Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Design, syntese, og foto kemiske egenskaber af klikbare Caged forbindelser

Published: October 15, 2019 doi: 10.3791/60021
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biomolecular Science, Faculty of Science, Toho University

Summary

En protokol til syntese og måling af de foto kemiske egenskaber af modulære bur forbindelser med klikbare fugt præsenteres.

Abstract

Caged forbindelser muliggør foto-medieret manipulation af celle fysiologien med høj spatiotemporale opløsning. Den begrænsede strukturelle diversitet i de aktuelt tilgængelige anbringelse-grupper og vanskelighederne i forbindelse med syntetisk modifikation uden at ofre deres fotolyse effektivitet er imidlertid hindringer for at udvide det repertoire af bur forbindelser til levende celle Programmer. Da den kemiske modifikation af coumarin-typen foto-caging grupper er en lovende tilgang til fremstilling af bur forbindelser med forskellige fysiske og kemiske egenskaber, rapporterer vi en metode til syntese af klikbare bur forbindelser, der kan ændres let med forskellige funktionelle enheder via kobber (I)-katalyseret Huisgen cyklisering. Den modulære platform molekyle indeholder en (6-Bromo-7-hydroxycoumarin-4-yl) methyl (BHC) gruppe som en foto-caging gruppe, som udviser en høj fotolyse effektivitet i forhold til de konventionelle 2-nitrobenzyls. Der fremlægges generelle procedurer for tilberedning af klikbare bur-forbindelser indeholdende aminer, alkoholer og carboxylater. Yderligere egenskaber såsom vandopløselighed og celle målretning evne kan let inkorporeres i klikbar bur forbindelser. Desuden blev de fysiske og foto kemiske egenskaber, herunder fotolyse kvante udbyttet, målt og fandtes at være overlegne i forhold til de tilsvarende BHC-bur-forbindelser. Den beskrevne protokol kan derfor betragtes som en potentiel løsning på manglen på strukturel diversitet i de tilgængelige bur-forbindelser.

Introduction

Caged forbindelser er designet syntetiske molekyler, hvis oprindelige funktioner er tidsmæssigt maskeret af kovalent vedhæftet foto-flytbare beskyttelse grupper. Interessant, bur forbindelser af biologisk relevante molekyler giver en uundværlig metode til spatiotemporale kontrol af cellulære fysiologi1,2,3,4,5 ,6. I 1977 rapporterede Engels og Schlaeger 2-nitrobenzyl ester af lejren som en membran gennemtrængelig og photolabile derivat af cAMP7. Det følgende år, Kaplan rapporterede 1-(2-nitrophenyl) ethylester af ATP (NPE-ATP) og hedder denne sammensatte "caged" ATP8. Siden da, en række fotokemisk aftagelige beskyttende grupper såsom 2-nitrobenzyls, p-hydroxyphenacyls9, 2-(2-nitrophenyl) ethyls10,11, 7-nitroindolin-1-yls12, 13, og (coumarin-4-yl) methyls14,15,16 er blevet anvendt til fremstilling af bur forbindelser.

Syntesen af bur forbindelser med ønskelige yderligere egenskaber såsom membran permeabilitet, vandopløselighed, og cellulære målretning evne forventes at lette celle biologiske applikationer. Da de fysiske og foto kemiske egenskaber af disse molekyler primært afhænger af den kemiske struktur af de fotokemisk flytbare beskyttelse grupper, der anvendes til at forberede dem, et mangfoldigt repertoire af foto-caging grupper er påkrævet. Men den strukturelle mangfoldighed af nuværende tilgængelige anbringelse grupper, der udviser høj fotolyse effektivitetsgevinster er begrænset. Dette kunne være en hindring for at øge brugen af bur forbindelser.

For at løse dette problem, er repertoiret af foto-caging grupper blevet udvidet med den kemiske modifikation af eksisterende photoremovable beskyttelse grupper eller udformningen af nye photolabile kromoforer med overlegne photophysical og foto kemiske egenskaber. Eksempler omfatter nitrodibenzofuran (ndbf)17, [3-(4,5-dimethoxy-2-nitrophenyl) -2-butyl] (dmnpb)18,19, et calcium følsomt 2-nitrobenzyl photocage20, substitueret coumarinylmethyls (DEAC45021 , Deadccm22, 7-azetidinyl-4-methylcoumarin23, og styryl coumariner24), cyanine derivater (cyet-pan)25, og bodipy derivater26,27.

Derudover har vi tidligere udviklet (6-Bromo-7-hydroxycoumarin-4-yl) methyl (BHC) gruppe og med succes syntetiseret forskellige bur forbindelser af neurotransmittere28, anden budbringere29,30, og oligonukleotider31,32,33 udviser store en-og to-foton excitation tværsnit. Hvis yderligere egenskaber kan installeres nemt i anbringelse grupper uden at kompromittere deres lysfølsomhed, så repertoiret af bur forbindelser kan udvides34,35,36, 37,38,39. Vi designede derfor modulære bur-forbindelser, der består af tre dele, nemlig BHC-gruppen som en foto lydhør kerne, kemiske håndtag til installation af yderligere funktionaliteter og de molekyler, der skal maskeres40, 41.

Således indeholder denne artikel en praktisk metode til fremstilling af bur forbindelser af biologisk relevante molekyler. Denne protokol beskriver metoder til udarbejdelse af en klikbar platform for foto-caging grupper, indførelse af yderligere funktionaliteter til at udvide repertoiret af bur forbindelser, måling af deres fysiske og foto kemiske egenskaber, og den celle-type selektiv målretning af en klikbart bur sammensatte for yderligere cellulære applikation.

Protocol

1. syntese af den modulære anbringelse pabhc gruppe for klikbare bur forbindelser28,41

  1. Tilberedning af (6-brom-7-hydroxycoumarin-4-yl) methylchlorid (BHC-CH2CL)
    1. Sted 4-bromoresorcinol (9,742 g, 51,5 mmol) i en 100 mL rundbundet kolbe udstyret med en omrørs stang.
    2. Tilsæt conc. H2så4 (98%, 30 ml) til kolben og rør blandingen for at opløse den.
    3. Tilsæt ethyl 4-chloroacetoacetat (10 mL, 74 mmol) dropwise.
    4. Fortsæt omrøring af blandingen ved omgivelsestemperatur i 5 dage.
    5. Hver for sig anbringes knuste isterninger (~ 200 mL) i en 500 mL Erlenmeyer-kolbe.
    6. Hæld reaktionsblandingen i isen og rør kraftigt i 30 minutter, indtil der opnås et fint pulverformet bundfald.
    7. Opsamles bundfaldet via vakuum filtrering. Skyl det lysebrune bundfald med vand fem gange.
    8. Bundfaldet tørres under vakuum natten over for at give BhcCH2cl som et let brunt pulver (13,57 g, 46,9 mmol).
  2. Klargøring af (6-brom-7-hydroxycoumarin-4-yl) methanol (BhcCH2Oh)
    1. Den forberedte BhcCH2Cl (1,1440 g, 3,95 mmol) og 1 M HCl (300 ml) anbringes i en 1 L rundbundet kolbe, der er udstyret med en Dimroth-kondensator. Blandingen omrøres ved 140 °C i 5 dage. Efter denne tid, afkøles blandingen til omgivende temperatur.
    2. Fjern vandet fra reaktionen ved roterende fordampning under vakuum for at give BhcCH2Oh (1) som et let brunt pulver (1,0359 g, 3,82 mmol, 97% udbytte).
      Bemærk: brugen af 250 mL af 1 M HCl pr. 1 g BhcCH2CL giver et tilfredsstillende resultat.
  3. Klargøring af paBhcCH2Oh (2) via mannich-reaktionen
    1. PARAFORMALDEHYD (446,4 mg, 14,9 mmol) anbringes i en 50 mL rundbundet kolbe. Tilsæt vandfri ethanol (5 mL) og N-methylpropargylamin (1,25 mL, 14,8 mmol) til kolben.
    2. Blandingen omrøres ved omgivende temperatur i 1 time under en AR-atmosfære.
    3. Tilsæt BhcCH2Oh (1) (1,367 g, 5,04 mmol) til kolben. Blandingen opvarmes til 80 °C med et blok varmeapparat, og blandingen fortsættes ved 80 °C i 2 timer under en AR-atmosfære.
    4. Stop blok varmer og Afkøl reaktionsblandingen til stuetemperatur.
    5. Saml det resulterende lysebrunt-gule bundfald ved vakuum filtrering. Bundfaldet vaskes to gange med en lille mængde vandfri ethanol (1 mL hver gang).
    6. Fjern den overskydende ethanol under vakuum for at give paBhcCH2Oh (2) (1,393 g, 3,96 mmol).

2. klargøring af klikbare bur forbindelser

Bemærk: følgende procedurer kan anvendes til fremstilling af andre klikbare bur forbindelser, der indeholder hydroxyl-, amino-og carboxylat-funktionelle grupper.

  1. Generel procedure 1: klargøring af et klikbart bur Amin
    1. Placer paBhcCH2Oh (2) (709,6 mg, 2,02 mmol) og n,n '-carbonyl diimidazol (CDI, 397,6 mg, 2,45 mmol) i en 30 ml rundbundet kolbe. Tilsæt tør LM2CL2 (6 ml) og rør opløsningen ved omgivende temperatur i 1 time.
    2. Tilsæt 4-dimethylaminopyridin (4-DMAP, 324,8 mg, 2,66 mmol) og tert-butyl (6-aminohexyl) carbamat (533,1 mg, 2,46 mmol). Opløsningen omrøres ved omgivende temperatur i 3 timer.
    3. Fjern opløsningsmidlet og andre flygtige materialer ved hjælp af en rotationsfordamper under vakuum. Rense rester direkte ved hjælp af silica gel flash kolonne kromatografi.
  2. Generel procedure 2: klargøring af et klikbart bur alkohol
    1. Paclitaxel (PTX, 48,7 mg, 0,057 mmol) anbringes i en 30 mL rundbundet kolbe, der er udstyret med en trevejs stophane og en AR-ballon. Tilsæt tør LM2CL2 (1 ml), 4-DMAP (17,1 mg, 0,14 mmol) og 4-nitrophenyl chloroformat (26,0 mg, 0,13 mmol).
    2. Opløsningen omrøres ved omgivende temperatur for 2,5 h under en AR-atmosfære.
    3. Tilsæt 4-DMAP (15,7 mg, 0,13 mmol) og paBhcCH2Oh (2) (39,1 mg, 0,111 mmol) til opløsningen. Fortsæt omrøring af blandingen ved omgivelsestemperatur i 17 timer.
    4. Tilsæt CHCl3 (10 ml) og 15% vandig NaHCO3 (5 ml) til blandingen. Blandingen omrøres kraftigt i ca. 3 min. Fjern det vandige lag med en pipette.
    5. Tilsæt 0,5 M citronsyre (5 mL) til kolben indeholdende det organiske lag. Bland blandingen og fjern det vandige lag som ovenfor.
    6. Separer det organiske lag ved hjælp af en fase separations søjle. Fjern opløsningsmidlerne med en rotationsfordamper under vakuum. Rense produktet ved hjælp af standard silicagel flash kolonne kromatografi.
  3. Generel procedure 3: klargøring af en klikbar carboxylsyre
    1. Arachidonsyre opløses (33,0 μL, 0,100 mmol), paBhcCH2Oh (2) (39,6 mg, 0,112 mmol) og 4-DMAP (14,1 mg, 0,115 MMOL) i tør LM2CL 2 (2 ml ). Tilsæt n,n-diisopropylcarbodiimide (Dipc, 17,0 μl, 0,110 mmol) og rør opløsningen ved omgivelsestemperatur i 140 min.
    2. Fjern opløsningsmidlet under vakuum. Rense rester direkte ved hjælp af silica gel flash kolonne kromatografi.

3. installation af en funktionel enhed i de klikbare bur forbindelser

  1. Kobber (II) sulfat pentahydrat (249 mg) opløses i ionbyttet vand (IEW, 10 mL) for at give en 0,1 M CuSO4 opløsning.
  2. 2-paBhcmoc-PTX opløses (8,0 mg, 6,5 μmol), tris (3-hydroxypropyltriazolylmethyl) Amin (THPTA, 17,5 mg, 40,3 μmol), natrium l-Ascorbat (162,4 mg, 0,825 mmol) og 15-chloro-3, 6, 9-trioxapentadecyl-Azid (3,1 mg, 11 μmol) i et blandet opløsningsmiddel på 0,1 M fosfat buffer (2,5 mL, pH 7,2) og dimethylsulfoxid (DMSO, 0,5 mL).
  3. Tilsæt 0,1 M CuSO4 -opløsningen (81,2 μL, 8,1 μmol) til reaktionsblandingen. Blandingen omrøres ved omgivende temperatur i 80 min. Overvåg forløbet af reaktionen ved hjælp af højtydende væskekromatografi (HPLC).
  4. Bundfaldet opløses ved tilsætning af en 75% acetonitril/vand opløsning (3,5 mL). Anvend den resulterende opløsning direkte på det semi-præparative HPLC-system for at rense det ønskede produkt.
    Bemærk: Solubilisering af reaktionsblandingen ved tilsætning af tert-butanol kan fremskynde progression af reaktionen.

4. photolytic-ucaging reaktion af de bur forbindelser

  1. Klargøring af stamopløsninger
    1. Den ønskede bur-forbindelse (5 μmol) opløses i DMSO (500 μl) for at tilberede en 10 mm stamopløsning. En alikvot af hver opløsning (10 μL) dispenserer i et 1,5 mL mikrocentrifuge glas og opbevares i en fryser (− 20 °C) indtil lige før brug.
    2. 6 mM K3[Fe (C2O4)3] (100 ml): Opløs den omkrystalliserede kaliumferrioxalat (0,295 g, 0,675 mmol) i 80 ml vand. Tilsæt 0,5 M H2så4 (10 ml) og en passende mængde af iew at gøre op volumen til 100 ml.
      Bemærk: Kaliumferrioxalat skal renses via omkrystallisering fra varmt vand og opbevares i mørke. Endrystalliseret kalium ferrioxalat opnås som trihydrat; Derfor er dens formel K3[Fe (C2O4)3] · 3h2o og en formel vægt på 491,24 bør overvejes under tilberedning af stamopløsningen. Kontroller renheden af 6 mM opløsningen ved at måle dens absorption ved 510 nm. Hvis absorbansen er < 0,02, er den egnet til brug i forsøget.
    3. 0,1% buffer-Phen (30 mL): Opløs NaOAc · 3H2O (7,35 g), 1, 10-phenanthroline (Phen) · H2O (30 mg) og conc. H2så4 (0,9 ml) i iew (20 ml). Tilføj IEW for at gøre lydstyrken op til 30 mL.
      Bemærk: opløsningen indeholder 1,8 M NaOAc, 0,54 M H2så4, og 0,1% 1, 10-phenanthroline.
  2. Måling af antallet af fotoner ved brug af ferrioxalataktinometri
    1. Placer 6 mM K3[Fe (C2O4)3] (V1 L) i kvarts kuvette. Irradiate opløsningen med 350 nm lys for 5 s.
    2. Den bestrålede opløsning overføres til en Pyrex-kuvette med en længde på l [cm].
    3. Tilsæt 0,1% buffer-Phen (V2 L) til den bestrålede prøveopløsning, og bland godt ved pipettering. Prøvens absorbans måles ved 510 nm. Beregn den gennemsnitlige absorptions ændring pr. tidsenhed (ΔA510 [s− 1]).
    4. Beregn antallet af mol af genererede fe2 + ioner pr. tidsenhed i henhold til følgende ligning:
      NFE2 + [mol s− 1] = ((v1 + v2) [l] × ΔA510 [s− 1])/(L [cm] × ε510 [l mol− 1 cm− 1]),
      hvor (v1 + v2) er volumenet af prøven til absorptions målingen, er l den optiske stilængde af kuvetten, og ε510 er den molære absorption af fe2 +- Phen-kompleks ved 510 nm.
      Bemærk: i de typiske eksperimentelle betingelser, værdier v1 = 2,0 × 10− 3 l, v2 = 0,33 × 10− 3 l, L = 1,0 cm, og ε510 = 1,1 × 104 L mol− 1 cm− 1 blev anvendt.
    5. Beregn antallet af modermærker af fotoner, der når prøven (I0) ved hjælp af følgende formel:
      I0 [Einstein cm− 2 s− 1] = NFE2 +/Φ350
      hvor Φ 350 er kvante effektiviteten af fotoreduktion af ferrioxalat ved 350 nm.
      Bemærk: selv om kvante effektiviteten af kaliumferrioxalatactinometer ved 350 nm ikke rapporteres, blev den rapporterede værdi af 1,2542 ved 358 nm anvendt.
  3. Kvante effektivitetsmålinger ved 350 nm
    1. Prøve stamopløsningen fortyndes (i DMSO, 10 μL) med K-MOPS buffer (pH 7,2, 10 mL) for at give en 10 μM opløsning i K-MOPS indeholdende 0,1% DMSO.
      Bemærk: K-MOPS-bufferen bestod af 100 mM KCl og 10 mM 3-(N-morpholino) propanesulfonsyre (Mops) titreret til pH 7,2 med Koh.
    2. En alikvot opløsning (V1 L) overføres til samme kuvette, som anvendes ved foto virkningen af det kemiske aktinometer. Udstråle prøveopløsningen ved hjælp af samme opsætning som beskrevet i trin 4.2.1.
    3. Fjern en alikvot (50 μL) fra den bestrålede opløsning periodisk og analysér ved hjælp af HPLC.
    4. Fastlægge bestrålings tiden i sekunder, hvor 90% af udgangsmaterialet reagerede (t90%) ved at montere observationsområder for udgangsmaterialets tidsafhængige forsvinden.
      Bemærk: absorbansen af den bestrålede prøve skal holdes på < 0,1, således at den indvendige filtrering af strålingen kan ignoreres. Det er ønskeligt, at det fotolytiske forbrug af udgangsmaterialet kan tilnærtes ved enkelt eksponentiel forfald, således at der ikke er nogen uønsket sekundær effekt, der forstyrrer fotolyse processen.
    5. Beregn Quantum udbyttet af forsvinden (ΦDIS) ved hjælp af følgende ligning28:
      ΦDIS = 1/(t90% × I0 × σ350)
      hvor t90% [s] er bestrålings tiden, hvor 90% af udgangsmaterialet blev forbrugt, i0 [Einstein cm− 2 s− 1] er antallet af mol af fotoner, og σ350 [cm 2 mol− 1] er prøvens decadiske ekstinktionskoefficient ved 350 nm.
      Bemærk: σ350 [cm2 mol− 1] = 103ε350 [M− 1 cm− 1].

5. målretning af et klikbart bur sammensatte med en halotag ligand

Bemærk: før brug skal du vedligeholde HeLa-cellerne i Dulbecco's modificerede Eagle-medium (DMEM, lavt glucose, natriumpyruvat, l-glutamin) suppleret med 10% føtal bovint serum (FBS), der indeholder 1% antibiotika (streptomycin-sulfat, penicillin G og amphotericin) ved 37 °C og 5% CO2.

  1. Fjern mediet og trypsinisér cellerne ved behandling med trypsin-ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA, 1 mL) ved 37 °C i 1 min. Tilsæt DMEM (4 mL) til cellerne og re-suspendere cellerne ved pipettering forsigtigt. Frø ca. 5 × 105 celler pr. skål i 35 mm glasbund retter i DMEM (2 ml) 24 h før transfection.
  2. For fire retter, i et 1,5 mL mikrocentrifuge glas, fortyndes plasmid-DNA (pcDNA3-Halo-EGFR, 14 μg) i det reducerede serum medium (700 μL). Separat fortyndes lipofection reagens (5 μL) i det reducerede serum medium (150 μL) til hvert af fire rør og lader dem stå ved omgivende temperatur i 5 min.
  3. Tilsæt en del af det fortyndede plasmid-DNA (150 μL) til hver af de fortyndede lipofection reagens prøver. Inkuber ved omgivende temperatur i 5 min.
  4. Efter opretholdelse af cellerne ved 37 °C og 5% CO2 i 24 timer, ASPIRER DMEM og skyl cellerne med fosfat-bufferet saltvand (PBS, 2 ml). Tilsæt det reducerede serum medium (1,5 mL).
  5. Tilsæt plasmid-lipofection reagens (150 μL) kompleks til hver skål. Cellerne fastholdes ved 37 °C og 5% CO2 for 48 h.
  6. Aspirér mediet, tilsæt en portion frisk tilberedt DMEM (1 mL) indeholdende 2 μM paBhc-hex-FITC/Halo, og Inkuber cellerne ved 37 °C og 5% CO2 i 30 min.
  7. Aspirer mediet, der indeholder det bur sammensatte, og skyl cellerne to gange med PBS + (1 ml pr. skylning) for at fjerne ubundne forbindelser. Tilsæt det reducerede serum medium (500 μL), og Inkuber cellerne ved 37 °C og 5% CO2 i 30 minutter for at fjerne de forbindelser, der indgik i cellerne.
    Bemærk: PBS + er fosfat-bufferet saltvand suppleret med 2 mM CaCl2 og 1 mm mgcl2.
  8. Fjern mediet, og skyl cellerne to gange med PBS + (1 mL). Tilsæt en del af et medium (1 mL), der ikke indeholder phenol rødt. Optag fluorescensbilleder ved Laserscanning Konfokal Fluorescens mikroskopi.

6. photomediated modulation af en kinase lokalisering ved hjælp af et klikbart bur sammensatte

Bemærk: før brug skal du vedligeholde CHO-K1-cellerne i skinke F-12-medium suppleret med 10% FBS ved 37 °C og 5% CO2.

  1. Forbered en 100 × arbejdsopløsning (1 mM) af paBhc-AA (5) i DMSO.
    Bemærk: en 10 mM stamopløsning af forbindelsen tilberedes og opbevares i en fryser (-20 °C).
  2. Frø ca. 5 × 105 celler pr. skål i 35 mm glasbund retter i DMEM (2 ml) 24 h før transfection.
  3. Transfect CHO-K1 celler med en plasmid kodning for GFP-DGKγ 48 h før de onder forsøg.
    Bemærk: Transfection udføres i henhold til trin 5.2 – 5.5.
  4. Udskift mediet med et reduceret serum medium (2 mL). Tilsæt 100 × paBhc-AA-arbejdsopløsningen (20 μL), og Inkuber cellerne ved 37 °C og 5% CO2 i mellem 5 min og 1 time.
    Bemærk: indlæsningstiden afhænger af den anvendte forbindelse.
  5. Placer cellerne på den objektive fase af et inverteret fluorescerende mikroskop udstyret med en fluorescens lampe med to lyskilder.
  6. Tag et fluorescerende billede hver 10 s. Irradiate cellerne med 330 – 385 nm lys gennem et mikroskop mål for en passende tid. Alternativt, bestråle cellerne med 405 nm lys ved hjælp af en XE lampe gennem fleksible kvarts fibre.
  7. Fortsæt med at optage fluorescerende billeder i 10 min.

Representative Results

Klikbare bur forbindelser af nogle biologisk interessante molekyler, herunder arachidonsyre og paclitaxel, blev med succes syntetiseret (figur 1)28,41. Yderligere egenskaber såsom vandopløselighed og cellulære målretnings evne blev introduceret i paBhcmoc-PTX via kobber (I)-katalyseret Huisgen cyklisering ("Click"-reaktion) (figur 2). Disse klikbare bur ptxs blev derefter photolyzed til at producere deres forælder ptxs ved bestråling ved 350 nm (figur 3), og de fysiske og foto kemiske egenskaber af de klikbare bur forbindelser er opsummeret i tabel 1. Quantum-udbyttet af klikbare bur-forbindelser 2-GLC-pabhcmoc-PTX(φDIS 0,14) og pabhc-AA(φDIS 0,083) var mere end dobbelt så meget som de konventionelle BHC-bur-forbindelser 2-bhcmoc-PTX (φDIS 0,040) og BHC-AA (Φdis 0,038)43. Desuden blev der observeret en forbedret vandopløselighed for 2-GLC-paBhcmoc-PTX, som indeholder en glucoseparthed.

I levende celle eksperimenter blev målretningen af paBhc-hex-FITC/Halo til de dyrkede pattedyrsceller, der transitivt udtrykker et fusionsprotein af et HaloTag-protein og epidermal vækstfaktor receptor (EGFR), opnået med succes. Grøn fluorescens af fluorescein delen af paBhc-hex-FITC/Halo blev observeret på cellemembranen (figur 4). Der blev opnået foto medieret graduering af den subcellulære lokalisering af en kinase ved hjælp af en pabhc-bur-forbindelse. Translokation af diacylglycerinkinase γ (DGKγ) er blevet rapporteret til at være aktiveret ved tilstedeværelse af arachidonsyre (AA)44. CHO-K1-celler, der i forbigående udtrykker GFP-DGKγ, blev behandlet med enten AA eller paBhc-AA (5). Tilsætning af AA forårsagede modulationen af den subcellulære lokalisering af DGKγ (figur 5A, B). Tilsvarende ændringer i lokaliseringen af DGKγ blev observeret for de paBhc-AA-behandlede celler efter udsættelse for UV-lys (figur 5C, D).

Figure 1
Figur 1: klargøring af de klikbare bur forbindelser.
A) reagenser og betingelser: a. ethyl 4-chloracetoacetat/conc. H2so4/rt/7 dage/91% afkast, b. 1 M HCL/reflux/3 dage/97% udbytte. c. N-methylpropargylamin/HCHO/EtOH, tilsæt derefter (1) og Opvarm ved refluks for 17 t/79% udbytte. (B) synteser af de klikbare bur Amin, PTX, og arachidonsyre. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: installation af funktionelle enheder i klikbare bur forbindelser.
A) syntese af et vandopløseligt, bur PTX via kobber (i)-katalyseret huisgen-cyklisering. (B) strukturer af klikbare bur forbindelser, der indeholder halotag ligand for cellulær målretning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Photolyse af 2-GLC-paBhcmoc-PTX (6).
Prøver (10 μM) i K-MOPS opløsning (pH 7,2) blev bestrålet ved 350 nm. A) typiske HPLC-spor for fotolysen på 6 (målt ved 254 nm). Prøverne blev analyseret ved den specificerede bestrålings tid. B) tidsforløb for fotolysen af 6. Blå cirkler viser forbruget af 6. Den solide linje viser den mindste kvadraters kurve, der passer til en simpel rådnende eksponentiel for 6. Røde firkanter viser udbyttet af PTX. Fejllinjerne repræsenterer standardafvigelsen (± SD). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: fluorescensbilleder af dyrkede pattedyrsceller inkuberet med paBhc-hex-FITC/Halo (8).
Celler transficeret med pcDNA3-Halo-EGFR blev inkuberet med en 2 μM opløsning af sammensatte 8 ved 37 °c i 30 min. Billederne blev opnået efter gentagen vask med PBS +. Mock-behandlede HEK293T celler (A: differential interferens kontrast (dic) billede og D: fluorescens billede). HEK293T celler (b og e) og Hela celler (C og F) transitivt udtrykker Halo-EGFR (b og C: dic billeder og e og F: fluorescensbilleder). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: fluorescensbilleder efter UV-bestråling af Cho-K1-cellerne inkuberet med BHC bur arachidonsyre. CHO-K1-celler blev transficeret med et fusionsprotein DGKγ-EGFP.
A) et fluorescens billede af de transficeret celler. B) 100 s efter tilsætning af en 10 μM opløsning af arachidonsyre. C) cellerne blev inkuberet med en 10 μM-opløsning af pabhc-AA (5) ved 37 °c i 5 min. (D) 100 s efter 20-s UV-bestråling (330 – 385 nm). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Forbindelser λMax (nm)a εMax (M-1 cm-1)b φDISc εφDISd Opløselighed (μM)e
Ptx 1,0
2 '-bhcmoc-PTX 340 10500 0,040 400 55
2 '-paBhcmoc-PTX 359 9300 0,059 670 8,3
2 '-GLC-Bhcmoc-PTX 373 12300 0,14 1280 650
BHC-AA 341 10800 0,038 390
paBhc-AA 366 10300 0,083 750

Tabel 1: fysiske og foto kemiske egenskaber af de klikbare bur forbindelser.
a. absorptionsmaksimum (nm), b. molær absorptionsevne ved λMax (M− 1 cm− 1), c. kvanteudbytte af råvarernes forsvinden ved 350 nm, d. Produktet af molær absorptivitet og Quantum udbyttet af forsvinden ved 350 nm, e. Koncentrationen af den mættede opløsning i K-MOPS (pH 7,2) (μg mL− 1).

Discussion

Vi har tidligere udviklet BHC bur forbindelser af forskellige biologisk aktive molekyler, der udviser høj fotolytiske effektivitetsgevinster28,45,46,47. Med det formål at udvide repertoiret af BHC anbringelse grupper, vi også rapporteret platforme af modulære bur forbindelser, der kan ændres nemt ved indførelsen af forskellige funktionelle enheder32,40,41. Denne protokol repræsenterer derfor en metode til syntese af en klikbart forløber for BHC anbringelse grupper, der kan modificeres via kobber (I)-katalyseret huisgen cyklisering. Syntesen af den klikbare forløber, paBhcCH2Oh (2), blev opnået via en fire-trins reaktions sekvens startende fra den kommercielt tilgængelige 4-bromoresorcinol (figur 1a). Fordelen ved denne protokol er, at der ikke er behov for besværlige rensningstrin (f. eks. kolonne kromatografiske separationer).

Som klikbare forløber pabhcch2Oh (2) kan bruges til at maskere forskellige funktionelle grupper, klikbare bur forbindelser af aminer, alkoholer, og carboxylsyrer blev syntetiseret ved hjælp af 2 som forløber (figur 1b). Aminer blev modificeret som deres carbamater, mens alkoholer blev modificeret som deres carbonater. I generelle procedurer 1 og 2 blev CDI anvendt til fremstilling af klikbare carbamater, mens 4-nitrophenyl chloroformat blev anvendt til fremstilling af carbonater. Som det fremgår af reaktions mekanismen, kan begge reagenser anvendes til fremstilling af carbamater og carbonater. Det skal også bemærkes, at udbyttet af den ønskede bur sammensatte afhænger af den kemiske struktur af molekyle, der skal bur. Andre eksempler kan ses i vores tidligere rapporter28,30,33,48.

Klik på ændring blev derefter udført ved hjælp af en mindre ændring af den rapporterede procedure49. Tilsætning af tris (triazolylmethyl) Amin-baserede ligander er nødvendig for at opnå de ønskede produkter i god til høje udbytter. Da en række azider er let tilgængelige både fra kommercielle kilder og fra litteratur procedurer, kan vi forberede forskellige modulære bur forbindelser med yderligere egenskaber såsom vandopløselighed og cellulære målretning evne (figur 2).

Kvante udbyttet af photolyse blev derefter målt i henhold til en rapporteret procedure28,50. Figur 3 viser, at det fotolytiske forbrug af 2-GLC-paBhcmoc-PTX og frigivelsen af PTX var tilnærmende ved en enkelt eksponentiel henfald og stigning, hvilket antyder, at der ikke var nogen indre filtrering af strålingen eller uønskede sekundære virkninger. Der blev observeret forbedrede kvante udbytter (Φ) og fotolyse-effektivitet (εφ) for de klikbare pabhc-bur-forbindelser sammenlignet med de tidligere rapporterede BHC-bur-forbindelser (tabel 1)41 . 43. da fotolysis-effektiviteten (εφ) af BHC-bur-forbindelser er mere end 100 gange højere end for 2-nitrobenzyl-type-bur-forbindelser48, er den markante forbedring på grund af tilstedeværelsen af pabhc-anbringelse-grupper klart en fordel for dette system.

Som et proof-of-concept-eksperiment blev en hydrofile-delen introduceret i 2 '-paBhcmoc-PTX (4) og en cellulær målrettethed blev introduceret i sammensatte 3 (figur 2). Vandopløseligheden af 2-GLC-paBhcmoc-PTX var 650 gange højere end for moderselskabet PTX (tabel 1). Selektiv cellulær målretning blev opnået ved hjælp af et tag-Probe system, og paBhcmoc-hex-FITC/Halo (8) med halotag ligand blev med succes målrettet til cellemembranen af dyrkede pattedyrsceller, der udtrykker halotag/EGFR fusion protein ( Figur 4). Foto medieret graduering af den subcellulære lokalisering af en kinase blev også opnået ved hjælp af et klikbart bur sammensatte 5 (figur 5).

Afslutningsvis, vi med succes demonstreret en metode til fremstilling af klikbare platforme for foto-caged forbindelser af biologisk interessante molekyler, der kan ændres nemt med yderligere egenskaber, såsom vandopløselighed og en cellulær målretning evne. Da pabhc anbringelse-gruppen kan anvendes til at forberede eventuelle molekyler med modificerbare funktionelle grupper, er anvendelsen af denne protokol ikke begrænset til de molekyler, der er beskrevet heri. Ved hjælp af en modulær platform, nemlig pabhc anbringelse gruppe, de ønskede bur forbindelser kan let forberedes, og deres fysiske og kemiske egenskaber kan moduleres via Click modifikation.

Disclosures

Vi har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af JSPS KAKENHI Grant Number JP16H01282 (TF), en støtte til videnskabelig forskning i innovative områder "Memory dynamik" og JP19H05778 (TF), "MolMovies."

Materials

Name Company Catalog Number Comments
acetonitrile, EP Nacalai 00404-75
acetonitrile, super dehydrated FUJIFILM Wako 010-22905
Antibiotic-Antimycotic, 100X Thermo Fisher 15240062
4-bromoresorcinol TCI Chemicals B0654
N,N’-carbonyldiimidazole FUJIFILM Wako 034-10491
chloroform Kanto 07278-71
Copper (II) Sulfate Pentahydrate, 99.9% FUJIFILM Wako 032-12511
dichloromethane, dehydrated Kanto 11338-05
N,N'-Diisopropylcarbodiimide (DIPC) TCI Chemicals D0254
4-dimethylaminopyridine TCI Chemicals D1450
dimethylsulfoxide, dehydrated -super- Kanto 10380-05
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium Sigma D6046-500ML
dual light source fluorescence illuminator, IX2-RFAW Olympus
Ethanol (99.5) FUJIFILM Wako 054-07225
Ethyl 4-Chloroacetoacetate TCI Chemicals C0911
Ham's F-12 with L-Glutamine and Phenol Red FUJIFILM Wako 087-08335
hydrochloric acid FUJIFILM Wako 087-01076
inverted fluorescent microscope IX-71 Olympus
ISOLUTE Phase Separator, 15 mL Biotage 120-1906-D
L-(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt FUJIFILM Wako 196-01252
laser scanning fluorescence confocal microscopy, FLUOVIEW FV1200/IX-81 Olympus
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher 11668027 lipofection reagent
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Dojindo 345-01804 MOPS
4-nitrophenylchloroformate (4-NPC) TCI Chemicals C1400
Opti-MEM I Reduced Serum Medium, no phenol red Thermo Fisher 11058021 reduced serum medium contains no phenol red
1,10-Phenanthroline Monohydrate Nacalai 26707-02
Photochemical reactor with RPR 350 nm lamps Rayonet
Potassium Trioxalatoferrate (III) trihydrate FUJIFILM Wako W01SRM19-5000
Sodium Acetate Trihydrate Nacalai 31115-05
Sodium Bicarbonate FUJIFILM Wako 199-05985
Sulfuric Acid, 96-98% FUJIFILM Wako 190-04675
Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA) ALDRICH 762342-100MG
tri-Sodium Citrate Dihydrate Nacalai 31404-15
Xenon light source, MAX-303 Asahi Spectra

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mayer, G., Heckel, A. Biologically active molecules with a "light switch". Angewandte Chemistry International Edition. 45 (30), 4900-4921 (2006).
  2. Bort, G., Gallavardin, T., Ogden, D., Dalko, P. I. From One-Photon to Two-Photon Probes: Caged” Compounds, Actuators, and Photoswitches. Angewandte Chemistry International Edition. 52 (17), 4526-4537 (2013).
  3. Klan, P., et al. Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy. Chemical Reviews. 113 (1), 119-191 (2013).
  4. Abe, M., et al. Design and Synthesis of Two-Photon Responsive Chromophores for Near-Infrared Light-Induced Uncaging Reactions. Synthesis-Stuttgart. 49 (15), 3337-3346 (2017).
  5. Ankenbruck, N., Courtney, T., Naro, Y., Deiters, A. Optochemical Control of Biological Processes in Cells and Animals. Angewandte Chemistry International Edition. 57 (11), 2768 (2018).
  6. Hou, Y., Zhou, Z., Huang, K., Yang, H., Han, G. Long Wavelength Light Activated Prodrug Conjugates for Biomedical Applications. ChemPhotoChem. 2, 1005 (2018).
  7. Engels, J., Schlaeger, E. J. Synthesis, structure, and reactivity of adenosine cyclic 3',5'-phosphate benzyl triesters, Rapid photolytic release of adenosine 5'-triphosphate from a protected analogue: utilization by the Na:K pump of human red blood cell. Journal of Medicinal Chemistry. 20 (7), 907-911 (1977).
  8. Kaplan, J. H., Forbush, B., Hoffman, J. F. Rapid photolytic release of adenosine 5'-triphosphate from a protected analogue: utilization by the Na:K pump of human red blood cell ghosts. Biochemistry. 17 (10), 1929-1935 (1978).
  9. Park, C. H., Givens, R. S. New Photoactivated Protecting Groups. 6. p-Hydroxyphenacyl: A Phototrigger for Chemical and Biochemical Probes. Journal of the American Chemical Society. 119 (10), 2453-2463 (1997).
  10. Hasan, A., et al. Photolabile protecting groups for nucleosides: synthesis and photo-deprotection rates. Tetrahedron. 53 (12), 4247-4264 (1997).
  11. Heckel, A., Mayer, G. Light regulation of aptamer activity: an anti-thrombin aptamer with caged thymidine nucleobases. Journal of the American Chemical Society. 127 (3), 822-823 (2005).
  12. Papageorgiou, G., Corrie, J. E. T. Effects of aromatic substituents on the photocleavage of 1-acyl-7-nitroindolines. Tetrahedron. 56 (41), 8197-8205 (2000).
  13. Matsuzaki, M., Ellis-Davies, G. C., Nemoto, T., Miyashita, Y., Iino, M., Kasai, H. Dendritic spine geometry is critical for AMPA receptor expression in hippocampal CA1 pyramidal neurons. Nature Neuroscience. 4 (11), 1086-1092 (2001).
  14. Givens, R. S., Matuszewski, B. Photochemistry of phosphate esters: an efficient method for the generation of electrophiles. Journal of the American Chemical Society. 106 (22), 6860-6861 (1984).
  15. Furuta, T., Torigai, H., Sugimoto, M., Iwamura, M. Photochemical Properties of New Photolabile cAMP Derivatives in a Physiological Saline Solution. Journal of Organic Chemistry. 60 (13), 3953-3956 (1995).
  16. Hagen, V., Frings, S., Wiesner, B., Helm, S., Kaupp, U. B., Bendig, J. 7-(Dialkylamino)coumarin-4-yl]methyl-Caged Compounds as Ultrafast and Effective Long-Wavelength Phototriggers of 8-Bromo-Substituted Cyclic Nucleotides. ChemBioChem. 4 (5), 434-442 (2003).
  17. Momotake, A., Lindegger, N., Niggli, E., Barsotti, R. J., Ellis-Davies, G. C. The nitrodibenzofuran chromophore: a new caging group for ultra-efficient photolysis in living cells. Nature Methods. 3 (1), 35-40 (2006).
  18. Specht, A., et al. New photoremovable protecting groups for carboxylic acids with high photolytic efficiencies at near-UV irradiation. Application to the photocontrolled release of L-glutamate. ChemBioChem. 7 (11), 1690-1695 (2006).
  19. Petersen, S., Alonso, J. M., Specht, A., Duodu, P., Goeldner, M., del Campo, A. Phototriggering of cell adhesion by caged cyclic RGD peptides. Angewandte Chemistry International Edition. 47 (17), 3192-3195 (2008).
  20. Heckman, L. M., et al. Design and Synthesis of a Calcium-Sensitive Photocage. Angewandte Chemistry International Edition. 55 (29), 8363-8366 (2016).
  21. Olson, J. P., Banghart, M. R., Sabatini, B. L., Ellis-Davies, G. C. Spectral Evolution of a Photochemical Protecting Group for Orthogonal Two-Color Uncaging with Visible Light. Journal of the American Chemical Society. 135 (42), 15948-15954 (2013).
  22. Gandioso, A., et al. Sequential Uncaging with Green Light can be Achieved by Fine-Tuning the Structure of a Dicyanocoumarin Chromophore. ChemistryOpen. 6 (3), 375-384 (2017).
  23. Bassolino, G., Nancoz, C., Thiel, Z., Bois, E., Vauthey, E., Rivera-Fuentes, P. Photolabile coumarins with improved efficiency through azetidinyl substitution. Chemical Science. 9 (2), 387-391 (2018).
  24. Lin, Q. N., et al. Coumarin Photocaging Groups Modified with an Electron-Rich Styryl Moiety at the 3-Position: Long-Wavelength Excitation, Rapid Photolysis, and Photobleaching. Angewandte Chemistry International Edition. 57 (14), 3722-3726 (2018).
  25. Nani, R. R., et al. In Vivo Activation of Duocarmycin-Antibody Conjugates by Near-Infrared Light. ACS Central Science. 3 (4), 329-337 (2017).
  26. Umeda, N., et al. Boron Dipyrromethene As a Fluorescent Caging Group for Single-Photon Uncaging with Long-Wavelength Visible Light. ACS Chemical Biology. 9 (10), 2242-2246 (2014).
  27. Slanina, T., et al. In Search of the Perfect Photocage: Structure–Reactivity Relationships in meso-Methyl BODIPY Photoremovable Protecting Groups. Journal of the American Chemical Society. 139 (42), 15168-15175 (2017).
  28. Furuta, T., et al. Brominated 7-hydroxycoumarin-4-ylmethyls: Photolabile protecting groups with biologically useful cross-sections for two photon photolysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (4), 1193-1200 (1999).
  29. Furuta, T., et al. Bhc-cNMPs as either water-soluble or membrane-permeant photoreleasable cyclic nucleotides for both one- and two-photon excitation. ChemBioChem. 5 (8), 1119-1128 (2004).
  30. Suzuki, A. Z., et al. Coumarin-4-ylmethoxycarbonyls as phototriggers for alcohols and phenols. Organic Letters. 5 (25), 4867-4870 (2003).
  31. Ando, H., Furuta, T., Tsien, R. Y., Okamoto, H. Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos. Nature Genetics. 28 (4), 317-325 (2001).
  32. Teraoka, A., Murakoshi, K., Fukamauchi, K., Suzuki, A. Z., Watanabe, S., Furuta, T. Preparation and affinity-based purification of caged linear DNA for light-controlled gene expression in mammalian cells. Chemical Communications. 50 (6), 664-666 (2014).
  33. Watanabe, T., et al. Synthesis of nucleobase-caged peptide nucleic acids having improved photochemical properties. Organic and Biomolecular Chemistry. 12 (28), 5089-5093 (2014).
  34. Horinouchi, T., Nakagawa, H., Suzuki, T., Fukuhara, K., Miyata, N. A novel mitochondria-localizing nitrobenzene derivative as a donor for photo-uncaging of nitric oxide. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 21 (7), 2000-2002 (2011).
  35. Leonidova, A., et al. Photo-induced uncaging of a specific Re(I) organometallic complex in living cells. Chemical Science. 5 (10), 4044-4056 (2014).
  36. Nadler, A., et al. Exclusive photorelease of signalling lipids at the plasma membrane. Nature Communications. 6, 10056 (2015).
  37. Feng, S. H., et al. Mitochondria-specific photoactivation to monitor local sphingosine metabolism and function. Elife. 7, e34555 (2018).
  38. Wagner, N., Stephan, M., Hoglinger, D., Nadler, A. A Click Cage: Organelle-Specific Uncaging of Lipid Messengers. Angewandte Chemistry International Edition. 57 (40), 13339-13343 (2018).
  39. Feng, S., Harayama, T., Chang, D., Hannich, J. T., Winssinger, N., Riezman, H. Lysosome-targeted photoactivation reveals local sphingosine metabolism signatures. Chemical Science. 10 (8), 2253-2258 (2019).
  40. Furuta, T., Manabe, K., Teraoka, A., Murakoshi, K., Ohtsubo, A., Suzuki, A. Design, synthesis, and photochemistry of modular caging groups for photoreleasable nucleotides. Organic Letters. 14 (24), 6182-6185 (2012).
  41. Suzuki, A. Z., et al. A clickable caging group as a new platform for modular caged compounds with improved photochemical properties. Chemical Communications. 55 (4), 451-454 (2019).
  42. Hatchard, C. G., Parker, C. A. A new sensitive chemical actinometer - II. Potassium ferrioxalate as a standard chemical actinometer. Proceedings of the Royal Society A. 235 (1203), 518-536 (1956).
  43. Furuta, T., Nishiyama, K., Manabe, A., Fukuoka, M., Iwamura, M. Design, synthesis and photochemical properties of caged compounds of lipid mediators. Proceedings of the ISBC. , 124-125 (2003).
  44. Shirai, Y., Segawa, S., Kuriyama, M., Goto, K., Sakai, N., Saito, N. Subtype-specific Translocation of Diacylglycerol Kinase ? and ? and Its Correlation with Protein Kinase C. The Journal of Biological Chemistry. 275 (32), 24760-24766 (2000).
  45. Furuta, T., Noguchi, K. Controlling cellular systems with Bhc-caged compounds. TrAC, Trends in Analytical Chemistry. 23 (7), 511-519 (2004).
  46. Furuta, T. Designing caged compounds for spatiotemporal control of cellular chemistry. Journal of the Synthetic Organic Chemistry Japan. 69 (11), 1164-1169 (2012).
  47. Furuta, T. Coumarin-4-ylmethyl Phototriggers. Dynamic Studies in Biology: Phototriggers, Photoswitches and Caged Biomolecules. Goeldner, M., Givens, R. S. , WILEY-VCH. 29-55 (2005).
  48. Furuta, T., Watanabe, T., Tanabe, S., Sakyo, J., Matsuba, C. Phototriggers for Nucleobases with Improved Photochemical Properties. Organic Letters. 9 (23), 4717-4720 (2007).
  49. Manova, R., van Beek, T. A., Zuilhof, H. Surface Functionalization by Strain-Promoted Alkyne–Azide Click Reactions. Angewandte Chemistry International Edition. 50 (24), 5428-5430 (2011).
  50. Adams, S. R., Kao, J. P. Y., Grynkiewicz, G., Minta, A., Tsien, R. Y. Biologically Useful Chelators That Release Ca2+ Upon Illumination. Journal of the American Chemical Society. 110 (10), 3212-3220 (1988).

Tags

Kemi udgave 152 bur forbindelser syntese fotokemi klik kemi prodrug kemisk biologi kemiske sonder
Design, syntese, og foto kemiske egenskaber af klikbare Caged forbindelser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Suzuki, A. Z., Shiraishi, Y., Aoki,… More

Suzuki, A. Z., Shiraishi, Y., Aoki, H., Sasaki, H., Watahiki, R., Furuta, T. Design, Synthesis, and Photochemical Properties of Clickable Caged Compounds. J. Vis. Exp. (152), e60021, doi:10.3791/60021 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter