Summary
Здесь мы представляем подробные протоколы обработки для визуализации деликатных образцов тканей с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM). Три различных метода обработки, а именно: hexamethyl disilazana (HMDS) химической сушки, простой сушки воздуха, и критической точки сушки описаны для подготовки жесткой яйцеклетки, эмбрионы на ранних стадиях развития, и грибковые культуры соответственно.
Abstract
Хотя сканирование электронной микроскопии (SEM) широко используется для ультра-структурного анализа различных биологических и небиологических образцов, методы, участвующие в обработке различных биологических образцов, включают в себя уникальные методы. Все обычные практики, описанные в литературе для обработки образцов, по-прежнему находят полезные применения, но незначительные изменения в подготовке образца могут изменить качество изображения, а также ввести артефакты. Таким образом, использование уникальной методики подготовки образца, специфичной для типа анализируемой ткани, необходимо для получения изображения хорошего качества с ультраструктурным разрешением. Основное внимание в этом исследовании заключается в обеспечении оптимальных протоколов подготовки образцов для визуализации эмбрионов, жесткой яичной скорлупы и грибковых культур с использованием SEM. Следующие оптимизации были рекомендованы для получения хороших результатов для трех различных деликатных биологических образцов, исследованных. Использование более мягких фиксаторов, таких как 4% параформальдегида или 3% глютаральдегида с последующим обезвоживанием с помощью этанола серии является обязательным. Грибковый мицелий на агарных блоках, полученных слайд-культурами, дает лучшую ультраструктурную целостность по сравнению с культурами, взятыми непосредственно из агарных пластин. Химическая сушка эмбрионов с помощью HMDS обеспечивает сушки без введения артефактов поверхностного натяжения по сравнению с критической точкой сушки. HMDS предотвращает растрескивание, вызванное усадкой, так как образцы менее хрупки во время сушки. Однако, для грибковой культуры, критической точки сушки обеспечивает приемлемое качество изображения по сравнению с химической сушки. Яичная скорлупа может быть изображена без каких-либо специальных шагов подготовки, за исключением тщательного мытья и сушки воздуха до монтажа. Методологии подготовки были стандартизированы на основе приемлемого качества изображения, полученного с каждым испытанием.
Introduction
Сканирующий электронный микроскоп (SEM) ультраструктурный анализ и внутриклеточные изображения дополняют световую микроскопию для трехмерного профилирования прокариот, растений и животных. Высокое пространственное разрешение SEM делает его одним из самых универсальных и мощных методов, доступных для изучения микроструктурных характеристик образцов на нанометре до микрометрового масштаба. Высохшие образцы решаются композиционных и топографических структур с интенсивной детализацией, что обеспечивает основу для разработки достоверных выводов о функциональных отношениях1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 (г. , 8 , 9. При интерпретации SEM изображения биологических образцов, это большая проблема, чтобы различать родные структуры и артефакты, которые создаются во время обработки. SEM, как правило, работает на очень высоком вакууме, чтобы избежать каких-либо помех от молекул газа, влияющих на первичные, вторичные или backscattered электронных лучей, испускаемых из образца10,11. Кроме того, биологические материалы подвержены радиационному повреждению из-за их неудовлетворительных или непроводящих свойств. Очень важно для образцов, загруженных в SEM, чтобы быть полностью сухим и свободным от каких-либо органических загрязняющих веществ, чтобы устранить любые возможные outgassing в условиях высокой вакуумной среды10,11. Поскольку биологические образцы в основном состоят из воды, необходимы дополнительные методы подготовки для обеспечения сохранения местных структур.
Полученное разрешение основано на оптимизации методов подготовки, характерных для используемых типов образцов и инструментальных параметров. Таким образом, необходимо избегать использования обобщенных шагов обработки для всех типов тканей. Некоторые биологические образцы потребуют менее строгой обработки, чтобы сохранить свою структуру, в то время как для деликатных типов образцов может потребоваться больше времени и заботы, чтобы избежать введения артефактов сушки, таких как усадка и коллапс. Подготовка образцов является важным шагом в визуализации SEM; результаты морфометрических исследований удивительно подвержены влиянию процедур подготовки образцов12,13. Общие шаги подготовки для многих биологических образцов фиксации, обезвоживания и покрытия с металлом, таких как золото, платина или палладий, чтобы преобразовать их поверхности, чтобы быть проводящих для анализа SEM. Характер и сочетание используемых шагов будет варьироваться в зависимости от типа ткани, и конкретные цели исследования. Наращивание заряда, чувствительность к повреждению вакуумного и электронного луча создают проблемы при обработке мягких нежных биологических образцов, что требует дополнительных этапов обработки для сохранения родной структуры объекта. Используя обычные методы, такие как фиксация тетроксида осмия и обезвоживание вызывают усадку и коллапс тонких тканей14,15,16,17. Целью исследования является создание элегантных методологий, полученных путем объединения идей из более ранних исследований с модификациями для подготовки и изображения мягких тонких тканей (например, эмбрионы рептилий, яичная скорлупа окрашенных черепах и грибковых культур).
Выбор подходящего метода фиксации является первым наиболее важным шагом для микроскопического анализа биологических образцов. Фиксация тканей сразу после изоляции от организма имеет важное значение для предотвращения изменения в их морфологии из-за разложения. Эффективный фиксатор должен прекратить клеточные процессы, быстро пронизывающие клетки и сохраняя эффект необратимо, чтобы стабилизировать структуру образца, чтобы выдержать как последующие шаги обработки, так и экспертизу в рамках SEM17 , 18. Хотя некоторые химические и физические методы фиксации известны, химическая фиксация чаще используется для биологических образцов, чтобы избежать каких-либо клеточных изменений из-за автолиза, гнилости и сушки эффектов. Существуют многочисленные фиксаторные химические формулировки, обсуждаемые в литературе17,19,20,21,22,23, фиксаторы, которые работают путем денатурирования и коагуляние биологических макромолекулов, и те, которые фиксируют ковалентно перекрестных связывания макромолекулы. Алкоголь используется в качестве денатурирующим фиксации, которые очень плохо сохраняют ультраструктуру и используются в основном для световой микроскопии и не рекомендуется для электронного микроскопического анализа. Перекрестные фиксаторы, такие как формальдегид, гюйтаральдегид и тетроксид осмия создают межмолекулярные и внутримолекулярные перекрестные связи между макромолекулами в тканях, обеспечивая превосходное сохранение ультраструктур11 ,24,25,26. Биологические образцы чувствительны к температуре. Температура в начале фиксации рекомендуется быть 4 градуса По Цельсию, чтобы уменьшить боковую подвижность мембранных белков, замедлить диффузию межклеточных молекул, а также замедлить скорость фиксации11. Время, необходимое для фиксации тканей во многом зависит от размера образца и скорости, с которой фиксатор рассеивается и реагирует с компонентами образца. Ночная фиксация в 4% параформальдегида или 3% глютаральдегида в PBS при 4 градусах по Цельсию является предпочтительным методом для АНАЛИЗА SEM образцов, используемых в данном исследовании для их последовательных проникающих свойств, которые позволяют более мелкие деликатные образцы, которые будут обработаны17 , 18 лет , 19 лет , 20 , 27. Пост-фиксация шаг с тетроксидом осмия устраняется не только из-за его токсического характера, но и найти для реализации не дополнительное преимущество для улучшения качества изображения для образцов, проанализированных в этом исследовании.
Биологические образцы содержат жидкости, которые мешают операции SEM; следовательно, образцы должны быть высушены, прежде чем вставлять его в камере образца SEM. После того, как обезвоживание обеспечивается, растворитель должен быть удален из ткани без создания артефактов в образцы из-за поверхностного натяжения / сушки. Три различных метода сушки были широко использованы при обработке тканей для SEM изображений: сушка воздуха, критической точки сушки, и заморозить сушки образцов28,29,30,31. Немногие изучения сообщают все 3 метода сушки производя идентичные результаты с образцами ткани животных28,29,30,31. Общая практика, используемая для небольших образцов химического обезвоживания, восходящей концентрации серии алкоголя и гексаметилдизилазан (HMDS), но более крупные образцы сушатсивается с помощью критической точки сушки (CPD) инструмент32. В процессе сушки значительные силы образуются в небольших полости, которые проходят через образец с помощью жидкого/газового интерфейса; это может даже привести к полному коллапсу полых структур33. Любая деформация, возникающая из-за лечения, может быть ошибочно принята как родная структурная особенность образца. Таким образом, обобщенный феномен обработки должен быть ликвидирован и уникальный процесс сушки должен быть стандартизирован для каждого типа ткани, особенно при анализе деликатных образцов ткани.
В нескольких исследованиях, проведенных с использованием различных комбинаций всех вышеупомянутых процессов, мы стандартизировали методы, которые могут быть использованы для SEM анализа трех тонких тканей: эмбрионов рептилий, яичной скорлупы окрашенных черепах и грибковых культур. Биологи и морфологи описывают нормальный и аномальный морфогенез во время развития эмбриона у репрезентативных позвоночных животных. Исследования по пути генной сигнализации зависят от морфологического описания новых структур. Чтобы избежать резких изменений в структуре эмбриона позвоночных во время анализа SEM, мы рекомендуем химическую сушку после обезвоживания. Химическая сушка с использованием HMDS является относительно новейшим методом сушки и преимущества включают относительную быстроту, простота использования, потери стоимости, а также ограниченный опыт и оборудование, необходимые9. CPD является широко используемой техникой сушки с использованием проходного CO2 через образцы при определенной температуре и давлении. Мы определили, что HMDS подходит для сушки мягких тонких тканей и позволяет более крупные образцы для обработки по сравнению с критической точки сушки, что вызвало обширную деформацию эмбриональных тканей. Несколько методов были использованы для подготовки образцов для SEM изображений для изучения морфологических характеристик грибов34. Грибковые образцы обычно фиксируются в тетроксид осмия следуют обезвоживание этанола и критической точки сушки, которые могут обеспечить удовлетворительные результаты, хотя токсическое воздействие тетроксида осмия6,7,35 и потеря грибковых материалов при изменении растворов во время обработки являются явными недостатками. Метод подготовки образца с использованием сушки воздуха без фиксации также практикуется36, но приводит к сморщенным и рухнувшим структурам, и наблюдение за такими образцами может быть легко неправильно истолковано при характеристике вида. Грибковые гифы теряет свою целостность в контакте с жидкостями и даже сушки не может быть достигнуто для восстановления структуры. Из-за этого эффекта, замораживание сушки обычно используется для сушки мягких тканей, как грибковый мицелий. Замораживание сушки хорошо работает для чистых материалов, но наличие каких-либо солей или секреции будет скрывать детали поверхности, которые будут определены только на стадии просмотра SEM. Мы соединили метод культуры слайдов с фиксацией гюмтараальдегида и критической точкой сушки, чтобы получить структурные детали нетронутых грибковых гифи и спор. Хотя сушка CPD вызвала усадку эмбрионов, она привела к хорошо сохранившимся мицелеевым структурам в сочетании с фиксацией глютаральдегида. Яичная скорлупа имеет первостепенное значение для эмбриона овипарных животных, не только действуя в качестве защитного покрытия, но и обеспечивая механическую стабильность, проницаемость газа и воды, а также запас кальция для развивающегося эмбриона. Пресноводные черепахи яичной скорлупы классифицируются как "жесткие" в зависимости от их структуры, и из-за их наличия получили значительное внимание от биологов1,2,3,4 , 5 , 6 , 7 (г. , 37 , 38.
Мы подробно простые методы для легкого изучения яичной скорлупы и оболочки мембраны окрашены черепахи, которые могут быть применены к любой жесткой яичной скорлупы видов. Методологии подготовки оценивались на основе полученного качества изображения и сокращения потенциальных артефактов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашенные черепахи (Chrysemys picta) яйца, используемые в этом исследовании были собраны во время гнездования сезона мая по июнь 2015-16 от Райс-Крик полевой станции, Освего Нью-йорк с разрешения, полученного от Государственного департамента штата Нью-йорк по вопросам окружающей среды Сохранение (DEC).
1. Метод химической сушки для обработки эмбрионов для SEM
- Собирайте яйца черепах с полевых участков во время гнездования. Приготовьте инкубационные камеры заранее, изготовленные из пластиковых коробок с крышками (L x W x H) 6,7 см х 25,4 см х 10,2 см, наполненные постельными принадлежностями среды, приготовленной с влажной смесью вермикулита и торфяного мха (коэффициент 1:1). Сделайте 4-6 отверстий примерно 0,25 см по бокам ящиков и на крышке, чтобы позволить аэрацию.
- Аккуратно удалите почву из гнезда, чтобы раскрыть яйца. Протрите поверхность черепашьих яиц разбавленной настойкой йода (1:25,000) для контроля микробного загрязнения во время инкубации. Поместите сцепления отдельно друг от друга, размер сцепления окрашенной черепахи может варьироваться от 5-9 яиц и разместить максимум 8-9 яиц на коробку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательно обрабатывать яйца во время сбора, вытирая, маркировки и размещения внутри коробки. Позиция и выравнивание яйцеклеток должны быть такими же, как они были заложены, любое движение будет препятствовать развитию эмбриона. - Вручную закапывать яйца наполовину в постельные принадлежности, накрыть крышкой и поместить коробку в инкубатор, установленный при 30 градусах Цельсия. Инкубировать яйца в течение 10-17 дней, чтобы получить эмбриональные этапы 12, 13 и 18 соответственно, используемых в этом исследовании. Добавьте дистиллированную воду, чтобы частично промокнуть среду постельных принадлежностей через день, чтобы избежать обезвоживания и поддерживать уровень влаги для нормального развития эмбрионов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубационные и постановка эмбрионов в соответствии с полной таблице развития опубликованы ранее39. - Исправить эмбрионы, сделав первый разрез на одной стороне псовой яичной скорлупы и желтка мембраны вместе, вертикально к длинной оси с помощью отметил ножницами. Вставьте ножницы в желток тщательно, чтобы избежать резки эмбрионального диска. Теперь вырежьте боковую сторону яйца вдоль длинной оси, а затем вырежьте другую сторону яйца вдоль короткой оси.
- Очистите отсеиваем кусок с эмбрионом сторону вверх с помощью щипки. Вырезать другую боковую сторону яичной скорлупы и поместить вырезанный кусок в фосфат буферный солен (PBS на рН 7,4).
ПРИМЕЧАНИЕ: Яйцо черепахи наполнено очень вязким яичным желтком, а сочная сторона эмбриона придерживается мембраны яичной скорлупы. Мембрана яичной скорлупы вблизи эмбриона меняется с инкубации от полупрозрачного белого до непрозрачного, мелового белого. Это позволяет найти эмбрион в центре длинной оси и рассматриваться как темное кальцифицированное пятно от внешнего40,41. - Используйте стереомикроскоп, чтобы изолировать эмбрионы вместе с желткой мембраны, пилинг их из яичной скорлупы с помощью щипц. Удалите экстраэмбриональные мембраны с помощью щипочек и микро-ножниц. Перенесите эмбрион с помощью ложки эмбриона в свежие PBS в чашке Петри, чтобы вымыть кровь или желток.
- Используйте прозрачные 12-колодцы пластины, чтобы исправить эмбрионы на ночь в 4% параформальдегида в PBS при 4 C или в 2-3% глютаральдегида в PBS. Поместите от одного до трех эмбрионов в каждый колодец в зависимости от размера эмбрионов. Убедитесь в полной инфильтрации (образцы будут выглядеть белыми) для старых эмбрионов, продлевая время фиксации на 2-3 дня. Промыть эмбрионы 3x со свежими PBS в течение 5 минут каждый промыть.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте повреждения поверхности эмбриона с помощью полистирола вставки с полиэфирной сетки днища для 12-колодных пластин для передачи образцов из одного растворителя в другой. - Обезвоживание образцов с использованием ряда концентрации этанола в дистиллированной воде: 30%, 50%, 70%, 80%, 95%, и 100% и лечения образцов для 1 ч в каждом растворе обезвоживания. Повторите шаг со 100% этанолом дважды, чтобы обеспечить полное обезвоживание. Если не использовать сразу, хранить образцы в 70% этанола при -20 градусов по Цельсию в течение более длительного периода.
- Сухие эмбрионы с использованием серии гексаметилдисилазана (HMDS) до 100% концентрации этанола: 1:2, 2:1 и 100%. Оставьте образцы в каждом растворе в течение 20 минут и держите чашку Петри частично покрыта во время процесса.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполнить все шаги, связанные с HMDS в дым капота с необходимым исправным снаряжением защиты, как HMDS является высокотоксичным. - Оставьте эмбрионы в окончательном 100% HMDS решение покрыто полностью или частично в дым капота ночь помощи в испарении HMDS, оставляя образцы готовы для монтажа и распыления покрытия. Обложка блюдо для устранения пыли урегулирования над образцами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ткань будет выглядеть белой после полной сушки и частично высушенные образцы будут выглядеть желтого цвета, оставить эти ткани в дым капот в течение более длительного времени. - Выберите размер алюминиевых заглушек и углеродной клейкой ленты на размер анализируемого образца. Тщательно смонтируйте высушенные образцы на стандартной алюминиевой заглушки (12,7 мм х 8 мм) с помощью двойной углеродной проводящей ленты (12 мм).
- Введите установленные образцы в камеру распылителя пальто, чтобы покрыть образец с очень тонкой пленкой из золота, чтобы устранить эффект заряда. Золотая пластина образцов для 60-120 с на распылите 35 mA.
- Смонтировать заглушки к соответствующим пор-пластинам, надежно закрепляя сеты. Передача держателя образца в или из образец камеры SEM с помощью инструмента обмена образца. Изображение образцов в режиме высокого вакуума с ускоряющимся напряжением пучка 10 кВ и излучение тока 10 ЗА.
ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда носите перчатки при обработке образцов, образцов держателей, монтаж заглушки, и передачи инструментов, чтобы избежать загрязнения жира из рук в систему SEM. - Испытайте альтернативные методы, перечисленные ниже, чтобы сравнить разрешение образцов, полученных из вышеуказанной процедуры.
- Включите пост-фиксацию с 1% тетроксид осмия на 1 ч при комнатной температуре после шага 1.7.
- Частично или полностью удалить HMDS на шаг 1.10 для быстрого быстрого испарения HMDS.
- Обработка эмбрионов после шага 1.8 с использованием критической точки сушки (CPD) путем следующих шагов 3.3-3.4.
2. Подготовка яичной скорлупы для SEM с использованием метода сушки воздуха
- Соберите и инкубировать окрашенные черепахи (Chrysemys picta) яйца, чтобы исправить эмбрионы, как указано в шагах 1.1-1.7.
- Сохранить яичную скорлупу в дистиллированной воде после фиксации эмбриона в шаге 2.1. Чистота яичной скорлупы тщательно замачивания в дистиллированной воде, по крайней мере 1 ч для устранения желтка и альбумина загрязнения.
- Воздушно-сухие яичные скорлупы после мытья на тонких антистатических салфетках в дымка ночь. Храните сушеные яичные скорлупы в чистых бутылках образца, помеченных номером и этапом.
- Гора, распыление пальто и изображение образцов, следуя шагам, указанным в шагах 1.11-1.13.
3. Метод сушки критических точек для подготовки грибковых культур для SEM
- Создание культур слайдов
- Подготовка картофеля dextrose агар (PDA) средства массовой информации для грибковых культур: Добавить 39 г энергии КПК в 1 л дистиллированной воды в колбе Erlenmeyer. Хорошо перемешайте, закрученной колбу и автоклав ат-клавировать средства массовой информации на 121 кв. м в течение 30 мин. Разрешить медиа-решение для охлаждения, а затем добавить антибиотик хлорамфеникол (25 мкг/мл) с помощью стерильного микропипетка.
ПРИМЕЧАНИЕ: После стерилизации, агар решение должно быть горячим, и он не затвердеет в ближайшее время. Охладить его достаточно, чтобы он не будет инактивировать антибиотики. - Смешайте его, закрученной и залить пластины (примерно 10-12 мл средств массовой информации на каждые 10 см Петри блюдо), тщательно укладывать и пусть затвердеть.
- Используйте стерильное лезвие скальпеля, чтобы вырезать небольшие блоки агара около 1/2 до 3'4 дюйма. Удалите и поместите агар блок на чистый стеклянный микроскоп слайд.
- Поместите слайд в чистую чашку Петри, чтобы предотвратить загрязнение и сохранить влагу во время инкубации.
- Поднимите слайд с нижней части чашки Петри с помощью стерильной зубочистки для создания поверхностного напряжения между пластиной и слайд, чтобы удалить стеклянный слайд, не нарушая тонкий рост после инкубации.
- Используйте стерильную петлю или иглу для переноса некоторых грибов из образца инокулума на каждую из четырех сторон агарного блока на слайде.
- Поместите чистый покрывало на поверхность агар-блока после прививки. Добавьте несколько капель стерильной дистиллированной воды в чашку Петри вокруг горки, чтобы обеспечить влагу для растущих грибов.
- Печать пластины частично с помощью парафина пленки и инкубировать пластину при 30 градусов по Цельсию в течение соответствующего периода времени (для fusarium видов инкубировать от 36 до 48 ч).
- Удалите слайд из чашки Петри и отделить плотно придерживается крышкой от агар блока с помощью стерильных щипцы. Исправить агар блоков в 3% глютаральдегида в PBS ночь на 4 градусов по Цельсию.
- Подготовка картофеля dextrose агар (PDA) средства массовой информации для грибковых культур: Добавить 39 г энергии КПК в 1 л дистиллированной воды в колбе Erlenmeyer. Хорошо перемешайте, закрученной колбу и автоклав ат-клавировать средства массовой информации на 121 кв. м в течение 30 мин. Разрешить медиа-решение для охлаждения, а затем добавить антибиотик хлорамфеникол (25 мкг/мл) с помощью стерильного микропипетка.
- Обезвождение образцов путем прохождения через этанол серии: 10%, 25%, 50%, 75% и 90% с 15 мин за изменение. Обработайте образцы для окончательного обезвоживания с двумя изменениями в 100% этанола продолжительностью 30 минут каждый, чтобы обеспечить полное насыщение.
- Критические точки сушки: Место обезвоженных образцов в камере аппарата CPD. Печать и охладить камеру, открыв клапаны, чтобы жидкость CO2 в и вентиляции этанола, пока жидкость CO2 полностью заполняет камеру.
- Печать и тепло камеры медленно для достижения критической точки, когда давление камеры превышает 1000 пси и температура превышает 31 градусов по Цельсию, жидкостной и газовой фазы CO2 находится в равновесии. Медленно слейте CO2 из камеры и образца в качестве газа, чтобы избежать последствий поверхностного натяжения.
- Выполняйте монтаж, золотое покрытие и визуализацию образцов, выполняя шаги, указанные в шагах 1.11-1.13.
- Выполняйте сравнительный анализ путем химической сушки образцов со ступени 3.2 с помощью HMDS, выполняя шаги 1.9-1.13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1 показан сканирующий электронный микрографический анализ окрашенных эмбрионов черепах (Chrysemyspicta). Окрашенные яйца черепахи собраны и инкубированы на постельных принадлежностей среды, установленна на алюминиевых заглушках после химической сушки были использованы для SEM изображений(Рисунок 1A-E). Боковой вид эмбриона 12-го этапа показывает черепно-мозговые структуры; верхнечелюстной известности выходит за рамки нижней челюсти и ограничивает хорошо отмечены носовой ямы медиально; пять фарингиальных арок были также отмечены(рисунок 1F). Новообразованные сомиты в задней хвостовой части эмбриона легко подсчитываются по сравнению с сегментированными сомитами тела. Почки forelimb появляются длиннее по сравнению с задними почками конечностей и точками более caudally, чем вентерально. Четко определенный рост карапаса хребта виден вдоль всей межконечной фланговой области эмбриона стадии 15(рисунок 1G. На 18-м этапе расписные черепахи обладают короткой, слабо проецирующей мордой. Нижний клюв лежит в верхней челюсти и слегка перевернут с терминальным крюком, который вписывается в центральную выемку верхнего клюва(рисунок 1H). Верхняя челюсть окрашенных черепах показывает зазубренный внешний вид формирования медиальuобразного U-V формы дистальный кончик с небольшой порог с каждой стороны, крошечный зуб яйцо начинает формироваться на кончике верхней челюсти. Почки конечностей, которые появились дольше на более ранних стадиях образуют весло-подобную структуру на этапах 13-14 с цифровой пластиной смутно указано. Лимб мезенхим, демаркированный акциальным эктодермальным хребтом, виден вдоль передне-задних окраин(рисунок 1I-J).
На рисунке 2 показан ультраструктурный анализ яичной скорлупы Chrysemys picta и оболочки мембраны с использованием SEM-изображений. Окрашенные черепахи яичной скорлупы были получены, как описано выше, и были подвергнуты сушки воздуха после мытья двойной дистиллированной воды(Рисунок 2A,B). Яичная скорлупа, установленная на алюминиевых заглянах с двусторонней углеродной лентой(рисунок 2C) были изображены с помощью SEM. Боковой вид оболочки показал внешний извраженный слой яичной скорлупы, прочно прикрепляющийся к внутренней нитевидной оболочке(рисунок 2D). Внешняя поверхность яичной скорлупы состоит из хорошо отличающихся минерализованных блоков оболочки, изготовленных из шаровых/сферических конкреций, расположенных группами, а между соседними оболочками концентрация небольших округлых впадино или пор различных размеров наблюдается(рисунок 2E). Узелки из каждой группы единиц оболочки встречаются на перекрестке соединения, центральной точки(рисунок 2F). Внешняя поверхность была вручную очищена с помощью щипков для наблюдения за поверхностью оболочки мембраны. Были замечены ряды центральных бляшек, которые обеспечивают точку крепления между оболочкой единиц и лежащей в основе многослойной волокнистой мембраны(рисунок 2G).
На рисунке 3 показана морфологическая характеристика аскомицетового грибкового изолята из слайд-культур, наблюдаемых с помощью SEM-изображений. Схема установки слайд-культуры создана(Рисунок 3А),показывающая грибковый рост на агарном блоке в течение двух дней после прививки. Колонии быстро растут с белым и кремовым цветом воздушного мицелия(Рисунок 3B). SEM изображений после критической точки сушки и распыления покрытие агара ломтиками показали грибковых гиф, изогнутые конидии, и рис, как споры. Conidiophores были замечены возникающих боковой от septate воздушных гиф(Рисунок 3C). Макроконидия производится на короткие, разветвленные conidiophores умеренно изогнутые, с короткими, тупой актика и нечетко pedicellate базальных клеток в основном septate(Рисунок 3D).
На рисунке 4 показаны сравнительные результаты обработки аналогичных образцов с использованием альтернативных методов. Погружение головки эмбрионов 15-й стадии в HMDS и высыхание путем постепенного испарения показывают хорошо сохранившиеся черепно-мозговые структуры, почти не наблюдается усадки или искажения при длительном периоде медленного испарения от HMDS(рисунок 4A). Эмбрионы, установленные с тетродом осмия, не показали различимой разницы в качестве изображения, за исключением небольшого усадки тканей по сравнению с медленной обработкой HMDS(рисунок 4B). Высыхание эмбрионов путем частичного или полного удаления HMDS позволяет быстрое испарение приводит к структурным искажениям и усадке(рисунок 4C),в то время как медленное испарение решило отличные поверхностные структуры аналогично поставленного эмбриона ( Рисунок 4 A). Артефакты сушки были замечены в эмбрионах, обработанных методом CPD, вызывая обширное усадку и разрушение тканей(рисунок 4D,E). Агар ломтики из слайд культур показать неполное сушки грибкового изолята с HMDS лечения по сравнению с CPD (Рисунок F). Полная сушка достигается с ПОМОЩЬю CPD лечения ломтиками агара с хорошо высушенным белым образцом, показывающим нетронутые структурные особенности грибковых гифи и спор(рисунок 4G-G'). Агар блоки с грибковых культур появляются сморщенные и желтый цвет делает их не подходит для SEM изображений(Рисунок 4H-H').
Рисунок 1 : Сканирование электронных микрографов Chrysemys пикта эмбрионов, подготовленных путем химической сушки. (A) Chrysemys пикта, гнездование во время сезона размножения на Райс-Крик полевой станции, Освего, штат Нью-Джерси. (B) Хорошо построенное гнездо снаружи. (C) Поверхностная почва удалена с осторожностью воздействия отложенных яиц. (D) Яйца помещены в инкубационную камеру со средой постельных принадлежностей. (E) Монтаж эмбрионов на алюминиевые заглушки после химической сушки, E4 показаны распыления покрытием эмбриона. (F) Боковой вид эмбриона стадии 12, показывающий структуры лица, почки конечностей и сомиты. (G) Хорошо определенный хребет карапаса и веслообразные почки конечностей видны на стадии 15. (H) Craniofacial структур стадии 18 эмбриона с указанием верхней и нижней челюсти, обратите внимание на небольшой зуб яйцо формируется на кончике верхнего клюва. (Я) Дорсальный вид правой передний конечности на этапе 13-14 и крупным планом зрения AER (J) на дорсал-вентральной границы. Шкала баров: F-H, 500 мкм; I, 100 мкм, и J, 10 мкм. Ключи: mb, midbrain; np, носовая яма; mxp, челюсть; pa, фарингиальные арки; h, сердце; fl, forelimb; s, somite; hl, задняя конечность; t, кончик хвоста; cr, карачальный хребет; et et, яичко зуб; oc, oral cavity; , нижняя челюсть; м, мезенхим, AER, актикальный эктодермальный хребет. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2 : Ультраструктурные анализы высушенной на воздухе яичной скорлупы и оболочки мембраны окрашенных яиц черепахи. (A) После фиксации эмбрионов, яичная скорлупа были тщательно промывают в дистиллированной воде, чтобы удалить желток и альбумин. ( B) Чистые яичные скорлупы были высушены воздухом по крайней мере на ночь. (C) Монтаж яичной скорлупы на алюминиевые заглушки. (D) Радиальный вид оболочки фрагмент, показывающий внешний извращительный слой и внутреннюю мембрану оболочки. (E) Внешний calcareous слой показывает шаровые единицы оболочки (su) расположены в группах и поры видели между этими единицами(звездочки). (F) Увеличенный вид узелса, показывающий центральную точку (c) между единицами оболочки. (G) Удаление извращивленного слоя показывает внешнюю поверхность оболочки мембраны с впадины слева сломанной от оболочки единиц. Шкала баров: E, 100 мкм; F, 10 мкм, и G, 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3 : Подготовка грибковой культуры для визуализации SEM. (A) Схема диаграмма, чтобы показать настройки слайд-культуры. (B) Белые цветные грибковые колонии видели на агар блок после двух дней инкубации при 30 градусах Цельсия. (C) SEM изображение, показывающее раздел мицелия Fusarium solani, черные звездочки маркировки макроконидии в sporodochia, стрелка, указывающая на фиалид, и наконечники стрел, направленных на микроконии, шкала бар, 10 мкм. (D) Увеличенное изображение септатах хламидоспор, шкала бар 5 мкм. Ключи: ab, агар блок; cs, coverslip; f, грибковая культура. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4 : Сравнительный анализ альтернативных методов обработки аналогичных образцов. (A) Фронтальный вид окрашенной головы черепахи сушатся с медленным испарением HMDS (A), после пост-фиксации с тетрооксидом осмия (B), быстрое быстрое испарение HMDS (C), и CPD (D-E). В том числе пост-фиксации шаг с использованием тетроксида осмия не показывают каких-либо видимых различий в качестве изображения по сравнению с HMDS лечения без пост-фиксации. Деформации наблюдаются после быстрого испарения HMDS, в то время как постепенная высыхание с медленным испарением обеспечивает лучшую структуру поверхности. Различные степени усадки и рухнул структур видны в регионах мозга, глаз и лица известность в эмбрионах, обработанных с CPD. (F) Монтаж слайд культур, обработанных с HMDS (1), CPD (2) и распыленной покрытием CPD обработанных образцов (3) на алюминиевые заглушки. (G-G') Полная сушка рассматривается как нетронутый белый цвет агар ломтик с грибковым икосить достигнуты химногу достигается CPD сохранения структур грибковых мицелий и споры Fusarium solani. (H-H') Неадекватная сушка слайд-культуры, усадка и поврежденная структурная целостность, наблюдаемая с помощью метода сохранения HMDS. Шкала баров: A-E, 500 мкм; G-H, 2 мм, и G'-H', 20 мкм. Ключи: et, яичный зуб; oc, полость рта; e, глаз; uj, верхняя челюсть; lj, нижняя челюсть; черные звездочки, макроконидия в спородохии; стрелка, фиалид; и наконечники стрел, микроконидия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В нашем исследовании были протестированы различные агенты фиксации, методы обезвоживания и сушки для подготовки трех различных деликатных биологических образцов для визуализации SEM: эмбрионы, яичные скорлупы и грибковые культуры. SEM обычно используется для анализа поверхности, поэтому фиксативное проникновение менее относительно, но следует понимать, что плохо фиксированные внутренние структуры вызовет внутреннее сокращение или / и рухнул поверхностных структур. Расширенное время фиксации также следует рассматривать для больших образцов тканей, заменив фиксаторное решение несколько раз в зависимости от продолжительности фиксации. Благодаря активному взаимодействию между фиксатором и тканью, осмотические свойства клеток значительно изменятся. Ткань жидкости будет разбавлять фиксатории и, таким образом, эффект альдегида, способствующих общей осмолальности можно пренебречь, насколько влияние на объем клеток обеспокоены. Кроме того, формальдегид будет проникать быстрее в ткани и является более эффективным, как поперечный связующий по сравнению с глютаральдегидом. Буферная смесь формальдегида-глютаральдегида также была зарегистрирована для фиксации широкого спектра тканей, хотя для монослойных и клеточных суспензий разбавленные растворы больше подходили для фиксации15,16. Однако разбавленные растворы также гипертонизируются, поэтому альдегиды сами по себе не осметически активны. Для деликатных образцов, используемых в этом исследовании, PBS на рН 7.4 был использован в качестве средства для фиксации агентов, как фосфатные буферы, как полагают, больше похожи на цитоплазматические среды большинства биологических образцов. Кроме того, осмолялитность определяется как в пределах физиологического диапазона, необходимого для образца в то время как PBS выступает в качестве транспортного средства для крепления агента. Послефиксации с тетроксидом осмия часто рекомендуется для различных биологических образцов16,22,42, но был ликвидирован для всех биологических образцов, используемых в этом исследовании. Образцы без тетроксида осмия дали четкие изображения и образцы, зафиксированные тетроком осмия, дали неотличимые результаты(рисунок 4А). Тетроксид осмия вызывает искажение структур листовой ткани и дает более плохую консервацию образцов по сравнению с гютаральдегидом и формальдегидной смесью43,и было высказано предположение, что накопление молекул осмия может препятствовать инфильтрации обезвоживание агентов и переходных агентов, используемых в CPD, и растворители, как HMDS, используемых для химической сушки. Эффект является тканевым и за исключением тетроксида осмия не будет иметь никакого влияния на качество изображения для типа деликатных образцов, проанализированных в этом исследовании. Для других типов тканей использование тетроксида осмия может быть устранено с расширенной первичной фиксацией.
HMDS сушеных черепахи эмбриона образцы показали хорошо сохранившиеся поверхности, и меньше искажений или усадки по сравнению с CPD(рисунок 4). CPD сводит к минимуму вероятность искажения в морфологии клеток и артефактов производства из-за нулевого или минимального поверхностного натяжения, созданного в процессе. Тем не менее, CPD может вызвать потенциальную физическую опасность для хрупких хрупких образцов. В соответствии с нашими наблюдениями, HMDS дали аналогичные или более высокое качество изображения путем минимизации поверхностного натяжения, вызванного из-за сушки на основе предыдущих исследований, опубликованных44,45,46,47. По сравнению с cpD обработки, HMDS сохранили структурные детали органической сетки отлично в травленных двустворчатых и ракушек48 и при условии высокого разрешения структурных особенностей сложной внутренней организации мермитид нематод49 и внутренние ткани насекомых28. Артефакты сушильной пластины были замечены в больших количествах на образцах, подготовленных методом CPD по сравнению с техникой HMDS. Мембранные пятна и гранулы артефакты были увеличены в шейных клетках, подготовленных с помощью метода CPD50. HMDS реагирует с водой для получения гексаметилдилоксана и аммиака, оба из которых испаряются от объекта. HMDS широко используется в газовой хроматографии для создания силиловых этерсов соединений, таких как сахар, аминокислоты, спирты и множество других соединений. Не известно, если HMDS реагирует с некоторыми из этих соединений в тканях. HMDS может перекрестные белки и ужесточить ткани во время процесса сушки28, хотя точная причина того, что HMDS обеспечивает лучшее сохранение эмбрионов не может быть объяснено, за исключением специфики тканей. Основываясь на результатах нашего исследования, CPD вызвало обширное усадку по сравнению с HMDS, и гораздо больше подходит для обработки эмбриональных тканей, особенно для анализа структуры поверхности для ранних постановочных эмбрионов. Механизм, с помощью которого HMDS работает на сушке тканей не был выяснен, хотя медленное высыхание с постепенным испарением в абсолютной ангидроусовой среде может быть причиной для получения отличной поверхностной структуры животных.
Небольшие кусочки агарблоков с грибковыми колониями из ранее установленных слайд-культур были использованы в этом исследовании, чтобы избежать проблем с поддержанием первоначальной пушистости мицелиального мата. CPD сушки агара куски с грибковых колоний привело к стирке эффект, в то время как изменения в фиксаторы, буферы, и этанол было установлено, что лучший выбор преодоления трудностей с замораживанием сушки. HMDS, который хорошо работает для эмбрионов всех стадий был не в состоянии решить грибковые культуры, в то время как сушки воздуха с HMDS представляет собой значительную проблему: свернувшись калачиком и потери структурной жесткости. В то время как CPD хорошо работает для грибковых культур, это вызвало мгновенное повреждение эмбрионов, особенно на ранних стадиях развития, вызывая усадку на поверхности. При использовании HMDS и CPD для эмбрионов и грибковых культур, соответственно, не наблюдалось никаких артефактов зарядки или сушки. Для жесткой ткани, как яичная скорлупа черепах, никакой специальной обработки не требуется, за исключением стирки и высыхания воздуха при комнатной температуре до монтажа для визуализации.
Независимо от метода приготовления, постепенные шаги градиента этанола должны быть использованы для уменьшения потенциала для сушки артефактов. Первоначально, как HMDS и CPD образцов было установлено, что поверхностные артефакты с усадкой после обезвоживания и сушки протоколов, доступных в литературе. После серии стандартизации, мы определили, что артефакты были результатом обезвоживания алкоголя. Очень важно использовать медленный процесс обезвоживания с использованием более постепенного увеличения этанола во время обезвоживания. Кроме того, продолжительность каждой итерации должна быть больше для эмбрионов по сравнению с грибковыми культурами. Далее дополнительным шагом при 100% этаноле обеспечивается полное равномерное насыщение. HMDS могут быть удалены полностью или частично, чтобы позволить сушки воздуха образцов, но расширенное воздействие HMDS и постепенное высыхание воздуха путем испарения были признаны эффективными для эмбрионов, чтобы избежать нарушения (Рисунок 4A,C) вызванных большой поверхности напряженности, как наблюдается для микробных клеток вложения51. Погружение образцов в HMDS и медленное высыхание в одночасье выявили отличную структуру поверхности в daphnia вида52, предполагая, что мягкие тонкие ткани могут извлечь выгоду из медленного процесса сушки. Приемлемое качество изображения эмбрионов может быть получено при медленной химической сушке путем постепенного увеличения концентрации HMDS к этанолу после обезвоживания.
Все образцы были установлены на алюминиевые заглушки с помощью двусторонней углеродной ленты, чтобы обеспечить проводящих поверхности, тонкий слой бесцветного лака для ногтей также может быть использован, если тот же образец должен быть изображен в другой ориентации. Образцы могут быть легко удалены из заглушки, когда лак для ногтей используется на поверхности заглушки и позиционирование образцов в альтернативных плоскостях возможно по сравнению с использованием двусторонней углеродной ленты. Поскольку образцы непроводящие, необходимо распылить тонкий слой металла на образцах, чтобы увеличить проводимость. Золотая цель была использована в этом исследовании во время распыления покрытия, и золото-палладий также дает аналогичные результаты, избегая зарядки эффектов. Правильное напряжение луча зависит от образца, для образцов с легким покрытием, визуализация с полевым излучением SEM на уровне 2-5 кВ обеспечит хорошее определение поверхностных структур. Для тканей с адекватным покрытием, 5 кВ обычно обеспечивает лучший сигнал без более проникновения луча. Для образцов, которые не имеют глубины и покрыты только золотом, визуализация при более высоком напряжении (10 кВ) позволила лучше визуализировать рельеф поверхности.
Подготовка тонких тканей для SEM создает особые проблемы, и ряд методов подготовки образцов может быть использован для преодоления и минимизации артефактов изображения. Мы предоставляем комплексные методы для обработки трех различных деликатных биологических образцов ткани, для SEM изображений: эмбрионы, жесткие яичной скорлупы, и грибковых культур. В нашем исследовании были сделаны тонкие изменения в популярных методах, доступных из ранее опубликованных исследований, и мы определили наиболее подходящие методы обезвоживания и сушки, характерные для каждого деликатного типа ткани. Эти протоколы можно было бы адаптировать для получения приемлемого качества изображения SEM из аналогичных биологических образцов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Даниэля Балдассарре, SUNY Oswego за полезные обсуждения и комментарии к рукописи. Это исследование было поддержано Райс-Крик Associate Гранты, Освего; Вызов Гранты SUNY Oswego и Национальный научный фонд (NSF) Малые гранты для PGL и JG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Fischer Scientific | S25127A | for slide cultures |
| Aluminum pin stub | Tedpella | 16111 | 12.7 mm x 8 mm |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: Potato Dextrose Agar | BD 213400 | DF0013-17-6 | Media for isolation and cultivation of Fungi, yeast and molds |
| Chloramphenicol | Fischer BioReagents | BP904-100 | Antibiotic for media |
| Coarse Vermiculite | Greenhouse Megastore | SO-VER-12 | bedding medium |
| Clear 12- well plate | Corning | 07-201-589 | for fixing embryo |
| Coverslips | Fischer Scientific | S17525B | for slide culture |
| Critical Point Dryer | Quorum CPD | EMS850 | critical point drying |
| Culture dishes | Fischer Scientific | 08 747B | DISH PETRI 100X10MM 12/PK |
| Ethanol | Fischer Scientific | A406P 4 | dehydration agent |
| Forceps- Aquarius Tweezers | Tedpella | 5804 | style 4, length 108mm, widh x thickness 0.017 x 0.17 mm |
| Glutaraldehyde | Fischer Scientific | G151-1 | fixative |
| Gold target for sputter coater | DENTON VACUUM | TAR001-0158 | Gold Target, 2.375″ D X .002″ |
| Hexamethyldisilazana | Fischer Scientific | C19479-5000 | chemical drying agent |
| Kim wipes | Kimtech | S-8115 | cleaning |
| Microscope slides | Thermo Scientific | 67-762-16 | for slide culture |
| Microscopy Scissors | Tedpella | 1327 | Double pointed, stainless steel, 100 mm L (3-5/8"). |
| Micro-scissors | Tedpella | 1346 | Vannas-type, straight, 80mm L |
| Moria Perforated Embryo Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Length 14.5 cm, tip diameter 20 mm, spoon depth 5 mm |
| Netwell Inserts | Corning | 0330B09 | 15 mm Inserts with 74 µm Mesh Size Polyester Membrane act as handy carriers during specimen processing into different solvents |
| Paraformaldehyde | Fischer Scientific | T353 500 | fixative |
| Peat moss | Walmart- Miracle Gro | 551705263 | bedding medium |
| PELCO tabs double stick carbon conductive tape | Tedpella | 5000 | 12 mm OD |
| Sputter coater | DENTON VACUUM | DESK V | thin metal coating |
| SEM | JEOL USA | JEOL JSM 6610LV scanning electron scope | electron microscopy |
References
- Packard, M. J. Ultrastructural Morphology of the Shell and Shell Membrane of Eggs of Common Snapping Turtles (Chelydra serpentina). Journal of Morphology. 165 (2), 187-204 (1980).
- Solomon, S. E., Watt, J. M. The structure of the eggshell of the leatherback turtle (Dermochelys coriacea). Animal Technology. 36 (1), 19-27 (1985).
- Sahoo, G., Mohapatra, B. K., Sahoo, R. K., Mohanty-Hejmadi, P. Ultrastructure and Characteristics of Eggshells of the Olive Ridley Turtle (Lepidochelys olivacea) from Gahirmatha, India. Acta Anatomica. 156, 261-267 (1996).
- Mitrus, S. The calcareous layer eggshell of the turtle Emys Orbicularis: Ultrastructure and composition. Italian Journal of Zoology. 70 (1), 13-16 (2003).
- Chang, Y., Chen, P. Y. Hierarchical structure and mechanical properties of snake (Naja atra) and turtle (Ocadia sinensis) eggshells. Acta Biomaterialia. 31, 33-49 (2016).
- Samson, R. A., Stalpers, J. A., Verkerke, W. A simplified technique to prepare fungal specimens for scanning electron microscopy. Cytobios. 24, 7-11 (1979).
- Kaminskyj, S. G. W., Dahms, T. E. S. High spatial resolution surface imaging and analysis of fungal cells using SEM and AFM. Micron. 39, 349-361 (2008).
- Wisse, E., et al. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World Journal of Gastroenterology. 16 (23), 2851-2866 (2010).
- Braet, F., De Zanger, R., Wisse, E. Drying cells for SEM, AFM and TEM by hexamethyldisilazane: a study on hepatic endothelial cells. Journal of Microscopy. 186 (1), 84-87 (1997).
- Echlin, P. Handbook of Sample Preparation for Scanning Electron Microscopy and X-Ray Microanalysis. , UK: Springer. (2009).
- Bell, P. B., Safiejko-Mroczka, B. Preparing whole mounts of biological specimens for imaging macromolecular structures by light and electron microscopy. International Journal of Imaging System Technology. 8 (3), 225-239 (1997).
- Bahr, G. F., Bloom, G., Friberg, U. Volume changes of tissues in physiological fluids during fixation in osmium tetroxide or formaldehyde and during subsequent treatment. Experimental Cell Research. 12 (2), 342-355 (1957).
- Baker, J. R. Principles of biological microtechnique; a study of fixation and dyeing. , Wiley. London Methuen; New York. (1958).
- Glauert, A. M. Practical methods in electron microscopy. Journal of Microscopy. 3, 5-65 (1974).
- Hayst, M. A. Biological Applications. Principles and techniques of electron microscopy, 4th ed. , Cambridge University Press. 13-105 (1970).
- Pathan, A. K., Bond, J., Gaskin, R. E. Sample preparation for SEM of plant surfaces. Materials Today. 12 (1), 32-43 (2010).
- Hayat, M. A. Electron microscopy: Biological applications. 4th ed. , Cambridge University Press. New York. (2000).
- Hayat, M. A. Fixation for electron microscopy. , Academic Press. New York. (1981).
- Karnovsky, M. J. A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolarity for use in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 27, 137-138 (1965).
- McDowell, E. M., Trump, B. F. Histologic fixatives suitable for diagnostic light and electron microscopy. Archives Pathology and Laboratory Medicine. 100, 405 (1976).
- Wisse, E., et al. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World Journal of Gastroenterology. 16 (23), 2851-2866 (2010).
- Fischer, E. R., Hnasen, B. T., Nair, V., Hoyt, F. H., Dorward, D. W. Scanning Electron Microscopy. Current Protocols in Microbiology. , Unit2B.2 (2012).
- Magalhaes, M., et al. Embryonic development of the Giant South American River Turtle, Podocnemis expansa (Testudines: Podocnemididae). Zoomorphology. 136 (4), 523-537 (2017).
- Hopwood, D. Fixatives and fixation: a review. The Histochemistry Journal. 1 (4), 323-360 (1969).
- Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde fixation. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 33 (8), 845-853 (1985).
- Bell, P. B., Rundquist, I., Svensson, I., Collins, V. P. Formaldehyde sensitivity of a GFAP epitope, removed by extraction of the cytoskeleton with high salt. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 35 (12), 1375-1380 (1987).
- Hayat, M. A. Glutaraldehyde: Role in electron microscopy. Micron and Microscopica Acta. 17 (2), 115-135 (1986).
- Nation, J. L. A new method using hexamethyldisilazane for preparation of soft insect tissues for scanning electron microscope. Stain Technology. 58 (6), 347-351 (1983).
- Bray, D. F., Bagu, J., Koegler, P. Comparison of hexamethyldisilazane (HMDS), Peldri II, and critical point drying methods for scanning electron microscopy of biological specimens. Microscopy Research Technique. 26 (6), 489-495 (1993).
- Barre, C., O'Neil, D., Bricelj, V. M. Preparation of large bivalve specimens for scanning electron microscopy using Hexamethyldisilazane (HMDS). Journal of Shellfish Research. 25 (2), 639-641 (2006).
- Lee, J. T. Y., Chow, K. L. SEM sample preparation for cells on 3D scaffolds by freeze-drying and HMDS. SCANNING. 33, 1-14 (2011).
- Araujo, J. C., et al. Comparison of hexamethyldisilazane and critical point drying treatments for SEM analysis of anaerobic biofilms and granular sludge. Journal of Electron Microscopy. 52, 429-433 (2003).
- Boyde, A., Bailey, E., Jones, S. J., Tamarin, A. Dimensional changes during specimen preparation for scanning electron microscopy. SEM/IITRI. 10, 507-518 (1977).
- Read, N. D., Porter, R., Beckett, A. A comparison of preparative techniques for the examination of the external morphology of fungal material with the scanning electron microscope. Canadian Journal of Botany. 61 (8), 2059-2078 (1983).
- Melo, I. S., Faull, J. L. Scanning electron microscopy of conidia of Thichoderma stromaticum, a biocontrol agent of witches broom disease of cocoa. Brazilian Journal of Microbiology. 35, 330-332 (2004).
- Pathan, A. K., Bond, J., Gaskin, R. E. Sample preparation for scanning electron microscope of plant surfaces- Horses for courses. Micron. 39, 1049-1061 (2008).
- Packard, G. C., Taigen, T. L., Packard, M. J., Boardman, T. J. Water relations of pliable-shelled eggs of common snapping turtle (Chelydra serpentine). Canadian Journal of Zoology. 58, 1404-1411 (1979).
- Packard, M. J., Packard, G. C., Boardman, T. J. Structure of eggshells and water relations of reptilian eggs. Herpetologica. 38, 136-155 (1982).
- Cordero, G. A., Janzen, F. J. An Enhanced Developmental Staging Table for the Pianted Turtle, Chrysemys picta (Testudines: Emydidae). Journal of Morphology. 275, 442-455 (2014).
- Yntema, C. L. Procurement and use of turtle embryos for experimental procedures. The Anatomical Record. 149, 577-586 (1964).
- Matsubara, Y., Kuroiwa, A., Suzuki, T. Efficient harvesting methods for early-stage snake and turtle embryos. Development Growth Differentiation. 58, 241-249 (2016).
- Moran, P., Coats, B. Biological Sample Preparation for SEM Imaging of Porcine Retina. Microscopy Today. , 10-12 (2012).
- Bray, D. F., Bagu, J., Koegler, P. Comparison of hexamethyldisilazane (HMDS), Peldri II, and critical point drying methods for scanning electron microscopy of biological specimens. Microscopy Research Technique. 26, 489-495 (1993).
- Botes, L., Price, B., Waldron, M., Pitcher, G. C. A simple and rapid Scanning Electron Microscope preparative technique for delicate "Gymnodinioid" Dinoflagellates. Microscopy Research Technique. 59, 128-130 (2002).
- Dekker, N. P., Lammel, C. J., Brooks, G. F. Scanning Electron Microscopy of piliated Neisseria gonorrhoeae processed with hexamethyldisilazane. Journal of Electron Microscopy. 19, 461-467 (1991).
- Fratesi, S., Lynch, F. L., Kirkland, B. L., Brown, L. R. Effects of SEM preparation techniques on the appearance of bacteria and biofilms in the Carter Sandstone. Journal of Sedimentary Research. 74, 858-867 (2004).
- Jung, S. W., Joo, H. M., Park, J. S., Lee, J. H. Development of a rapid and effective method for preparing delicate dinoflagellates for scanning electron microscopy. Journal of Applied Phycology. 22, 313-317 (2010).
- Bernd, S., Bentley, D. Use of HMDS (hexamethyldisilazane) to dry organic microstructures in etched bivalve mollusk and barnacle shells. Nautilus -Greenville then Sanibel. 116, 25-31 (2002).
- Bowen, W. R., Hemann, C. C., Johnson, A. A., Good, B. H. Mermithid Nematodes: SEM Observations Comparing Hexamethyldisilazane and Critical Point Drying Methods. Journal of the Arkansas Academy of Science. 44, Article 6 (1990).
- Jusman, J., Ng, S. C., Osman, N. A. A. Investigation of CPD and HMDS Sample Preparation Techniques for Cervical Cells in Devloping Computer-Aided Screening System Based on FE-SEM/EDX. The Scientific World Journal. 289817, 1-11 (2014).
- Hazrin-Chong, N. H., Manefield, M. An alternative SEM drying method using hexamethyldisilazane (HMDS) for microbial cell attachment studies on sub-bituminous coal. Journal of Microbiological Methods. 90, 96-99 (2012).
- Laforsch, C., Tollrian, R. A new preparation technique of daphnids for Scanning Electron Microscopy using hexamethyldisilazane. Arch Hydrobiology. 149 (4), 587-596 (2000).
