Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Design, syntes och fotokemiska egenskaper hos klickbara Caged föreningar

Published: October 15, 2019 doi: 10.3791/60021
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biomolecular Science, Faculty of Science, Toho University

Summary

Ett protokoll för syntes och mätning av de fotokemiska egenskaperna hos modulära bur föreningar med klickbara komponenter presenteras.

Abstract

Caged föreningar möjliggöra foto-medierad manipulation av cellfysiologi med hög spatiotemporal upplösning. Den begränsade strukturella mångfalden av nu tillgängliga placer ing grupper och svårigheterna med syntetisk modifiering utan att offra deras fotolys effektivitetsvinster är dock hinder för att utvidga repertoaren av bur föreningar för levande cell Program. Som kemisk modifiering av kumarin-typ foto-caging grupper är en lovande metod för beredning av bur föreningar med olika fysikaliska och kemiska egenskaper, Vi rapporterar en metod för syntes av klickbara bur föreningar som kan ändras enkelt med olika funktionella enheter via förkoppra (I)-katalyseras Huisgencyclization. Den modulära plattformen molekylen innehåller en (6-Bromo-7-hydroxycoumarin-4-yl) metyl (BHC) grupp som en foto-caging grupp, som uppvisar en hög fotolys effektivitet jämfört med de konventionella 2-nitrobenzyls. Allmänna förfaranden för beredning av klickbara bur föreningar som innehåller aminer, alkoholer och karboxylater presenteras. Ytterligare egenskaper såsom vattenlöslighet och cellinriktning förmåga kan lätt införlivas i klickbara bur föreningar. Dessutom mättes de fysikaliska och fotokemiska egenskaperna, inklusive fotolysis Quantum Yield, och befanns vara överlägsna dem hos motsvarande BHC-bur föreningar. Det beskrivna protokollet kan därför anses vara en potentiell lösning för bristen på strukturell mångfald i de tillgängliga bur föreningarna.

Introduction

Bur föreningar är utformade syntetiska molekyler vars ursprungliga funktioner tidsmässigt maskeras av kovalent bifogade foto-löstagbara skydda grupper. Intressant, Bur föreningar av biologiskt relevanta molekyler ger en oumbärlig metod för spatiotemporal kontroll av cellulär fysiologi1,2,3,4,5 ,6. I 1977, Engels och Schlaeger anmälde 2en-nitrobenzyl Ester av lägret som ett genomträngligt membran och photolabile derivata av lägret7. Följande år, Kaplan rapporterade 1-(2-nitrofenyl) etylester av ATP (NPE-ATP) och namngivna denna sammansatta "bur" ATP8. Sedan dess har ett sortiment av fotokemiskt löstagbara skyddsgrupper såsom 2-nitrobenzyls, p-hydroxifenacyls-9, 2-(2-nitrofenyl) etyler10,11, 7-nitroindolin-1-yls12, 13, och (kumarin-4-yl) methyls14,15,16 har använts för beredning av bur föreningar.

Syntesen av bur föreningar med önskvärda ytterligare egenskaper såsom membran permeabilitet, vattenlöslighet, och cellulära inriktning förmåga skulle förväntas underlätta cellbiologiska tillämpningar. Eftersom de fysikaliska och fotokemiska egenskaperna hos dessa molekyler främst beror på den kemiska strukturen hos de fotokemiskt avtagbara skyddsgrupper som används för att förbereda dem, krävs en mångsidig repertoar av fotocaging-grupper. Men den strukturella mångfalden av närvarande tillgängliga placer ing grupper som uppvisar höga fotolys effektivitetsvinster är begränsad. Detta kan vara ett hinder för att öka användningen av bur föreningar.

För att lösa detta problem har repertoaren av foto-caging grupper utökats genom kemisk modifiering av befintliga photoremovable skyddande grupper eller utformningen av nya photolabile förekommer med överlägsen foto fysikaliska och fotokemiska egenskaper. Exempel är nitrodibenzofuran (ndbf)17, [3-(4,5-dimetoxi-2-nitrofenyl) -2-butyl] (dmnpb)18,19, en kalcium-Sensitive 2-nitrobensylphotocage20, substituerade coumarinylmethyls (DEAC45021 , Deadccm22, 7-azetidinyl-4-methylcoumarin23, och styryl Kumariner24), cyanin derivat (cyet-Pan)25, och bodipy derivat26,27.

Dessutom har vi tidigare utvecklat (6-Bromo-7-hydroxycoumarin-4-yl) metyl (BHC) grupp och framgångsrikt syntetiseras olika bur föreningar av neurotransmittorer28, andra budbärare29,30, och oligonukleotides31,32,33 uppvisar stora en-och två-Photon excitation tvärsnitt. Om ytterligare egenskaper kan installeras enkelt i placer ing grupper utan att äventyra deras ljuskänslighet, då repertoaren av bur föreningar kan utökas34,35,36, 37,38,39. Vi konstruerade därför modulära bur föreningar som består av tre delar, nämligen BHC-gruppen som en foto-lyhörd kärna, kemiska handtag för installation av ytterligare funktioner, och de molekyler som ska maskeras40, 41.

Sålunda, denna artikel ger en praktisk metod för beredning av bur föreningar av biologiskt relevanta molekyler. Det nuvarande protokollet beskriver metoder för att förbereda en klickbar plattform för foto-caging grupper, införandet av ytterligare funktioner för att utöka repertoaren av bur föreningar, mätning av deras fysiska och fotokemiska celltyp selektiv inriktning av en klickbar bur förening för ytterligare cellulära program.

Protocol

1. syntes av den modulära placer ing pabhc Group för klickbara bur föreningar28,41

  1. Beredning av (6-Bromo-7-hydroxykumarin-4-yl) metylklorid (BHC-CH2cl)
    1. Placera 4-bromresorcinol (9,742 g, 51,5 mmol) i en 100 mL rundbottnad kolv utrustad med en omröraren bar.
    2. Tillsätt conc. H2so4 (98%, 30 ml) till kolven och rör blandningen för att lösa upp.
    3. Tillsätt etyl4-kloracetoacetat (10 mL, 74 mmol) droppvis.
    4. Fortsätt omrörning blandningen vid omgivningstemperatur i 5 dagar.
    5. Var för sig, placera krossade isbitar (~ 200 mL) i en 500 mL Erlenmeyer-kolv.
    6. Häll reaktionsblandningen i isen och rör kraftigt i 30 min tills en fint pulveriserad fällningen erhålls.
    7. Samla upp fällningsmedlet via vakuum filtrering. Tvätta den ljusbruna fällningen med vatten fem gånger.
    8. Torka fällningen under vakuum över natten för att ge BhcCH2cl som ett ljusbrunt pulver (13,57 g, 46,9 mmol).
  2. Beredning av (6-Bromo-7-hydroxykumarin-4-yl) metanol (BhcCH2OH)
    1. Placera den beredda BhcCH2Cl (1,1440 g, 3,95 mmol) och 1 M HCl (300 ml) i en 1 L rundkolv utrustad med en dimroth-kondensator. Rör blandningen vid 140 ° c i 5 dagar. Efter denna tid, kyla blandningen till omgivningstemperatur.
    2. Ta bort vattnet från reaktionen genom roterande avdunstning under vakuum för att ge BhcCH2OH (1) som en ljusbrun pulver (1,0359 g, 3,82 mmol, 97% avkastning).
      Anmärkning: användning av 250 mL 1 M HCl per 1 g BhcCH2cl ger ett tillfredsställande resultat.
  3. Beredning av paBhcCH2OH (2) via Mannich-reaktionen
    1. Placera PARAFORMALDEHYD (446,4 mg, 14,9 mmol) i en 50 mL rundbottnad kolv. Tillsätt vattenfri etanol (5 mL) och N-metylpropargylamin (1,25 mL, 14,8 mmol) till kolven.
    2. Rör blandningen vid omgivningstemperatur under 1 h under en ar-atmosfär.
    3. Tillsätt BhcCH2OH (1) (1,367 g, 5,04 mmol) till kolven. Värm blandningen till 80 ° c med en block värmare apparat, och fortsätt omrörning blandningen vid 80 ° c för 2 h under en ar atmosfär.
    4. Stoppa block värmare och kyla reaktionsblandningen till rumstemperatur.
    5. Samla den resulterande ljusbrun-gul fällnings genom vakuum filtrering. Tvätta fällningen två gånger med en liten mängd vattenfri etanol (1 mL varje gång).
    6. Ta bort överflödig etanol under vakuum för att ge paBhcCH2OH (2) (1,393 g, 3,96 mmol).

2. beredning av klickbara bur föreningar

Anmärkning: följande procedurer kan tillämpas på beredning av andra klickbara bur föreningar som innehåller hydroxyl, amino, och karboxylate funktionella grupper.

  1. Allmänt förfarande 1: beredning av en klickbar bur Amine
    1. Placera pabhcch2OH (2) (709,6 mg, 2,02 mmol) och n,n '-Karbonylklorid diimidazol (CDI, 397,6 mg, 2,45 mmol) i en 30 ml rundbottnad kolv. Tillsätt torr CH2cl2 (6 ml) och rör lösningen vid omgivningstemperatur under 1 h.
    2. Tillsätt 4-dimetylaminopyridin (4-DMAP, 324,8 mg, 2,66 mmol) och tert-butyl (6-aminohexyl) karbamat (533,1 mg, 2,46 mmol). Rör om lösningen vid omgivningstemperatur under 3 timmar.
    3. Ta bort lösningsmedlet och andra flyktiga ämnen med hjälp av en roterande indunstare under vakuum. Rena återstoden direkt med hjälp av kiselgel blixt kolonnkromatografi.
  2. Allmänt förfarande 2: beredning av en klickbar alkohol i bur
    1. Placera paklitaxel (PTX, 48,7 mg, 0,057 mmol) i en 30 mL rundbottnad kolv utrustad med trevägsstopcock och en ar-ballong. Tillsätt torr CH2cl2 (1 ml), 4-dmap (17,1 mg, 0,14 mmol), och 4-nitrofenyl chloroformate (26,0 mg, 0,13 mmol).
    2. Rör om lösningen vid omgivningstemperatur under 2,5 h under en ar-atmosfär.
    3. Tillsätt 4-DMAP (15,7 mg, 0,13 mmol) och paBhcCH2OH (2) (39,1 mg, 0,111 mmol) till lösningen. Fortsätt omrörning blandningen vid omgivningstemperatur i 17 h.
    4. Tillsätt CHCl3 (10 ml) och 15% vattenhaltigt NaHCO3 (5 ml) till blandningen. Rör blandningen kraftigt i ca 3 min. ta bort vattenskiktet med en pipett.
    5. Tillsätt 0,5 M citronsyra (5 mL) till kolven som innehåller det organiska skiktet. Rör om blandningen och ta bort vattenskiktet enligt ovan.
    6. Separera det organiska lagret med hjälp av en fas separations kolumn. Ta bort lösningsmedlen med en roterande indunstare under vakuum. Rena produkten med hjälp av vanlig kiselgel blixt kolonnkromatografi.
  3. Allmänt förfarande 3: beredning av en klickbar karboxylsyra
    1. Lös arakidsyra (33,0 μL, 0,100 mmol), paBhcCH2OH (2) (39,6 mg, 0,112 mmol) och 4-dmap (14,1 mg, 0,115 MMOL) i torr CH2cl2 (2 ml). Tillsätt n,n'-diisopropylcarbodiimide (Dipc, 17,0 μl, 0,110 mmol) och rör om lösningen vid omgivningstemperatur i 140 min.
    2. Ta bort lösningsmedlet under vakuum. Rena återstoden direkt med hjälp av kiselgel blixt kolonnkromatografi.

3. installation av en funktionell enhet i de klickbara bur föreningarna

  1. Lös upp koppar (II) sulfatpentahydrat (249 mg) i Jon-utbytt vatten (IEW, 10 mL) för att ge en 0,1 M CuSO4 -lösning.
  2. Lös 2 '-paBhcmoc-PTX (8,0 mg, 6,5 μmol), tris (3-hydroxipropyltriazolylmetyl) Amin (THPTA, 17,5 mg, 40,3 μmol), natrium l-askorbat (162,4 mg, 0,825 mmol) och 15-klor-3, 6, 9-trioxapentadecylazid (3,1 mg, 11 μmol) i ett blandat lösningsmedel på 0,1 M fosfat buffert (2,5 mL, pH 7,2) och dimetylsulfoxid (DMSO, 0,5 mL).
  3. Tillsätt 0,1 M CuSO4 -lösningen (81,2 μL, 8,1 μmol) till reaktionsblandningen. Rör blandningen vid omgivningstemperatur under 80 min. övervaka förloppet av reaktionen med hjälp av högpresterande vätskekromatografi (HPLC).
  4. Lös upp fällen genom att tillsätta en 75% acetonitril/vattenlösning (3,5 mL). Applicera den resulterande lösningen direkt på semi-Preparative HPLC-systemet för att rena den önskade produkten.
    Anmärkning: Solubilisering av reaktionsblandningen genom tillsats av tert-butanol kan påskynda utvecklingen av reaktionen.

4. fotolytic uncaging reaktion av bur föreningar

  1. Beredning av Stamlösningarna
    1. Lös upp den önskade bur-substansen (5 μmol) i DMSO (500 μl) för att bereda en 10 mm stamlösning. Fördela en alikvot av varje lösning (10 μL) i ett 1,5 mL microcentrifugerör och förvara den i en frys (− 20 ° c) till strax före användning.
    2. 6 mm K3[FE (C2O4)3] (100 ml): Lös upp lokalt kaliumferrioxalat (0,295 g, 0,675 mmol) i 80 ml vatten. Tillsätt 0,5 M H2so4 (10 ml) och en lämplig mängd IEW för att kompensera volymen till 100 ml.
      Notera: kaliumferrioxalat ska renas via omkristallisering från varmt vatten och förvaras i mörker. Recrystallized kaliumferrioxalat erhålls som trihydrat; Därför är dess formel K3[FE (C2o4)3] · 3h2o och en formel vikt på 491,24 bör övervägas vid beredning av stamlösningen. Kontrollera 6 mM-lösningens renhet genom att mäta dess absorption vid 510 nm. Om absorbansen är < 0,02, är den lämplig för användning i experimentet.
    3. 0,1% buffert-Phen (30 mL): lös NaOAc · 3H2O (7,35 g), 1, 10-fenanthroline (Phen) · H2O (30 mg) och conc. H2so4 (0,9 ml) i IEW (20 ml). Lägg till IEW för att kompensera för volymen till 30 mL.
      Anmärkning: lösningen innehåller 1,8 M NaOAc, 0,54 M H2så4, och 0,1% 1, 10-fenanthroline.
  2. Mätning av antalet fotoner med ferrioxalataktinometri
    1. Placera 6 mM K3[FE (C2O4)3] (V1 L) i en kvarts kuvette. Bestråla lösningen med 350 nm ljus för 5 s.
    2. Överför den bestrålade lösningen till en pyrex-kuvette med en l [cm]-banans längd.
    3. Tillsätt 0,1% buffert-Phen (V2 L) till den bestrålade provlösningen och blanda väl genom pipettering. Mät provets absorbans vid 510 nm. Beräkna den genomsnittliga absorptionsförändringen per tidsenhet (ΔA510 [s− 1]).
    4. Beräkna antalet mol genererade FE2 + joner per tidsenhet enligt följande ekvation:
      NFE2 + [mol s− 1] = ((V1 + V2) [l] × δa510 [s− 1])/(l [cm] × ε510 [l mol− 1 cm− 1]),
      där (V1 + v2) är provets volym för absorptionsmätningen, l är den optiska Stig längden på kuvette, och ε510 är molar absorptivity för FE2 +- komplexet på 510 nm.
      Anmärkning: i typiska experimentella förhållanden, värden på v1 = 2,0 × 10− 3 l, v2 = 0,33 × 10− 3 l, l = 1,0 cm, och ε510 = 1,1 × 104 L mol− 1 cm− 1 användes.
    5. Beräkna antalet mullvadar av fotoner som når provet (I0) med hjälp av följande formel:
      I0 [Einstein cm− 2 s− 1] = NFE2 +/Φ350
      där Φ 350 är den kvantmekaniska verkningsgraden hos fotoreduktion av ferrioxalat vid 350 nm.
      Anm.: även om kaliumferrioxalatactinometerns kvantmekaniska verkningsgrad vid 350 nm inte rapporteras, användes det redovisade värdet 1,2542 vid 358 nm.
  3. Kvanteffektivitetsmätningar vid 350 nm
    1. Späd prov stamlösningen (i DMSO, 10 μL) med K-MOPS-buffert (pH 7,2, 10 mL) för att ge en lösning på 10 μM i K-moppar som innehåller 0,1% DMSO.
      Anmärkning: K-MOPS buffert bestod av 100 mM KCl och 10 mM 3-(N-morpholino) propanesulfonic Acid (mops) titreras till pH 7,2 med Koh.
    2. Överför en alikvot av lösningen (V1 L) till samma kuvette som används i den kemiska actinometerns foto reaktion. Bestråla provlösningen med samma inställning som beskrivs i steg 4.2.1.
    3. Ta bort en alikvot (50 μL) från den bestrålade lösningen med jämna mellanrum och analysera med HPLC.
    4. Bestäm bestrålningstiden, i sekunder, i vilken 90% av utgångsmaterialet reagerade (t90%) genom att montera tomter av utgångsmaterialets tidsberoende försvinnande.
      Anmärkning: det bestrålade provets absorbans skall bibehållas vid < 0,1 så att den inre filtreringen av strålningen kan försummas. Det är önskvärt att den fotolytiska konsumtionen av utgångsmaterialet kan approximeras genom en-exponentiell nedbrytning så att det inte finns någon oönskad sekundär effekt som stör fotolysis-processen.
    5. Beräkna den kvantmekaniska avkastningen av försvinnandet (Φdis) med hjälp av följande ekvation28:
      Φdis = 1/(t90% × I0 × σ350)
      där t90% [s] är den bestrålnings tid i vilken 90% av utgångsmaterialet konsumerades , i0 [Einstein cm− 2 s− 1] är antalet mullvadar av fotoner, och σ350 [cm 2 mol− 1] är den deadiserande utrotningskoefficienten för provet vid 350 nm.
      Anmärkning: σ350 [cm2 mol− 1] = 103ε350 [M− 1 cm− 1].

5. inriktning av en klickbar bur förening med en halotag ligand

Anmärkning: före användning, underhålla hela celler i Dulbecco modifierade Eagle medium (DMEM, låg glukos, natriumpyruvat, l-glutamin) kompletteras med 10% foster bovint serum (FBS) som innehåller 1% antibiotika (streptomycin Sulfate, penicillin G, och amfotericin) vid 37 ° c och 5% CO2.

  1. Ta bort mediet och trypsinize cellerna genom att behandla med trypsin-etylendiamintetraättiksyra (EDTA, 1 mL) vid 37 ° c i 1 min. Tillsätt DMEM (4 mL) till cellerna och återsuspendera cellerna genom att Pipettera försiktigt. Utsäde ca 5 × 105 celler per maträtt i 35 mm glasbotten rätter i DMEM (2 ml) 24 h före transfektion.
  2. För fyra rätter, i en 1,5 mL microcentrifug röret, späd plasmid DNA (pcDNA3-Halo-EGFR, 14 μg) i det reducerade serum mediet (700 μL). Späd ut lipofektionsreagenset (5 μL) i det reducerade serum mediet (150 μL) till var och en av fyra rör och låt dem stå vid rumstemperatur i 5 minuter.
  3. Tillsätt en del av det utspädda plasmid-DNA (150 μL) till var och en av de utspädda lipofektionsreagenproverna. Inkubera vid rumstemperatur i 5 minuter.
  4. Efter att ha behållit cellerna vid 37 ° c och 5% CO2 för 24 h, ASPIRERA DMEM och skölj cellerna med fosfatbuffrad saltlösning (PBS, 2 ml). Tillsätt det reducerade serum mediet (1,5 mL).
  5. Tillsätt plasmid-lipofection reagens (150 μL) komplex till varje maträtt. Underhålla cellerna vid 37 ° c och 5% CO2 för 48 h.
  6. Aspirera mediet, tillsätt en del av nyberedd DMEM (1 mL) som innehåller 2 μM paBhc-hex-FITC/Halo, och inkubera cellerna vid 37 ° c och 5% CO2 för 30 min.
  7. Aspirera mediet som innehåller bur substansen och skölj cellerna två gånger med PBS + (1 mL per sköljning) för att avlägsna obundna föreningar. Tillsätt det reducerade serum mediet (500 μL) och inkubera cellerna vid 37 ° c och 5% CO2 under 30 min för att ta bort de föreningar som kom in i cellerna.
    Obs: PBS + är fosfatbuffrad saltlösning kompletterad med 2 mM CaCl2 och 1 mm mgcl2.
  8. Ta bort mediet och skölj cellerna två gånger med PBS + (1 mL). Tillsätt en del av ett medium (1 mL) som inte innehåller fenolrött. Spela in fluorescensbilder med laserskanning av konfokalfluorescens-mikroskopi.

6. photomediated modulering av en Kinas lokalisering med hjälp av en klickbar bur förening

Anmärkning: före användning, underhålla CHO-K1 celler i Hams F-12 medium kompletteras med 10% FBS vid 37 ° c och 5% CO2.

  1. Bered en 100 × arbetslösning (1 mM) av paBhc-AA (5) i DMSO.
    Anmärkning: en 10 mM stamlösning av substansen bereds och förvaras i frys (-20 ° c).
  2. Utsäde ca 5 × 105 celler per maträtt i 35 mm glasbotten rätter i DMEM (2 ml) 24 h före transfektion.
  3. Transfect CHO-K1 celler med en Plasmid kodning för GFP-DGKγ 48 h före uncaging experiment.
    Anmärkning: transfektion utförs enligt steg 5.2 – 5.5.
  4. Byt ut mediet mot ett reducerat serum medium (2 mL). Tillsätt 100 × paBhc-AA arbetslösning (20 μL) och inkubera cellerna vid 37 ° c och 5% CO2 för mellan 5 min och 1 h.
    Obs: Laddningstiden beror på vilken förening som används.
  5. Placera cellerna på det objektiva stadiet av ett inverterat fluorescerande Mikroskop utrustat med en fluorescensbelysare med dubbla ljuskällor.
  6. Ta en fluorescerande bild varje 10 s. bestråla cellerna med 330 – 385 nm ljus genom ett Mikroskop mål för en lämplig tid. Alternativt, bestråla cellerna med 405 nm ljus med en XE-lampa genom flexibla kvarts fibrer.
  7. Fortsätt att spela in fluorescerande bilder i 10 minuter.

Representative Results

Klickbara bur föreningar av vissa biologiskt intressanta molekyler, inklusive arakionsyra och paklitaxel, var framgångsrikt syntetiseras (figur 1)28,41. Ytterligare egenskaper såsom vattenlöslighet och cellulär inriktning förmåga infördes i paBhcmoc-PTX via koppar (I)-katalyseras Huisgen cyklisering ("klick" reaktion) (figur 2). Dessa klickbara bur ptxs var sedan photolyzed att producera sina överordnade ptxs vid bestrålning vid 350 nm (figur 3), och de fysiska och fotokemiska egenskaperna hos de klickbara bur föreningarna sammanfattas i tabell 1. De kvantmekaniska avkastningarna av klickbara bur föreningar 2 '-GLC-paBhcmoc-PTX(φdis 0,14) och pabhc-AA(φdis 0,083) var mer än dubbelt så höga som för konventionella BHC-bur föreningar 2 '-bhcmoc-PTX (φdis 0,040) och BHC-AA (Φdis 0,038)43. Dessutom observerades en förbättrad vattenlöslighet för 2-GLC-paBhcmoc-PTX, som innehåller en glukos-fraktion.

I levande cell experiment, inriktningen av paBhc-hex-FITC/Halo till odlade däggdjursceller transitivt uttrycker ett fusionsprotein av en HaloTag protein och epidermal tillväxtfaktorreceptor (EGFR) uppnåddes framgångsrikt. Grön fluorescens av fluorescein delen av paBhc-hex-FITC/Halo observerades på cellmembranet (figur 4). Foto-medierad modulering av subcellulära lokalisering av en Kinas uppnåddes med hjälp av en pabhc bur förening. Transplaceringen av diacylglycerolkinas γ (DGKγ) har rapporterats vara aktiverad i närvaro av arakidonic Acid (AA)44. CHO-K1-celler som transitivt uttrycker GFP-DGKγ behandlades med antingen AA eller paBhc-AA (5). Tillsats av AA orsakade modulering av den subcellulära lokalisering av DGKγ (figur 5A, B). Liknande förändringar i lokaliseringen av DGKγ observerades för de paBhc-AA-behandlade cellerna efter exponering för UV-ljus (figur 5C, D).

Figure 1
Figur 1: beredning av de klickbara bur föreningarna.
Areagenser och betingelser: A. etyl 4-kloracetoacetat/conc. H2so4/RT/7 dagar/91% avkastning, b. 1 M HCL/reflux/3 dagar/97% avkastning. c. N-metylpropargylamin/HCHO/EtOH, tillsätt sedan (1) och värm vid reflux för 17 h/79% avkastning. (B) synteser av den klickbara bur Amine, PTX, och arakidonsyra Acid. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: installation av funktionella enheter i klickbara bur föreningar.
(A) syntes av ett vattenlösligt bur PTX via koppar (i)-katalyseras huisgen cyklisering. B) strukturer för klickbara bur föreningar som innehåller halotag ligand för cellulär inriktning. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: fotolys av 2-GLC-paBhcmoc-PTX (6).
Prover (10 μM) i K-MOPS lösning (pH 7,2) bestrålades vid 350 nm. A) typiska HPLC-spår för fotolys på 6 (mätt vid 254 nm). Proverna analyserades vid angiven bestrålnings tid. (B) tidsförlopp för fotolys på 6. Blått cirklar visar förbrukningen av 6. Den solida linjen visar minsta kvadratkurvan passar för en enkel ruttnande exponentiell för 6. Röda kvadrater visar avkastningen av PTX. Felstaplarna representerar standardavvikelsen (± SD). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: fluorescens bilder av odlade däggdjursceller inkuberas med paBhc-hex-FITC/Halo (8).
Celler som transfekterade med pcDNA3-Halo-EGFR inkuberades med en 2 μm lösning av sammansatta 8 vid 37 ° c i 30 min. Bilderna erhölls efter upprepad tvättning med PBS +. Mock-behandlade HEK293T celler (A: differential interferens kontrast (DIC) bild och D: fluorescens bild). HEK293T celler (b och e) och hela Cells (C och F) som transitivt uttrycker Halo-EGFR (b och C: DIC images och e och F: fluorescensbilder). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Fluorescensbilder efter UV-bestrålning av CHO-K1-cellerna inkuberas med BHC-kaged arakidsyra. Cho-K1 celler var transfekterade med ett fusionsprotein dgkγ-egfp.
A) enfluorescensbild av de transfekterade cellerna. B) 100 s efter tillsats av en 10 μm lösning av arakionisyra. C) cellerna inkuberades med en lösning på 10 ΜM av pabhc-AA (5) vid 37 ° c i 5 min. (D) 100 s efter 20-s UV-strålning (330 – 385 nm). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Föreningar λMax (Nm)a εMax (M-1 cm-1)b φdisc εφdisd Löslighet (μM)e
Ptx 1,0
2 '-bhcmoc-PTX 340 10500 0,040 400 55
2 '-paBhcmoc-PTX 359 9300 0,059 670 8,3
2 '-GLC-Bhcmoc-PTX 373 12300 0,14 1280 650
BHC-AA 341 10800 0,038 390
paBhc-AA 366 10300 0,083 750

Tabell 1: fysikaliska och fotokemiska egenskaper hos de klickbara bur föreningarna.
a. absorption maximum (Nm), b. molar absorptivity vid λMax (M− 1 cm− 1), c. Quantum Yield av försvinnandet av utgångsmaterialen vid 350 nm, d. Produkten av molar absorptivity och Quantum avkastningen av försvinnandet vid 350 nm, e. Koncentrationen av den mättade lösningen i K-moppar (pH 7,2) (μg mL− 1).

Discussion

Vi har tidigare utvecklat BHC bur föreningar av olika biologiskt aktiva molekyler som uppvisar höga fotolytic effektivitetsvinster28,45,46,47. I syfte att utvidga repertoaren av BHC placer ing grupper, rapporterade vi också plattformar för modulära bur föreningar som kan modifieras enkelt genom införandet av olika funktionella enheter32,40,41. Det nuvarande protokollet utgör därför en metod för syntes av en klickbar föregångare av BHC placer ing grupper som kan modifieras via koppar (i)-katalyseras huisgen cyklisering. Syntesen av den klickbara föregångaren, paBhcCH2OH (2), uppnåddes via en fyra stegs reaktionssekvens med början från den kommersiellt tillgängliga 4-bromresorcinolen (figur 1a). Fördelen med det nuvarande protokollet är att inga mödosamma reningssteg (t. ex. kolonnkromatografiska separationer) krävs.

Som klickbara föregångare paBhcCH2OH (2) kan användas för att maskera olika funktionella grupper, klickbara bur föreningar av aminer, alkoholer, och karboxylsyror var syntetiseras med hjälp av 2 som föregångaren (figur 1b). Aminer ändrades som deras karbamater medan alkoholer ändrades som deras karbonater. I de allmänna procedurerna 1 och 2 användes CDI för beredning av klickbara karbamater, medan 4-nitrofenylklatformat användes för beredning av karbonater. Som framgår av reaktionsmekanismen kan båda reagenser användas för beredning av karbamater och karbonater. Det bör också noteras att avkastningen av önskad bur förening beror på den kemiska strukturen av molekylen som skall bur. Andra exempel kan ses i våra tidigare rapporter28,30,33,48.

Klicka på modifiering utfördes sedan med en smärre ändring av det rapporterade förfarandet49. Tillsats av tris (triazolylmetyl) Amine-baserade ligander är nödvändigt för att få de önskade produkterna i god till hög avkastning. Eftersom en mängd olika azider är lätt tillgängliga både från kommersiella källor och från litteratur förfaranden, kan vi förbereda olika modulära bur föreningar med ytterligare egenskaper såsom vattenlöslighet och cellulära inriktning förmåga (figur 2).

Den kvantmekaniska avkastningen av fotolys mättes sedan enligt ett rapporterat förfarande28,50. Figur 3 visar att den photolytic konsumtionen av 2 '-GLC-paBhcmoc-PTX och frisättning av PTX var approximeras av Single-exponentiell förfall och öka, respektive, tyder ingen inre filtrering av strålning eller oönskade sekundära effekter. Förbättrade fotolys kvantavkastningar (Φ) och fotolys effektivitetsvinster (εφ) observerades för de klickbara pabhc-bur-föreningarna jämfört med de tidigare rapporterade BHC-bur föreningarna (tabell 1)41 . 43. eftersom fotolys effektivitetsvinster (εφ) av BHC-bur-föreningar är mer än 100 gånger högre än de med 2-nitrobensyltyp-bur-föreningar48, är den markant förbättringen på grund av närvaron av pabhc-placer ing-grupper klart en fördel för detta system.

Som ett proof-of-Concept-experiment infördes en hydrofilisk del i 2 '-paBhcmoc-PTX (4) och en cellulär inriktning ligand infördes i förening 3 (figur 2). Vattenlöslighet av 2 '-GLC-paBhcmoc-PTX var 650 gånger högre än för den överordnade PTX (tabell 1). Selektiv cellulär inriktning uppnåddes med hjälp av ett taggsond-system, och paBhcmoc-hex-FITC/Halo (8) med halotag ligand riktades framgångsrikt mot cellmembranet hos odlade däggdjursceller som uttryckte HALOTAG/EGFR fusionsprotein ( Figur 4). Foto-medierad modulering av den subcellulära lokalisering av en Kinas uppnåddes också med hjälp av en klickbar bur förening 5 (figur 5).

Sammanfattningsvis har vi framgångsrikt visat en metod för beredning av klickbara plattformar för foto-bur föreningar av biologiskt intressanta molekyler som kan ändras enkelt med ytterligare egenskaper, såsom vattenlöslighet och en cellulär inriktnings förmåga. Eftersom pabhc placer ing gruppen kan användas för att förbereda alla molekyler med modifierbara funktionella grupper, är tillämpningen av det nuvarande protokollet inte begränsat till de molekyler som beskrivs häri. Med hjälp av en modulär plattform, nämligen pabhc placer ing Group, kan önskad bur föreningar vara lätt förberedd, och deras fysiska och kemiska egenskaper kan moduluppställas via Klicka modifiering.

Disclosures

Vi har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av JSPS KAKENHI Grant Number JP16H01282 (TF), ett bidrag-in-Aid för vetenskaplig forskning om innovativa områden "Memory dynamik" och JP19H05778 (TF), "MolMovies."

Materials

Name Company Catalog Number Comments
acetonitrile, EP Nacalai 00404-75
acetonitrile, super dehydrated FUJIFILM Wako 010-22905
Antibiotic-Antimycotic, 100X Thermo Fisher 15240062
4-bromoresorcinol TCI Chemicals B0654
N,N’-carbonyldiimidazole FUJIFILM Wako 034-10491
chloroform Kanto 07278-71
Copper (II) Sulfate Pentahydrate, 99.9% FUJIFILM Wako 032-12511
dichloromethane, dehydrated Kanto 11338-05
N,N'-Diisopropylcarbodiimide (DIPC) TCI Chemicals D0254
4-dimethylaminopyridine TCI Chemicals D1450
dimethylsulfoxide, dehydrated -super- Kanto 10380-05
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium Sigma D6046-500ML
dual light source fluorescence illuminator, IX2-RFAW Olympus
Ethanol (99.5) FUJIFILM Wako 054-07225
Ethyl 4-Chloroacetoacetate TCI Chemicals C0911
Ham's F-12 with L-Glutamine and Phenol Red FUJIFILM Wako 087-08335
hydrochloric acid FUJIFILM Wako 087-01076
inverted fluorescent microscope IX-71 Olympus
ISOLUTE Phase Separator, 15 mL Biotage 120-1906-D
L-(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt FUJIFILM Wako 196-01252
laser scanning fluorescence confocal microscopy, FLUOVIEW FV1200/IX-81 Olympus
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Thermo Fisher 11668027 lipofection reagent
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Dojindo 345-01804 MOPS
4-nitrophenylchloroformate (4-NPC) TCI Chemicals C1400
Opti-MEM I Reduced Serum Medium, no phenol red Thermo Fisher 11058021 reduced serum medium contains no phenol red
1,10-Phenanthroline Monohydrate Nacalai 26707-02
Photochemical reactor with RPR 350 nm lamps Rayonet
Potassium Trioxalatoferrate (III) trihydrate FUJIFILM Wako W01SRM19-5000
Sodium Acetate Trihydrate Nacalai 31115-05
Sodium Bicarbonate FUJIFILM Wako 199-05985
Sulfuric Acid, 96-98% FUJIFILM Wako 190-04675
Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA) ALDRICH 762342-100MG
tri-Sodium Citrate Dihydrate Nacalai 31404-15
Xenon light source, MAX-303 Asahi Spectra

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mayer, G., Heckel, A. Biologically active molecules with a "light switch". Angewandte Chemistry International Edition. 45 (30), 4900-4921 (2006).
  2. Bort, G., Gallavardin, T., Ogden, D., Dalko, P. I. From One-Photon to Two-Photon Probes: Caged” Compounds, Actuators, and Photoswitches. Angewandte Chemistry International Edition. 52 (17), 4526-4537 (2013).
  3. Klan, P., et al. Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy. Chemical Reviews. 113 (1), 119-191 (2013).
  4. Abe, M., et al. Design and Synthesis of Two-Photon Responsive Chromophores for Near-Infrared Light-Induced Uncaging Reactions. Synthesis-Stuttgart. 49 (15), 3337-3346 (2017).
  5. Ankenbruck, N., Courtney, T., Naro, Y., Deiters, A. Optochemical Control of Biological Processes in Cells and Animals. Angewandte Chemistry International Edition. 57 (11), 2768 (2018).
  6. Hou, Y., Zhou, Z., Huang, K., Yang, H., Han, G. Long Wavelength Light Activated Prodrug Conjugates for Biomedical Applications. ChemPhotoChem. 2, 1005 (2018).
  7. Engels, J., Schlaeger, E. J. Synthesis, structure, and reactivity of adenosine cyclic 3',5'-phosphate benzyl triesters, Rapid photolytic release of adenosine 5'-triphosphate from a protected analogue: utilization by the Na:K pump of human red blood cell. Journal of Medicinal Chemistry. 20 (7), 907-911 (1977).
  8. Kaplan, J. H., Forbush, B., Hoffman, J. F. Rapid photolytic release of adenosine 5'-triphosphate from a protected analogue: utilization by the Na:K pump of human red blood cell ghosts. Biochemistry. 17 (10), 1929-1935 (1978).
  9. Park, C. H., Givens, R. S. New Photoactivated Protecting Groups. 6. p-Hydroxyphenacyl: A Phototrigger for Chemical and Biochemical Probes. Journal of the American Chemical Society. 119 (10), 2453-2463 (1997).
  10. Hasan, A., et al. Photolabile protecting groups for nucleosides: synthesis and photo-deprotection rates. Tetrahedron. 53 (12), 4247-4264 (1997).
  11. Heckel, A., Mayer, G. Light regulation of aptamer activity: an anti-thrombin aptamer with caged thymidine nucleobases. Journal of the American Chemical Society. 127 (3), 822-823 (2005).
  12. Papageorgiou, G., Corrie, J. E. T. Effects of aromatic substituents on the photocleavage of 1-acyl-7-nitroindolines. Tetrahedron. 56 (41), 8197-8205 (2000).
  13. Matsuzaki, M., Ellis-Davies, G. C., Nemoto, T., Miyashita, Y., Iino, M., Kasai, H. Dendritic spine geometry is critical for AMPA receptor expression in hippocampal CA1 pyramidal neurons. Nature Neuroscience. 4 (11), 1086-1092 (2001).
  14. Givens, R. S., Matuszewski, B. Photochemistry of phosphate esters: an efficient method for the generation of electrophiles. Journal of the American Chemical Society. 106 (22), 6860-6861 (1984).
  15. Furuta, T., Torigai, H., Sugimoto, M., Iwamura, M. Photochemical Properties of New Photolabile cAMP Derivatives in a Physiological Saline Solution. Journal of Organic Chemistry. 60 (13), 3953-3956 (1995).
  16. Hagen, V., Frings, S., Wiesner, B., Helm, S., Kaupp, U. B., Bendig, J. 7-(Dialkylamino)coumarin-4-yl]methyl-Caged Compounds as Ultrafast and Effective Long-Wavelength Phototriggers of 8-Bromo-Substituted Cyclic Nucleotides. ChemBioChem. 4 (5), 434-442 (2003).
  17. Momotake, A., Lindegger, N., Niggli, E., Barsotti, R. J., Ellis-Davies, G. C. The nitrodibenzofuran chromophore: a new caging group for ultra-efficient photolysis in living cells. Nature Methods. 3 (1), 35-40 (2006).
  18. Specht, A., et al. New photoremovable protecting groups for carboxylic acids with high photolytic efficiencies at near-UV irradiation. Application to the photocontrolled release of L-glutamate. ChemBioChem. 7 (11), 1690-1695 (2006).
  19. Petersen, S., Alonso, J. M., Specht, A., Duodu, P., Goeldner, M., del Campo, A. Phototriggering of cell adhesion by caged cyclic RGD peptides. Angewandte Chemistry International Edition. 47 (17), 3192-3195 (2008).
  20. Heckman, L. M., et al. Design and Synthesis of a Calcium-Sensitive Photocage. Angewandte Chemistry International Edition. 55 (29), 8363-8366 (2016).
  21. Olson, J. P., Banghart, M. R., Sabatini, B. L., Ellis-Davies, G. C. Spectral Evolution of a Photochemical Protecting Group for Orthogonal Two-Color Uncaging with Visible Light. Journal of the American Chemical Society. 135 (42), 15948-15954 (2013).
  22. Gandioso, A., et al. Sequential Uncaging with Green Light can be Achieved by Fine-Tuning the Structure of a Dicyanocoumarin Chromophore. ChemistryOpen. 6 (3), 375-384 (2017).
  23. Bassolino, G., Nancoz, C., Thiel, Z., Bois, E., Vauthey, E., Rivera-Fuentes, P. Photolabile coumarins with improved efficiency through azetidinyl substitution. Chemical Science. 9 (2), 387-391 (2018).
  24. Lin, Q. N., et al. Coumarin Photocaging Groups Modified with an Electron-Rich Styryl Moiety at the 3-Position: Long-Wavelength Excitation, Rapid Photolysis, and Photobleaching. Angewandte Chemistry International Edition. 57 (14), 3722-3726 (2018).
  25. Nani, R. R., et al. In Vivo Activation of Duocarmycin-Antibody Conjugates by Near-Infrared Light. ACS Central Science. 3 (4), 329-337 (2017).
  26. Umeda, N., et al. Boron Dipyrromethene As a Fluorescent Caging Group for Single-Photon Uncaging with Long-Wavelength Visible Light. ACS Chemical Biology. 9 (10), 2242-2246 (2014).
  27. Slanina, T., et al. In Search of the Perfect Photocage: Structure–Reactivity Relationships in meso-Methyl BODIPY Photoremovable Protecting Groups. Journal of the American Chemical Society. 139 (42), 15168-15175 (2017).
  28. Furuta, T., et al. Brominated 7-hydroxycoumarin-4-ylmethyls: Photolabile protecting groups with biologically useful cross-sections for two photon photolysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (4), 1193-1200 (1999).
  29. Furuta, T., et al. Bhc-cNMPs as either water-soluble or membrane-permeant photoreleasable cyclic nucleotides for both one- and two-photon excitation. ChemBioChem. 5 (8), 1119-1128 (2004).
  30. Suzuki, A. Z., et al. Coumarin-4-ylmethoxycarbonyls as phototriggers for alcohols and phenols. Organic Letters. 5 (25), 4867-4870 (2003).
  31. Ando, H., Furuta, T., Tsien, R. Y., Okamoto, H. Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos. Nature Genetics. 28 (4), 317-325 (2001).
  32. Teraoka, A., Murakoshi, K., Fukamauchi, K., Suzuki, A. Z., Watanabe, S., Furuta, T. Preparation and affinity-based purification of caged linear DNA for light-controlled gene expression in mammalian cells. Chemical Communications. 50 (6), 664-666 (2014).
  33. Watanabe, T., et al. Synthesis of nucleobase-caged peptide nucleic acids having improved photochemical properties. Organic and Biomolecular Chemistry. 12 (28), 5089-5093 (2014).
  34. Horinouchi, T., Nakagawa, H., Suzuki, T., Fukuhara, K., Miyata, N. A novel mitochondria-localizing nitrobenzene derivative as a donor for photo-uncaging of nitric oxide. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 21 (7), 2000-2002 (2011).
  35. Leonidova, A., et al. Photo-induced uncaging of a specific Re(I) organometallic complex in living cells. Chemical Science. 5 (10), 4044-4056 (2014).
  36. Nadler, A., et al. Exclusive photorelease of signalling lipids at the plasma membrane. Nature Communications. 6, 10056 (2015).
  37. Feng, S. H., et al. Mitochondria-specific photoactivation to monitor local sphingosine metabolism and function. Elife. 7, e34555 (2018).
  38. Wagner, N., Stephan, M., Hoglinger, D., Nadler, A. A Click Cage: Organelle-Specific Uncaging of Lipid Messengers. Angewandte Chemistry International Edition. 57 (40), 13339-13343 (2018).
  39. Feng, S., Harayama, T., Chang, D., Hannich, J. T., Winssinger, N., Riezman, H. Lysosome-targeted photoactivation reveals local sphingosine metabolism signatures. Chemical Science. 10 (8), 2253-2258 (2019).
  40. Furuta, T., Manabe, K., Teraoka, A., Murakoshi, K., Ohtsubo, A., Suzuki, A. Design, synthesis, and photochemistry of modular caging groups for photoreleasable nucleotides. Organic Letters. 14 (24), 6182-6185 (2012).
  41. Suzuki, A. Z., et al. A clickable caging group as a new platform for modular caged compounds with improved photochemical properties. Chemical Communications. 55 (4), 451-454 (2019).
  42. Hatchard, C. G., Parker, C. A. A new sensitive chemical actinometer - II. Potassium ferrioxalate as a standard chemical actinometer. Proceedings of the Royal Society A. 235 (1203), 518-536 (1956).
  43. Furuta, T., Nishiyama, K., Manabe, A., Fukuoka, M., Iwamura, M. Design, synthesis and photochemical properties of caged compounds of lipid mediators. Proceedings of the ISBC. , 124-125 (2003).
  44. Shirai, Y., Segawa, S., Kuriyama, M., Goto, K., Sakai, N., Saito, N. Subtype-specific Translocation of Diacylglycerol Kinase ? and ? and Its Correlation with Protein Kinase C. The Journal of Biological Chemistry. 275 (32), 24760-24766 (2000).
  45. Furuta, T., Noguchi, K. Controlling cellular systems with Bhc-caged compounds. TrAC, Trends in Analytical Chemistry. 23 (7), 511-519 (2004).
  46. Furuta, T. Designing caged compounds for spatiotemporal control of cellular chemistry. Journal of the Synthetic Organic Chemistry Japan. 69 (11), 1164-1169 (2012).
  47. Furuta, T. Coumarin-4-ylmethyl Phototriggers. Dynamic Studies in Biology: Phototriggers, Photoswitches and Caged Biomolecules. Goeldner, M., Givens, R. S. , WILEY-VCH. 29-55 (2005).
  48. Furuta, T., Watanabe, T., Tanabe, S., Sakyo, J., Matsuba, C. Phototriggers for Nucleobases with Improved Photochemical Properties. Organic Letters. 9 (23), 4717-4720 (2007).
  49. Manova, R., van Beek, T. A., Zuilhof, H. Surface Functionalization by Strain-Promoted Alkyne–Azide Click Reactions. Angewandte Chemistry International Edition. 50 (24), 5428-5430 (2011).
  50. Adams, S. R., Kao, J. P. Y., Grynkiewicz, G., Minta, A., Tsien, R. Y. Biologically Useful Chelators That Release Ca2+ Upon Illumination. Journal of the American Chemical Society. 110 (10), 3212-3220 (1988).

Tags

Kemi utgåva 152 Bur föreningar syntes Fotokemi klicka kemi prodrug kemisk biologi kemisk sonder
Design, syntes och fotokemiska egenskaper hos klickbara Caged föreningar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Suzuki, A. Z., Shiraishi, Y., Aoki,… More

Suzuki, A. Z., Shiraishi, Y., Aoki, H., Sasaki, H., Watahiki, R., Furuta, T. Design, Synthesis, and Photochemical Properties of Clickable Caged Compounds. J. Vis. Exp. (152), e60021, doi:10.3791/60021 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter