Summary
Selektiv intrabronkial syra instillation till vänster lunga hos möss resulterar i ensidig och självbegränsad Akut lungskada som modeller humant akut andnödssyndrom (ARDS) induceras av magsyra aspiration.
Abstract
Selektiv intrabronkial instillation av saltsyra (HCL) till murin vänster mainstem luftrör orsakar akut vävnadsskada med histopatologiska fynd som liknar humant akut andnödssyndrom (ARDS). Den resulterande alveolära ödem, alveolära-kapillär barriär skada, och leukocyter infiltration främst påverka den vänstra lungan, bevara den högra lungan som en oskadad kontroll och tillåter djur att överleva. Denna modell av självbegränsad Akut lungskada möjliggör utredning av vävnadsmekanismer, såsom makrofagefferocytos av apoptotiska neutrofiler och återställande av den alveolära-kapillära barriär integriteten. Denna modell har bidragit till att identifiera viktiga roller för resolutions agonister, inklusive specialiserade Pro-lösa medlare (SPMs), som ger en grund för utvecklingen av nya terapeutiska metoder för patienter med ARDS.
Introduction
Akut andnödssyndrom (ARDS) är en viktig orsak till akut andningssvikt1. Det är en vanlig och dödlig eller handikappande sjukdom som uppträder hos 10% av alla patienter som tas upp till intensivvårdsavdelningar i hela världen2. Enligt Berlin definition3, ARDS definieras av den akuta uppkomsten av hypoxemiska andningssvikt (< 1 vecka) och bilaterala pulmonella infiltrat på bröstet röntgenbilder som inte förklaras av hjärtsvikt4. Den bakomliggande patobiologin kännetecknas av ett överdrivet inflammatoriskt svar. Lungan kan skadas direkt, såsom i lunginflammation eller med magsyra aspiration, eller indirekt, såsom i sepsis eller efter flera blodtransfusioner4. Efter den första förolämpningen, ARDS patogenes fortskrider i tre faser: exsudativ, proliferativ, och fibrotiska faser1. Dessa faser kännetecknas av olika molekylära och cellulära immun-och reparationsmekanismer som bestämmer prognosen för ARDS patienter. Stödjande vård förblir stöttepelaren för ARDS patienter; för närvarande finns det inga effektiva farmakologiska behandlingar för ARDS, så det finns ett brådskande behov av ny forskning om detta förödande tillstånd4.
Dysreglering av det medfödda immunsvaret under exsudativ fas bidrar till den akuta uppkomsten av ARDS och tillhörande andningssvikt1. Potent pro-inflammatorisk medlare signalering orkesterar det initiala immunsvaret, vilket leder till störningar i alveolära-kapillär barriären, diffust alveolärt ödem, och neutrofila infiltration till platsen för lungvävnad skada4. I ARDS, ineffektiva broms signaler för akut inflammation predisponera för lungsvikt och kan fördröja tid catabasis av skadade lungvävnad5. För detta ändamål kan preklinisk undersökning av de endogena initierande och Pro-resolutionsmekanismerna hos ARDS avslöja nya terapeutiska strategier. En sådan undersökning kräver självbegränsade experimentella in vivo-modeller av Akut lungskada som nära liknar egenskaper hos mänskliga ARDS, vilket medger förhör av mekanismer som legat till grund för vävnads skadans inledande och rekonstruktions faser.
Den murina modell som presenteras här producerar direkt Akut lungskada som visar kardinal patobiologiska processer exsudative ARDS, nämligen alveolära-kapillär barriär störningar och neutrofila infiltration. Metoden förlitar sig på selektiv intrabronkiell instillation av HCl genom kanylering av vänster mainstem bronchus, lokalisera skadan och inflammatoriska svar till vänster lunga; den oskadade högra lungan kan användas som en intern kontroll för utvalda bestämningar av vävnadsskada och inflammation. Dessutom är ensidig lungskada icke-dödande och avslöjar ett resolutions program. Detta erbjuder ett distinkt fönster i upplösning av lunginflammation som kan utnyttjas för identifiering av endogena Pro-lösa medlare och cellulära mekanismer och att öppna nya terapeutiska vägar för ARDS som betonar upplösning fysiologi och Farmakologi.
Protocol
Alla djur procedurer nedan har granskats och godkänts av den institutionella djuromsorg och användning kommittén vid Brigham and Women ' s Hospital (protokoll #2016N000356).
Anmärkning: Steril teknik följdes för alla överlevnads procedurer. Ett sterilt fält inrättades för varje operation med hjälp av en steril drapera handduk, medan kirurger bar sterila kirurgiska handskar, mössor, masker, och rena laboratorie rockar. Alla kirurgiska instrument var steriliseras med hjälp av en autoklav, och sterilitet upprätthölls med hjälp av en pärla autoklav.
1. beredning av 0,1 N HCl
- Tillsätt 11 mL ddH2O till en bärnstensfärgad glas flaska. Tillsätt långsamt 1 mL 37% HCl (12 N) för att skapa en 1 N HCl-arbetsstock.
Försiktighet: Se till att HCl tillsätts i vattnet. Detta är ett säkerhetsproblem eftersom tillsats av vatten direkt till syran kan orsaka syra att koka och stänk ur flaskan. Vid hantering av koncentrerad HCl, se till att syran förvaras i en ventilerade kemisk huva och lämplig personlig skyddsutrustning bärs, inklusive Lab Coat, handskar och skyddsglasögon. - Tillsätt långsamt 4 mL av den tidigare utspädda HCl-arbetsstocken i 35 mL ddH2O i ett 50 ml koniskt rör för att skapa ett experimentellt lager på 0,1 N HCl.
- Mät pH-värdet i försöks beståndet med hjälp av en elektronisk pH-sond efter två punkts kalibrering med låga pH-lösningar. Titrera till pH 1,1 med hjälp av NaOH eller HCl lagerlösningar som behövs så att den slutliga volymen är 40 ml.
Anmärkning: Det kan vara svårt att mäta de låga pH-värdena. För att säkerställa noggrann mätning, se till att pH-sonden är korrekt kalibrerad med låga pH-standarder för att undvika överextrapolering av mätningen. - Omedelbart före försöket, filtrera 1 – 2 mL av den experimentella HCl lager genom ett 0,22 μm sterilt filter till en steril microcentrifug röret.
2. selektiv Intrabronkiell instillation av HCl
-
Förberedelse av operationsområdet
- Inducera narkos genom att leverera en ketamin (100 mg/kg) och xylazin (10 mg/kg) blandning av intraperitoneal injektion. Se till att musen är helt sövda genom att försiktigt klämma spetsen på svansen eller bakfoten. Brist på abstinensbesvär krävs innan du gör en hud incision. Administrera ytterligare anestesi boluses, om det behövs.
- Leverera 0,1 mg/kg buprenorfin subkutant under halsen. Preoperativ smärtstillande medel kommer att stärka effekten av anestesi och kommer att lindra pre-och postoperativ smärta till följd av förfarandet.
- Använd elektriska Clippers för att försiktigt raka det kirurgiska området på den ventrala ytan av musen, under hakan i halsregionen i halsen, med hjälp av långsamma nedåt stroke. Ta bort lös päls för att helt exponera den underliggande huden.
- Förbered det kirurgiska området genom att svabbing den rakade webbplatsen med 10% povidon-jod lösning. Efter applicering av aseptisk lösning, Rengör anläggningen med hjälp av en 70% isopropylalkoholservett. Upprepa detta steg 3x.
-
Isolerar luftstrupen
- Placera musen i en liggande position på en ren kirurgisk bräda och täck musen i en steril kirurgisk drapera samtidigt som exponeringen av det kirurgiska området. Fäst draperi på plats.
- Gör en 0,5 cm längsgående snitt i huden ovanför luftstrupen och spottkörtlarna. Använd lätt böjda tandade pinkippar att försiktigt dra tillbaka huden och försiktigt separera spottkörtlarna att exponera trakealmusklerna.
- Med hjälp av tandad tång för Blunt dissektion, försiktigt skjuta isär paratracheal muskler och retas bort fascian som omger luftstrupen tills brosk ringarna i luftstrupen är helt exponerade.
- Använd helt böjda tandade pinkippar att lyfta luftstrupen och separera bindväv mellan retro-luftstrupen och retro-fascia. När bindväv är frånkopplad, spetsen av pincett bör glida helt bakom luftstrupen.
- Håll böjda tång bakom luftstrupen och ta tag i en 10-15 cm bit 4-0 flätad sidensutur med spetsarna på tång. Dra suturen bakom luftstrupen så att det finns en jämn längd på vardera sidan.
- När suturen är på plats, försiktigt dra sidorna av suturen mot bakre av musen och håll sidorna på plats.
-
Selektivt kanylera vänster mainstem luftrör och ingjutning HCL
- Ta en 24 G x 3/4 "angiocatheter och sätt in nålen, avfasning upp, i den främre regionen av luftstrupen mellan den första och andra trakealringarna. När korrekt insättning bekräftas genom direkt visualisering av nålspetsen i trakeal lumen, släpp suturen och förväg kanyl över nålen och in i luftstrupen tills motståndet är nådd, sedan dra tillbaka nålen. Vinkel riktningen för insättning mot den vänstra huvudstammen luftrör för selektiv instillation i den vänstra lungan.
- När kanylen är på plats, ta tag i injektionsporten för att förhindra att katetern förskjuts.
- Använda en P200 pipett och sterila P200 pipettspetsar, ingjuta 2,5 mL/kg (50 μL för en 20 g mus) av steril filtrerad 0,1 N HCl in i katetern, följt av en identisk volym av luft.
- Dra snabbt ut katetern och lyft upp operationsbordet till en 60 ° vinkel i 30 s.
-
Stänga operationsområdet
- Lägg den kirurgiska styrelsen platt och ta bort suturen från bakom luftstrupen.
- Använd 4-0 vaxbelagd flätad sidensutur för att stänga huden snitt med 2-3 stygn.
3. postoperativ vård
- När snittet är stängd, Placera musen på sin vänstra sida på en varm värmedyna tills musen återhämtar sig från anestesi. Börja övervaka musen för smärta och aktivitetsnivå innan du återvänder den till normala bostäder.
Anmärkning: Buprenorfin bör administreras på 0,1 mg/kg subkutant varje 6-12 h för den första 24 h. Om ihållande genombrottssmärta är närvarande, förlänga den analgetiska regimen tills smärtan avtar.
4. hela lung Bronalveolär lavage (BAL) och leukocyter Immunophenotyping
-
Euthanize musen genom att administrera 3x dosen av ketamin/xylazin används i steg 2.1.1.
- För att differentiera interstitiell och intravaskulär neutrofiler, injicera intravenöst en utvald fluorophore-märkt Ly6G antikropp 5 min före eutanasi. Denna etikett bör vara lämplig för detektion genom flödescytometri för att särskilja intravaskulära neutrofiler från lunginterstitiell och alveolära neutrofiler, som kommer att märkas under vävnads beredningen med en annan fluorofore (se nedan).
- Placera musen på ett kirurgiskt bräde och haka de främre framtänderna runt en slinga av 2-0 flätad sidensutur.
- Följ steg 2.2.2 – 2.2.6. för att bereda luftstrupen för kanylering.
Anmärkning: Se till att membranet inte punkteras för att maximera transalveolar blåsa tryck under lung sköljning; vänster lung Compliance minskar efter skada, vilket kan kräva ett högre transalveolärt tryckkrav för lung sköljning. - Kanylera luftstrupen efter steg 2.3.1, men gå inte vidare med katetern under Carina; för in katetern parallellt med luftstrupen.
- Med katetern insatt, binda suturen runt luftstrupen för att hålla katetern på plats.
- Ingjuta och dra två på varandra följande 1 mL alikvoter av iskall PBS-/-(utan magnesium eller kalcium) med 0,6 mM EDTA med en 1 cc spruta. För immunophenotypning med flödescytometri, ta bort varje alikvot och återgå till en 5 mL polystyren FACS rör på is.
- För att säkerställa eutanasi, utföra en thorakotomi med kirurgisk sax följt av hjärt punktering. Lungorna kan skördas för vidare bearbetning.
- Centrifugera BAL i 10 min vid 800 g vid 4 ° c för att pelleten cellerna.
- Dekanera supernatanten i ett 2 mL mikrocentrifugrör och alikvot i 1,5 mL mikrocentrifugrör. Förvaras vid-80 ° c för efterföljande analys.
- Omsuspendera cellpelleten i PBS-/-med 2% FBS för differential analys av leukocyter med flödescytometri.
- För att differentiera interstitiell och intravaskulär neutrofiler, ta bort vänster och höger lunga separat och bearbeta lungorna för flödescytometri som i Abdulnour et al. 20146.
- Fläcken den resulterande cellsuspensionen med hjälp av valda FACS antikroppar, se till att färga för Ly6G som är konjugerat med en annan fluorophore än Ly6G antikropp från steg 4.1.1.
5. bedömning av alveolar barriär permeabilitet med Evan ' s Blue Dye (EBD)
- Intravenöst injicera Evan ' s Blue Dye (40 mg/kg) 30 min före eutanasi.
- Euthanize musen med överdosering av ketamin/xylazin (steg 4,1).
- För att mäta den alveolära barriärens integritet, Följ steg 4.2 – 4.9 för BAL-uppsamling.
- Överför 100 μL BALF till en klar botten 96-väl mikroplatta, tillsammans med 100 μL av dubbla EBD-standarder. Använd PBS-/-som en tom.
- Använd en mikroplattläsare för att mäta BALF-absorbansen vid 620 nm och 740 nm. Använd absorbansen vid 740 Nm för att korrigera för heme-kontaminering i proverna7.
- För att mäta vaskulär barriär integritet, BEGJUTA lungorna genom att sakta injicera 5 ml iskall PBS-/-genom höger kammare i hjärtat. Ta bort den vänstra lungan.
- Torka vänster lunga för 72 h vid 58 ° c för att ta bort överflödigt vatten.
- Bearbeta den torkade lungvävnaden som i Radu och Chernoff 20138, och Mät absorbanserna vid 620 nm och 740 nm.
6. lunghistologi
- Cannulate luftstrupen genom att följa steg 4.1 – 4.5.
- Till tryck Fix lungorna vid 20 cm H2O, Använd en ring stativ och klämma för att lyfta en 60 ml spruta försedd med ventilstyrda slangar och fylld med en SELECT fixativ lösning (t. ex., zink fixativ) så att menisken av fixativ lösning är 20 cm över Lungorna.
- Fäst slangen till katetern och öppna värdet. Långsamt fylla lungorna med fixativ tills de slutar blåsa.
- Ta bort katetern 3/4 av vägen ut ur luftstrupen. Fäst av luftstrupen med suturen innan du helt tar bort katetern för att minimera förlust av fixativ.
- Ta bort lungorna och hjärtat en bloc.
Anmärkning: Se till att lungorna inte punkteras under avlägsnande att behålla den tryck infunderade fixativ. - Fix lungorna för 24 h i 25 mL fixativ vid rumstemperatur.
- Tvätta de fasta lungorna för sekventiell 20 min intervall i PBS-/-, 30% etanol, och 50% etanol.
- Efter den sista tvätten, förvara lungorna i 70% etanol för histologi bearbetning som i Eickmeier et al. 20139.
Representative Results
Selektiv intrabronkiell HCl-instillation resulterar i ensidig Akut lungskada
Metoden för selektiv intrabronkiell instillation av HCl till vänster mainstem luftrör illustreras i figur 1a. Den därav följande akuta lung skadan involverar hela den vänstra lungan, och efter intravenös administrering av EBD och lung perfusion förblev EBD endast i den vänstra lungan (figur 1b). EBD extravasering till vänster lunga kvantifierades och konstaterades vara signifikant ökad i förhållande till simulerad selektiv instillation (figur 1c; anpassad från Abdulnour et al. 20146). Som svar på lungskada, cirkulerande leukocyter diapedese i inflammerad vävnad. I denna modell genomgår vaskulära neutrofiler transendotelial migration till den skadade lungan interstitium. Interstitiella neutrofiler ackumulerade i vänster lunga 24 h efter HCl instillation, i motsats till den högra lungan där få interstitiella neutrofiler observeras (figur 1d). Dessa resultat indikerar att den selektiva vänstermainstem intrabronkiala instillation metoden resulterade i murina Akut lungskada som var till stor del lokaliserad till vänster lunga och producerade patologiska förändringar som också ses med mänskliga ARDS, inklusive ökad kapillärbarriär och neutrofila infiltration.
Ensidig Akut lungskada möjliggör utredning av resolutionsmekanismer
För att studera lösningsfasen av syra-inducerad Akut lungskada möss måste kunna överleva den första förolämpningen. Skild från intratrakeal HCl, instillation i endast den vänstra mainstem luftrör leder till en egen begränsad skada med enhetlig överlevnad i övrigt friska möss. Lungorna kan erhållas från möss vid antingen tidiga eller senare tidpunkter som i figur 2A. Lung histologi visar vävnadsskada och inflammation på orgel och cellulär nivå med exsudativ inflammation 24 h efter skada kännetecknad av markerade alveolära ödem och neutrofila infiltration i den vänstra lungan. Observera att det inte finns någon signifikant skada eller inflöde av leukocyter i den oskadade kontroll högra lungan (figur 2A). 72 h efter skada, ödem och cellulära infiltrat minskas avsevärt, vilket motsvarar en lösning exsudativ fas. Alveolära neutrofiler kan övervakas med flödescytometri (CD45+/Cd68-/F4/80-/Ly6g+/cd11b+) som erhålls genom hel lung sköljning. Neutrofiler ökar i vänstra lungan 24 h efter den initiala skadan och minskar kraftigt vid 48 och 72 h (figur 2b). Om senare tidpunkter undersöks kommer neutrofila tal att återgå till baseline och mekanismer i senare faser av katabasis, såsom fibroproliferativa reaktioner, kan studeras.
Figur 1: selektiv intrabronkiell HCL-instillation ger ensidig lungskada definierad av alveolära barriär brott och neutrofila infiltration. (A) representation av kanylering av murina vänster mainstem luftrör för selektiv instillation av HCL i vänster lunga. (B) resected höger (RL) och vänster (ll) lungor utsätts för selektiv Syra instillation och perfunderade efter intravenös Evan ' s Blue Dye. (C) kvantifiering av interstitiell Evan ' s Blue Dye från homogeniserad, perfunderade lung 24 h efter syra skada eller simulerad kontroll; Figur anpassad från Abdulnour et al. 20146. Värden representerar medelvärde ± SEM, där n ≥ 5. *p < 0,05, Mann-Whitney U-test.D) representativ flödescytometri av intravaskulär (I.V.; fluorophore 1) och interstitiell (I.S.; fluorophore 2) neutrofiler i procent av totalt CD45+ celler i bearbetad lung 24 h efter syra skada. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: ensidig Akut lungskada är själv-lösa. A) representativa H & E histologi (10X) av vänster lungor som erhållits från naiva möss (0 H) eller möss 24, 48, 72 H efter skada, tillsammans med den associerade högra lungan från samma mus (skalbar = 250 μm). B) representativ flödescytometri av alveolära neutrofiler (Ly6G+ CD11b+) som erhållits från hel lung sköljning i procent av totalt CD45+ celler i naiva (0 h) möss eller möss 24, 48 och 72 h efter syra skada. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Den intrabronkiala instillation metod som beskrivs här använder selektiv kanylering av vänster mainstem luftrör att ingjuta HCL i vänster lunga, vilket resulterar i ensidiga och självbegränsade murina Akut lungskada. Denna murina syra lungskada modell nära representerar den inflammatoriska reaktionen, histopatologi, och fysiologiska dysfunktion ses i mänskliga ARDS, där magsyra aspiration är en vanlig fällningsmedel eller bidragande faktor4. Exponering av murina luftvägarna till lågt pH HCL resulterar i ökad permeabilitet av alveolära-kapillär barriären, alveolära ödem, och djupa neutrofila infiltration på platsen för skadan. Dessa händelser observeras inte i den oskadade högra lungan. Dessutom, denna modell ger snabba inflammatoriska reaktioner som topp inom 24 h efter syra instillation, och aktier förändringar i genuttryck med mänskliga ARDS, såsom differential uttryck av fosfolipas D isoformer10.
Även om denna murina prekliniska modellen återger många av funktionerna i ARDS på molekylär, cellulära och vävnadsnivå, det inte helt recapitulate mänskliga ARDS. Definitionen av ARDS omfattar bilaterala lung engagemang3, medan instillation metod som beskrivs här resultat av design i ensidig lungsjukdom. Dessutom, djuren kräver inte kontinuerlig mekanisk ventilation, orörlighet, eller parenteral sedering. Resultat som presenteras här (vide Supra) och på andra håll6,9,11,12,13 visar att ensidig syra-inducerad lungskada återger de flesta av de patologiska kännetecken av Samtidigt som den ger en unik möjlighet att använda rätt lunga som intern kontroll och att studera rekonstruktions fasen av denna sjukdom. Som sådan, den modell som diskuteras här modeller ARDS Pathobiology, men också möjliggör mekanistisk utredning av grundläggande lungvävnad svar på skador och mekanismer lösning som kan vara relevanta för att ta itu med denna viktiga sjukdom.
Instillation av HCl representerar direkt Akut lungskada, så det är modellering aspekter av patofysiologin i samband med aspiration pneumonit. Dessutom, den initiala vänstra lung förolämpningen i denna modell genereras med hjälp av steril HCl snarare än bakteriefladen maginnehåll ses i vissa mänskliga aspiration händelser som också kan leda till lunginflammation14. Hos människor kan aspiration av patogena bakterier resultera i sekundär bakteriell lunginflammation som förvärerar den akuta inflammatoriska reaktionen, förlänger den initiala lung skadan och ökar patientens känslighet för att utveckla ARDS14. Denna potentiella begränsning har behandlats av utredare avsiktligt ingjutande patogena bakterier Escherichia coli (E. coli)15 efter steril HCl. Dessutom har denna metod använts för att undersöka patogena-medierade inflammation ensidig bakteriell lunginflammation kan induceras av selektiv vänster lung instillation av bakterier, såsom E. coli16,17, Pseudomonas aeruginosa16, och Streptococcus pneumoniae18 . Den självbegränsade akuta lung skade modellen som beskrivs här kan också användas för att studera ventilatorinducerad lungskada (VILI), en viktig orsak till ökad dödlighet i mänskliga ARDS19. Försöksdjur modeller av Vili innebär vanligtvis mekanisk ventilation i naiva möss med tidvatten volymer som är mycket högre än vad som kliniskt används för att orsaka lungskada (> 15 ml/kg, se tidigare arbete20,21). Mot en mer kliniskt relevant modell av VILI, intrabronkialsyra instillation som beskrivs här kan användas först för att inducera icke-dödlig lungskada följt av mekanisk ventilation vid tidvatten volymer inom kliniskt intervall (6-12 mL/kg). Denna hypotetiska djurmodell kan göra det möjligt för utredarna att studera VILI på ett kliniskt relevant sätt när de väl har utvecklats och validerats. Tillsammans, dessa murina modeller belysa mångsidigheten hos den selektiva intrabronchial instillation metod för att generera ensidiga lung förolämpningar som liknar patologier i samband med mänskliga lungsjukdomar.
Förutom att tillåta selektiv instillation av olika skadliga agenter till vänster lunga, tekniken för intrabronkial instillation efter tracheostomi kräver inte utökad utbildning, lång procedur tid, eller komplicerad utrustning, och i erfarna händer orsakar minimalt lidande för djuren. Trots detta kan flera problem uppstå under selektiv HCl instillation förfarande som kan påverka experimentella resultat. Felaktig kanylering av den vänstra huvudstammen luftrör kan resultera i bilaterala lungskador som minskar överlevnaden av experimentella möss och blandar ihop användningen av den högra lungan som en oskadad intern kontroll. Detta kan undvikas genom att vinkla katetern tillräckligt mot vänster lunga under kanylering tills motståndet uppnås. Efter injektion av HCl, en bolus av luft bör injiceras, katetern snabbt bort, och kirurgiska styrelsen förde upprätt till en 60 ° vinkel. Dessa steg är avgörande för att säkerställa att syran når distala luftvägarna i den vänstra lungan och förhindrar återflöde av syra i rätt lunga och luftstrupe, som kan orsaka proximala skada. Inom 24 h efter instillation, skadan i den vänstra lungan är diffus med omfattande lungödem, påverkar både distala och proximala vänster lunga.
Under metodutveckling hos vuxna 8-12 veckor gamla möss, 2,5 ml/kg av intrabronkial HCL produceras betydande men subletala Akut lungskada; lägre doser av HCl leder inte till reproducerbar och homogen lungskada. Även om vi inte har utfört denna modell hos yngre (t. ex. 3-6 veckor gamla) eller äldre möss (t. ex. 10-14 månader gamla), räknar vi med att viktbaserad dosering av HCl kommer att resultera i en lungskada fenotyp liknande den som noteras i 8-12 veckor gamla möss. Vi rekommenderar att utredarna titrera HCl doser för att uppnå önskad grad av lungskada innan du utför experiment med möss vid extrema vikt.
Denna selektiva syra instillation förfarande erbjuder en icke-dödlig murina modell av steril vävnad inflammation som minskar behovet av stödjande vård, såsom mekanisk ventilation. Med förlängd överlevnad av skadade möss, den syra-inducerad inflammation har tillräckligt med tid att själv-lösa. Lösningsfasen av denna modell har använts för att identifiera temporally reglerade endogena bioaktiva Lipidmediatorer, kallas specialiserade Pro-lösa medlare (SPMs), såsom lipoxinanaloger A4 (LXA4), maresin 1 (MaR1), och varken6 ,11,12,16. Administrera exogena SPMs till skadade möss påskyndar upplösningen av surt inducerad lungskada genom att dämpa inflammatoriska mekanismer och främja catabasis av skadade lungvävnad. Dessa SPMs främja clearance av alveolära ödem12, öka efferocytosis av apoptotiska neutrofiler genom rekryterade makrofager16, och påskynda re-epitelialisering av luftvägarna och alveoler12 för att minska vaskulär läckage och vävnads hypoxi. I en modell av patogen-inducerad lungskada, 15-EPI-resolvin D1 uppvisade också antimikrobiella åtgärder genom ökad bakteriell fagocytos av makrofager och förbättrad bakteriell clearance från den infekterade lungan16. Undersöka dessa endogena resolutionsmekanismer ger insikt i potentiella nya terapeutiska strategier för patienter med ARDS5.
För att bäst studera den spatiotemporal regleringen av resolutionsmekanismer behövs in vivo experimentella modeller. Akuta lungskador modeller måste inkludera relevanta akuta inflammatoriska reaktioner och organdysfunktion med engagemang av värd upplösning främja molekylära och cellulära processer. Dessa mekanismer kan kvantifieras med hjälp av fastställda resolutions index22. Den selektiva intrabronkiala instillation metod för att generera ensidig Akut lungskada har visat sig användbart i detta avseende att sonden endogena upplösning medlare och vägar. Framtida studier som fördjupar vår förståelse av dessa aktiva resolutions processer har löftet att leda till terapeutiska agonister som imiterar bioactions av endogena Lipidmediatorer för att förbättra upplösningen av inflammation och lindra sjuklighet och dödligheten hos ARDS och andra viktiga lungsjukdomar.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Dr Joseph Mizgerd för hans bidrag till utvecklingen av den selektiva intrabronkiala metoden och för hans hjälpsamma kommentarer och översyn av manuskriptet. Detta arbete stöddes av National Institute of Health Grants P01GM095467 (B.D.L.) och K08HL130540 (R.E.A.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Zinc Fixative | BD Biosciences | 552658 | |
| 2-0 Braided Silk Suture | Surgical Specialties | SP118 | |
| 24 G x 3/4" Disposable Safelet I.V. Catheter | Excel | 26751 | |
| 33 mm, 0.22 µm syringe filter unit | Millipore-Sigma | SLGP033RS | |
| 4" Long Serrated Slight Curve Graefe Forceps | Roboz | RS-5135 | |
| 4" Long Tip Serrated Full Curve Graefe Forceps | Roboz | RS-5137 | |
| 4.5 " Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5912 | |
| 6" Crile Wood Needle Holder | Roboz | RS-7860 | |
| 60 mL syringe | BD Biosciences | 309653 | |
| Anti-mouse FITC-Ly6G antibody | Thermo Fisher Scientific | 11-9668-82 | Preferred fluorophore can be used |
| Anti-mouse PE-Ly6G antibody | Thermo Fisher Scientific | 12-9668-82 | Preferred fluorophore can be used |
| Bead sterilizer | |||
| Betadine Solution Swabstick | Betadine | 67618-153-01 | |
| Buprenex | Reckitt Benckiser | NDC: 12496-0757-1, 12496-0757-5 | |
| Clear flat-bottomed 96-well microplate | Thermo Fisher Scientific | 12565501 | |
| Dulbeccos's Phosphate Buffered Saline (PBS) without Ca2+ or Mg+ | life technologies | 14190-144 | |
| Electric clippers | |||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore-Sigma | E6758 | |
| Evans Blue Dye | Millipore-Sigma | E-2129 | |
| Heating pad | |||
| Hydrochloric acid, 37% | Millipore-Sigma | 258148 | |
| Ketamine | Henry-Schein | 56344 | |
| Microplate reader (640, 720 nm) | |||
| P200 Pipette | |||
| P200 Pipette Tips | |||
| pH probe | |||
| Ring stand with extension clamp | |||
| Sterile Alcohol Prep Pads | Thermo Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Sterile Mouse Drape 8" x 8" with Oval Adhesive Fenestration | Steris | 88VCSTF | |
| Sterile Nitrile Gloves | Kimberly-Clark | 56890 | |
| Sterile Towl Drape | Dynarex | 4410 | |
| Wax Coated 4-0 Braided Silk Suture | Covidien | SS733 | |
| Xylazine | AKORN | NDC: 59399-111-50 |
References
- Baron, R. M., Levy, B. D., et al. Acute Respiratory Distress Syndrome. Harrison's Principles of Internal Medicine, 20e. Jameson, J. L. , McGraw-Hill Education. (2018).
- Bellani, G., et al. Epidemiology, Patterns of Care, and Mortality for Patients With Acute Respiratory Distress Syndrome in Intensive Care Units in 50 Countries. The Journal of the American Medical Association. 315 (8), 788-800 (2016).
- The ARDS Definition Task. Acute Respiratory Distress Syndrome: The Berlin DefinitionThe Berlin Definition of ARDS. The Journal of the American Medical Association. 307 (23), 2526-2533 (2012).
- Thompson, B. T., Chambers, R. C., Liu, K. D. Acute Respiratory Distress Syndrome. New England Journal of Medicine. 377 (6), 562-572 (2017).
- Krishnamoorthy, N., Levy, B. D., Walker, K. H., Abdulnour, R. -E. E., Engstrom, B. D. Specialized Proresolving Mediators in Innate and Adaptive Immune Responses in Airway Diseases. Physiological Reviews. 98 (3), 1335-1370 (2018).
- Abdulnour, R. -E. E., et al. Maresin 1 biosynthesis during platelet-neutrophil interactions is organ-protective. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (46), 16526 (2014).
- Chen, H., et al. Pulmonary permeability assessed by fluorescent-labeled dextran instilled intranasally into mice with LPS-induced acute lung injury. PLoS ONE. 9 (7), (2014).
- Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. Journal of Visualized Experiments. 73 (73), e50062 (2013).
- Eickmeier, O., et al. Aspirin-triggered resolvin D1 reduces mucosal inflammation and promotes resolution in a murine model of acute lung injury. Mucosal Immunology. 6 (2), 256-266 (2013).
- Abdulnour, R. -E. E., et al. Phospholipase D isoforms differentially regulate leukocyte responses to acute lung injury. Journal of Leukocyte Biology. 103 (5), 919-932 (2018).
- Fukunaga, K., Kohli, P., Bonnans, C., Fredenburgh, L. E., Levy, B. D. Cyclooxygenase 2 Plays a Pivotal Role in the Resolution of Acute Lung Injury. Journal of Immunology. 174 (8), 5033 (2005).
- Colby, J. K., et al. Resolvin D3 and Aspirin-Triggered Resolvin D3 Are Protective for Injured Epithelia. American Journal of Pathology. 186 (7), 1801-1813 (2016).
- Bonnans, C., Fukunaga, K., Keledjian, R., Petasis, N. A., Levy, B. D. Regulation of phosphatidylinositol 3-kinase by polyisoprenyl phosphates in neutrophil-mediated tissue injury. The Journal of Experimental Medicine. 203 (4), 857-863 (2006).
- Mandell, L. A., Niederman, M. S. Aspiration Pneumonia. New England Journal of Medicine. 380 (7), 651-663 (2019).
- Seki, H., et al. The anti-inflammatory and proresolving mediator resolvin E1 protects mice from bacterial pneumonia and acute lung injury. Journal of Immunology. 184 (2), 836-843 (2010).
- Abdulnour, R. E., et al. Aspirin-triggered resolvin D1 is produced during self-resolving gram-negative bacterial pneumonia and regulates host immune responses for the resolution of lung inflammation. Mucosal Immunology. 9 (5), 1278-1287 (2016).
- Traber, K. E., et al. Myeloid-epithelial cross talk coordinates synthesis of the tissue-protective cytokine leukemia inhibitory factor during pneumonia. American journal of physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 313 (3), L548-L558 (2017).
- Yamamoto, K., et al. Roles of lung epithelium in neutrophil recruitment during pneumococcal pneumonia. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (2), 253-262 (2014).
- Acute Respiratory Distress Syndrome Network. Ventilation with Lower Tidal Volumes as Compared with Traditional Tidal Volumes for Acute Lung Injury and the Acute Respiratory Distress Syndrome. New England Journal of Medicine. 342 (18), 1301-1308 (2000).
- Peng, X., et al. Inducible nitric oxide synthase contributes to ventilator-induced lung injury. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 172 (4), 470-479 (2005).
- Abdulnour, R. -E. E., et al. Mechanical stress activates xanthine oxidoreductase through MAP kinase-dependent pathways. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (3), L345-L353 (2006).
- Serhan, C. N., Levy, B. D. Resolvins in inflammation: emergence of the pro-resolving superfamily of mediators. The Journal of Clinical Investigation. 128 (7), 2657-2669 (2018).
