Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

التصميم والتوليف والخصائص الكيميائية الضوئية لمركبات القفص القابلة للنقر

Published: October 15, 2019 doi: 10.3791/60021
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biomolecular Science, Faculty of Science, Toho University

Summary

يتم تقديم بروتوكول لتوليف وقياس الخواص الكيميائية الضوئية للمركبات الحبيسة المعيارية مع الجماليات القابلة للنقر.

Abstract

المركبات قفص تمكين التلاعب الصورة بوساطة من فسيولوجيا الخلية مع القرار المكانية عاليه. ومع ذلك ، فان التنوع الهيكلي المحدود للمجموعات المتاحة حاليا والصعوبات في التعديلات التركيبية دون التضحية بكفاءة التحلل الضوئي هي عقبات امام توسيع ذخيرة المركبات الحبيسة للخلايا الحية التطبيقات. وبما ان التعديل الكيميائي للمجموعات المصورة من نوع الكومارين يعد نهجا واعدا لاعداد المركبات الحبيسة ذات الخواص الفيزيائية والكيميائية المتنوعة ، فاننا نقوم بالإبلاغ عن طريقه لتوليف المركبات الحبيسة القابلة للنقر التي يمكن تعديلها بسهوله مع مختلف الوحدات الوظيفية عن طريق النحاس (I)-تحفيز Huisgen الخلوية. جزيء منصة وحدات يحتوي علي (6-برومو-7-هيدروكسي كومارين-4-yl) الميثيل (Bhc) مجموعه كمجموعه الصورة الشيخوخة ، الذي يسلك كفاءه عاليه التحلل الضوئي مقارنه مع تلك التقليدية 2-نيتروبنزيلز. يتم عرض الإجراءات العامة لاعداد المركبات الحبيسة القابلة للنقر التي تحتوي علي الأمينات والكحوليات والكربوكسيلات. يمكن ادراج خصائص اضافيه مثل القدرة علي الذوبان في الماء واستهداف الخلايا بسهوله في المركبات الحبيسة القابلة للنقر. وعلاوة علي ذلك ، تم قياس الخواص الفيزيائية والكيميائية الضوئية ، بما في ذلك الغلة الكمية لانحلال الضوء ، وتبين انها اعلي من تلك الموجودة في المركبات الموازية في قفص Bhc. ولذلك يمكن اعتبار البروتوكول الموصوف حلا محتملا للافتقار إلى التنوع الهيكلي في المجمعات الحبيسة المتاحة.

Introduction

تم تصميم المركبات قفص الجزيئات الاصطناعية التي الوظائف الاصليه هي ملثمين وقتيا بواسطة المرفقة تساهميا الصور القابلة للازاله حماية المجموعات. ومن المثير للاهتمام ، والمركبات قفص من الجزيئات ذات الصلة بيولوجيا توفر وسيله لا غني عنها للسيطرة المكانية من فسيولوجيا الخلوية1،2،3،4،5 ،6. في 1977 ، ذكر انجلس و Schlaeger استر 2-نيتروالبنزيل من كامب كغشاء نفاذيه ومشتق photolabile من كامب7. في العام التالي ، وذكرت كابلان 1-(2-نيتروف# ينيل) استر ايثيل من ATP (NPE-ATP) وسميت هذا المركب "قفص" ATP8. ومنذ ذلك الحين ، مجموعه من المجموعات الكيميائية القابلة للازاله الضوئية مثل 2-نيتروبنزيلز ، ف-هيدروكسي فيناثلس9، 2-(2-نيتروففنين) اثيلس10،11، 7-نيتروينولين-1-ايلس 12، 13، و (coumarin-4-yl) ميثليس14،15،16 وقد استخدمت لاعداد المركبات قفص.

ومن المتوقع ان يؤدي تركيب المركبات الحبيسة ذات الخصائص الاضافيه المستصوبه مثل نفاذيه الغشاء ، والذوبان في الماء ، وقدره الاستهداف الخلوي إلى تيسير التطبيقات البيولوجية للخلايا. وبما ان الخواص الفيزيائية والكيميائية لهذه الجزيئات تعتمد في المقام الأول علي التركيب الكيميائي لمجموعات الحماية القابلة للازاله الضوئية المستخدمة في اعدادها ، فانه يلزم وجود ذخيرة متنوعة من مجموعات الصور. ومع ذلك ، فان التنوع الهيكلي للمجموعات المتاحة حاليا التي تظهر كفاءه عاليه في التحلل الضوئي محدود. وقد يشكل ذلك عقبه امام زيادة استخدام المركبات الحبيسة.

ولمعالجه هذه المسالة ، تم توسيع ذخيرة مجموعات الصور الفوتوغرافية بواسطة التعديل الكيميائي لمجموعات الحماية القابلة للازاله الضوئية الموجودة أو تصميم الكروم الضوئية الجديدة ذات الخواص الفوتوفيسيكاله الفائقة والكيميائية الضوئية. ومن الامثله علي ذلك نيتروديبنيوبورون (ndbf)17، [3-(4 ، 5-dimethoxy-2-نيتروفيف# ينيل) -2 بوتيل] (دمنبب)18،19، والكالسيوم حساسة 2-نيتروالبنزيل الضوئية20، المستبدلة الكومارينيلميثيل (DEAC45021 , Deadccm22, 7-azetidinyl-4-ميثيلكومارين23, و styryl كومارينس24), مشتقات كستنائي (كستنائي-pan)25, ومشتقات bodipy26,27.

الاضافه إلى ذلك ، قمنا مسبقا بتطوير (6-برومو-7-هيدروكسي كومارين-4-yl) مجموعه الميثيل (bhc) وتوليفها بنجاح مختلف المركبات قفص من الناقلات العصبية28، الرسل الثاني29،30، و [اوليغكليوكليدس]31,32,33 يبدي كبيره واحده-و [2-فوتون] أثاره [كروس-لدس]. إذا كان يمكن تثبيت خصائص اضافيه بسهوله في المجموعات حبس دون المساس بحساسيتها للضوء ، ثم مرجع المركبات قفص يمكن توسيع34،35،36، 37،38،39. ولذلك فقد صممنا مركبات حبيسه مكونه من ثلاثه أجزاء ، وهي مجموعه Bhc كنواه مستجيبة للصور ، ومقابض كيميائية لتركيب وظائف اضافيه ، والجزيئات التي سيتم إخفاؤها40، 41.

وهكذا ، توفر هذه المادة طريقه عمليه لاعداد المركبات في قفص من الجزيئات ذات الصلة بيولوجيا. يصف هذا البروتوكول طرق اعداد منصة قابله للنقر للمجموعات المصورة ، وإدخال وظائف اضافيه لتوسيع ذخيرة المركبات الحبيسة ، وقياس المواد الكيميائية الفيزيائية والضوئية خصائص ، والاستهداف الانتقائي من نوع الخلية لمركب محبوس قابل للنقر لمزيد من التطبيقات الخلوية.

Protocol

1-توليف مجموعه باباتش النمطية لمركبات القفص القابلة للنقر28،41

  1. اعداد (6-برومو-7-هيدروكسيكومارين-4-yl) كلوريد الميثيل (Bhc-CH2Cl)
    1. ضع 4-بروموريسورسينول (9.742 غ ، 51.5 ملليمول) في قارورة ذات قاع دائري 100 مل مجهزه بشريط الركاب.
    2. يضاف المزيجالرابع (98 ٪ ، 30 مل) إلى القارورة ويحرك الخليط ليذوب.
    3. أضافه ايثيل 4-كلورواسيتالوخلات (10 مل ، 74 ملليمول) قطره.
    4. استمر في تحريك الخليط في درجه الحرارة المحيطة لمده 5 أيام.
    5. بشكل منفصل ، مكان مكعبات الثلج المسحوق (~ 200 mL) في قارورة 500 mL Erlenmeyer.
    6. يسكب خليط التفاعل في الثلج ويحرك بقوة لمده 30 دقيقه حتى يتم الحصول علي الترسبات المسحوقة ناعما.
    7. جمع الراسب عن طريق الترشيح فراغ. يغسل الضوء البني الراسب مع الماء خمس مرات.
    8. تجفيف الراسب تحت فراغ بين عشيه وضحيها لإنتاج BhcCH2Cl كمسحوق بني فاتح (13.57 غرام ، 46.9 ملليمول).
  2. اعداد (6-برومو-7-هيدروكسيكومارين-4-yl) الميثانول (BhcCH2OH)
    1. ضع BhcCH2Cl (1.1440 g ، 3.95 ملليمول) و 1 م HCl (300 مل) في قارورة ذات قاع مستديرة 1 لتر مجهزه بمكثف ديروث. يحرك المزيج عند 140 درجه مئوية لمده 5 أيام. بعد هذا الوقت ، وتبريد الخليط إلى درجه الحرارة المحيطة.
    2. أزاله الماء من رد الفعل عن طريق التبخر الدوارة تحت فراغ لإنتاج BhcCH2آوه (1) كمسحوق بني فاتح (1.0359 غرام ، 3.82 ملليمول ، 97 ٪ الغلة).
      ملاحظه: استخدام 250 مل من حمض الهيدروكلوريك 1 م لكل 1 غرام من BhcCH2Cl يعطي نتيجة مرضيه.
  3. اعداد باباتش2آوه (2) عبر رد الفعل مانيش
    1. مكان بارافورمالدهيد (446.4 ملغ ، 14.9 ملليمول) في قارورة 50 mL جولة القاع. أضافه الايثانول لامائية (5 مل) و N-ميثيلبروبارجيليمين (1.25 ml ، 14.8 ملليمول) إلى القارورة.
    2. يحرك المزيج في درجه حرارة المحيط لمده 1 ساعة تحت الغلاف الجوي.
    3. أضف BhcCH2OH (1) (1.367 g, 5.04 ملليمول) إلى القارورة. يسخن الخليط إلى 80 درجه مئوية مع جهاز سخان كتله ، ومواصله أثاره الخليط في 80 درجه مئوية لمده 2 ساعة تحت الجو Ar.
    4. وقف سخان كتله وتبريد خليط التفاعل إلى درجه حرارة الغرفة.
    5. جمع الناتج الضوء البني والأصفر يعجل عن طريق الترشيح فراغ. يغسل الراسب مرتين مع كميه صغيره من الايثانول لامائي (1 مل في كل مره).
    6. أزاله الايثانول الزائد تحت فراغ لإنتاج باباتش2آوه (2) (1.393 g ، 3.96 ملليمول).

2-اعداد المركبات الحبيسة القابلة للنقر

ملاحظه: يمكن تطبيق الإجراءات التالية لاعداد المركبات الأخرى القابلة للنقر التي تحتوي علي الهيدروكسيل والامينيه والمجموعات الوظيفية الكربوكسيل في وقت متاخر.

  1. الاجراء العام 1: اعداد أمين قفص قابل للنقر
    1. ضع باباتش2آوه (2) (709.6 mg, 2.02 ملليمول) و n,n '-الكربوكسيل ديميدازول (CDI, 397.6 ملغ, 2.45 ملليمول) في قارورة 30 مل مستديرة القاع. أضافه الجافة CH2Cl2 (6 مل) ويحرك الحل في درجه الحرارة المحيطة لمده 1 ساعة.
    2. أضافه 4-ثنائي ميثيل امينوبيدودين (4-دماب ، 324.8 ملغ ، 2.66 ملليمول) وتيرتيبوتيل (6-aminohexyl) carbamate (533.1 ملغ ، 2.46 ملليمول). يحرك المحلول عند درجه الحرارة المحيطة لمده 3 ساعات.
    3. أزاله المذيبات وغيرها من المواد المتطايرة باستخدام المبخر دواره تحت فراغ. تنقيه بقايا مباشره باستخدام السيليكا هلام العمود اللوني فلاش.
  2. الإجراءات العامة 2: اعداد الكحول في قفص القابل للنقر
    1. مكان باكليتاكسيل (ptx ، 48.7 ملغ ، 0.057 ملليمول) في قارورة 30 مل مستديرة القاع مجهزه محبس ثلاثي الاتجاات وبالون Ar. أضافه الجافة CH2Cl2 (1 مل) ، 4-dmap (17.1 ملغ ، 0.14 ملليمول) ، و 4-نيتروف# ينيل كلوروفورماتي (26.0 ملغ ، 0.13 ملليمول).
    2. يحرك المحلول في درجه حرارة المحيطة ل 2.5 h تحت جو Ar.
    3. أضافه 4-دماب (15.7 ملغ ، 0.13 ملليمول) و باباتش2آوه (2) (39.1 ملغ ، 0.111 ملليمول) إلى الحل. مواصله تحريك الخليط في درجه حرارة المحيطة لمده 17 ساعة.
    4. أضافه CHCl3 (10 مل) و 15 ٪ هيدروكسيد الماء3 (5 مل) إلى الخليط. يحرك المزيج بقوة لمده 3 دقائق تقريبا. أزاله الطبقة المائية مع ماصه.
    5. يضاف حمض الستريك 0.5 M (5 مل) إلى القارورة التي تحتوي علي الطبقة العضوية. يحرك المزيج ويزيل الطبقة المائية علي النحو المذكور أعلاه.
    6. افصل الطبقة العضوية باستخدام عمود فصل المرحلة. أزاله المذيبات مع المبخر الدوارة تحت فراغ. تنقيه المنتج باستخدام معيار السيليكا هلام العمود اللوني فلاش.
  3. الاجراء العام 3: اعداد حمض الكربوكسيليه القابل للنقر في قفص
    1. تذوب حمض الاراكيدوريك (33.0 μL ، 0.100 ملليمول) ، باباتش2آوه (2) (39.6 ملغ ، 0.112 ملليمول) ، و 4-دماب (14.1 ملغ ، 0.115 ملليمول) فيCH 2Cl 2 (2 مل ). أضف n,n غاربار-diisoب# روبيل كربوديوميد (Dipc, 17.0 μl, 0.110 ملليمول) ويحرك المحلول عند درجه الحرارة المحيطة لمده 140 دقيقه.
    2. أزاله المذيب تحت فراغ. تنقيه بقايا مباشره باستخدام السيليكا هلام العمود اللوني فلاش.

3-تركيب وحده وظيفية في المركبات الحبيسة القابلة للنقر

  1. حل النحاس (الثاني) كبريتات pentahydrate (249 ملغ) في المياه المتبادلة بين الأيونات (IEW ، 10 مل) لإعطاء 0.1 M CuSO4 محلول.
  2. تذوب 2 غاربار-بابهموك-PTX (8.0 ملغ ، 6.5 μmol) ، تريس (3-هيدروكسي بروبيل تريوليلميثيل) أمين (THPTA ، 17.5 ملغ ، 40.3 μmol) ، الصوديوم l-اسكوربات (162.4 ملغ ، 0.825 ملليمول) ، و 15-كلورو-3 ، 6 ، 9-تريوكسيابينادريل أزيد (3.1 ملغ ، 11 μmol) في مذيب مختلط من 0.1 M الفوسفات العازلة (2.5 ml ، pH 7.2) وديميثيل سلفوكسيد (dmso ، 0.5 mL).
  3. أضافه الحل 0.1 M CuSO4 (81.2 μl ، 8.1 μmol) إلى خليط التفاعل. يحرك المزيج في درجه الحرارة المحيطة لمده 80 دقيقه. رصد التقدم المحرز في رد الفعل باستخدام اللوني السائل عاليه الأداء (HPLC).
  4. حل الرواسب عن طريق أضافه 75 ٪ اسيتلونيتريل/محلول المياه (3.5 mL). تطبيق الحل الناتج مباشره إلى نظام HPLC شبه معد لتنقيه المنتج المطلوب.
    ملاحظه: الاذابه من خليط التفاعل باضافه ثالثي-butanol يمكن تسريع تطور رد الفعل.

4. رد فعل التحلل الضوئي من المركبات قفص

  1. اعداد حلول الأسهم
    1. حل المجمع المطلوب في قفص (5 ميكرومول) في DMSO (500 μL) لاعداد حل الأسهم 10 ملم. الاستغناء عن كل محلول (10 μL) في أنبوب الطرد المركزي الصغير 1.5 mL وتخزينها في الفريزر (− 20 درجه مئوية) حتى قبل الاستخدام مباشره.
    2. 6 ملم K3[Fe (C2O4)3] (100 mL): أذابه بلوره البوتاسيوم الفيوكسيالات (0.295 غرام ، 0.675 ملليمول) في 80 مل من الماء. أضافه 0.5 M H2حتى4 (10 مل) وكميه مناسبه من iew لتشكل حجم إلى 100 مل.
      ملاحظه: يجب تنقيه الفيوكسيالات البوتاسيوم عن طريق تبلور من الماء الساخن وتخزينها في الظلام. يتم الحصول علي بلوره البوتاسيوم الفيوكسيالات كما تريهيدرات. ولذلك ، فان تركيبته هي K3[Fe (C2o4)3] · 3h2o ووزن الصيغة من 491.24 ينبغي ان تؤخذ في الاعتبار اثناء اعداد حل الأسهم. تحقق من نقاء المحلول 6 ملم عن طريق قياس امتصاصه عند 510 نانومتر. إذا كان الامتصاص هو < 0.02 ، فهو مناسب للاستخدام في التجربة.
    3. 0.1 ٪ العازلة-phen (30 مل): أذابه NaOAc · 3H2O (7.35 g) ، 1 ، 10-الخط الظاهري (phen) · H2O (30 ملغ) ، و conc. h2حتى4 (0.9 ml) في iew (20 مل). أضافه IEW لتشكل حجم إلى 30 مل.
      ملاحظه: يحتوي الحل علي 1.8 M NaOAc ، 0.54 M H2SO4، و 0.1% 1 ، 10-الخط الظاهري.
  2. قياس عدد الفوتونات باستخدام قياس الاكسده الفيوكسيالات
    1. مكان 6 مم ك3[Fe (C2O4)3] (V1 L) في cuvette الكوارتز. يشع الحل مع ضوء 350 nm لمده 5 ليالي.
    2. نقل المحلول المشع إلى كوفيت pyrex مع طول المسار l [cm].
    3. أضافه 0.1 ٪ العازلة-phen (V2 L) إلى محلول عينه المشع وتخلط جيدا عن طريق التنضيد. قياس امتصاص العينة في 510 نانومتر. يحسب متوسط تغيير الامتصاص لكل وحده زمنيه (ΔA510 [s− 1]).
    4. حساب عدد الشامات من الحديد المتولدة2 + الأيونات لكل وحده الوقت وفقا للمعادلة التالية:
      nfe2 + [mol s− 1] = ((v1 + v2) [ل] × δa510 [s− 1])/(l [cm] × ε510 [l mol− 1 سم− 1]) ،
      حيث (v1 + v2) هو حجم العينة لقياس الامتصاص ، l هو طول المسار البصري لل cuvette ، و ε510 هو امتصاصية المولي من Fe2 +- مجمع فينو في 510 نانومتر.
      ملاحظه: في الظروف التجريبية النموذجية ، قيم v1 = 2.0 × 10− 3 لتر ، v2 = 0.33 × 10− 3 لتر ، l = 1.0 سم ، و ε510 = 1.1 × 104 لترمول− 1 استخدمت سم− 1 .
    5. احسب عدد الشامات من الفوتونات التي تصل إلى العينة (I0) باستخدام الصيغة التالية:
      انا0 [اينشتاين سم− 2 س− 1] = nfe2 +/Φ350
      حيث Φ 350 هو كفاءه الكم من فوتوكسيالات في 350 nm.
      ملاحظه: علي الرغم من انه لم يتم الإبلاغ عن الكفاءة الكمية لمقياس الصوديوم الفيوكسيالات المؤكسد عند 350 نانومتر ، فان القيمة المبلغ عنها 1.2542 في 358 نانومتر كانت تستخدم.
  3. قياسات كفاءه الكم عند 350 نانومتر
    1. تمييع محلول الأسهم عينه (في DMSO ، 10 μL) مع العازلة K-MOPS (pH 7.2 ، 10 مل) لإعطاء محلول 10 μM في ك-MOPS التي تحتوي علي 0.1 ٪ DMSO.
      ملاحظه: وتالفت العازلة K-MOPS من 100 mM KCl و 10 مم 3-(ن-مورفينو) حمض بروبانيسولفونيك (mops) معايره لدرجه الحموضة 7.2 مع كوة.
    2. نقل المحلول (V1 L) إلى نفس كوفيت المستخدمة في فوتورياكشن من مقياس الاكاكتيمتر الكيميائي. يشع الحل عينه باستخدام نفس الاعداد كما هو موضح في الخطوة 4-2-1.
    3. أزاله قسامه (50 μl) من المحلول المشع بشكل دوري وتحليل باستخدام hplc.
    4. حددت الإشعاع وقت, في ثانيه, في اي 90% من ال [سترتينغ متريل] يتجاوب ([ت]90%) ب يلائم قطعات من الاختفاء يعتمد وقت من ال يبدا ماده.
      ملاحظه: يجب الحفاظ علي امتصاص العينة المشعة عند < 0.1 بحيث يمكن إهمال التصفية الداخلية للإشعاع. فمن المستحسن ان استهلاك الضوئية من مواد البداية يمكن ان يقترب من تسوس أحاديه الاسي بحيث لا يوجد اي تاثير ثانوي غير مرغوب فيه ان يتداخل مع عمليه التحلل الضوئي.
    5. حساب الغلة الكم من الاختفاء (Φديس) باستخدام المعادلة التالية28:
      Φديس = 1/(t90 ٪ × انا0 × σ350)
      حيث t90 ٪ [s] هو الوقت التشعيع الذي تم استهلاك 90 ٪ من مواد البداية ، انا0 [اينشتاين سم− 2 ق− 1] هو عدد من الشامات من الفوتونات ، و σ350 [سم 2 [مول-1] [ديكاديك] انقراض معامل من العينة في 350 [نم].
      ملاحظه: σ350 [cm2 mol −1] = 103ε350 [م− 1 سم− 1].

5. استهداف مجمع قفص قابل للنقر مع الاربطه HaloTag

ملاحظه: قبل الاستخدام ، والحفاظ علي الخلايا هيلا في المتوسط النسر دولبيكو المعدلة (DMEM ، وانخفاض الجلوكوز ، بيروفات الصوديوم ، l-الجلوتامين) تستكمل مع 10 ٪ مصل الأبقار الجنينية (التي تحتوي علي 1 ٪ المضادات الحيوية (كبريتات العقديات ، البنسلين G ، و amphotericin) في 37 درجه مئوية و 5% CO2.

  1. أزاله المتوسطة وتريبسينايز الخلايا عن طريق علاج مع حمض التريبسين-ايثيل ديلينترايتاياستيك (أدتا ، 1 مل) في 37 درجه مئوية لمده 1 دقيقه. أضافه DMEM (4 مل) إلى الخلايا وأعاده تعليق الخلايا عن طريق التنقيط برفق. البذور تقريبا 5 × 105 خلايا لكل طبق في الاطباق السفلية من الزجاج 35 مم في dmem (2 مل) 24 ساعة قبل التحويل.
  2. لأربعه اطباق ، في أنبوب الطرد المركزي 1.5 mL ، تمييع الحمض النووي البلازميد (pcDNA3-هاله-egfr ، 14 ميكروغرام) في المتوسط مصل مخفضه (700 μl). بشكل منفصل ، تمييع كاشف الدهون (5 μL) في المصل المنخفض المتوسط (150 μL) في كل من أربعه أنابيب والسماح لهم الوقوف في درجه حرارة المحيطة لمده 5 دقائق.
  3. أضافه جزء من الحمض النووي المخفف البلازميد (150 μl) لكل من عينات كاشف ليبوفيكشن المخفف. احتضان في درجه الحرارة المحيطة لمده 5 دقائق.
  4. بعد الحفاظ علي الخلايا في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2 ل 24 ساعة ، يستنشق dmem وشطف الخلايا مع الفوسفات-مخزنه المالحة (تلفزيوني ، 2 مل). يضاف المصل المخفض المتوسط (1.5 مل).
  5. يضاف الكاشف الشحمي بالبلازما (150 μL) إلى كل طبق. الحفاظ علي الخلايا في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2 ل 48 h.
  6. يستنشق المتوسطة ، أضافه جزء من DMEM أعدت طازجه (1 مل) التي تحتوي علي 2 μM بابهك-عرافه-FITC/هاله ، واحتضان الخلايا في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2 لمده 30 دقيقه.
  7. يستنشق المتوسطة التي تحتوي علي المركب في قفص وشطف الخلايا مرتين مع تلفزيوني + (1 مل لكل شطف) لأزاله اي مركبات غير منضم. يضاف متوسط المصل المخفض (500 μL) واحتضان الخلايا عند 37 درجه مئوية و 5% CO2 لمده 30 دقيقه لأزاله المركبات التي دخلت الخلايا.
    ملاحظه: وهو الفوسفات-المحلول الملحي المخزنة مع 2 مم cacl 2 و 1 ممmgcl 2.
  8. أزاله المتوسطة وشطف الخلايا مرتين مع تلفزيوني + (1 مل). أضف جزءا من متوسط (1 مل) لا يحتوي علي الفينول الأحمر. سجل الصور الفلورية عن طريق المسح الضوئي بالليزر المجهر مضان البؤري.

6. التحوير photomediated من التعريب كيناز باستخدام مجمع قفص القابل للنقر

ملاحظه: قبل الاستخدام ، والحفاظ علي الخلايا تشو-K1 في المتوسطة F-12 Ham المضافة مع 10 ٪ في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2.

  1. اعداد 100 العمل × الحل (1 ملم) من باباتش-AA (5) في dmso.
    ملاحظه: يتم اعداد حل الأسهم 10 ملم من المجمع وتخزينها في الفريزر (-20 درجه مئوية).
  2. البذور تقريبا 5 × 105 خلايا لكل طبق في الاطباق السفلية من الزجاج 35 مم في dmem (2 مل) 24 ساعة قبل التحويل.
  3. Transfect تشو-K1 الخلايا مع الترميز البلازميد ل gfp-dgkγ 48 h قبل التجارب غير المزدحمة.
    ملاحظه: يتم تنفيذ التحويل وفقا للخطوات 5.2 – 5.5.
  4. استبدل الوسط بوسط مصل مخفض (2 مل). أضافه 100 × الحل العمل بابهك-AA (20 μL) واحتضان الخلايا في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2 لمده تتراوح بين 5 دقيقه و 1 ساعة.
    ملاحظه: يعتمد وقت التحميل علي المركب المستخدم.
  5. ضع الخلايا علي المرحلة الموضوعية من المجهر الفلوري المقلوب المزود بمصباح مضان للضوء المزدوج.
  6. خذ صوره فلورية كل 10 ليالي. يشع الخلايا مع 330-385 نانومتر الضوء من خلال هدف المجهر لوقت مناسب. بدلا من ذلك ، تشع الخلايا مع ضوء 405 nm باستخدام مصباح Xe من خلال ألياف الكوارتز المرنة.
  7. استمر في تسجيل الصور الفلورية لمده 10 دقائق.

Representative Results

مركبات قفص قابل للنقر من بعض الجزيئات المثيرة للاهتمام بيولوجيا ، بما في ذلك حمض الاراشيدوريك و paclitaxel ، تم توليفها بنجاح (الشكل 1)28،41. وقدمت خصائص اضافيه مثل الذوبان في الماء والقدرة علي استهداف الخلوية في بابهموك-PTX عن طريق النحاس (I)-تحفيز Huisgen cyclization ("انقر" رد فعل) (الشكل 2). ثم تم فحص هذه PTXs القابلة للنقر في قفص لإنتاج PTXs الام عند التشعيع عند 350 نانومتر (الشكل 3) ، ويلخص الجدول 1 الخواص الفيزيائية والكيميائية الضوئية للمركبات القابلة للنقر في القفص. غله الكم من المركبات قفص قابل للنقر 2 غاربار--glc-بابهموك-PTX (φديس 0.14) و باباتش-AA (φديس 0.083) كانت أكثر من ضعف تلك المركبات التقليدية قفص BHC 2 غاربار-bhcموك-ptx (Φديس 0.040) و Bhc-AA (Φdis 0.038)43. الاضافه إلى ذلك ، لوحظ تحسن الذوبان في الماء لمده 2 غاربار-glc-بابهموك-PTX ، الذي يحتوي علي الجلوكوز moiety.

في تجارب الخلايا الحية ، تم تحقيق استهداف باباتش-عرافه-FITC/هاله إلى خلايا الثدييات مثقف التعبير عن البروتين الانصهار من بروتين HaloTag ومستقبلات عامل نمو البشرة (EGFR) بنجاح. ولوحظ الفلورية الخضراء من فلوريسئين شارده من باباتش عرافه-fitc/هاله علي غشاء الخلية (الشكل 4). وقد تم التوصل إلى تشكيل التعريب الخلوي للكيناز باستخدام مركب باباتش في قفص. تم الإبلاغ عن النقل من γ كيناز التشكيل (DGKγ) ليتم تنشيطها في وجود حمض الاراكيدوريك (AA)44. تم التعامل مع الخلايا تشو-K1 عابره التعبير عن GFP-DGKγ مع اما AA أو باباتش-AA (5). وتسببت أضافه AA في تحوير التوطين تحت الخلوية من DGKγ (الشكل 5ا ، ب). ولوحظت تغييرات مماثله في توطين DGKγ للخلايا المعالجة باباتش-AA بعد التعرض للضوء فوق البنفسجي (الشكل 5ج ، د).

Figure 1
الشكل 1: اعداد المركبات الحبيسة القابلة للنقر.
(ا) الكواشف والشروط: ا. ايثيل 4-كلورواسيتالوخلات/كونك. ح2حتى4/rt/7 أيام/91 ٪ العائد ، b. 1 م HCl/الجزر/3 أيام/97 ٪ العائد. c. N-ميثيلبروبارجيليمين/Hcho/etoh ، ثم أضافه (1) والحرارة في الجزر ل 17 h/79 ٪ العائد. (ب) التوليفات من أمين قفص القابلة للنقر ، ptx ، وحمض الاراشيدوريك. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تركيب الوحدات الوظيفية في المركبات الحبيسة القابلة للنقر.
(ا) توليف الأقفاص القابلة للذوبان في الماء بواسطة النحاس (I)-يحفز الخلايا الخلوية. (ب) هياكل المركبات الحبيسة القابلة للنقر التي تحتوي علي الاربطه الخلوية ولاستهداف الخلايا. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: التحلل الضوئي لغاربارين (6).
عينات (10 μM) في الحل ك-MOPS (pH 7.2) كانت المشع في 350 نانومتر. (ا) اثار hplc النموذجية للتحلل الضوئي ل 6 (مقاسه عند 254 نانومتر). تم تحليل العينات في وقت التشعيع المحدد. (ب) الدورة الزمنيه لتحلل الصور من 6. الدوائر الزرقاء تظهر استهلاك 6. خط الصلبة يظهر منحني الأقل المربعات يصلح لاسي المتحللة بسيطه ل 6. تظهر المربعات الحمراء العائد من PTX. تمثل أشرطه الخطا الانحراف المعياري (± SD). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: الصور الفلورية لخلايا الثدييات المثقفة المحتضنة مع باباتش-هيكس-FITC/Halo (8).
تم احتضان الخلايا مع pcDNA3-هاله-EGFR مع محلول 2 μM من مجمع 8 في 37 درجه مئوية لمده 30 دقيقه. تم الحصول علي الصور بعد الغسيل المتكرر مع تلفزيوني +. الخلايا HEK293T المعالجة الصورية (A: صوره تباين التداخل التفاضلي (DIC) و D: صورهمضان). خلايا HEK293T (b و E) والخلايا هيلا (c و F) تعبر بصوره عابره هاله-egfr (B و C: الصور DIC و E و F: الصور الفلورية). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: الصور الفلورية بعد الاشعه فوق البنفسجية للخلايا تشو-K1 حضنت مع bhc في قفص الاراكيدونيك حمض. تم نقل خلايا تشو K1 مع بروتين الانصهار DGKγ-EGFP.
(ا) صوره مضانه للخلايا الناقلة. (B) 100 s بعد أضافه محلول 10 μM من حمض الاراكيدوريك. (ج) تم احتضان الخلايا مع محلول 10 ΜM من باباتش-AA (5) عند 37 درجه مئوية لمده 5 دقائق (د) 100 ثانيه بعد الاشعه فوق البنفسجية 20-s (330-385 نانومتر). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

المركبات λماكس (nm) (ا ) εماكس (م-1 سم-1) (ب ) φديسc د الذوبان (μM)ه
PTX 1.0
2 '-bhcmoc-PTX 340 10500 0.040 400 55
2 '-بابهموك-PTX 359 9300 0.059 670 8.3
2 '-glc-Bhcmoc-PTX 373 12300 0.14 1280 650
Bhc-AA 341 10800 0.038 390
باباتش-ا 366 10300 0.083 750

الجدول 1: الخواص الفيزيائية والكيميائية الضوئية للمركبات المحبوسة القابلة للنقر.
ا. امتصاص الحد الأقصى (نانومتر) ، b. امتصاصية المولي في λmax (م− 1 سم− 1) ، c. الغلة الكم من اختفاء مواد البداية في 350 نانومتر ، د. المنتج من امتصاصية المولي والغلة الكم من الاختفاء في 350 نانومتر ، ه. تركيز المحلول المشبع في K-MOPS (pH 7.2) (ميكروغرام mL− 1).

Discussion

وضعنا سابقا bhc المركبات قفص من مختلف الجزيئات النشطة بيولوجيا التي تظهر كفاءه عاليه الضوئية28،45،46،47. وبهدف توسيع نطاق مرجع مجموعات bhc ، أبلغنا أيضا عن منصات للمركبات الحبيسة المعيارية التي يمكن تعديلها بسهوله عنطريق إدخال وحدات وظيفيةمختلفه 32 ،40،41. ولذلك فان هذا البروتوكول يمثل طريقه لتوليف سلائف قابله للنقر عليها من مجموعات Bhc التي يمكن تعديلها عن طريق النحاس (I)-الذي يحفز الخلايا الخلوية. وقد تحقق توليف السلائف القابلة للنقر ، باباتش2آوه (2) ، عن طريق تسلسل رد فعل من أربع خطوات بدءا من المتاحة تجاريا 4-بروموريسورسينول (الشكل 1a). وميزه هذا البروتوكول هي انه لا يلزم اتخاذ خطوات تنقيه مضنيه (مثل فصل الفواصل اللونية للعمود).

كما السلائف القابلة للنقر باباتش2آوه (2) يمكن استخدامها لإخفاء المجموعات الوظيفية المختلفة ، المركبات قفص قابل للنقر من الأمينات والكحول ، وتم توليفها الأحماض الكربوكسيليه باستخدام 2 كما السلائف (الشكل 1b). تم تعديل الأمينات كما بكارباميت في حين تم تعديل الكحول والكربونات الخاصة بهم. في الإجراءات العامة 1 و 2 ، تم استخدام CDI لاعداد carbamates القابلة للنقر ، في حين تم استخدام 4-نيتروف# ينيل كلوروفورماتي لاعداد الكربونات. كما هو مبين من قبل اليه رد الفعل ، يمكن استخدام كل من الكواشف لاعداد كارباماتيس والكربونات. وتجدر الاشاره أيضا إلى ان الغلة من المجمع قفص المطلوب يعتمد علي التركيب الكيميائي لجزيء ان يكون في قفص. ويمكن النظر إلى أمثله أخرى في تقاريرنا السابقة28،30،33،48.

انقر فوق التعديل ثم أجريت باستخدام تعديل طفيف للاجراء المبلغ عنه49. أضافه تريس (تريرازيلميثيل) المستندة إلى أمين يغاندس ضروري للحصول علي المنتجات المطلوبة في جيده لغلات عاليه. منذ مجموعه متنوعة من أزيد متاحه بسهوله علي حد سواء من المصادر التجارية ومن الإجراءات الادبيه ، يمكننا اعداد مختلف المركبات قفص وحدات مع خصائص اضافيه مثل الذوبان في الماء والقدرة علي استهداف الخلوية (الشكل 2).

ثم قيس المحصول الكمي من التحلل الضوئي وفقا للاجراء المبلغ عنه28،50. ويبين الشكل 3 ان استهلاك الصور الضوئية من 2 غاربار--Glc-بابهموك-ptx والإفراج عن ptx كانت تقريبيه الاضمحلال الاسي واحد وارتفاع ، علي التوالي ، مما يوحي بعدم وجود تصفيه داخلية للإشعاع أو الآثار الثانوية غير المرغوب فيها. لوحظ تحسن في غله الكم الكمي (φ) وكفاءه التحلل الضوئي (εφ) لمركبات باباتش القابلة للنقر بالمقارنة مع مركبات bhc المحبوسةسابقا (الجدول 1)41، 43. وبما ان كفاءه التحلل الضوئي (εφ) من مركبات bhc في قفص هي أكثر من 100 مره اعلي من تلك المركبات 2-نيتروالبنزيل-نوع قفص48، والتحسن الملحوظ بسبب وجود مجموعات الشيخوخة باباتش بشكل واضح ميزه لهذا النظام.

كتجربة إثبات المفهوم ، أدخلت شارده المائية إلى 2 غاربار-بابهموك-ptx (4) والخلوية استهداف يجند أدخلت إلى مجمع 3 (الشكل 2). وكان ذوبان الماء من 2 غاربار--glc-بابهموك-PTX 650 مرات اعلي من ذلك من PTX الأصل (الجدول 1). وتم تحقيق الاستهداف الخلوي الانتقائي باستخدام نظام التحقق من العلامات ، وكانت بابهموك-عرافه-FITC/Halo (8) التي تحمل الجهاز halotag واستهدفت بنجاح إلى غشاء الخلية من خلايا الثدييات مثقف التعبير عن البروتين الانصهار halotag/egfr ( الشكل 4). كما تم التوصل إلى تحوير الصورة الخلوية للكيناز باستخدام المركب المحبوس القابل للنقر 5 (الشكل 5).

في الختام ، نجحنا في إثبات طريقه لاعداد منصات قابله للنقر للمركبات الصورة في قفص من جزيئات مثيره للاهتمام بيولوجيا التي يمكن تعديلها بسهوله مع خصائص اضافيه ، مثل الذوبان في الماء والخلوية استهداف القدرة. وبما انه يمكن استخدام مجموعه "باباتش" لاعداد اي جزيئات ذات مجموعات وظيفية قابله للتعديل ، فان تطبيق هذا البروتوكول لا يقتصر علي الجزيئات الموصوفة هنا. باستخدام منصة وحدات ، وهي مجموعه باباتش الشيخوخة ، ويمكن اعداد المركبات قفص المطلوب بسهوله ، ويمكن التضمين خصائصها الفيزيائية والكيميائية عن طريق تعديل النقر.

Disclosures

ليس لدينا ما نكشف عنه

Acknowledgments

وكان هذا العمل مدعوما من قبل JSPS KAKENHI منحه رقم JP16H01282 (TF) ، ومنحه في المعونة للبحوث العلمية في مجالات مبتكره "دينامية الذاكرة" ، و JP19H05778 (TF) ، "MolMovies".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
acetonitrile, EP Nacalai 00404-75
acetonitrile, super dehydrated FUJIFILM Wako 010-22905
Antibiotic-Antimycotic, 100X Thermo Fisher 15240062
4-bromoresorcinol TCI Chemicals B0654
N,N’-carbonyldiimidazole FUJIFILM Wako 034-10491
chloroform Kanto 07278-71
Copper (II) Sulfate Pentahydrate, 99.9% FUJIFILM Wako 032-12511
dichloromethane, dehydrated Kanto 11338-05
N,N'-Diisopropylcarbodiimide (DIPC) TCI Chemicals D0254
4-dimethylaminopyridine TCI Chemicals D1450
dimethylsulfoxide, dehydrated -super- Kanto 10380-05
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium Sigma D6046-500ML
dual light source fluorescence illuminator, IX2-RFAW Olympus
Ethanol (99.5) FUJIFILM Wako 054-07225
Ethyl 4-Chloroacetoacetate TCI Chemicals C0911
Ham's F-12 with L-Glutamine and Phenol Red FUJIFILM Wako 087-08335
hydrochloric acid FUJIFILM Wako 087-01076
inverted fluorescent microscope IX-71 Olympus
ISOLUTE Phase Separator, 15 mL Biotage 120-1906-D
L-(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt FUJIFILM Wako 196-01252
laser scanning fluorescence confocal microscopy, FLUOVIEW FV1200/IX-81 Olympus
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher 11668027 lipofection reagent
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Dojindo 345-01804 MOPS
4-nitrophenylchloroformate (4-NPC) TCI Chemicals C1400
Opti-MEM I Reduced Serum Medium, no phenol red Thermo Fisher 11058021 reduced serum medium contains no phenol red
1,10-Phenanthroline Monohydrate Nacalai 26707-02
Photochemical reactor with RPR 350 nm lamps Rayonet
Potassium Trioxalatoferrate (III) trihydrate FUJIFILM Wako W01SRM19-5000
Sodium Acetate Trihydrate Nacalai 31115-05
Sodium Bicarbonate FUJIFILM Wako 199-05985
Sulfuric Acid, 96-98% FUJIFILM Wako 190-04675
Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA) ALDRICH 762342-100MG
tri-Sodium Citrate Dihydrate Nacalai 31404-15
Xenon light source, MAX-303 Asahi Spectra

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mayer, G., Heckel, A. Biologically active molecules with a "light switch". Angewandte Chemistry International Edition. 45 (30), 4900-4921 (2006).
  2. Bort, G., Gallavardin, T., Ogden, D., Dalko, P. I. From One-Photon to Two-Photon Probes: Caged” Compounds, Actuators, and Photoswitches. Angewandte Chemistry International Edition. 52 (17), 4526-4537 (2013).
  3. Klan, P., et al. Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy. Chemical Reviews. 113 (1), 119-191 (2013).
  4. Abe, M., et al. Design and Synthesis of Two-Photon Responsive Chromophores for Near-Infrared Light-Induced Uncaging Reactions. Synthesis-Stuttgart. 49 (15), 3337-3346 (2017).
  5. Ankenbruck, N., Courtney, T., Naro, Y., Deiters, A. Optochemical Control of Biological Processes in Cells and Animals. Angewandte Chemistry International Edition. 57 (11), 2768 (2018).
  6. Hou, Y., Zhou, Z., Huang, K., Yang, H., Han, G. Long Wavelength Light Activated Prodrug Conjugates for Biomedical Applications. ChemPhotoChem. 2, 1005 (2018).
  7. Engels, J., Schlaeger, E. J. Synthesis, structure, and reactivity of adenosine cyclic 3',5'-phosphate benzyl triesters, Rapid photolytic release of adenosine 5'-triphosphate from a protected analogue: utilization by the Na:K pump of human red blood cell. Journal of Medicinal Chemistry. 20 (7), 907-911 (1977).
  8. Kaplan, J. H., Forbush, B., Hoffman, J. F. Rapid photolytic release of adenosine 5'-triphosphate from a protected analogue: utilization by the Na:K pump of human red blood cell ghosts. Biochemistry. 17 (10), 1929-1935 (1978).
  9. Park, C. H., Givens, R. S. New Photoactivated Protecting Groups. 6. p-Hydroxyphenacyl: A Phototrigger for Chemical and Biochemical Probes. Journal of the American Chemical Society. 119 (10), 2453-2463 (1997).
  10. Hasan, A., et al. Photolabile protecting groups for nucleosides: synthesis and photo-deprotection rates. Tetrahedron. 53 (12), 4247-4264 (1997).
  11. Heckel, A., Mayer, G. Light regulation of aptamer activity: an anti-thrombin aptamer with caged thymidine nucleobases. Journal of the American Chemical Society. 127 (3), 822-823 (2005).
  12. Papageorgiou, G., Corrie, J. E. T. Effects of aromatic substituents on the photocleavage of 1-acyl-7-nitroindolines. Tetrahedron. 56 (41), 8197-8205 (2000).
  13. Matsuzaki, M., Ellis-Davies, G. C., Nemoto, T., Miyashita, Y., Iino, M., Kasai, H. Dendritic spine geometry is critical for AMPA receptor expression in hippocampal CA1 pyramidal neurons. Nature Neuroscience. 4 (11), 1086-1092 (2001).
  14. Givens, R. S., Matuszewski, B. Photochemistry of phosphate esters: an efficient method for the generation of electrophiles. Journal of the American Chemical Society. 106 (22), 6860-6861 (1984).
  15. Furuta, T., Torigai, H., Sugimoto, M., Iwamura, M. Photochemical Properties of New Photolabile cAMP Derivatives in a Physiological Saline Solution. Journal of Organic Chemistry. 60 (13), 3953-3956 (1995).
  16. Hagen, V., Frings, S., Wiesner, B., Helm, S., Kaupp, U. B., Bendig, J. 7-(Dialkylamino)coumarin-4-yl]methyl-Caged Compounds as Ultrafast and Effective Long-Wavelength Phototriggers of 8-Bromo-Substituted Cyclic Nucleotides. ChemBioChem. 4 (5), 434-442 (2003).
  17. Momotake, A., Lindegger, N., Niggli, E., Barsotti, R. J., Ellis-Davies, G. C. The nitrodibenzofuran chromophore: a new caging group for ultra-efficient photolysis in living cells. Nature Methods. 3 (1), 35-40 (2006).
  18. Specht, A., et al. New photoremovable protecting groups for carboxylic acids with high photolytic efficiencies at near-UV irradiation. Application to the photocontrolled release of L-glutamate. ChemBioChem. 7 (11), 1690-1695 (2006).
  19. Petersen, S., Alonso, J. M., Specht, A., Duodu, P., Goeldner, M., del Campo, A. Phototriggering of cell adhesion by caged cyclic RGD peptides. Angewandte Chemistry International Edition. 47 (17), 3192-3195 (2008).
  20. Heckman, L. M., et al. Design and Synthesis of a Calcium-Sensitive Photocage. Angewandte Chemistry International Edition. 55 (29), 8363-8366 (2016).
  21. Olson, J. P., Banghart, M. R., Sabatini, B. L., Ellis-Davies, G. C. Spectral Evolution of a Photochemical Protecting Group for Orthogonal Two-Color Uncaging with Visible Light. Journal of the American Chemical Society. 135 (42), 15948-15954 (2013).
  22. Gandioso, A., et al. Sequential Uncaging with Green Light can be Achieved by Fine-Tuning the Structure of a Dicyanocoumarin Chromophore. ChemistryOpen. 6 (3), 375-384 (2017).
  23. Bassolino, G., Nancoz, C., Thiel, Z., Bois, E., Vauthey, E., Rivera-Fuentes, P. Photolabile coumarins with improved efficiency through azetidinyl substitution. Chemical Science. 9 (2), 387-391 (2018).
  24. Lin, Q. N., et al. Coumarin Photocaging Groups Modified with an Electron-Rich Styryl Moiety at the 3-Position: Long-Wavelength Excitation, Rapid Photolysis, and Photobleaching. Angewandte Chemistry International Edition. 57 (14), 3722-3726 (2018).
  25. Nani, R. R., et al. In Vivo Activation of Duocarmycin-Antibody Conjugates by Near-Infrared Light. ACS Central Science. 3 (4), 329-337 (2017).
  26. Umeda, N., et al. Boron Dipyrromethene As a Fluorescent Caging Group for Single-Photon Uncaging with Long-Wavelength Visible Light. ACS Chemical Biology. 9 (10), 2242-2246 (2014).
  27. Slanina, T., et al. In Search of the Perfect Photocage: Structure–Reactivity Relationships in meso-Methyl BODIPY Photoremovable Protecting Groups. Journal of the American Chemical Society. 139 (42), 15168-15175 (2017).
  28. Furuta, T., et al. Brominated 7-hydroxycoumarin-4-ylmethyls: Photolabile protecting groups with biologically useful cross-sections for two photon photolysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (4), 1193-1200 (1999).
  29. Furuta, T., et al. Bhc-cNMPs as either water-soluble or membrane-permeant photoreleasable cyclic nucleotides for both one- and two-photon excitation. ChemBioChem. 5 (8), 1119-1128 (2004).
  30. Suzuki, A. Z., et al. Coumarin-4-ylmethoxycarbonyls as phototriggers for alcohols and phenols. Organic Letters. 5 (25), 4867-4870 (2003).
  31. Ando, H., Furuta, T., Tsien, R. Y., Okamoto, H. Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos. Nature Genetics. 28 (4), 317-325 (2001).
  32. Teraoka, A., Murakoshi, K., Fukamauchi, K., Suzuki, A. Z., Watanabe, S., Furuta, T. Preparation and affinity-based purification of caged linear DNA for light-controlled gene expression in mammalian cells. Chemical Communications. 50 (6), 664-666 (2014).
  33. Watanabe, T., et al. Synthesis of nucleobase-caged peptide nucleic acids having improved photochemical properties. Organic and Biomolecular Chemistry. 12 (28), 5089-5093 (2014).
  34. Horinouchi, T., Nakagawa, H., Suzuki, T., Fukuhara, K., Miyata, N. A novel mitochondria-localizing nitrobenzene derivative as a donor for photo-uncaging of nitric oxide. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 21 (7), 2000-2002 (2011).
  35. Leonidova, A., et al. Photo-induced uncaging of a specific Re(I) organometallic complex in living cells. Chemical Science. 5 (10), 4044-4056 (2014).
  36. Nadler, A., et al. Exclusive photorelease of signalling lipids at the plasma membrane. Nature Communications. 6, 10056 (2015).
  37. Feng, S. H., et al. Mitochondria-specific photoactivation to monitor local sphingosine metabolism and function. Elife. 7, e34555 (2018).
  38. Wagner, N., Stephan, M., Hoglinger, D., Nadler, A. A Click Cage: Organelle-Specific Uncaging of Lipid Messengers. Angewandte Chemistry International Edition. 57 (40), 13339-13343 (2018).
  39. Feng, S., Harayama, T., Chang, D., Hannich, J. T., Winssinger, N., Riezman, H. Lysosome-targeted photoactivation reveals local sphingosine metabolism signatures. Chemical Science. 10 (8), 2253-2258 (2019).
  40. Furuta, T., Manabe, K., Teraoka, A., Murakoshi, K., Ohtsubo, A., Suzuki, A. Design, synthesis, and photochemistry of modular caging groups for photoreleasable nucleotides. Organic Letters. 14 (24), 6182-6185 (2012).
  41. Suzuki, A. Z., et al. A clickable caging group as a new platform for modular caged compounds with improved photochemical properties. Chemical Communications. 55 (4), 451-454 (2019).
  42. Hatchard, C. G., Parker, C. A. A new sensitive chemical actinometer - II. Potassium ferrioxalate as a standard chemical actinometer. Proceedings of the Royal Society A. 235 (1203), 518-536 (1956).
  43. Furuta, T., Nishiyama, K., Manabe, A., Fukuoka, M., Iwamura, M. Design, synthesis and photochemical properties of caged compounds of lipid mediators. Proceedings of the ISBC. , 124-125 (2003).
  44. Shirai, Y., Segawa, S., Kuriyama, M., Goto, K., Sakai, N., Saito, N. Subtype-specific Translocation of Diacylglycerol Kinase ? and ? and Its Correlation with Protein Kinase C. The Journal of Biological Chemistry. 275 (32), 24760-24766 (2000).
  45. Furuta, T., Noguchi, K. Controlling cellular systems with Bhc-caged compounds. TrAC, Trends in Analytical Chemistry. 23 (7), 511-519 (2004).
  46. Furuta, T. Designing caged compounds for spatiotemporal control of cellular chemistry. Journal of the Synthetic Organic Chemistry Japan. 69 (11), 1164-1169 (2012).
  47. Furuta, T. Coumarin-4-ylmethyl Phototriggers. Dynamic Studies in Biology: Phototriggers, Photoswitches and Caged Biomolecules. Goeldner, M., Givens, R. S. , WILEY-VCH. 29-55 (2005).
  48. Furuta, T., Watanabe, T., Tanabe, S., Sakyo, J., Matsuba, C. Phototriggers for Nucleobases with Improved Photochemical Properties. Organic Letters. 9 (23), 4717-4720 (2007).
  49. Manova, R., van Beek, T. A., Zuilhof, H. Surface Functionalization by Strain-Promoted Alkyne–Azide Click Reactions. Angewandte Chemistry International Edition. 50 (24), 5428-5430 (2011).
  50. Adams, S. R., Kao, J. P. Y., Grynkiewicz, G., Minta, A., Tsien, R. Y. Biologically Useful Chelators That Release Ca2+ Upon Illumination. Journal of the American Chemical Society. 110 (10), 3212-3220 (1988).

Tags

الكيمياء ، الإصدار 152 ، المركبات المحبوسة ، التوليف ، الكيمياء الضوئية ، انقر فوق الكيمياء ، prodrug ، البيولوجيا الكيميائية ، المسبارات الكيميائية
التصميم والتوليف والخصائص الكيميائية الضوئية لمركبات القفص القابلة للنقر
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Suzuki, A. Z., Shiraishi, Y., Aoki,… More

Suzuki, A. Z., Shiraishi, Y., Aoki, H., Sasaki, H., Watahiki, R., Furuta, T. Design, Synthesis, and Photochemical Properties of Clickable Caged Compounds. J. Vis. Exp. (152), e60021, doi:10.3791/60021 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter