Summary
Selektiv intra-bronkial syre drypping til venstre lunge i mus resulterer i ensidig og selv-begrenset akutt lungeskade som modeller menneskelig akutt respiratorisk nød syndrom (ARDS) indusert av magesyren aspirasjon.
Abstract
Selektiv intra-bronkial drypping av saltsyre (HCl) til murine venstre høyre bronkie forårsaker akutt vevsskade med histopathologic funn som ligner på humant akutt åndedretts nød syndrom (ARDS). Den resulterende alveolære ødem, alveolære-kapillær barriere skade, og leukocytter infiltrasjon hovedsakelig påvirke venstre lunge, bevare den høyre lungen som en uskadet kontroll og la dyrene til å overleve. Denne modellen av selv-begrenset akutt lungeskade muliggjør gransking av vev oppløsning mekanismer, slik som macrophage efferocytosis av apoptotisk nøytrofile og restitusjon av alveolære-kapillær barriere integritet. Denne modellen har bidratt til å identifisere viktige roller for resolusjon agonister, inkludert spesialiserte Pro-løse meglere (SPMs), som gir et grunnlag for utvikling av nye terapeutiske tilnærminger for pasienter med ARDS.
Introduction
Akutt åndedretts nød syndrom (ARDS) er en viktig årsak til akutt respirasjonssvikt1. Det er en vanlig og dødelig eller deaktivere sykdom som oppstår i 10% av alle pasienter inntatt til intensivavdelinger over hele verden2. Ifølge Berlin definisjonen3, ARDS er definert av akutt utbruddet av hypoksemirespirasjonssvikt respirasjonssvikt (< 1 uke) og bilaterale lunge infiltrerer på brystet røntgenbilder som ikke er forklart ved hjertesvikt4. Den underliggende pathobiology er karakterisert ved en overdreven inflammatorisk respons. Lungene kan være skadet direkte, for eksempel i lungebetennelse eller med magesyren aspirasjon, eller indirekte, for eksempel i sepsis eller etter flere blodoverføringer4. Etter den første fornærmelse, ARDS patogenesen utvikler seg i tre faser: exudative, proliferativ, og antifibrotiske faser1. Disse fasene er preget av distinkte molekylære og cellulære immun-og reparasjons mekanismer som bestemmer prognosen for ARDS pasienter. Støttende omsorg er fortsatt bærebjelke for ARDS pasienter; Foreløpig er det ingen effektive farmakologiske behandlinger for ARDS, så det er et presserende behov for ny forskning på denne ødeleggende tilstand4.
Feilregulering av medfødt immunrespons under exudative fasen bidrar til akutt utbruddet av ARDS og tilhørende respirasjonssvikt1. Potent Pro-inflammatorisk mekler signal appartefakter de første immunresponser, som fører til forstyrrelse av alveolære-kapillær barriere, diffus alveolære ødem, og nøytrofile infiltrasjon til området av lunge vevsskade4. I ARDS, ineffektiv bremsing signaler for akutt betennelse predisponere til lunge svikt og kan forsinke rettidig catabasis av den skadde lungevevet5. For dette formål, prekliniske etterforskning av endogene initiere og Pro-oppløsning mekanismer for ARDS kan avdekke romanen terapeutiske strategier. Slike undersøkelser krever selv-begrenset eksperimentell in vivo modeller av akutt lungeskade som ligner funksjoner i menneskelige ARDS, tillater avhør av mekanismer underliggende initiering og oppløsning faser av vevsskade.
Den murine modellen som presenteres her produserer direkte akutt lungeskade som demonstrerer kardinal pathobiological prosesser av exudative ARDS, nemlig alveolære-kapillær barriere avbrudd og nøytrofile infiltrasjon. Metoden er avhengig av selektiv intra-bronkial drypping av HCl gjennom kanyleringen av venstre høyre bronkie, lokalisere skaden og inflammatorisk respons på venstre lunge; uskadet høyre lunge kan brukes som en intern kontroll for utvalgte bestemmelser av vevskader og betennelser. I tillegg er ensidig lungeskade ikke-dødelige og presenterer en resolusjon program. Dette gir en distinkt vindu i oppløsning på lungebetennelse som kan utnyttes for identifisering av endogene Pro-løse meglere og cellulære mekanismer og å åpne nye terapeutiske veier for ARDS som understreker oppløsning fysiologi og Farmakologi.
Protocol
Alle dyr prosedyrer neden ha blitt anmelder og anerkjent av det institusjonell dyr bekymre og bruk komité for Brigham og kvinner ' gjestfrihet (protokollen #2016N000356).
Merk: Steril teknikk ble fulgt for alle overlevelse prosedyrer. Et sterilt felt ble etablert for hver operasjon ved hjelp av et sterilt håndkle, mens kirurger brukte sterile kirurgiske hansker, caps, masker og rene laboratorie frakker. Alle kirurgiske instrumenter ble sterilisert ved hjelp av en autoklav, og sterilitet ble opprettholdt ved hjelp av en perle steriliseringsapparat.
1. utarbeidelse av 0,1 N HCl
- Tilsett 11 mL ddH2O til en Amber glass flaske. Sakte Tilsett 1 mL av 37% HCl (12 N) for å opprette en 1 N HCl arbeids lager.
Forsiktig: Sørg for at HCl legges i vannet. Dette er en sikkerhet bekymring fordi legge vann direkte til syre kan føre til syre å koke og sprute ut av flasken. Når du håndterer konsentrert HCl, må du sørge for at syren oppbevares i en ventilert, kjemisk hette og egnet personlig verneutstyr er slitt, inkludert Laboratoriefrakk, hansker og vernebriller. - Sakte tilsett 4 mL av tidligere fortynnet HCl arbeider lager i 35 mL ddH2O i a 50 ml konisk rør for å lage en 0,1 N HCL eksperimentell lager.
- Mål pH i eksperimentell lager ved hjelp av en elektronisk pH-sonde etter to-punkts kalibrering ved hjelp av lav pH-løsninger. Titrere til pH 1,1 ved hjelp av NaOH eller HCL lager løsninger etter behov, slik at det endelige volumet er 40 ml.
Merk: Det kan være vanskelig å måle de lave pH-verdiene. For å sikre nøyaktig måling, må du kontrollere at pH-proben er riktig kalibrert ved hjelp av lave pH-standarder for å unngå ekstrapolering av målingen. - Umiddelbart før eksperimentet filtrerer du 1 – 2 mL av den eksperimentelle HCl-aksjen gjennom et sterilt filter på 0,22 μm til et sterilt mikrosentrifugen rør.
2. selektiv intra-bronkial drypping av HCl
-
Klargjøre operasjonsområdet
- Indusere generell anestesi ved å levere en ketamin (100 mg/kg) og xylazine (10 mg/kg) blanding ved intraperitoneal injeksjon. Sørg for at musen er helt anesthetized ved å forsiktig klemme tuppen av halen eller bak foten. Mangel på abstinens respons er nødvendig før du gjør en hud snitt. Administrer ytterligere anestesi boluser, om nødvendig.
- Lever 0,1 mg/kg buprenorfin subkutant under scruff av nakken. Pre-operative smertestillende vil styrke effekten av anestesi og vil bøte pre-og post-operative smerter som følge av prosedyren.
- Bruk elektriske Clippers å forsiktig barbere operasjonsområdet på den ventrale overflaten av musen, under haken i livmorhalsen i halsen, ved hjelp av langsomme nedadgående strøk. Fjern løs pels for å eksponere den underliggende huden.
- Forbered operasjonsområdet ved å skure det barberte nettstedet med 10% povidon-jod-løsning. Etter å ha brukt aseptisk løsning, rengjør området ved hjelp av en 70% isopropylalkohol alkoholserviett. Gjenta dette trinnet 3x.
-
Isolere luftrøret
- Plasser musen i en liggende posisjon på et rent kirurgisk bord og dekk musen i en steril kirurgisk gardin og samtidig opprettholde eksponeringen av operasjonsområdet. Fest den på plass.
- Lag en 0,5 cm langsgående snitt i huden over luftrøret og spyttkjertler. Bruk litt buet taggete tang for å forsiktig trekke tilbake huden og forsiktig skille Spyttkjertlene til å eksponere tracheal musklene.
- Ved hjelp av taggete tang for Butt disseksjon, trykk forsiktig fra hverandre de paratracheal musklene og erte bort konseptet som omgir luftrøret til de cartilaginous ringene på luftrøret er helt eksponert.
- Bruk fullt buet taggete tang for å løfte luftrøret og skille bindevevet mellom retro-luftrøret og retro-konseptet. Når bindevevet er løsrevet, bør tuppen av pinsett gli helt bak luftrøret.
- Hold den buede tang bak luftrøret og ta tak i en 10-15 cm stykke 4-0 flettet silke Sutur med tips av tang. Trekk Sutur bak luftrøret slik at det er en jevn lengde på hver side.
- Når Sutur er på plass, trekk forsiktig i sidene av Sutur mot bakre av musen og hold sidene på plass.
-
Selektivt cannulating venstre høyre bronkie og instilling HCl
- Ta en 24 G x 3/4 "angiocatheter og sett nålen, skrå opp, inn i den fremre regionen av luftrøret mellom første og andre tracheal ringer. Når riktig innsetting er bekreftet ved direkte visualisering av nålespissen i tracheal lumen, slipp Sutur og før kanyle over nålen og inn i luftrøret til motstanden er nådd, og deretter trekke nålen. Vinkelen retning av innsetting mot venstre hoved stamme bronkie for selektiv drypping inn i venstre lunge.
- Når kanyle er på plass, ta godt tak i injeksjons porten for å hindre at kateteret skifter.
- Ved hjelp av en P200 pipette og sterile P200 pipette tips, innpode 2,5 mL/kg (50 μL for en 20 g mus) av sterile filtrert 0,1 N HCl inn i kateteret, etterfulgt av et identisk volum av luft.
- Raskt trekke kateteret og løft kirurgisk bord til en 60 ° vinkel for 30 s.
-
Lukke operasjonsområdet
- Legg det kirurgiske brettet flatt og fjern Sutur fra bak luftrøret.
- Bruk 4-0 voksbelagt flettet silke Sutur å lukke huden snitt med 2-3 masker.
3. postoperativ pleie
- Når snittet er lukket, plasserer du musen på venstre side på en varm oppvarming pad til musen gjenoppretter fra anestesi. Begynn å overvåke musen for smerte og aktivitetsnivå før du returnerer den til normal bolig.
Merk: Buprenorfin skal administreres ved 0,1 mg/kg subkutant hver 6-12 h for de første 24 h. Hvis vedvarende gjennombrudd smerte er til stede, forlenge smertestillende diett til smerten avtar.
4. hel lunge lunges tømming (BAL) og leukocytter Immunfenotyping
-
Euthanize musen ved å administrere 3x dosen av ketamin/xylazine som brukes i trinn 2.1.1.
- For å skille mellomliggende og intravaskulær nøytrofile, intravenøst injisere et valgt fluoroforen-merket Ly6G antistoff 5 min før døds aktiv. Denne etiketten bør være egnet for påvisning av Flow flowcytometri å skille intravaskulær nøytrofile fra lunge interstitiell og alveolære nøytrofile, som vil bli merket under vevet forberedelse med en annen fluoroforen (se nedenfor).
- Plasser musen på et kirurgisk bord og krok den fremre fortenner rundt en løkke av 2-0 flettet silke Sutur.
- Følg trinn 2.2.2-2.2.6. å forberede luftrøret for kanyleringen.
Merk: Sørg for at membranen ikke er punktert for å maksimere trans-alveolære blåse trykk under lunge tømming; venstre lunge overholdelse reduseres etter skade, noe som kan kreve et høyere alveolære trykk krav for lunge tømming. - Kannelerer luftrøret følgende trinn 2.3.1, men ikke forhånd kateteret under Carina; inn kateteret parallelt med luftrøret.
- Med kateteret inn, bind Sutur rundt luftrøret for å holde kateteret på plass.
- Innpode og trekke tilbake to påfølgende 1 mL alikvoter av iskald PBS-/-(uten magnesium eller kalsium) med 0,6 mM EDTA ved hjelp av en 1 cc sprøyte. For immunfenotyping av Flow flowcytometri, fjerne hver alikvot og gå tilbake til en 5 mL polystyren FACS tube på isen.
- For å sikre aktiv dødshjelp, Utfør en toraktomi med kirurgisk saks etterfulgt av hjerte punktering. Lungene kan høstes for videre behandling.
- Sentrifuger BAL i 10 min ved 800 g ved 4 ° c til pellets cellene.
- Dekanter supernatanten i et 2 mL mikrosentrifugen rør og alikvot inn i 1,5 mL mikrosentrifugen rør. Oppbevares ved-80 ° c for påfølgende analyse.
- Resuspend celle pellet i PBS-/-med 2% FBS for leukocytter differensial analyse ved flyt flowcytometri.
- For å skille mellomliggende og intravaskulær nøytrofile, fjerner du venstre og høyre lunge separat og behandler lungene for strømnings flowcytometri som i Abdulnour et al. 20146.
- Stain den resulterende celle suspensjonen ved hjelp av utvalgte FACS-antistoffer, og pass på å farge for Ly6G som bøyes likt med en annen fluoroforen enn Ly6G-antistoff fra trinn 4.1.1.
5. vurdering av Alveolære Barrier permeabilitet bruke Evan ' s Blue Dye (EBD)
- Intravenøst injisere Evan ' s Blue Dye (40 mg/kg) 30 min før døds aktiv.
- Euthanize musa med ketamin/xylazine overdose (trinn 4,1).
- For å måle alveolære barriere integritet, Følg trinn 4.2 – 4.9 for BAL-oppsamling.
- Overfør 100 μL av BALF til en klar bunn 96-brønn mikroplate, sammen med 100 μL av dupliserte EBD-standarder. Bruk PBS-/-som en blank.
- Bruk en mikroplate-leser til å måle absorbansen til BALF ved 620 NM og 740 NM. Bruk absorbansen ved 740 NM for å korrigere for måltema kontaminering i prøvene7.
- For å måle vaskulær barriere integritet, perfuse lungene ved langsomt å injisere 5 mL iskald PBS-/-gjennom høyre ventrikkel i hjertet. Fjern venstre lunge.
- Tørk venstre lunge for 72 i h ved 58 ° c for å fjerne overflødig vann.
- Behandle tørket lunge vev som i Radu og Chernoff 20138, og måle absorbances ved 620 nm og 740 NM.
6. Lung histologi
- Kannelerer luftrøret ved å følge trinn 4.1 – 4.5.
- Til press fikse lungene ved 20 cm H2O, bruk en ringstativ og klemme for å heve en 60 ml sprøyte utstyrt med ventil-kontrollerte slangen og fylt med en utvalgt bindemiddel løsning (f. eks, sink bindemiddel) slik at menisk av den bindemiddel løsningen er 20 cm over Lungene.
- Fest slangen til kateteret og åpne verdien. Langsomt fylle lungene med bindemiddel før de slutter å blåse.
- Fjern kateteret 3/4 av veien ut av luftrøret. Tie av luftrøret med Sutur før helt fjerne kateteret for å minimere tap av bindemiddel.
- Fjern lungene og hjerte en blokk.
Merk: Pass på at lungene ikke er punktert under fjerning for å beholde trykket tilført bindemiddel. - Fest lungene i 24 timer i 25 mL bindemiddel ved romtemperatur.
- Vask den faste lungene for sekvensielle 20 min intervaller i PBS-/-, 30% etanol, og 50% etanol.
- Etter siste vask, Oppbevar lungene i 70% etanol for histologi behandling som i Eickmeier et al. 20139.
Representative Results
Selektiv, intra-HCl drypping resultater i ensidig akutt lungeskade
Metoden for selektiv intra-bronkial drypping av HCl i venstre høyre bronkie er illustrert i figur 1a. Den påfølgende akutte lunge skaden omfatter hele den venstre lungen, og etter intravenøs administrering av EBD og lunge-, forble EBD bare i venstre lunge (figur 1B). EBD-Ekstravasasjon inn i den venstre lungen ble kvantifisert og funnet å være betydelig økt i forhold til humbug selektive drypping (figur 1C; tilpasset fra Abdulnour et al. 20146). Som svar på lungeskade, sirkulerende leukocytter diapedese inn i betent vev. I denne modellen, vaskulær nøytrofile gjennomgår trans-endothelial migrasjon i den skadde lunge interstitium. Interstitiell nøytrofile akkumulert i venstre lunge 24 h etter HCl drypping, i motsetning til høyre lunge der få interstitiell nøytrofile er observert (figur 1d). Disse resultatene tyder på at selektiv venstre høyre intra-bronkial drypping metoden resulterte i murine akutt lungeskade som i stor grad var lokalisert til venstre lunge og produserte patologiske forandringer som også er sett med menneskelige ARDS, inkludert økt alveolære-kapillær barriere brudd og nøytrofile infiltrasjon.
Ensidig akutt lungeskade gjør det mulig å undersøke løsnings mekanismer
Å studere oppløsning fase av syre-indusert akutt lungeskade mus må være i stand til å overleve den første fornærmelse. Forskjellig fra intratrakeal HCl, drypping inn bare venstre høyre bronkie fører til en selv-begrenset skade med ensartet overlevelse i ellers friske mus. Lungene kan fås fra mus på enten tidlig eller senere tidspunkter som i figur 2a. Lung histologi viser vevskader og betennelser på organ og cellenivå med exudative betennelse 24 h etter skade preget av merket alveolære ødem og nøytrofile infiltrasjon i venstre lunge. Merk at det ikke er noen signifikant skade eller leukocytter tilstrømning i uskadet kontroll høyre lunge (figur 2a). 72 h etter skade, ødem og cellulære infiltrerer er betydelig redusert, som representerer en løse exudative fase. Alveolære nøytrofile kan overvåkes av Flow flowcytometri (CD45+/CD68-/F4/80-/Ly6G+/CD11b+) innhentet av hele lunge tømming. Nøytrofile økning i venstre lunge 24 h etter den første skaden og nedgangen betydelig på 48 og 72 h (figur 2b). Hvis senere tidspunkt undersøkes, vil de nøytrofile tallene gå tilbake til Baseline og mekanismer i senere faser av catabasis, slik som fibroproliferative svar, kan bli studert.
Figur 1: selektiv drypping HCL produserer ensidig lungeskade definert av alveolære barriere brudd og nøytrofile infiltrasjon. (A) representasjon av kanyleringen av murine venstre høyre bronkie for selektiv drypping av HCL i venstre lunge. (B) resected høyre (RL) og venstre (ll) lunger eksponert for selektiv syre drypping og perfusert etter intravenøs Evan ' s blå fargestoff. (C) kvantifisering av interstitiell Evan ' s blå fargestoff fra homogenisert, perfusert lunge 24 h etter syre skade eller humbug kontroll; figur tilpasset fra Abdulnour et al. 20146. Verdiene representerer gjennomsnittlig ± SEM, der n ≥ 5. *p < 0,05, mann-Whitney U test. (D) representant flyt flowcytometri av intravaskulær (IV; fluoroforen 1) og interstitiell (I.S.; fluoroforen 2) nøytrofile som prosent av totalt CD45+ celler i bearbeidet lunge 24 h etter syre skade. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: ensidig akutt lungeskade er selv løse. (A) representant H & E histologi (10x) av venstre lunger Hentet fra naive mus (0 H) eller mus 24, 48, 72 H etter skade, sammen med tilhørende høyre lunge fra samme mus (Scale bar = 250 μm). (B) representant flyt flowcytometri av alveolære nøytrofile (Ly6G+ CD11b+) innhentet fra hele LUNGE tømming som prosent av totalt CD45+ celler i naiv (0 h) mus eller mus 24, 48 og 72 h etter syre skade. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Den intra-bronkial drypping metoden beskrevet her bruker selektiv kanyleringen av venstre høyre bronkie å innpode HCl inn i venstre lunge, noe som resulterer i ensidig og selv-begrenset murine akutt lungeskade. Dette murine acid lungeskade modellen tett representerer inflammatorisk respons, histopatologi, og fysiologiske dysfunksjon sett i menneskelig ARDS, der magesyren aspirasjon er en felles overilet eller medvirkende faktor4. Eksponering av murine luftveiene til lav pH HCl resulterer i økt permeabilitet av alveolære-kapillær barriere, alveolære ødem, og dyp nøytrofile infiltrasjon på stedet av skade. Disse hendelsene er ikke observert i uskadet høyre lunge. I tillegg produserer denne modellen raske inflammatoriske reaksjoner som peak innen 24 h etter syre drypping, og aksjer endringer i genuttrykk med menneskelige ARDS, slik som differensial uttrykk for fosfolipase D isoformene10.
Selv om dette murine prekliniske modellen reproduserer mange av funksjonene i ARDS på molekylær, cellulære og vev nivåer, betyr det ikke fullt recapitulate menneskelig ARDS. Definisjonen av ARDS omfatter bilateral lunge involvering3, mens den drypping metoden beskrevet her resultater av design i ensidig lungesykdom. Videre gjør dyrene ikke krever kontinuerlig mekanisk ventilasjon, immobilitet, eller parenteral sedasjon. Resultatene som presenteres her (vide Supra) og andre steder6,9, 11,12,13 demonstrere at ensidig syre-indusert lungeskade reproduserer de fleste av patologiske kjennetegnene til ARDS samtidig som det gir en unik mulighet til å bruke høyre lunge som intern kontroll og å studere oppløsningen fasen av denne sykdommen. Som sådan, modellen diskutert her modeller ARDS pathobiology, men også gjør det mulig mekanistisk etterforskning av grunnleggende lunge vev svar på skade og oppløsning mekanismer som kan være relevant for adressering denne viktige sykdommen.
Drypping av HCl representerer direkte akutt lungeskade, så det er modellering aspekter av patofysiologi forbundet med aspirasjon pneumonitt. I tillegg er den første venstre lunge fornærmelse i denne modellen er generert ved hjelp av sterile HCl stedet bakterier-Laden mageinnholdet sett i noen menneskelig aspirasjon hendelser som kan også føre til lungebetennelse14. Hos mennesker kan aspirasjon av patogene bakterier føre til sekundær bakteriell lungebetennelse som forverrer akutt inflammatorisk respons, forlenge den første lunge skaden og øke pasientens mottakelighet for å utvikle ARDS14. Denne potensielle begrensningen har blitt behandlet av etterforskere med vilje instilling patogene bakterier Escherichia coli (E. coli)15 etter steril HCL. i tillegg har denne metoden blitt brukt til å undersøke patogen-mediert betennelse ensidig bakteriell lungebetennelse kan bli indusert av selektiv venstre lunge drypping av bakterier, slik som E. coli16,17, Pseudomonas aeruginosa16, og Streptococcus pneumoniae18 . Den selv begrensede akutte lungeskade modellen som beskrives her, kan også brukes til å studere Ventilator-indusert lungeskade (VILI), en viktig årsak til økt dødelighet i humant ARDS19. Eksperimentelle dyremodeller av VILI innebærer vanligvis mekanisk ventilasjon i naive mus med tidevanns volumer som er mye høyere enn det som er klinisk brukt til å forårsake lungeskade (> 15 ml/kg; se tidligere arbeid20,21). Mot en mer klinisk relevant modell av VILI, kan intra-bronkial drypping som beskrevet her brukes først til å indusere ikke-dødelig lungeskade etterfulgt av mekanisk ventilasjon ved tidevanns volumer innen klinisk rekkevidde (6-12 mL/kg). Denne hypotetiske dyre modellen kan tillate etterforskere å studere VILI på en klinisk relevant måte når de er utviklet og validert. Sammen fremhever disse murine modellene allsidigheten til den selektive intrabronchial drypping metoden for å generere ensidige lunge fornærmelser som ligner patologi i forbindelse med menneskelige lungesykdommer.
I tillegg til å tillate selektiv drypping av ulike skadelige stoffer til venstre lunge, teknikken for intra-bronkial drypping etter trakeostomi krever ikke utvidet trening, lang prosedyre tid, eller komplekst utstyr, og i erfarne hender forårsaker minimal nød til dyrene. Til tross for dette kan det oppstå flere problemer under den selektive HCl-drypping prosedyren som kan påvirke eksperimentelle resultater. Uriktig kanyleringen av venstre Stam bronkie kan føre til bilateral lungeskade som minsker overlevelse av eksperimentelle mus og forundrer bruk av høyre lunge som en uskadet intern kontroll. Dette kan unngås ved å fiske kateteret tilstrekkelig mot venstre lunge under kanyleringen til motstanden er nådd. Etter injeksjon av HCl, bør en bolus luft injiseres, kateteret raskt fjernet, og kirurgisk bord brakt oppreist til en 60 ° vinkel. Disse trinnene er avgjørende for å sikre at syren når den opp-og ut-luftveiene på venstre lunge og forhindrer reflux av syre i høyre lunge og luftrør, noe som kan føre til proksimale Kader. Innen 24 h etter drypping, skaden i venstre lunge er diffus med omfattende lungeødem, påvirker både den proksimale og venstre lunge.
Under metodeutvikling i voksen 8-12 uke gamle mus, 2,5 mL/kg av intra-bronkial HCl produsert betydelig ennå subletale akutt lungeskade; lavere doser av HCl ikke resultere i reproduserbar og homogen lungeskade. Selv om vi ikke har utført denne modellen i yngre (for eksempel 3-6 uker gamle) eller eldre mus (for eksempel 10-14 måneder gammel), forventer vi at vekt-basert dosering av HCl vil resultere i en lungeskade fenotype ligner på det som er notert i 8-12 uke gamle mus. Vi anbefaler at etterforskerne titrere HCl doser å oppnå ønsket grad av lungeskade før utføre eksperimenter med mus på ekstreme vekt.
Denne selektive syre drypping prosedyren tilbyr en ikke-dødelig murine modell av steril vev betennelse som reduserer behovet for støttende omsorg, slik som mekanisk ventilasjon. Med utvidet overlevelse av skadde mus, har syre-indusert betennelse nok tid til selv-løse. Oppløsningen fase av denne modellen har blitt brukt til å identifisere timelig regulert endogene bioaktive lipid meglere, betegnet spesialisert Pro-løse meglere (SPMs), for eksempel lipoxin A4 (LXA4), maresin 1 (MaR1), og resolviner6 ,11,12,16. Administrere eksogene SPMs til skadde mus quickens oppløsningen av syre indusert lungeskade ved å dempe inflammatoriske mekanismer og fremme catabasis av skadet lunge vev. Disse SPMs fremme clearance av alveolære ødem12, øke efferocytosis av apoptotisk nøytrofile av rekruttert makrofager16, og akselerere re-epithelialization av luftveiene og alveoler12 for å redusere vaskulær lekkasje og vevs hypoksi. I en modell av patogen-indusert lungeskade, 15-Epi-resolvin D1 også utstilt antimikrobielle handlinger gjennom økt bakteriell fagocytose av makrofager og forbedret bakteriell klaring fra den infiserte lunge16. Gransker disse endogene oppløsning mekanismer gir innsikt i potensielle romanen terapeutiske strategier for pasienter med ARDS5.
Til beste studere spatiotemporal regulering av oppløsning mekanismer, in vivo eksperimentelle modeller er nødvendig. Akutt lungeskade modeller må inkludere relevante akutte inflammatoriske reaksjoner og organ dysfunksjon med engasjement av verts oppløsning fremme molekylær og cellulære prosesser. Disse mekanismene kan kvantifisert ved hjelp av etablerte oppløsning indekser22. Den selektive intra-bronkial drypping metode for å generere ensidig akutt lungeskade har vist seg nyttig i denne forbindelse å granske endogene oppløsning meglere og trasé. Fremtidige studier som utdype vår forståelse av disse aktive oppløsning prosesser har løftet om å lede til terapeutiske agonister som etterligner bioactions av endogene lipid meglere for å forbedre oppløsningen av betennelser og dempe sykelighet og dødelighet av ARDS og andre viktige lungesykdommer.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke Dr. Joseph Mizgerd for hans bidrag til utviklingen av den selektive intra-bronkial metoden og for hans hjelpsomme kommentarer og gjennomgang av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health Grants P01GM095467 (B.D.L.) og K08HL130540 (R.E.A.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Zinc Fixative | BD Biosciences | 552658 | |
| 2-0 Braided Silk Suture | Surgical Specialties | SP118 | |
| 24 G x 3/4" Disposable Safelet I.V. Catheter | Excel | 26751 | |
| 33 mm, 0.22 µm syringe filter unit | Millipore-Sigma | SLGP033RS | |
| 4" Long Serrated Slight Curve Graefe Forceps | Roboz | RS-5135 | |
| 4" Long Tip Serrated Full Curve Graefe Forceps | Roboz | RS-5137 | |
| 4.5 " Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5912 | |
| 6" Crile Wood Needle Holder | Roboz | RS-7860 | |
| 60 mL syringe | BD Biosciences | 309653 | |
| Anti-mouse FITC-Ly6G antibody | Thermo Fisher Scientific | 11-9668-82 | Preferred fluorophore can be used |
| Anti-mouse PE-Ly6G antibody | Thermo Fisher Scientific | 12-9668-82 | Preferred fluorophore can be used |
| Bead sterilizer | |||
| Betadine Solution Swabstick | Betadine | 67618-153-01 | |
| Buprenex | Reckitt Benckiser | NDC: 12496-0757-1, 12496-0757-5 | |
| Clear flat-bottomed 96-well microplate | Thermo Fisher Scientific | 12565501 | |
| Dulbeccos's Phosphate Buffered Saline (PBS) without Ca2+ or Mg+ | life technologies | 14190-144 | |
| Electric clippers | |||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore-Sigma | E6758 | |
| Evans Blue Dye | Millipore-Sigma | E-2129 | |
| Heating pad | |||
| Hydrochloric acid, 37% | Millipore-Sigma | 258148 | |
| Ketamine | Henry-Schein | 56344 | |
| Microplate reader (640, 720 nm) | |||
| P200 Pipette | |||
| P200 Pipette Tips | |||
| pH probe | |||
| Ring stand with extension clamp | |||
| Sterile Alcohol Prep Pads | Thermo Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Sterile Mouse Drape 8" x 8" with Oval Adhesive Fenestration | Steris | 88VCSTF | |
| Sterile Nitrile Gloves | Kimberly-Clark | 56890 | |
| Sterile Towl Drape | Dynarex | 4410 | |
| Wax Coated 4-0 Braided Silk Suture | Covidien | SS733 | |
| Xylazine | AKORN | NDC: 59399-111-50 |
References
- Baron, R. M., Levy, B. D., et al. Acute Respiratory Distress Syndrome. Harrison's Principles of Internal Medicine, 20e. Jameson, J. L. , McGraw-Hill Education. (2018).
- Bellani, G., et al. Epidemiology, Patterns of Care, and Mortality for Patients With Acute Respiratory Distress Syndrome in Intensive Care Units in 50 Countries. The Journal of the American Medical Association. 315 (8), 788-800 (2016).
- The ARDS Definition Task. Acute Respiratory Distress Syndrome: The Berlin DefinitionThe Berlin Definition of ARDS. The Journal of the American Medical Association. 307 (23), 2526-2533 (2012).
- Thompson, B. T., Chambers, R. C., Liu, K. D. Acute Respiratory Distress Syndrome. New England Journal of Medicine. 377 (6), 562-572 (2017).
- Krishnamoorthy, N., Levy, B. D., Walker, K. H., Abdulnour, R. -E. E., Engstrom, B. D. Specialized Proresolving Mediators in Innate and Adaptive Immune Responses in Airway Diseases. Physiological Reviews. 98 (3), 1335-1370 (2018).
- Abdulnour, R. -E. E., et al. Maresin 1 biosynthesis during platelet-neutrophil interactions is organ-protective. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (46), 16526 (2014).
- Chen, H., et al. Pulmonary permeability assessed by fluorescent-labeled dextran instilled intranasally into mice with LPS-induced acute lung injury. PLoS ONE. 9 (7), (2014).
- Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. Journal of Visualized Experiments. 73 (73), e50062 (2013).
- Eickmeier, O., et al. Aspirin-triggered resolvin D1 reduces mucosal inflammation and promotes resolution in a murine model of acute lung injury. Mucosal Immunology. 6 (2), 256-266 (2013).
- Abdulnour, R. -E. E., et al. Phospholipase D isoforms differentially regulate leukocyte responses to acute lung injury. Journal of Leukocyte Biology. 103 (5), 919-932 (2018).
- Fukunaga, K., Kohli, P., Bonnans, C., Fredenburgh, L. E., Levy, B. D. Cyclooxygenase 2 Plays a Pivotal Role in the Resolution of Acute Lung Injury. Journal of Immunology. 174 (8), 5033 (2005).
- Colby, J. K., et al. Resolvin D3 and Aspirin-Triggered Resolvin D3 Are Protective for Injured Epithelia. American Journal of Pathology. 186 (7), 1801-1813 (2016).
- Bonnans, C., Fukunaga, K., Keledjian, R., Petasis, N. A., Levy, B. D. Regulation of phosphatidylinositol 3-kinase by polyisoprenyl phosphates in neutrophil-mediated tissue injury. The Journal of Experimental Medicine. 203 (4), 857-863 (2006).
- Mandell, L. A., Niederman, M. S. Aspiration Pneumonia. New England Journal of Medicine. 380 (7), 651-663 (2019).
- Seki, H., et al. The anti-inflammatory and proresolving mediator resolvin E1 protects mice from bacterial pneumonia and acute lung injury. Journal of Immunology. 184 (2), 836-843 (2010).
- Abdulnour, R. E., et al. Aspirin-triggered resolvin D1 is produced during self-resolving gram-negative bacterial pneumonia and regulates host immune responses for the resolution of lung inflammation. Mucosal Immunology. 9 (5), 1278-1287 (2016).
- Traber, K. E., et al. Myeloid-epithelial cross talk coordinates synthesis of the tissue-protective cytokine leukemia inhibitory factor during pneumonia. American journal of physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 313 (3), L548-L558 (2017).
- Yamamoto, K., et al. Roles of lung epithelium in neutrophil recruitment during pneumococcal pneumonia. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (2), 253-262 (2014).
- Acute Respiratory Distress Syndrome Network. Ventilation with Lower Tidal Volumes as Compared with Traditional Tidal Volumes for Acute Lung Injury and the Acute Respiratory Distress Syndrome. New England Journal of Medicine. 342 (18), 1301-1308 (2000).
- Peng, X., et al. Inducible nitric oxide synthase contributes to ventilator-induced lung injury. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 172 (4), 470-479 (2005).
- Abdulnour, R. -E. E., et al. Mechanical stress activates xanthine oxidoreductase through MAP kinase-dependent pathways. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (3), L345-L353 (2006).
- Serhan, C. N., Levy, B. D. Resolvins in inflammation: emergence of the pro-resolving superfamily of mediators. The Journal of Clinical Investigation. 128 (7), 2657-2669 (2018).
