summary

Aqui, apresentamos protocolos de processamento detalhados para amostras de tecidos delicados de imagem usando microscopia eletrônica de varredura (SEM). Três métodos de processamento diferentes, a saber, a secagem química do disilazana do hexametil (HMDS), a secagem simples do ar, e a secagem crítica do ponto são descritos preparando cascas de ovo rígidas, embriões em estágios adiantados do desenvolvimento, e culturas fungosas respectivamente.

Abstract

Embora a microscopia eletrônica de varredura (MEV) esteja sendo amplamente utilizada para a análise ultraestrutural de várias amostras biológicas e não biológicas, os métodos envolvidos no processamento de diferentes amostras biológicas envolvem práticas únicas. Todas as práticas convencionais descritas na literatura para processamento de amostras ainda encontram aplicações úteis, mas mudanças sutis na preparação da amostra podem alterar a qualidade da imagem, bem como, introduzir artefatos. Assim, a utilização de uma técnica de preparo de amostra única específica para o tipo de tecido analisado é necessária para obter uma imagem de boa qualidade com resolução ultraestrutural. O foco deste estudo é fornecer os protocolos ideais da preparação da amostra para embriões da imagem latente, cascas de ovo rígidas, e culturas fungosas usando o SEM. As seguintes otimizações foram recomendadas para produzir bons resultados para as três diferentes amostras biológicas delicadas estudadas. O uso de fixadores mais leves como paraformaldeído a 4% ou glutaraldeído a 3% seguido de desidratação com séries de etanol é obrigatório. Micélio fúngico em blocos de agar obtidos por culturas de slides produz uma melhor integridade ultraestrutural em comparação com culturas tomadas diretamente de placas de agar. A secagem química de embriões com HMDS fornece secagem sem introduzir artefatos de tensão superficial em comparação com a secagem de ponto crítico. HMDS previne rachaduras causadas por encolhimento como as amostras são menos frágeis durante a secagem. No entanto, para a cultura fúngica, ponto crítico de secagem fornece qualidade de imagem aceitável em comparação com a secagem química. Os Eggshells podem ser imaged sem etapas especiais da preparação à exceção da lavagem completa e do ar que secam antes da montagem. As metodologias de preparo foram padronizadas com base na qualidade de imagem aceitável obtida com cada ensaio.

Introduction

Análise ultraestrutural do microscópio eletrônico de varredura (SEM) e microscopia de luz intracelular do suplemento da imagem latente para o perfilamento tridimensional dos prokaryotes, das plantas, e dos animais. A alta resolução espacial de um MEV torna uma das técnicas mais versáteis e poderosas disponíveis para o exame de características microestruturais de espécimes no nanômetro para escala de micrômetro. Espécimes dessecados são resolvidos para estruturas composicional e topográficas com detalhes intensos, o que fornece a base para o desenvolvimento de conclusões válidas sobre as relações funcionais1,2,3 , 4. º , 5. º , 6 anos de , 7 anos de , 8 . º , 9. ao interpretar imagens de sem de espécimes biológicos, é um grande desafio distinguir entre estruturas nativas e os artefatos que são criados durante o processamento. O SEM é operado geralmente em aspiradores muito elevados para evitar toda a interferência das moléculas de gás que afetam os feixes de elétron preliminares, secundários ou backdispersos emitidos da amostra10,11. Também, os materiais biológicos são suscetíveis aos danos da radiação devido a suas propriedades pobres ou não-conduzindo. É essencial para que os espécimes carregados no sem sejam completamente secos e livres de todos os contaminadores orgânicos para eliminar todo o desgaseificação possível em um ambiente elevado do vácuo10,11. Como espécimes biológicos são principalmente compostos de água, técnicas preparativas adicionais são necessárias para garantir que as estruturas nativas são mantidas.

A resolução obtida é baseada na otimização dos métodos de preparo específicos para os tipos de amostras e parâmetros instrumentais utilizados. Assim, é necessário evitar o uso de etapas de processamento generalizado para todos os tipos de tecido. Alguns espécimes biológicos exigirá um processamento menos rigoroso para preservar sua estrutura, enquanto mais tempo e cuidados podem ser necessários para tipos delicados de amostras para evitar a introdução de artefatos de secagem, como encolhimento e colapso. A preparação da amostra é um passo crítico na imagem SEM; os achados dos estudos morfométricos são notavelmente influenciados pelos procedimentos de preparo do espécime12,13. As etapas comuns da preparação para muitas amostras biológicas são fixação, desidratação e revestimento com um metal tal como o ouro, a platina ou o paládio para converter suas superfícies para ser condutoras para a análise de SEM. A natureza e a combinação das etapas utilizadas variarão dependendo do tipo de tecido e dos objetivos específicos do estudo. Acúmulo de carga, sensibilidade ao vácuo e dano de feixe de elétrons colocam problemas ao processar amostras biológicas delicadas suaves, necessitando de etapas adicionais de processamento para reter a estrutura nativa do objeto. O uso de métodos convencionais como a fixação do tetróxido de ósmio e a desidratação causam encolhimento e o colapso dos tecidos delicados14,15,16,17. O objetivo do estudo é estabelecer metodologias elegantes derivadas combinando ideias de estudos anteriores com modificações para preparar e imagem de tecidos delicados macios (por exemplo, embriões de répteis, casca de ovo de tartarugas pintadas e culturas fúngicas).

A seleção de um método apropriado da fixação é a primeira etapa a mais importante para a análise microscópica de espécimes biológicos. A fixação dos tecidos imediatamente após o isolamento de um organismo é essencial para evitar alterações na sua morfologia devido à decomposição. Um fixador eficaz deve encerrar os processos celulares, permeando as células rapidamente e mantendo o efeito irreversivelmente para estabilizar a estrutura da amostra para suportar as etapas de processamento subsequentes e exame o SEM17 , 18. embora diversos métodos químicos e físicos da fixação sejam sabidos, a fixação química é usada mais geralmente para espécimes biológicos para evitar todas as mudanças celulares devido à autólise, ao putrefaction, e aos efeitos de secagem. Existem inúmeras formulações químicas fixativas discutidas na literatura17,19,20,21,22,23, fixativas que trabalham por desnaturação e coagulando macromoléculas biológicas, e aquelas que fixam por macromoléculas de ligação cruzada covalentemente. Os álcoois são usados como fixadores desnaturando que preservam ultraestrutura muito mal e são usados na maior parte para a microscopia de luz e não recomendado para a análise microscópica do elétron. Os fixadores cross-linking como o formaldeído, o glutaraldeído e o tetróxido do ósmio criam o reticulação intermolecular e intramolecular entre macromoléculas dentro dos tecidos, fornecendo a preservação excelente das ultra-estruturas11 ,24,25,26. As amostras biológicas são sensíveis à temperatura. Recomenda-se que a temperatura no início da fixação seja de 4 ° c para reduzir a mobilidade lateral das proteínas da membrana, para retardar a difusão das moléculas intercelulares e retardar a taxa de fixação11. O tempo necessário para a fixação dos tecidos depende em grande parte do tamanho da amostra e da velocidade com que o fixador se difunde e reage com os componentes da amostra. Uma fixação durante a noite em paraformaldeído a 4% ou glutaraldeído a 3% em PBS a 4 ° c é o método preferencial para a análise de MeV de espécimes utilizados neste estudo para suas propriedades penetrantes sequenciais, que permitem a transformação de amostras delicadas menores17 , 18 anos de , 19 anos de , 20 anos de , 27. um passo pós-fixação com tetroxida de ósmio é eliminado não só devido à sua natureza tóxica, mas também não foi encontrado para implementar nenhuma vantagem adicional para melhorar a qualidade da imagem para as amostras analisadas neste estudo.

As amostras biológicas contêm fluidos que interferem na operação de SEM; daqui, as amostras precisam de ser secas antes de inseri-la na câmara da amostra de SEM. Uma vez que a desidratação é assegurada, o solvente deve ser removido do tecido sem criar artefatos nos espécimes devido à tensão de superfície/secagem. Três diferentes métodos de secagem foram comumente utilizados durante o processamento de tecidos para sem imagem: secagem de ar, secagem de ponto crítico e congelamento de amostras de secagem28,29,30,31. Poucos estudos relatam todos os três métodos de secagem produzindo resultados idênticos com amostras de tecido animal28,29,30,31. Uma prática geral usada para espécimes menores são a desidratação química por série de concentração ascendente de álcool e hexametildissilazano (HMDS), mas os espécimes maiores são secos usando um ponto crítico de secagem (CPD) instrumento32. Durante o processo de secagem, forças consideráveis formadas em pequenas cavidades que são passadas através do espécime por uma interface de líquido/gás; Isto pode mesmo conduzir a um colapso completo das estruturas ocas33. Qualquer deformação que ocorra devido ao tratamento pode então ser confundida como uma característica estrutural nativa do espécime. Assim, o fenômeno generalizado para o processamento deve ser eliminado e um processo de secagem original deve ser estandardizado para cada tipo de tecido especial quando os espécimes delicados do tecido são analisados.

Em vários ensaios realizados utilizando várias combinações de todos os processos acima mencionados, padronizamos os métodos que podem ser utilizados para a análise de MeV de três tecidos delicados: embriões de répteis, cascas de ovos de tartarugas pintadas e culturas fúngicas. Biólogos e morfologistas do desenvolvimento descrevem morfogênese normal e anormal durante o desenvolvimento embrionário em animais vertebrados representativos. As investigações sobre as vias de sinalização genética dependem da descrição morfológica das novas estruturas. Para evitar qualquer mudança abrupta na estrutura do embrião de vertebrados durante a análise de SEM, recomendamos a secagem química após a desidratação. A secagem química usando HMDS é o método de secagem relativamente o mais novo e as vantagens incluem o quickness relativo, a facilidade de utilização, o custo perdido, e a perícia e o equipamento limitados necessários9. O CPD é uma técnica de secagem comumente usada usando o de co2 nos espécimes em uma temperatura e pressão específicas. Nós identificamos que HMDS é apropriado para secar tecidos delicados macios e permite que as amostras maiores sejam processadas comparadas à secagem crítica do ponto, que causou a deformação extensiva aos tecidos embrionário. Vários métodos têm sido utilizados para preparar amostras para a imagem SEM para estudar as características morfológicas dos fungos34. Os espécimes fúngicos são comumente fixados em tetroxida de ósmio, seguidos por desidratação de etanol e secagem de ponto crítico, o que pode proporcionar resultados satisfatórios, embora os efeitos tóxicos do ósmio tetroxida6,7,35 e perder materiais fúngicos, enquanto as soluções em mudança durante o processamento são desvantagens pronunciadas. A técnica da preparação da amostra que usa o ar-secagem sem fixação foi praticada igualmente36 mas resultados em estruturas encolhidos e desmoronadas, e a observação de tais espécimes pode facilmente ser interpretada mal ao caracterizar a espécie. A hipha fúngica perde sua integridade em contato com líquidos e uma secagem até mesmo pode não ser alcançada para restaurar a estrutura. Devido a este efeito, a liofilização é comumente usada para secar tecidos moles como micélio fúngico. A secagem por congelamento funciona bem para materiais limpos, mas a presença de quaisquer sais ou secreção obscurecer os detalhes superficiais que serão identificados apenas no estágio de visualização de SEM. Nós acoplamos o método da cultura da corrediça com fixação do glutaraldeído e ponto crítico que secam para render detalhes estruturais de hifas e de spores fungosos intactos. Embora a secagem do CPD causasse o encolhimento nos embriões, conduziu às estruturas micelial bem preservadas quando acoplada com a fixação do glutaraldeído. A casca de ovo é de importância primordial para o embrião de animais oviparosos, não só agindo como uma cobertura protetora, mas também proporcionando estabilidade mecânica, permeabilidade ao gás e água, e uma reserva de cálcio para o embrião em desenvolvimento. As cascas de água doce da tartaruga são classificadas como "rígidas" com base em sua estrutura, e devido à sua disponibilidade têm recebido atenção significativa dos biólogos1,2,3,4 , 5. º , 6 anos de , 7 anos de , 37 , 38.

Nós detalham métodos simples para a examinação fácil da casca de ovo e das membranas da casca da tartaruga pintada que pode ser aplicada a toda a espécie rígida da casca de ovo. As metodologias de preparação foram avaliadas com base na qualidade da imagem resultante e redução de artefatos potenciais.

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Protocol

Nota: os ovos de tartaruga pintada (Chrysemys picta) utilizados neste estudo foram recolhidos durante a época de nidificação de maio a junho de 2015-16 de Rice Creek Field Station, Oswego New York, com permissão obtida do departamento de estado de Nova York de Environmental Conservação (DEC).

1. método de secagem química para processar embriões para SEM

  1. Colete ovos de tartaruga de locais de campo durante a temporada de nidificação. Prepare as câmaras de incubação com antecedência, feitas de caixas de plástico com tampas (L x W x H) 6,7 cm x 25,4 cm x 10,2 cm preenchido com meio de cama preparado com uma mistura úmida de vermiculita e musgo de turfa (1:1 ratio). Faça 4-6 furos de aproximadamente 0,25 cm ao longo dos lados das caixas e na tampa para permitir a aeração.
  2. Retire suavemente o solo do ninho para descobrir os ovos. Limpe a superfície de ovos de tartaruga com tintura de iodo diluída (1:25000) para controlar a contaminação microbiana durante a incubação. Coloc as embreagens separadas de se, o tamanho da embreagem da tartaruga pintada pode variar de 5-9 ovos e coloc um máximo de 8-9 ovos por a caixa.
    Nota: Manuseie cuidadosamente os ovos durante a recolha, limpeza, rotulagem e colocação no interior das caixas. A posição e o alinhamento dos ovos precisam ser os mesmos que foram colocados, qualquer movimento inibirá o desenvolvimento embrionário.
  3. Enterrar manualmente os ovos metade na cama, cubra e coloque a caixa dentro da incubadora fixado em 30 ° c. Incubar os ovos por 10-17 dias para obtenção dos estágios embrionários 12, 13 e 18, respectivamente, utilizados neste estudo. Adicione a água destilada para molhar parcialmente o meio do fundamento cada outro dia para evitar a desidratação e para manter o nível de umidade para o desenvolvimento normal dos embriões.
    Nota: os embriões da incubação e da plataforma são de acordo com uma tabela desenvolvente completa publicada mais cedo39.
  4. Fixar os embriões, fazendo o primeiro corte em um lado da casca de ovo e gema dorsal juntos, vertical para o eixo longo usando tesouras pontiagudas. Insira a tesoura na gema cuidadosamente para evitar cortar o disco embrionário. Agora corte o lado lateral do ovo ao longo do eixo longo e, em seguida, corte o outro lado do ovo ao longo do eixo curto.
  5. Descasque a parte extirpada aberta com o lado do embrião que usa o fórceps. Corte o outro lado lateral da casca de ovo e coloque a peça extirpada em salina tamponada com fosfato (PBS a um pH de 7,4).
    Nota: o ovo da tartaruga é enchido com a gema de ovo altamente viscosa e o lado dorsal do embrião adere à membrana da casca de ovo. A membrana da casca de ovo perto do embrião muda com a incubação do branco translúcido a um branco opaco, Chalky. Isso permite localizar o embrião no centro do eixo longo e ser visto como um ponto calcificado escuro do exterior40,41.
  6. Use um estereomicroscópio para isolar os embriões juntamente com a membrana da gema, descascando-os da casca de ovo usando fórceps. Remova as membranas extra-embrionárias usando fórceps e Microtesoura. Transfira o embrião usando uma colher de embrião para PBS fresco em uma placa de Petri para lavar qualquer sangue ou gema.
  7. Use placas claras de 12 poços para fixar os embriões durante a noite em paraformaldeído a 4% em PBS a 4 ° c ou em 2-3% de glutaraldeído em PBS. Coloque um a três embriões em cada poço, dependendo do tamanho dos embriões. Assegure a infiltração completa (as amostras parecerá brancas) para uns embriões mais velhos estendendo o tempo da fixação por 2-3 dias. Enxágüe os embriões 3x com PBS fresco durante 5 min cada enxaguadura.
    Nota: Evite danificar a superfície do embrião usando pastilhas de poliestireno com fundo de malha de poliéster para placas de 12 poços para transferir espécimes de um solvente para outro.
  8. Deshidratar amostras utilizando uma série de concentração de etanol em água destilada: 30%, 50%, 70%, 80%, 95% e 100% e tratar amostras para 1 h em cada solução de desidratação. Repita o passo com 100% de etanol duas vezes para garantir a desidratação completa. Se não for utilizado imediatamente, armazene amostras em 70% de etanol a-20 ° c por um período mais longo.
  9. Embriões secos utilizando uma série de hexamethyldisilazana (HMDS) para 100% de concentração de etanol: 1:2, 2:1 e 100%. Deixe as amostras em cada solução por 20 min e mantenha a placa de Petri parcialmente coberta durante o processo.
    Nota: realize todas as etapas envolvendo HMDS na capa das emanações com a engrenagem de proteção pessoal necessária como HMDS é altamente tóxico.
  10. Deixe os embriões na solução final de 100% HMDS coberta completamente ou parcialmente em uma capa de fumaça durante a noite auxiliando na evaporação de HMDS, deixando amostras prontas para montagem e revestimento de Sputter. Cubra o prato para eliminar a poeira que se fixam sobre as amostras.
    Nota: o tecido aparecerá branco após a secagem completa e amostras parcialmente secas vai olhar amarelo na cor, deixar esses tecidos na capa de fumaça por um longo tempo.
  11. Escolha o tamanho dos esboços de alumínio e fita adesiva de carbono por tamanho da amostra analisada. Monte as amostras secas cuidadosamente em um stub de pino de alumínio padrão (12,7 mm x 8 mm) usando fita condutora de carbono de vara dupla (12 mm).
  12. Introduza amostras montadas na câmara do coater do Sputter para revestir o espécime com uma película muito fina do ouro para eliminar o efeito da carga. Placa de ouro os espécimes para 60-120 s em um 35 mA Sputter.
  13. Monte os stubs nas placas de poros correspondentes, fixando firmemente os parafusos de fixação. Transfira o suporte da amostra para dentro ou para fora da câmara de amostra de SEM utilizando a ferramenta de troca de amostras. Imagem as amostras no modo de alto vácuo com uma tensão de feixe de aceleração de 10 kV e corrente de emissão 10 μA.
    Nota: sempre use luvas durante o manuseio de amostras, suportes de amostra, esboços de montagem e ferramentas de transferência para evitar a contaminação de graxa das mãos para o sistema SEM.
  14. Teste as técnicas alternativas alistadas abaixo para comparar a definição dos espécimes obtidos do procedimento acima.
    1. Inclua uma borne-fixação com o tetróxido do ósmio de 1% por 1 h na temperatura ambiente após a etapa 1,7.
    2. Remova parcialmente ou completamente o HMDS na etapa 1,10 para a evaporação rápida rápida de HMDS.
    3. Processe embriões após a etapa 1,8 usando a secagem de ponto crítico (CPD) seguindo as etapas 3.3-3.4.

2. preparando a casca de ovo para SEM usando um método de secagem de ar

  1. Coletar e incubar os ovos de tartaruga pintada (Chrysemys picta) para fixar os embriões conforme especificado nas etapas 1.1-1.7.
  2. Guarde as cascas de ovos em água destilada após a fixação do embrião no passo 2,1. Limpe as cascas de ovos completamente por imersão em água destilada por pelo menos 1 h para eliminar a contaminação de gema e albumina.
  3. Os ovos ar-secos após a lavagem em toalhetes antiestáticos delicados na capa da emanação durante a noite. Armazene cascas de ovo secas em garrafas de amostra limpas rotuladas por número e estágio.
  4. Monte, Sputter casaco e imagem os espécimes, seguindo as etapas especificadas nas etapas 1.11-1.13.

3. ponto crítico método de secagem para a preparação de culturas fúngicas para SEM

  1. Estabelecer culturas de slides
    1. Prepare a mídia de agar dextrose de batata (PDA) para culturas fúngicas: Adicione 39 g de potência PDA em 1 L de água destilada em um balão de Erlenmeyer. Misture bem girando o balão e autoclave a mídia em 121 ° c por 30 min. permitir que a solução de mídia esfriar e, em seguida, adicione o antibiótico cloranfenicol (25 μg/mL) usando uma micropipeta estéril.
      Nota: após a esterilização, a solução de agar deve ser quente e não solidificar em breve. Resfriá-lo o suficiente para que ele não vai desativar os antibióticos.
    2. Misture-o girando e despeje as placas (aproximadamente 10-12 mL de mídia para cada prato de Petri de 10 cm), empilhe cuidadosamente e deixe solidificar.
    3. Use uma lâmina de bisturi estéril para cortar pequenos blocos de agar cerca de 1/2 a 3/4 de uma polegada. Retire e coloque um bloco de agar em um slide de microscópio de vidro limpo.
    4. Coloque o slide em uma placa de Petri limpa para evitar a contaminação e preservar a umidade durante a incubação.
    5. Levante o slide da parte inferior da placa de Petri usando um palito estéril para criar tensão superficial entre a chapa e a corrediça para remover a lâmina de vidro sem interromper o crescimento delicado após a incubação.
    6. Use um laço estéril ou uma agulha para transferir alguns dos fungos do inóculo do espécime a cada um dos quatro lados do bloco do agar na corrediça.
    7. Coloque uma lamínula limpa na superfície do bloco de agar após a inoculação. Adicione algumas gotas de água destilada estéril ao prato de Petri em torno da corrediça para assegurar a umidade para os fungos crescentes.
    8. Selar a placa parcialmente usando a película de parafina e incubar a placa em 30 ° c por um período de tempo apropriado (para a espécie do Fusarium incubar para 36 a 48 h).
    9. Retire a lâmina da placa de Petri e separe a lamínula firmemente aderida do bloco de agar utilizando fórceps estéril. Fixar os blocos de agar em 3% de glutaraldeído em PBS durante a noite a 4 ° c.
  2. Desidrata as amostras passando por uma série de etanol: 10%, 25%, 50%, 75% e 90% com 15 min por mudança. Processe as amostras para a desidratação final com duas mudanças no etanol 100% com duração de 30 minutos cada para garantir a saturação completa.
  3. Secagem de ponto crítico: Coloque amostras desidratadas na câmara do aparelho de CPD. Sele e fixe a câmara abrindo as válvulas para permitir o líquido CO2 dentro e o ethanol do respiradouro para fora, até que o líquido co2 Encha completamente a câmara.
    1. Sele e aqueça a câmara lentamente para conseguir um ponto crítico quando a pressão da câmara excede 1000 libras por polegada quadrada e a temperatura excede 31 ° c, a fase do líquido e do gás de CO2 está no equilíbrio. Drene lentamente o CO2 da câmara e a amostra como o gás para evitar efeitos da tensão de superfície.
  4. Realize a montagem, chapeamento de ouro e imagem os espécimes seguindo as etapas especificadas nas etapas 1.11-1.13.
  5. Realize análises comparativas quimicamente secando os espécimes da etapa 3,2 usando HMDS seguindo as etapas 1.9-1.13.

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Representative Results

Figura 1 mostra análise micrográfica eletrônica de varredura de embriões de tartaruga pintada (Chrysemys picta) . Ovos de tartaruga pintados coletados e incubados em um meio de cama, montados em esboços de alumínio após secagem química, foram utilizados para a imagem SEM (Figura 1a-E). Uma vista lateral de um embrião do estágio 12 mostra as estruturas craniofacial; a proeminência Maxillary estende além do mandibular e limita um poço nasal bem marcado medially; cinco arcos faríngeos também foram observados (Figura 1F). Os mesodérmicos recém-formados na região posterior da cauda do embrião são facilmente contáveis em comparação com os mesodérmicos do corpo segmentado. Os botões do forelimb aparecem mais por muito tempo comparados aos botões e aos pontos traseiros do membro mais caudalmente do que ventrally. Um crescimento bem definido de uma crista de carapaça é observado ao longo de toda a região do flanco intermembro do embrião do estágio 15 (Figura 1G. No estágio 18, as tartarugas pintadas possuem um focinho de projeção curto e fraco. O bico inferior repousa dentro da mandíbula superior e é ligeiramente virado para cima com um gancho terminal que se encaixa no entalhe central do bico superior (Figura 1H). A mandíbula superior das tartarugas pintadas mostra uma aparência entalada formando uma ponta distal em forma de U-V medial com uma pequena cúspide em cada lado, um pequeno dente de ovo começa a se formar na ponta da mandíbula superior. Os botões do membro que apareceram mais por muito tempo durante estágios mais adiantados formam uma pá-como a estrutura durante estágios 13-14 com placa digital indicada vagamente. O mesênquima do membro demarcado pelo cume ectodérmica apical é visto ao longo das margens do anterior-posterior (Figura 1I-J).

A Figura 2 mostra a análise ultraestrutural de Chrysemys picta casca e membrana do escudo usando a imagem latente de sem. Cascas de tartaruga pintadas foram obtidas como descrito acima e submetidas à secagem de ar após lavagem com água destilada dupla (Figura 2A, B). Cascas de ovo montadas em esboços de alumínio com fita de carbono dupla face (Figura 2C) foram fotografadas utilizando sem. Uma vista lateral do escudo mostrou a camada calcarosa exterior do casca que une firmemente à membrana filamentosos interna do escudo (Figura 2D). A superfície exterior da casca de ovo consiste em unidades mineralizadas bem distinguidas do escudo, feitas de nodules globular/esféricos arranjados nos grupos e entre unidades adjacentes da casca uma concentração de depressões arredondadas pequenas ou de poros de vários tamanhos era observada (Figura 2E). Os nódulos de cada grupo de unidades de concha encontram-se em uma junção de conexão, o ponto central (Figura 2F). A superfície exterior foi descascada manualmente usando fórceps para observar a superfície da membrana do escudo. Foram observadas fileiras de placas centrais que fornecem o ponto de fixação entre as unidades de casca e a membrana fibrosa multicamada subjacente (Figura 2G).

A Figura 3 mostra a caracterização morfológica do isolado fúngico de ascomicetes de culturas de slides observadas com a utilização de sem imagem. Esquema de configuração da cultura de slides estabelecido (Figura 3a) mostrando crescimento fúngico no bloqueio de ágar no prazo de dois dias após a inoculação. Colônias crescendo rapidamente com o micélio aéreo de cor branca a creme (Figura 3B). A imagem de SEM que segue a secagem do ponto crítico e o revestimento do Sputter de fatias do ágar revelaram Hyphae fungosos, conídios curvados, e arroz como esporos. Os conidióforos foram vistos surgindo lateralmente a partir das hifas aéreas septadas (Figura 3C). Macroconidia produzidos em conidióforos mais curtos e ramificados são moderadamente curvados, com células basais de curto, sem corte apical e indistintamente pedicelladas, principalmente septadas (Figura 3D).

A Figura 4 mostra os resultados comparativos para o processamento de espécimes similares utilizando técnicas alternativas. As cabeças de imersão de embriões do estágio 15 em HMDS e a secagem pela evaporação gradual mostram estruturas craniofacial bem preservadas, quase nenhum encolhimento ou distorção são vistos com épocas prolongadas da evaporação lenta de HMDS (Figura 4A). Os embriões pós-fixados com tetroxida de ósmio não mostraram diferença distinta na qualidade da imagem, com exceção do encolhimento ligeiro do tecido em comparação com o processamento lento da HMDS (Figura 4B). Os embriões de secagem removendo HMDS parcialmente ou completamente permitindo a evaporação rápida resultam na distorção estrutural e no encolhimento (Figura 4C), visto que a evaporação lenta resolveu estruturas de superfície excelentes de um embrião similarmente encenado ( Figura 4 A ).os artefatos de secagem foram observados nos embriões tratados com a técnica de CPD causando encolhimento extensivo e destruição de tecido (Figura 4D, e). As fatias de agar de culturas de slides mostram Secagem incompleta do isolado fúngico com tratamento com HMDS em comparação ao CPD (Figura F). A secagem completa é conseguida com o tratamento do CPD de fatias do ágar com um espécime bem secado, branco que mostra características estruturais de alta resolução intactas de hifas e de esporos fungosos (Figura 4g-g '). Os blocos do agar com culturas fungosas aparecem encolhidos e amarelos na cor que fazem os não apropriados para a imagem latente de SEM (Figura 4h-h ').

Figure 1
Figura 1 : Micrografias de elétrons de digitalização Chrysemys picta embriões preparados por secagem química. (A) Chrysemys picta, aninhamento durante a época de reprodução em Rice Creek Field Station, Oswego, NY. (B) ninho bem construído de fora. (C) solo de superfície retirado com o cuidado à exposição os ovos colocados. D) ovos colocados na câmara de incubação com meio de cama. (E) embriões de montagem em esboços de alumínio após secagem química, E4 mostrando o embrião revestido de Sputter. (F) vista lateral do embrião do estágio 12 que mostra estruturas faciais, botões do membro e somites. (G) o cume bem definido da carapaça e os botões em forma de pá do membro são vistos na fase 15. (H) estruturas craniofaciais do embrião do estágio 18 mostrando mandíbula superior e inferior, nota um pequeno dente de ovo formado na ponta do bico superior. (I) visão dorsal do membro torácico direito no estádio 13-14 e uma visão de close-up da AER (J) no limite dorsal-ventral. Barras de escala: F-H, 500 μm; I, 100 μm, e J, 10 μm. chaves: MB, midbrain; NP, poço nasal; MXP, proeminência Maxillary; PA, arcos faríngea; h, coração; FL, forelimb; s, somite; HL, membro traseiro; t, ponta da cauda; CR, cume padrão; et, dente do ovo; OC, cavidade oral; e, olho; UJ, maxila superior; LJ , mandíbula inferior; m, mesenchyme, AER, cume ectodérmico apical. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Análises ultrastructural da casca de ovo secada e da membrana do escudo de ovos pintados da tartaruga. (A) após a fixação os embriões, as cascas de ovo foram lavadas abundantemente em água destilada para remover a gema e a albumina. (B) limpa cascas de ovo foram secas ao ar pelo menos durante a noite. (C) montagem de uma casca de ovo sobre os esboços de alumínio. (D) vista radial do fragmento do escudo que mostra a camada calcarosa exterior e a membrana interna do escudo. (E) a camada calcária externa mostra unidades de casca globular (Su) dispostas em grupos e poros observados entre essas unidades (asteriscos). (F) magnificada vista de um nódulo mostrando o ponto central (c) entre as unidades de casca. (G) a remoção da camada calcária mostra a superfície exterior da membrana do escudo com as depressões deixadas quebradas das unidades da casca. Barras de escala: E, 100 μm; F, 10 μm, e G, 20 μm. por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Preparando a cultura fúngica para imagens sem. (A) diagrama esquemático para mostrar a configuração da cultura do slide. (B) colônias fúngicas coloridas brancas observadas no bloco de ágar após dois dias de incubação a 30 ° c. (C) imagem sem mostrando uma seção de micélio de Fusarium solani, asteriscos negros marcando os macroconídios em esporodochia, uma seta apontando para phialide, e pontas de flechas direcionadas para microconídios, barra de escala, 10 μm. (D) imagem ampliada de chlamydosporos septados, barra de escala 5 μm. chaves: AB, bloco de agar; cs, COVERSLIP; f, cultura fúngica. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 : Análise comparativa de técnicas alternativas para processar espécimes similares. (A) vista frontal da cabeça de tartaruga pintada seca com evaporação lenta de HMDS (a), apósApós-fixação com Tetroxida de ósmio (B), rápida evaporação rápido de HMDS (C) e CPD (D-e). Incluir uma etapa da borne-fixação usando o tetróxido do ósmio não mostra nenhuma diferença visível na qualidade de imagem comparada ao tratamento de HMDS sem borne-fixação. As deformações são observadas após a rápida evaporação da HMDS, enquanto a secagem gradual com evaporação lenta proporciona uma melhor estrutura superficial. Diferentes graus de encolhimento e estruturas colapsadas são observados nas regiões do cérebro, olhos e proeminências faciais em embriões tratados com DPC.F) montagem de culturas de lâminas processadas com HMDS (1), CPD (2) e amostra tratada com CPD revestido de Sputter (3) Esboços de alumínio. (g-g ') Termine a secagem considerada como a fatia colorida branca intacta do agar com o inocular fungoso conseguido pelo CPD que preserva estruturas do micélio e dos esporos fungosos de solani de Fusarium. (h-h ') Secagem inadequada da cultura da corrediça, do encolhimento e da integridade estrutural danificada vista com técnica da preservação de HMDS. Barras de escala: A-E, 500 μm; G-H, 2 mm, e G'-H ', 20 μm. chaves: et, dente de ovo; OC, cavidade oral; e, olho; UJ, maxilar superior; LJ, mandíbula inferior; asteriscos pretos, macroconídios em esporodochia; seta, phialide; e ARROWHEADS, microconidia. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Em nosso estudo, diferentes agentes de fixação, métodos de desidratação e secagem foram testados para preparar três diferentes amostras biológicas delicadas para a imagem SEM: embriões, cascas de ovos e culturas fúngicas. O SEM é comumente usado para análise de superfície, de modo que a penetração fixativa é menos preocupante, mas deve ser entendido que estruturas internas mal fixas causarão encolhimento interno ou/e estruturas superficiais colapsadas. O tempo prolongado da fixação deve igualmente ser considerado para amostras de tecido maiores, substituindo a solução fixador algumas vezes dependendo da duração da fixação. Devido à interação ativa entre o fixador e o tecido, as propriedades osmóticas das células mudariam consideravelmente. Os fluidos teciduais diluiriam o fixador e, portanto, um efeito aldeído contribuindo para a osmolaridade global pode ser negligenciado na medida em que os efeitos no volume celular estejam preocupados. Também, o formaldehyde penetraria mais rapidamente nos tecidos e é mais eficaz como o cross-linker comparado ao glutaraldehyde. Uma mistura de formaldeído-glutaraldeído tamponado também foi relatada para a fixação de uma grande variedade de tecidos, embora para monocamadas e suspensões celulares as soluções diluídas fossem mais adequadas para a fixação15,16. No entanto, as soluções diluídas também são hipertónicas, portanto, os aldeídos não são eles próprios osmoticamente ativos. Para amostras delicadas utilizadas neste estudo, a PBS em pH 7,4 foi utilizada como veículo para os agentes de fixação, pois os buffers de fosfato são mais semelhantes aos ambientes citoplasmáticos da maioria das amostras biológicas. Além disso, a osmolaridade é identificada como estando dentro da faixa fisiológica exigida para a amostra, enquanto a PBS atua como um veículo para o agente de fixação. A pós-fixação com tetroxida de ósmio é frequentemente recomendada para várias amostras biológicas16,22,42 mas foi eliminada para todas as amostras biológicas utilizadas neste estudo. Amostras sem tetroxida de ósmio produziram imagens nítidas e espécimes fixos com tetroxida de ósmio produziram resultados indistinguíveis (Figura 4A). O tetróxido de ósmio causa a distorção de estruturas do tecido de folha e rende a preservação mais pobre do espécime comparado ao glutaraldeído e à mistura43do formaldehyde, e sugeriu-se que uma acumulação de moléculas do ósmio poderia inibir a infiltração de agentes desidratantes e agentes transitórios utilizados no CPD, e os solventes como HMDS utilizados para a secagem química. O efeito é específico do tecido e excluindo a tetroxida de ósmio não terá qualquer efeito sobre a qualidade da imagem para o tipo de espécimes delicados analisados neste estudo. Para outros tipos de tecidos, o uso de tetroxida de ósmio pode ser eliminado com fixação primária estendida.

Amostras de embriões de tartaruga secas com HMDS mostraram superfícies bem preservadas e menos distorção ou encolhimento em relação ao CPD (Figura 4). O CPD minimiza a chance de distorção na morfologia celular e produção de artefatos devido à tensão superficial zero ou mínima criada durante o processo. Entretanto, o CPD pode causar um risco físico potencial para amostras frágeis delicadas. Em consonância com a nossa observação, a HMDS produziu imagens de qualidade semelhante ou superior, minimizando a tensão superficial causada devido à secagem com base em estudos anteriores publicados44,45,46,47. Comparado ao tratamento do CPD, HMDS preservou detalhes estruturais do malha orgânico excelentemente em bivalves gravados e em escudos do Barnacle48 e forneceu a alta resolução das características estruturais da organização interna complexa do mermitídeos nematóides49 e tecidos internos do inseto28. Os artefatos da placa de secagem foram observados em quantidades elevadas nos espécimes preparados pela técnica de CPD em comparação com a técnica de HMDS. O blebs da membrana e os artefatos da pelota foram aumentados em pilhas cervicais preparadas usando a técnica50do CPD. HMDS reage com água para produzir hexametildisilazano e amônia, ambos os quais evaporam do objeto. HMDS é comumente usado em cromatografia gasosa para criar éteres de sililo de compostos como açúcares, aminoácidos, álcoois, e inúmeros outros compostos. Não se sabe se HMDS reage com alguns destes compostos nos tecidos. A HMDS pode vincular as proteínas e enduçar o tecido durante o processo de secagem28, embora a razão exata pela qual a HMDS forneça melhor preservação dos embriões não possa ser explicada, exceto pela especificidade do tecido. Baseado nos resultados de nossa investigação, o CPD causou o encolhimento extensivo comparado a HMDS, e é muito mais apropriado para processar tecidos embrionário, especial para analisar a estrutura de superfície para embriões encenados adiantados. O mecanismo pelo qual a HMDS atua na secagem tecidual não foi elucidado, embora a secagem lenta com evaporação gradual em ambientes anidrosos absolutos possa ser uma razão para a obtenção de uma excelente estrutura superficial dos animais.

Pequenos pedaços de blocos de agar com colônias fúngicas de culturas de slides previamente estabelecidas foram utilizados neste estudo para evitar problemas com a manutenção do fluffiness original do tapete micelial. A secagem de CPD de pedaços de ágar com colônias fúngicas resultou em um efeito de lavagem, enquanto mudanças nos fixativos, buffers e etanol foram encontradas como uma melhor escolha superando as dificuldades com a secagem por congelamento. HMDS que funciona bem para embriões de todas as etapas não foi capaz de resolver culturas fúngicas, enquanto a secagem do ar com HMDS representava um problema significativo: curling e perdendo a rigidez estrutural. Enquanto CPD funciona bem para culturas fúngicas, que induziu danos imediatos aos embriões, especialmente em estágios iniciais em desenvolvimento, causando encolhimento na superfície. Não foram observados artefatos de carga ou secagem quando HMDS e CPD foram utilizados para embriões e culturas fúngicas, respectivamente. Para o tecido rígido como a casca de ovo das tartarugas, nenhum processamento especial é exigido à exceção da lavagem e do ar que secam na temperatura ambiente antes da montagem para a imagem latente.

Independentemente do método de preparação, etapas graduais de gradiente de etanol devem ser usadas para reduzir o potencial de secagem de artefatos. Inicialmente, as amostras de HMDS e CPD foram encontradas para ter artefatos de superfície com encolhimento seguindo os protocolos de desidratação e secagem disponíveis na literatura. Após uma série de padronizações, determinamos que os artefatos foram o resultado da desidratação do álcool. É crítico usar um processo lento da desidratação usando uns aumentos mais graduais do ethanol durante a desidratação. Além disso, a duração de cada iteração deve ser maior para os embriões em comparação com culturas fúngicas. Além disso, um passo adicional em 100% etanol garantiu completa saturação uniforme. HMDS pode ser removido completamente ou parcialmente para permitir a secagem do ar das amostras, mas a exposição prolongada ao HMDS e a secagem gradual do ar pela evaporação foram encontradas para ser eficazes para que os embriões evitem o rompimento (Figura 4a, C) causado pela grande superfície tensão como observado para o acessório microbiano da pilha51. Os espécimes de imersão em HMDS e a secagem lenta durante a noite revelaram uma estrutura de superfície excelente em espécies de Daphnia52 sugerindo que os tecidos delicados macios pudessem se beneficiar do processo de secagem lenta. A qualidade de imagem aceitável para embriões pode ser obtida com secagem química lenta aumentando gradualmente a concentração de HMDS para etanol após a desidratação.

Todas as amostras foram montadas em esboços de alumínio usando uma fita dupla face de carbono para fornecer uma superfície condutora, uma fina camada de esmalte incolor também poderia ser usado se a mesma amostra precisa ser imaged em uma orientação diferente. As amostras podem facilmente ser removidas dos stubs quando o lustrador de prego é usado na superfície do stub e posicionar as amostras em planos alternativos é possível comparado a usar a fita dobro-tomada o partido do carbono. Como as amostras são não condutoras, é necessário Sputter uma fina camada de metal sobre as amostras para aumentar a condutância. Um alvo do ouro foi usado neste estudo durante o revestimento do Sputter, e o ouro-paládio igualmente rende resultados similares que evitam efeitos carregando. A tensão correta do feixe é dependente da amostra, para espécimes levemente revestidos, a imagem latente com uma emissão de campo SEM em 2-5 quilovolts fornecerá uma boa definição de estruturas de superfície. Para tecidos com revestimento adequado, 5 kV geralmente fornece melhor sinal sem maior penetração de feixe. Para espécimes que não têm profundidade e são revestidos com ouro sozinho, a imagem em uma tensão maior (10 kV) permitiu melhor visualização da topografia da superfície.

A preparação de tecidos delicados para SEM apresenta desafios distintos, e uma série de técnicas de preparação de amostras pode ser usada para superar e minimizar artefatos de imagem. Nós fornecemos métodos detalhados para processar três amostras biológicas delicadas diferentes do tecido, para a imagem latente de SEM: embriões, cascas de ovo rígidas, e culturas fungosas. Em nossa investigação, alterações sutis aos métodos populares disponíveis em estudos publicados anteriormente foram feitas, e identificamos os métodos de desidratação e secagem mais adequados específicos para cada tipo de tecido delicado. Estes protocolos podem ser adaptados para obter qualidade de imagem SEM aceitável de amostras biológicas semelhantes.

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Disclosures

Os autores não têm nada a divulgar

Acknowledgments

Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Daniel Baldassarre, SUNY Oswego para discussões úteis e comentários sobre o manuscrito. Este estudo foi apoiado por subsídios associados Rice Creek, Oswego; Concessões do desafio SUNY Oswego e concessões pequenas da Fundação Nacional da ciência (NSF) a PGL e a JG.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Fischer Scientific S25127A for slide cultures
Aluminum pin stub Tedpella 16111 12.7 mm x 8 mm
BD Difco Dehydrated Culture Media: Potato Dextrose Agar BD 213400 DF0013-17-6 Media for isolation and cultivation of Fungi, yeast and molds
Chloramphenicol Fischer BioReagents BP904-100 Antibiotic for media
Coarse Vermiculite Greenhouse Megastore SO-VER-12 bedding medium
Clear 12- well plate Corning 07-201-589 for fixing embryo
Coverslips Fischer Scientific S17525B for slide culture
Critical Point Dryer Quorum CPD EMS850 critical point drying
Culture dishes Fischer Scientific 08 747B DISH PETRI 100X10MM 12/PK
Ethanol Fischer Scientific A406P 4 dehydration agent
Forceps- Aquarius Tweezers Tedpella 5804 style 4, length 108mm, widh x thickness 0.017 x 0.17 mm
Glutaraldehyde Fischer Scientific G151-1 fixative
Gold target for sputter coater DENTON VACUUM TAR001-0158 Gold Target, 2.375″ D X .002″
Hexamethyldisilazana Fischer Scientific C19479-5000 chemical drying agent
Kim wipes Kimtech S-8115 cleaning
Microscope slides Thermo Scientific 67-762-16 for slide culture
Microscopy Scissors Tedpella 1327 Double pointed, stainless steel, 100 mm L (3-5/8").
Micro-scissors Tedpella 1346 Vannas-type, straight, 80mm L
Moria Perforated Embryo Spoon Fine Science Tools 10370-17 Length 14.5 cm, tip diameter 20 mm, spoon depth 5 mm
Netwell Inserts Corning 0330B09 15 mm Inserts with 74 µm Mesh Size Polyester Membrane act as handy carriers during specimen processing into different solvents
Paraformaldehyde Fischer Scientific T353 500 fixative
Peat moss Walmart- Miracle Gro 551705263 bedding medium
PELCO tabs double stick carbon conductive tape Tedpella 5000 12 mm OD
Sputter coater DENTON VACUUM DESK V thin metal coating
SEM JEOL USA JEOL JSM 6610LV scanning electron scope electron microscopy

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References

  1. Packard, M. J. Ultrastructural Morphology of the Shell and Shell Membrane of Eggs of Common Snapping Turtles (Chelydra serpentina). Journal of Morphology. 165 (2), 187-204 (1980).
  2. Solomon, S. E., Watt, J. M. The structure of the eggshell of the leatherback turtle (Dermochelys coriacea). Animal Technology. 36 (1), 19-27 (1985).
  3. Sahoo, G., Mohapatra, B. K., Sahoo, R. K., Mohanty-Hejmadi, P. Ultrastructure and Characteristics of Eggshells of the Olive Ridley Turtle (Lepidochelys olivacea) from Gahirmatha, India. Acta Anatomica. 156, 261-267 (1996).
  4. Mitrus, S. The calcareous layer eggshell of the turtle Emys Orbicularis: Ultrastructure and composition. Italian Journal of Zoology. 70 (1), 13-16 (2003).
  5. Chang, Y., Chen, P. Y. Hierarchical structure and mechanical properties of snake (Naja atra) and turtle (Ocadia sinensis) eggshells. Acta Biomaterialia. 31, 33-49 (2016).
  6. Samson, R. A., Stalpers, J. A., Verkerke, W. A simplified technique to prepare fungal specimens for scanning electron microscopy. Cytobios. 24, 7-11 (1979).
  7. Kaminskyj, S. G. W., Dahms, T. E. S. High spatial resolution surface imaging and analysis of fungal cells using SEM and AFM. Micron. 39, 349-361 (2008).
  8. Wisse, E., et al. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World Journal of Gastroenterology. 16 (23), 2851-2866 (2010).
  9. Braet, F., De Zanger, R., Wisse, E. Drying cells for SEM, AFM and TEM by hexamethyldisilazane: a study on hepatic endothelial cells. Journal of Microscopy. 186 (1), 84-87 (1997).
  10. Echlin, P. Handbook of Sample Preparation for Scanning Electron Microscopy and X-Ray Microanalysis. , UK: Springer. (2009).
  11. Bell, P. B., Safiejko-Mroczka, B. Preparing whole mounts of biological specimens for imaging macromolecular structures by light and electron microscopy. International Journal of Imaging System Technology. 8 (3), 225-239 (1997).
  12. Bahr, G. F., Bloom, G., Friberg, U. Volume changes of tissues in physiological fluids during fixation in osmium tetroxide or formaldehyde and during subsequent treatment. Experimental Cell Research. 12 (2), 342-355 (1957).
  13. Baker, J. R. Principles of biological microtechnique; a study of fixation and dyeing. , Wiley. London Methuen; New York. (1958).
  14. Glauert, A. M. Practical methods in electron microscopy. Journal of Microscopy. 3, 5-65 (1974).
  15. Hayst, M. A. Biological Applications. Principles and techniques of electron microscopy, 4th ed. , Cambridge University Press. 13-105 (1970).
  16. Pathan, A. K., Bond, J., Gaskin, R. E. Sample preparation for SEM of plant surfaces. Materials Today. 12 (1), 32-43 (2010).
  17. Hayat, M. A. Electron microscopy: Biological applications. 4th ed. , Cambridge University Press. New York. (2000).
  18. Hayat, M. A. Fixation for electron microscopy. , Academic Press. New York. (1981).
  19. Karnovsky, M. J. A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolarity for use in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 27, 137-138 (1965).
  20. McDowell, E. M., Trump, B. F. Histologic fixatives suitable for diagnostic light and electron microscopy. Archives Pathology and Laboratory Medicine. 100, 405 (1976).
  21. Wisse, E., et al. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World Journal of Gastroenterology. 16 (23), 2851-2866 (2010).
  22. Fischer, E. R., Hnasen, B. T., Nair, V., Hoyt, F. H., Dorward, D. W. Scanning Electron Microscopy. Current Protocols in Microbiology. , Unit2B.2 (2012).
  23. Magalhaes, M., et al. Embryonic development of the Giant South American River Turtle, Podocnemis expansa (Testudines: Podocnemididae). Zoomorphology. 136 (4), 523-537 (2017).
  24. Hopwood, D. Fixatives and fixation: a review. The Histochemistry Journal. 1 (4), 323-360 (1969).
  25. Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde fixation. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 33 (8), 845-853 (1985).
  26. Bell, P. B., Rundquist, I., Svensson, I., Collins, V. P. Formaldehyde sensitivity of a GFAP epitope, removed by extraction of the cytoskeleton with high salt. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 35 (12), 1375-1380 (1987).
  27. Hayat, M. A. Glutaraldehyde: Role in electron microscopy. Micron and Microscopica Acta. 17 (2), 115-135 (1986).
  28. Nation, J. L. A new method using hexamethyldisilazane for preparation of soft insect tissues for scanning electron microscope. Stain Technology. 58 (6), 347-351 (1983).
  29. Bray, D. F., Bagu, J., Koegler, P. Comparison of hexamethyldisilazane (HMDS), Peldri II, and critical point drying methods for scanning electron microscopy of biological specimens. Microscopy Research Technique. 26 (6), 489-495 (1993).
  30. Barre, C., O'Neil, D., Bricelj, V. M. Preparation of large bivalve specimens for scanning electron microscopy using Hexamethyldisilazane (HMDS). Journal of Shellfish Research. 25 (2), 639-641 (2006).
  31. Lee, J. T. Y., Chow, K. L. SEM sample preparation for cells on 3D scaffolds by freeze-drying and HMDS. SCANNING. 33, 1-14 (2011).
  32. Araujo, J. C., et al. Comparison of hexamethyldisilazane and critical point drying treatments for SEM analysis of anaerobic biofilms and granular sludge. Journal of Electron Microscopy. 52, 429-433 (2003).
  33. Boyde, A., Bailey, E., Jones, S. J., Tamarin, A. Dimensional changes during specimen preparation for scanning electron microscopy. SEM/IITRI. 10, 507-518 (1977).
  34. Read, N. D., Porter, R., Beckett, A. A comparison of preparative techniques for the examination of the external morphology of fungal material with the scanning electron microscope. Canadian Journal of Botany. 61 (8), 2059-2078 (1983).
  35. Melo, I. S., Faull, J. L. Scanning electron microscopy of conidia of Thichoderma stromaticum, a biocontrol agent of witches broom disease of cocoa. Brazilian Journal of Microbiology. 35, 330-332 (2004).
  36. Pathan, A. K., Bond, J., Gaskin, R. E. Sample preparation for scanning electron microscope of plant surfaces- Horses for courses. Micron. 39, 1049-1061 (2008).
  37. Packard, G. C., Taigen, T. L., Packard, M. J., Boardman, T. J. Water relations of pliable-shelled eggs of common snapping turtle (Chelydra serpentine). Canadian Journal of Zoology. 58, 1404-1411 (1979).
  38. Packard, M. J., Packard, G. C., Boardman, T. J. Structure of eggshells and water relations of reptilian eggs. Herpetologica. 38, 136-155 (1982).
  39. Cordero, G. A., Janzen, F. J. An Enhanced Developmental Staging Table for the Pianted Turtle, Chrysemys picta (Testudines: Emydidae). Journal of Morphology. 275, 442-455 (2014).
  40. Yntema, C. L. Procurement and use of turtle embryos for experimental procedures. The Anatomical Record. 149, 577-586 (1964).
  41. Matsubara, Y., Kuroiwa, A., Suzuki, T. Efficient harvesting methods for early-stage snake and turtle embryos. Development Growth Differentiation. 58, 241-249 (2016).
  42. Moran, P., Coats, B. Biological Sample Preparation for SEM Imaging of Porcine Retina. Microscopy Today. , 10-12 (2012).
  43. Bray, D. F., Bagu, J., Koegler, P. Comparison of hexamethyldisilazane (HMDS), Peldri II, and critical point drying methods for scanning electron microscopy of biological specimens. Microscopy Research Technique. 26, 489-495 (1993).
  44. Botes, L., Price, B., Waldron, M., Pitcher, G. C. A simple and rapid Scanning Electron Microscope preparative technique for delicate "Gymnodinioid" Dinoflagellates. Microscopy Research Technique. 59, 128-130 (2002).
  45. Dekker, N. P., Lammel, C. J., Brooks, G. F. Scanning Electron Microscopy of piliated Neisseria gonorrhoeae processed with hexamethyldisilazane. Journal of Electron Microscopy. 19, 461-467 (1991).
  46. Fratesi, S., Lynch, F. L., Kirkland, B. L., Brown, L. R. Effects of SEM preparation techniques on the appearance of bacteria and biofilms in the Carter Sandstone. Journal of Sedimentary Research. 74, 858-867 (2004).
  47. Jung, S. W., Joo, H. M., Park, J. S., Lee, J. H. Development of a rapid and effective method for preparing delicate dinoflagellates for scanning electron microscopy. Journal of Applied Phycology. 22, 313-317 (2010).
  48. Bernd, S., Bentley, D. Use of HMDS (hexamethyldisilazane) to dry organic microstructures in etched bivalve mollusk and barnacle shells. Nautilus -Greenville then Sanibel. 116, 25-31 (2002).
  49. Bowen, W. R., Hemann, C. C., Johnson, A. A., Good, B. H. Mermithid Nematodes: SEM Observations Comparing Hexamethyldisilazane and Critical Point Drying Methods. Journal of the Arkansas Academy of Science. 44, Article 6 (1990).
  50. Jusman, J., Ng, S. C., Osman, N. A. A. Investigation of CPD and HMDS Sample Preparation Techniques for Cervical Cells in Devloping Computer-Aided Screening System Based on FE-SEM/EDX. The Scientific World Journal. 289817, 1-11 (2014).
  51. Hazrin-Chong, N. H., Manefield, M. An alternative SEM drying method using hexamethyldisilazane (HMDS) for microbial cell attachment studies on sub-bituminous coal. Journal of Microbiological Methods. 90, 96-99 (2012).
  52. Laforsch, C., Tollrian, R. A new preparation technique of daphnids for Scanning Electron Microscopy using hexamethyldisilazane. Arch Hydrobiology. 149 (4), 587-596 (2000).

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Gibbons, J., Geetha-Loganathan, P. Processing Embryo, Eggshell, and Fungal Culture for Scanning Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (150), e60018, doi:10.3791/60018 (2019).

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