Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Multipleksed Co-İmmünopreyağış Kullanarak Protein Etkileşim Ağı Dinamiğinin Ölçülmesi

doi: 10.3791/60029 Published: August 21, 2019

Summary

Kantitatif Multipleks İmmünopantü (QMI), iki örnek arasındaki hedeflenen protein-protein etkileşimlerinin bolluğundaki farklılıkların hassas tespiti için akış sitometrisini kullanır. QMI biyomalzeme küçük bir miktar kullanılarak yapılabilir, genetiği değiştirilmiş etiketleri gerektirmez, ve daha önce tanımlanmış herhangi bir protein etkileşim ağı için adapte edilebilir.

Abstract

Dinamik protein-protein etkileşimleri, motiliteden DNA repliğine ve sinyal transdüksiyonuna kadar hücresel davranışı kontrol eder. Ancak, bir protein etkileşim ağında birden fazla protein arasındaki dinamik etkileşimleri izlemek teknik olarak zordur. Burada, Maruz Kalan Proteinlerin göreceli floresan ölçümlerine dayalı olarak protein etkileşimlerinde kat değişimlerinin kantitatif değerlendirmesini sağlayan Kantitatif Multipleks İmmünenyağış (QMI) için bir protokol sayılmiyoruz. Yüzey epitopleri (PiSCES). QMI'de, hücre lisatlarından gelen protein kompleksleri mikrokürelere immünpresipitat edilse ve pisces bolluğunu ölçmek için farklı bir protein için etiketli bir antikor ile incelenir. İmmünenen anatomikler farklı MagBead spektral bölgelere konjuge edilir, bu da bir akış sitometresinin birden fazla paralel immünoprepliti ayırt etmesini ve aynı anda her biriyle ilişkili prob antikor miktarını ölçmesini sağlar. QMI genetik etiketleme gerektirmez ve diğer immünopredipredityöntemleriile karşılaştırıldığında minimal biyomalzeme kullanılarak yapılabilir. QMI, etkileşim eden proteinlerin tanımlanmış herhangi bir grubu için uyarlanabilir ve şimdiye kadar T hücreleri ve nöronal glutamat sinapslarında sinyal ağlarını karakterize etmek için kullanılmıştır. Sonuçlar, potansiyel tanı ve tedavi uygulamaları ile yeni hipotez oluşumuna yol açmıştır. Bu protokol, ilk antikor paneli seçiminden çalışan tahlillere ve analiz verilerine kadar QMI'yi gerçekleştirmek için talimatlar içerir. Bir QMI tahlilinin ilk montajı, bir panel oluşturmak için antikorların taranmasını ve uygun bir lisis tamponunun ampirik olarak belirlenmesini içerir. Sonraki reaktif hazırlığı magbeadlar için kovalent kaplin immünopresian antikorlar içerir, ve bir streptavidin-konjuge florofile etiketlenmiş olabilir böylece biyotinilting prob antikorlar. Tofaş çalıştırmak için, lysate magbeads ile bir gecede karıştırılır, ve sonra boncuk bölünmüş ve farklı prob antikorları ile kuluçka, ve daha sonra bir florofor etiketi, ve akış sitometri tarafından okunur. PiSCES'i deneysel koşullar arasında önemli ölçüde farklılık gösteren iki istatistiksel test yapılır ve sonuçlar ısı haritaları veya düğüm kenarı diyagramları kullanılarak görselleştirilmiştir.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dinamik protein-protein etkileşimleri, çoğu hücresel fizyolojinin fonksiyonel temeli olan moleküler sinyalbasamaklarını ve hareketli yapıları oluşturur 1. Bu süreçler genellikle tek girişlere dayalı sabit durumlar arasında geçiş yapan doğrusal sinyal yolları olarak tasvir edilir, ancak deneysel ve modelleme verileri entegre ağlar olarak işlev ettiklerini açıkça göstermektedir2,3, 4. G proteinleri durumunda, farklı reseptörler genellikle aynı G proteinini aktive etme yeteneğine sahiptir ve tek bir reseptör de birden fazla G proteini türünü aktive edebilir5,6. Göreceli olarak az sayıda g protein sınıfının sinaptik iletim, hormon düzenlemesi ve hücre göçü gibi çok çeşitli hücresel fonksiyonları modüle edebilmesi için, hücrelerin bu sinyalleri hem entegre etmesi hem de farklılaştırmasıgerekir 4 , 5. Kanıtlar göstermiştir ki bu sinyal özgüllüğü, G proteinleri için yanı sıra diğerleri için, öncelikle ince ayarlı protein-protein etkileşimleri ve zamansal dinamikleri1temelinde türetilmiştir1 ,3, 4.2.2 , 5.000 , 6.000 , 7. Sinyal ağları birden fazla giriş, çıkış ve geri besleme döngüleri ile dinamik protein kompleksleri oluşur çünkü, tek bir pertürbasyon bir hücrenin fizyolojisi4 genel homeostatik dengesini değiştirmek için fırsat vardır ,7. Şimdi yaygın olarak sinyalizasyon daha iyi anlamak için bir ağ perspektifinden incelenmesi gerektiğini kabul edilir nasıl birden fazla girdi entegrasyonu sağlık ve hastalık ayrık hücresel fonksiyonları kontrol eder7,8, 9,10,11,12,13. Bunun ışığında, dinamik protein etkileşim ağlarında kıvrım değişiklikleri hakkında orta-iş- ve nicel veriler toplamak için Kantitatif Multipleks İmmünopantüen (QMI) geliştirilmiştir.

QMI, hücre lisatının floresan boyaların farklı oranlarda bulunan manyetik boncuklarla kovalent olarak birleşen immünopresid antikorlarından oluşan bir panel ile kuluçkaya yatırıldığı antikor bazlı bir tahlilidir. Farklı manyetik boncuk sınıfları ile birleşen spesifik antikorların olması, aynı lysate'den birden fazla hedef proteinin eşzamanlı olarak ko-immünoprepitasyon almasına olanak sağlar. İmmünenyağış (IP) sonrasında manyetik boncuklar ikinci bir florofor konjuge prob antikor (veya florofor konjuge streptavidin ile birlikte biyotinylated antikor) ile kuluçkaya yatırılır. Her IP antikor-probu antikor çifti veya PiSCES (maruz kalan yüzey epitoprepleri tarafından saptanan ortak komplekslerde proteinler) tarafından tanınan proteinler arasındaki ortak ilişki, akış sitometrisi tarafından saptanır ve farklı örnek koşulları14. Şekil 1'deki çizimler, flüoresanslı konjuge prob antikorları ile etiketlenmiş immünopsipitated protein kompleksleri ile manyetik boncuk diyagramı da dahil olmak üzere, bir QMI testi nin çalıştırılmasında yer alan adımları göstermektedir (Şekil 1C).

QMI'nin duyarlılığı, immünopresipitasyon için kullanılan manyetik boncuk sayısına göre lysate protein konsantrasyonuna bağlıdır ve %10 kat değişikliklerini tespit etmek için bir çözüm elde etmek, diğer co-IP yöntemleri14,15. Örneğin, QMI'de kullanılan başlangıç materyalinin miktarı sandviç Enzime Bağlı İmmünosorbent Test (ELISA) için gerekli olana benzer, ancak tek bir QMI testinde birden fazla etkileşim algılanır. 4 mm deri biyopsisinden izole edilmiş 1-5 x 105 primer T hücreleri, fare prefrontal korteksin 3 mm koronal bölümünden P2 sinaptozomal preparatlar veya 3 x 106 kültürlü fare primemi kullanılarak 20 IP ve 20 prob hedefi kullanılarak QMI tahlilleri yapılmıştır. kortikal nöronlar14,16,17. Bu duyarlılık QMI'yi klinik numuneler gibi sınırlı kullanılabilirlik teshisi olan hücrelerin veya dokunun analiziiçin yararlı hale getirir.

QMI daha önce tanımlanmış herhangi bir protein etkileşim ağına uyarlanabilir (antikorların mevcut olması koşuluyla) ve bugüne kadar T hücre antijen reseptörü (TCR) sinyalozomve nöronlarda glutamaterjik sinapslarda protein alt kümesini analiz etmek için geliştirilmiştir. 17.000 , 18- T hücre reseptör sinyalizasyonu çalışmalarında, QMI ilk PiSCES stimülasyon kaynaklı değişiklikleri belirlemek için kullanılan ve daha sonra bir kontrol grubundan otoimmün hastaları ayırt etmek için, endojen otoimmün sinyal tespit ve son olarak oluşturmak için etkileşimlerin dengesiz bir hastalık ilişkili alt ağ içeren hipotez14. Daha yakın zamanda, aynı QMI paneli timosit seçimi tcr ilişkili protein sinyal19 nitel farklılıklar yerinenicel tarafından belirlenir belirlemek için kullanılmıştır. Nöronlarda, QMI sinaptik plastisite yeni ortaya çıkan modelleri destekleyen bir şekilde giriş sinyalleri farklı türleri için bir protein etkileşim ağının giriş-özel yeniden düzenlenmesi tanımlamak için kullanılmıştır17. Ayrıca, bu sinaptik QMI paneli otizm yedi fare modeli farklılıkları belirlemek için kullanılmıştır, kendi PiSCES biyoimzadayalı alt gruplar halinde modelleri küme, ve doğru daha önce tanınmamış bir paylaşılan moleküler açık hipotez modellerinden birinde16. Benzer bir yaklaşım, farklı uyuşturucu tedavilerine yanıt verebilecek diğer alt grupları taramak veya belirli duyarlı alt gruplara ilaç atamak için de kullanılabilir. QMI temel bilime ek olarak tanı, hasta alt yazma ve ilaç geliştirme potansiyel uygulamalara sahiptir.

QMI antikor paneli oluşturmak için, ilk antikor taraması ve seçim protokolleri Bölüm 1'de aşağıda açıklanmıştır. Antikor panelleri tanımlandıktan sonra, seçilen antikorların IP için manyetik boncuklara konjugasyonu ve seçilen prob antikorlarının biyotinylasyonu için protokoller Bölüm 2'de açıklanmıştır. Hücre veya doku lysates üzerinde QMI test çalıştırmak için protokol Bölüm 3 açıklanmıştır. Son olarak, tek bir deneme ~ 5 x 105 bireysel veri noktaları, talimatlar ve bilgisayar kodları veri işleme, analiz ve görselleştirme yardımcı üretebilir beri Bölüm 4 sağlanır. Bölüm 2-4'te açıklanan iş akışına genel bir bakış Şekil1'de gösterilmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Ataşe tasarımı

  1. Aday antikor hazırlığı
    1. İlgi çekici her protein için, ekrana 3-5 antikor seçin. Mümkün olduğunda, farklı epitopsiyi tanıyan monoklonal antikorlar kullanın. Ayrıca bir non-spesifik kontrol antikor içerir.
    2. Tris'i kaldırmak için, antikor30 kDa spin filtresine ekleyerek, minimum hacmine inerek, 500 μL fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyerek ve 3 kez tekrarlayarak tampon değişimi gerçekleştirin. Taşıyıcı proteinleri çıkarmak için, üreticinin protokolüne göre antikor saflaştırma gerçekleştirin (spesifik arıtma tavsiyesi için Malzeme Tablosu'na bakın).
      NOT: Bu işlem, serbest amin gruplarına sahip taşıyıcı proteinler ve tamponların (Tris gibi) COOH gruplarıyla reaksiyona girerek sonraki boncuk kaplin ve biyotinylasyon reaksiyonlarını söndürmesi nedeniyle yapılır. Tüm antikorların saflaştırıldığından (taşıyıcı protein olmadığından) ve primer aminiçermeyen bir tamponda (yani Tris'siz) olduğundan emin olun.
    3. Davis ve Schrum20tarafından açıklandığı gibi karboksite modifiye lateks (CML) boncuk çift her antikor . Antikorkorumak için boncuk kaplin reaksiyonlarını 1/5'e kadar küçültün (yani, 10 μL 0.2-1 mg/mL antikorlu 3.6 x 106 boncuk).
    4. Hemositometre (genellikle ~108/mL) kullanarak boncuk sayılarını tahmin edin ve 4 °C'de saklayın. Boncuklar bir yılı aşkın bir süredir depolanmış ve QMI tahlillerinde başarıyla kullanılmıştır, ancak raf ömrü veya son kullanma tarihleri resmi olarak belirlenmemıştır. NaN3 B / S tampon bakteri büyümesini önler.
    5. Her antikorbir kısmını biyotinylate (aşağıdaki bölüm 2.2 bakınız). 4 °C'de saklayın.
    6. Etkili CmL boncuk kaplin ve doğru sayma 1 x 105 boncuk bir PE-konjuge antikor reaktif antikor hangi antikor yükseltilmiş ve bir akış sitometre üzerinde okuma ile boyama tarafından onaylayın.
    7. Streptavidin-HRP kullanarak nokta lekesi ile antikor biyotinylasyonu doğrulayın.
    8. Laboratuvar etkili olduğu bilinen reaktifler oluşturduktan sonra, bu reaktifleri 1.1.5 ve 1.1.6 adımlarında onay reaksiyonlarında pozitif kontroller olarak kullanın.
  2. IP-FCM ile antikor taraması (akış sitometrisi ile immünopresiye saptanır)
    1. Uygun bir tarama lysate karar verin. Bu ve diğer tüm qmi öncesi tarama adımları için (bu bölüm 1: Assay Design'da yer alan herhangi bir şey), sınırlı kullanılabilirlik te biyoörnekleri kullanmayın. Bunun yerine, wildtype fare dokusu, hücre hatları veya sınırlayıcı bir kaynak olmayan normal insan donör dokusu gibi karşılaştırılabilir bir kontrol malzemesi seçin.
      NOT: Bu tarak için bir lysis arabelleği seçmek önemsiz değildir ve bölüm 1.5: Deterjan Seçimi'nde ve Tartışma bölümünün sondan bir önceki paragrafında ele alınmıştır. Standart lisis tamponlar 150 mM NaCl, 50 mM Tris (pH 7.4), 10 mM sodyum florür, 2 mM sodyum ortonovaat ve proteaz ve fosfataz inhibitör kokteylleri tabanına sahiptir. QMI ile uyumlu deterjanlar içerir 1% NP-40, 1% Digitonin, 0.1-1% Triton X-100, ve 0.5-1% deoksiol14,16,17,18,19,21.
    2. Taranacak her IP-prob kombinasyonu için 10 μL kullanarak her IP için kullanılacak lysate'nin toplam hacmini hesaplayın. X prob antikorları ve bir IgG kontrolü kullanarak tarama varsa, her IP kullanır (X+1) * (10 μL) * (1.1 pipetleme hatası için); X+1 gerekli IgG prob kontrolü için hesap etmektir. Örneğin, bir 3x3 antikor ekranında, her IP 44 ul kullanmalıdır. IgG IP denetimi eklemeyi unutmayın (Şekil 2'deki örnek tarama kurulumuna bakın).
    3. Kullanılacak CML boncuk numarasını hesaplayın. X prob antikorlarını tarıyorsanız [(X+1) * 5 x 104 boncuk] kullanın. İdeal olarak, iyi başına 5.000 boncuk >2.000 boncuk başına iyi akış sitometre tarafından okunuyor neden olacaktır. Örneğin, 3 x 3 antikor ekranında, her IP 20.000 boncuk kullanmalıdır, bu da 1.1.3 adımdan yaklaşık 0,66 μL hazırlanmış CML boncuk stokudur (boncuklar ilk olarak doğruluğu sağlamak için bir hemositometre kullanılarak ölçülmelidir).
    4. Boncukların yerleşmesini önlemek için 1.2.3 adımdan, gece boyunca 4 °C'de, her BIR CML boncuk hacmi ile 1.2.2'den lysate hacmini inkübe edin. Tipik olarak, 96 kuyulu BIR PCR plakanın ilk sütununda kuluçka işlemleri yapın ve PCR tüp şerit kapakları ile kaplayın.
    5. 1 dk için 3.200 x g cml boncuk aşağı spin ve lavabo üzerinde plaka tek, hızlı flicking tarafından lysate kaldırın. Küçük bir beyaz pelet önce ve flicking sonra her kuyunun altında görünür olmalıdır.
    6. FlyP arabelleği hacmindeki CML boncukları her boncuk-prob çifti için 20°L'ye eşit olacak şekilde yeniden askıya alın; X prob antikorları için, 1.2.2 adımına benzer şekilde (X+1) * (20 μL) * (pipetleme hatası için 1.1) kullanın. 3 x 3 ekran için, FlyP arabelleği 88 μL'de yeniden askıya alın. FlyP tampon 100 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7.4, 1% BSA, 0.01% NaN3.
    7. Her IP'yi 96 kuyulu bir PCR plakanın (X+1) kuyularına dağıtın ve burada X, 20 μL/iyi kullanarak taranmakta olan prob antikorlarının sayısıdır. Şekil 2 A, örnek bir tarama kurulumu gösterir.
    8. Kuyu başına 200 μL FlyP tamponu kullanarak 2 kez daha yıkayın. Adım 1.2.5'teki gibi plakayı döndürün ve her yıkamadan sonra yıkama tamponunu çıkarmak için plakayı hareket ettirin. Peletler son derece küçük olacak, ancak her yıkamadan sonra görünür olmalıdır.
    9. Taranacak her biyotinylated antikor için, (Y+1) * 1.1 * 50 μL, Y'nin taranmakta olan IP antikor sayısı olduğu toplam hacmi hesaplayın. FlyP tamponbu hacminde çalışan bir konsantrasyona karşı antikor seyreltin, genellikle 0,5 mg/mL stok 1:100 seyreltme ile başlayan.
    10. Seyreltilmiş her antikor'u 96 kuyu plakasının her sütununa dağıtın ve CML boncuklarının askıya alınmasından emin olun.
    11. CML boncukların süspansiyonda kalmasını sağlamak için 15 dk aralıklarla dönme veya borulama ile 4 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
    12. Her yıkama santrifüjü için 200 μL FlyP tamponunda 3x yıkayın ve adım 1.2.5'teki gibi lysate'yi çıkarın.
    13. FlyP tamponundaki 1:200 Streptavidin-PE'nin 50 μL'lik tüm CML boncuklarını yeniden askıya alın.
    14. 30 dakika karanlıkta 4 °C'de kuluçka.
    15. Her yıkama santrifüjü için 200 μL FlyP tamponunda 3x yıkayın ve adım 1.2.5'teki gibi lysate'yi çıkarın.
    16. FlyP arabelleği 200 μL'de yeniden askıya alın ve bir akış sitometresi üzerinde çalıştırın.
  3. Tsay'a Dahil Etmek Için Antikorların Seçilmesi
    1. FSC-H vs SSC-H kullanarak boyut kapısı ve FSC-H vs FSC-A kullanarak doublets ortadan kaldırın.
    2. Test edilmiş çiftlerüzerine HEM IgG kontrolleri (IgG boncuk testi probu, test boncuk-IgG probu) hem DE PEfloresan yoğunluğu histogramları oluşturun ve bindirme (Şekil 2).
    3. Gürültü üzerinde net sinyal veren bir boncuk sondası çiftine bakın (Şekil 2B). Ayrıca, boncuk ve prob için aynı antikor kullanmak için ideal değildir. Diferansiyel epitop tanıma etkileşimleri gözlemleme şansını en üst düzeye çıkarır, çünkü bazı epitoplar bazı protein komplekslerinde tıkanmış olabilir. Kabul edilebilir bir seçenek yoksa, ek antikorlarla ekranı tekrarlayın.
  4. Antikor Özgüllüğünün Teyidi
    1. Amaçlanan hedefler için antikor özgüllüğü sağlamak için, hedefin nakavt edildiği lysate numunesi kullanın; örneğin, nakavt faresi veya RNAi hücre satırı. Alternatif olarak, hedef proteinin yapay olarak ifade edildiği hedef-negatif hücre hattından lysate kullanın.
    2. Adım 1.2'de açıklandığı gibi IP-FCM gerçekleştirin ve denemeyi sığdıracak şekilde değiştirin.
  5. Deterjan Seçimi
    1. Deterjanlar co-IP deneylerinde kritik öneme sahip olduğundan, testin değişiklikleri algılama olasılığının maksimum olduğundan emin olmak için farklı varyasyonları ampirik olarak test edin. Başlamak için, belirli bir durumda değiştiği bilinen ve/veya çalışmanızın özellikle ilgilendiği nispeten küçük bir etkileşim paneli (4-8) seçin.
    2. İlk ekranlar için yapılmış floresan olmayan, antikor konjuge CML boncukları kullanarak, çeşitli lisis tampon deterjan koşulları kullanılarak 1.2'de açıklandığı gibi IP-FCM gerçekleştirin. Deterjan perdeleri tek değişken olarak deterjanla veya her deterjan için farklı hücre koşullarıyla yapılabilir. Deterjanlar zaman zaman bazı IP-Probe kombinasyonlarında beklenmeyen arka plan lar ürettiğinden, her zaman hem boncuklar hem de problar için IgG kontrolleri kullanın.
    3. Ekrandaki MFI'lere göre, ilgi çekici PiSCES için sinyali optimize eden bir deterjan seçin. Bazı tavizler22yapılması gerekecektir muhtemeldir .

2. Multipleks reaktif hazırlama

  1. Manyetik boncuk kaplin
    1. Manyetik boncuk bölge haritasını kullanarak, çapraz algılama riskini en aza indiren bir desende kullanmak üzere boncuk bölgelerini seçin. Manyetik boncuk genellikle kadar ve sağa yayma, bu yüzden çapraz bitişik boncuk bölgeleri kaçının. Luminex web sitesinde gösterilen boncuk diyagramının diğer her sütunundan boncuk tavsiye edilir (https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/).
    2. 250 μL'de PBS'de 0,1 mg/mL 'de taşıyıcı içermeyen antikor hazırlayın.
    3. Vortex manyetik boncuklar yoğun, ve sonra bir amber mikrosantrifüj tüp içine 250 μL aliquot (photobleaching boncukları korumak için).
    4. Manyetik olarak 60 s için manyetik boncuklar ayırın ve supernatant kaldırın.
    5. 250 μL MES tampon (50 mM MES pH 6.0, 1 mM EDTA), girdap, manyetik olarak 60 s için ayrı ekleyin ve supernatant çıkarın. 200 μL MES tamponunda manyetik boncukları tekrarlayın ve yeniden askıya alın.
    6. 50 mg/mL stok yapmak için 2 mg sulfo-NHS tek kullanımlık tüpe 40 μL MES ekleyin.
    7. Manyetik boncuklar için taze yapılmış Sulfo-NHS 25 μL ekleyin. Girdap.
    8. MES tamponuna 50 mg/mL taze çözünmüş EDAC [1-etil-3-(-3-dimethylaminopropil) karbodiimid hidroklorür, ayrıca EDC olarak da adlandırılır] ekleyin. Girdap.
    9. Kapak ve oda sıcaklığında 20 dakika, 1000 rpm bir tüp tutma eki ile bir girdap üzerinde sallamak.
    10. Manyetik 60 s için ayrı ve supernatant kaldırın.
    11. PBS, girdap, manyetik 60 s için ayrı 500 μL resuspend ve supernatant kaldırın. Tekrar.
    12. 2.1.2 adımdan 250 μL antikor çözeltisinde resuspend. Girdap.
    13. 1000 rpm bir girdap üzerinde sallayarak oda sıcaklığında 2 saat kuluçka.
    14. Manyetik boncuklar, girdap, manyetik 60 s için ayrı 500 μL PBS ekleyin ve supernatant kaldırın.
    15. 750 μL Engelleme/Depolama (B/S) tamponu ekleyin (%PBS pH 7.4'te %1 BSA, %0.01 NaN3). Kapak ve oda sıcaklığında 30 dk kuluçka, 1000 rpm.
    16. Manyetik 60 s için ayrı ve supernatant kaldırın. 100 μL B/S arabelleğinde yeniden askıya alın.
    17. 4 °C'de saklayın. Boncuklar bir yılı aşkın bir süredir depolanmış ve QMI tahlillerinde başarıyla kullanılmıştır, ancak raf ömrü veya son kullanma tarihleri resmi olarak belirlenmemıştır. NaN3 B / S tampon bakteri büyümesini önlemek gerekir.
    18. 1.1.5 adımda olduğu gibi, bir floresan anti-konak türü ikincil ve bir akış sitometre üzerinde okuma ile birleştirilmiş manyetik boncuk ~0,25 μL boyama tarafından manyetik boncuk kaplin doğrulayın.
  2. Biyotinylasyon
    1. Antikorların taşıyıcı protein olmadan PBS'de olduğundan emin olun.
    2. Biyotinylated edilecek antikor toplam μg hesaplayın (100-200 μg multipleks kullanım için önerilen, 25-50 μg tarama için önerilir).
    3. Taze 10 mM sulfo-NHS-biotin hazırlayın (1 mg tartısız tüpe 224 μL ddH2O ekleyerek yapılabilir).
    4. Karıştırmak için 25 g antikor, girdap veya pipet başına 1 μL 10 mM sulfo-NHS-biotin ekleyin.
    5. 1 saat boyunca oda sıcaklığında kuluçka.
    6. 4 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
    7. Bağlanmamış biotinkaldırmak ve reaksiyonu durdurmak için 30 kDa spin filtresi kullanın. 500 μL PBS ekleyin ve minimum ses eulaşınakadar sütunu döndürün. 500 μL ek PBS ekleyin ve toplam 3 arabellek değişimi için tekrarlayın.
    8. Bir spektrofotometrede 1-2 μL'lik emiciliği ölçerek konsantrasyonu tahmin edin ve antikor konsantrasyonu 0,5 mg/mL'ye getirin.
    9. 4 °C'de saklayın.

3. Kantitatif multipleks immünopresidivar

  1. Plaka düzeni
    NOT: Bu test en iyi 96-iyi plakalar ve 2-4 örnek koşulları kullanılarak yapıldığında çalışır.
    1. Koşullar arasındaki değişiklikleri tespit etmek için her zaman uygun kontrolleri (örneğin, uyarılmış v. uyarılmamış hücreler) aynı plaka üzerinde çalıştırın. Her örneği plaka boyunca yatay olarak dağıtın ve her sütunu farklı bir prob antikoriçin kullanın. Her sonda için bir dizi teknik çoğaltma ilk kümeden hemen sonra çalıştırılmalıdır. Örnek olarak Şekil 3'e bakın.
    2. Doğru plaka yüklemesini ve analizini kolaylaştırmak için plaka düzenini dikkatle belgele.
  2. Numune hazırlama ve immünopresipitasyon (Gün 1)
    1. Proteaz ve fosfataz inhibitörleri ile uygun deterjan doku veya hücreleri lyse ve 15 dakika buz üzerinde kuluçka. Her zaman lysate soğuk tutmaya özen.
      NOT: Biyomalzeme ve lysatprotein konsantrasyonunun tam miktarı ampirik olarak belirlenmeli ve daha önce kullanılan örneklerin bazı örnekleri girişin üçüncü paragrafında listelenmiştir. Genel olarak, numune başına 200 μL 2 mg/mL protein aralığında geçmişte 20 IP ve 20 prob hedefi için başarılı olmuştur, ancak her antikor paneli ve hücre veya doku tipi için ideal girdiler ampirik olarak belirlenmelidir.
    2. Membranları ve döküntüleri temizlemek için 16.000 x g'da 15 dk için 4 °C'de aşağı doğru dön; lysate olarak supernatant tutun.
    3. Protein konsantrasyonlarını belirlemek için BCA Analizi veya benzeri bir işlem yapın ve numuneler arasındaki protein konsantrasyonu normalleştirin. Hücreleri kullanıyorsanız, koşul başına eşit sayıda hücre ile başlayın ve normalleştirme isteğe bağlıdır.
    4. Her sınıf başına ~250 manyetik boncuk içeren bir ana manyetik boncuk karışımı hazırlayın. Veri analizinden sonra boncuk sayılarını ayarlayın, böylece gelecekte her sınıftan ortalama 110 boncuk iyi okunacak.
      NOT: Örnek hesaplama: (Yeni boncuk hacmi) = [(Run Average) / 110] * (önceki boncuk hacmi). Boncuk hacimleri her 8 çalışır veya gerektiği gibi bu şekilde ayarlanmalıdır. Tipik olarak, her manyetik boncuk 3-4 μL (yukarıdaki gibi hazırlanan) 2 plakalı bir deney için kullanılır.
    5. Manyetik boncuk karışımını FlyP tamponunda 2x'i manyetik ayırma ile yıkayın ve flyp tamponunda yeniden askıya alın. Yeniden süspansiyon için, plaka başına numune başına 10 μL kullanın. FlyP tampon 100 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7.4, 1% BSA, 0.01% NaN3.
    6. Manyetik boncuk karışımını iyice girdapladıktan sonra, aliquot 10 μL buz gibi mikrosentrifüge tüplere (numune başına bir tüp) yerleştirin. İmmünenyağış için her tüpe eşit hacimlerde lysate (normalleştirilmiş konsantrasyonlarda) ekleyin.
    7. Aliquot lysate-manyetik boncuk karışımı çalıştırılan her plaka için bir tüp içine; örneğin 2 plakalı bir deney için lysate'yi iki tüpe bölün. İmmünyağış için gece boyunca 4 °C'de bir rotator üzerine tüpler yerleştirin, ışık uzak tutmak için kapalı.
  3. Atanın çalıştırıl (Gün 2)
    1. Plaka #1 için lysate-manyetik boncuk tüpleri ile başlayın. Manyetik boncuklardan lysate'yi çıkarmak için manyetik boncuk rafı kullanın ve ileride analiz için ayırın. 500 μL buz gibi FlyP tamponu içinde boncukları 2x yıkayın. Tüpleri her zaman buzda veya 4 °C'de tutun.
    2. Resuspension hacmini (prob sayısı) * (2 teknik çoğaltma sayısı) * (kuyu başına 25 μL) * (pipetleme hatası için 1,1) olarak hesaplayın. Hesaplanan buz gibi FlyP arabelleği hacminde IP'leri yeniden askıya alın.
    3. Manyetik boncukları nazik pipetleme ile iyice yeniden sulandırdıktan sonra, düz dipli 96 kuyu plakası boyunca her 25°L'yi buz üzerinde dağıtın.
    4. Farklı bir 96 kuyuplakasında, flyp tamponunda biyotinylated prob antikorlarını 2x çalışma konsantrasyonuna (çalışma konsantrasyonu tipik olarak 1:100 veya 1:200 olarak belirlenir) seyrelterek sıraları plaka düzenindeki sütunlara eşleşir (bkz. Şekil 3 ). Çalışma konsantrasyonundaki prob antikorlarının son hacmi kuyu başına 50°L olacaktır, bu nedenle hazırlanan her 2x antikorun hacmi (25 μL) * (biyolojik numune sayısı) * (2 teknik çoğaltma) * (pipetleme hatası için 1,1) olmalıdır.
    5. Manyetik boncuk içeren bir adak plakasına her probuantikor seyreltme 25 μL dağıtmak için çok kanallı bir pipet kullanın.
    6. Manyetik boncukları karıştırmak ve yeniden askıya almak için yatay bir plaka çalkalayıcı üzerinde sallayın ve sonra karanlıkta 450 rpm'de titreyerek 4 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
    7. 4 °C'de manyetik plakalı bir çamaşır lı üzerinde FlyP tamponu ile 3x yıkayın.
    8. 1:200 Streptavidin-PE 50 μL manyetik boncuklar resuspend.
    9. Sallamak ve boncukları yeniden askıya alın ve sonra karanlıkta 450 rpm'de sallayarak, 30 dakika boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın.
    10. 4 °C'de manyetik plakalı bir çamaşır lı üzerinde FlyP tamponu ile 3x yıkayın.
    11. FlyP arabelleği 125 μL'de yeniden askıya alın.
    12. Iyice boncukreaskıya 900 rpm 1 dakika çalkalayın.
    13. Soğutulmuş akış sitometreüzerinde çalıştırın (ŞekilS1'deki diyagrama bakın). Akış sitometre yazılımındaki "yüksek RP1 hedefi" ayarını ve bölge başına 1.000 boncukluk bir durdurma koşulunu (makinenin zamanından önce durmasını önlemek için herhangi bir kuyuda olması gereken sayıyı büyük ölçüde aşarak) ve 80 μL'lik numune hacmini kullanın.
    14. İşi yarı yolda durdurun ve yerleşmeyi önlemek için boncukları askıya alın.
    15. Veri dosyalarını .xml biçiminde dışa aktarın.
    16. 3.3.1 adımdan başlayarak kalan plakalar için işlemi tekrarlayın.

4. Veri analizi

NOT: ANC kodu, her biri her koşul için 2 teknik çoğaltma içeren N = 4 deneylerinden iki koşulu karşılaştırmak üzere tasarlanmıştır. Örneğin, hücreler dört bağımsız kez uyarılır, QMI kontrol (uyarılmamış) ve uyarılmış hücreler üzerinde dört farklı gün çalıştırılır, yukarıdaki gibi teknik çoğaltmalar ile, ve veri analizi aşağıda açıklandığı gibi devam eder.

  1. Ayarlanabilir alfa kesme (ANC) ile adaptif parametrik olmayan
    1. MATLAB'ı açın ve etkin dizini ANC program bileşenlerini ve akış sitometresinden dışa aktarılan .xml dosyalarını içeren bir klasöre ayarlayın.
    2. Deneysel tasarımın ayrıntılarını yansıtmak için "ANC girişi" dosyasını doldurun. Ek Dosya'da yer alan örnek dosya, ayrıca sağlanan örnek verileri çalıştırmak için önceden doldurulmuştur.
    3. Etkin dizine bir .csv dosyası yazacak programı çalıştırın. Dosya, kontrol ve deneysel koşullar arasında, 4 deneysel çoğaltmanın tümünde veya en az 3/4 çoğaltmada, yanlış pozitif (alfa) düzeyde 0,05'lik yanlış pozitif (alfa) düzeyde önemli ölçüde farklı pisces bildirir.
    4. 4.3.1 adımda kullanılmak üzere dosyada 3/4/4/4 olarak tanımlanan, en az 3 deneysel kopyada önemli farklılıklar alabilen PiSCES olarak tanımlanan 'ANC isabetleri' notu.
  2. Ağırlıklı korelasyon ağ analizi23 (CNA)
    1. "_MFI" ile biten Matlab tarafından veri dosyası çıktısının sütun başlıklarını yapıştırın.. CSV" yeni bir excel sayfasının ilk satırına. Deney numarası için "deney" ve deney tedavisi veya analiz edilecek diğer değişkenler için "deney" sütunlarını ekleyin. Bu dosyayı "traits.csv" olarak kaydedin.
    2. R stüdyosunu açın ve çalışma dizini "_MFI" içeren bir klasöre ayarlayın. CSV" ve "ÖZELLİkLerİ. CSV" dosyaları.
    3. R komutlarını, yorumlanan komut dosyasında ve dosyalarla birlikte verilen talimatlarda ayrıntılı olarak belirtildiği şekilde çalıştırın. Her bir deneysel özellik ile önemli ölçüde ilişkili WCNA modülleri bir grafik dosyası olarak çıktı ve her etkileşim IPi_ProbeJ her modül ile korelasyon bir .csv dosyası olarak çıktı.
    4. 4.3.1 adımda kullanılmak üzere, deneysel ilgi değişkeni ile önemli ölçüde ilişkili olarak tanımlanan bir modüle üyelik için modül üyeliği (MM) > 0.7 ve p < 0.05 ile etkileşim olarak tanımlanan 'CNA isabetleri' notu.
  3. Pozitif 'hits' & görselleştirme
    1. ANC çıktı dosyasındaki "3/4/4/4 isabet" listesindeki her etkileşim için (adım 4.1.4'ten itibaren), cna çıktı dosyasını işaretleyerek bu etkileşimin de bir "CNA hiti" olup olmadığını belirleyin (bkz. adım 4.2.6). Her ANC isabetinin de Bir CNA isabeti olup olmadığını belirten yeni bir sütun oluşturun.
    2. 4.1.3 adımdan ANC çıktı tablosu "_Hits.csv"de verilen değerlerin ortalamasını alarak her ANC-CNA isabeti için ortalama günlük2 kat değişim değerini hesaplayın. Değerleri ortalamadan önce2 kat değiştirerek günlüğü dönüştürün. Yalnızca 3/4 yinelemelerde önemli olan etkileşimler için, aykırı değeri silin.
    3. Bir sütunda IP, ikinci sütunda bir sonda ve üçüncü sütundaki kat değişim değeri olarak listelenen her ANC-CNA isabetli bir elektronik tablo yapın. Dosyayı ağ olarak içe aktararak Cytoscape'te düğüm kenarı diyagramı oluşturmak için bu elektronik tabloyu kullanın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Antikor Taraması
Şekil 2 B protein Connexin36 için bir ekran sonuçlarını gösterir. Ip_probe kombinasyonlarının çoğu IgG kontrolleri üzerinde sinyal üretmez. 1E5 veya poliklonal antikor 6200 ile monoklonal antikor 1E5 ve prob ile IP IgG kontrolleri ile karşılaştırıldığında boncuk dağılımında sağa doğru bir kayma üretir. Burada IP 1E5 ve probe 6200poly, hem spesifik olmayan bir proteinin iki bağımsız antikor tarafından tanınma olasılığını azaltmak hem de farklı epitoplar. IgG kontrollerine kıyasla en az 1-2 günlük daha yüksek MFI'ye sahip bir IP_probe kombinasyonu seçmek en iyisidir, ancak bazen alternatifler belirlenmezse kontrollerden sürekli olarak ayırt edilebilen daha zayıf MF'ler üreten çiftler kullanılabilir. Şekil 2 C, 1E5-6200poly kombinasyonu için bir özgüllük doğrulama deneyi gösterir. Connexin36 plazmidi ile transfece 293 hücrelerden lysate boncuk dağılımında ~ 1.5-günlük sağa kayma üretti, transfected hücreler IgG kontrolleri ile örtüşen ise. Bir çiftin özgüllüğünü doğrularken, hedef protein olmadan nakavt hayvan veya hücre hattından negatif kontrol lysate IgG kontrolleri benzer bir MFI olmalıdır.

Boncuk Kaplin
Tipik bir manyetik boncuk kaplin kalite kontrol reaksiyonu 3 ve 5 (PE veya FITC gibi) arasında bir parlaklık indeksi ile bir florofor konjuge ikincil bir antikor ile boyanmış zaman arka plan üzerinde bir MFI 3-4 günlükleri verecektir. Şekil 4, değiştirilen eski partiile karşılaştırıldığında yeni bir manyetik reklamın çekimini karşılaştıran tipik bir kalite kontrol reaksiyonu gösterir.

Veri Analizi
Her deneyde ANC, her bir kuyudaki her manyetik boncuk sınıfının floresan dağılımlarını (yani tüm olası IP_Probe kombinasyonları) kullanıcı tanımlı bir kontrol ve deneysel durum arasında karşılaştırır. Her bir kombinasyona, boncukların Kolomogrov-Shmirnov (K-S) istatistiklerine göre aynı popülasyonlardan örneklenme olasılığını yansıtan bir pdeğeri atar. Program daha sonra birden fazla karşılaştırma için düzelterek ve teknik değişkenlik (teknik çoğaltmalar arasındaki farklar) için muhasebe yaparak 0,05 yanlış pozitif oranı üretmek için gerekli K-S p-değeri hesaplar. K-S test p-değeri dört deneyde hesaplanan kesilmenin altına düşen VEYA en az 3/4 deney (3/4/4/4) tanımlanan IP_probe kombinasyonları (PiSCES). P-değer kesintileri bu farklı sıkılık düzeylerine bağlı olarak farklılık gösterirken, bazen PiSCES 4/4'te tanımlanır, ancak 3/4/4/4 olarak tanımlanmaz, bu nedenle ayrı listeler hesaplanır. Ayrıntılı ANC denklemleri için bkz. 14 WCNA analizi ve sonuçları hakkında ayrıntılı bilgi Langfelder ve ark.23 tarafından ayrıntılı olarak tartışılmıştır

Veri Sunumu
ANC ve CNA23 analizleri, pisces'i tanımlamak için yapılır, her ikisi de (1) en az 3/4'lük koşularda deneysel koşullar arasında önemli kat değişiklikleri gösterir ve (2) deneysel değişkenle ilişkili bir CNA modülüne aittir. İki bağımsız istatistiksel yaklaşımla tanımlanan bu yüksek güvenli PiSCES'e ANC-CNA PiSCES adı verilir. Bu etkileşimler, açık kaynak yazılım Cytoscape (Şekil5a) kullanılarak düğüm kenarı diyagramı olarak veya ek malzemede yer alan R kodu ve analiz talimatları kullanılarak Bir ısı haritası olarak görselleştirilebilir (Şekil 5b ).

Figure 1
Şekil 1 . Kantitatif Multipleks İmmünyağış'a Genel Bakış. (a) Daha önce taranmış antikorlar ayrı reaksiyonlarda farklı manyetik boncuk sınıfları ile kovalent olarak birleştiğinde. (b) Bir gecede protein kompleksleri antikor-çiftli manyetik boncukkarışımı kullanılarak immünopsipitated edilir. (c) Co-immünopsipitated proteinler bir prob antikor ve florofor ile etiketlenir. (d) Manyetik boncuklar ve etiketli protein kompleksleri, paylaşılan komplekslerde oluşan proteinlerin göreceli miktarlarını ölçmek için soğutulmuş akış sitometresi ile çalıştırılır. Özel soğutmanın şematik ayrıntıları için Şekil S1'e bakın. (e) Akış sitometre Yöneticisi Yazılımı MagBead'ları sınıfa göre ayırır ve (f) her boncuk bölgesinden floresan histogramlarını görüntüler. (g) Veriler .xml dosyaları olarak dışa aktarılır ve iki bağımsız istatistiksel yaklaşımla analiz edilir. Sadece her iki analiztarafından tanımlanan PiSCES ısı haritası ve düğüm kenarı diyagramı görselleştirmeleri kullanılarak raporlanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2 . IP-FCM kullanılarak Connexin 36 antikor taraması. (a) IP-FCM, fare beyin lysate üzerinde Connexin 36 (Cx36) CML boncuk ve problardan oluşan 4x4 panel kullanılarak gerçekleştirildi. Lysate plaka ayrı bir satırda her CML boncuk ile immünopsipitated oldu. Yıkamadan sonra, her boncuk satır boyunca dağıtıldı, böylece sütun başına bir sonda antikor eklenebilir. (b) Çoğu antikor kombinasyonu IgG arka plan üzerinde sinyal (turuncu) göstermez (gri, mavi). 6200Poly sondalı 1E5 IP kabul edilebilir pozitif sinyal gösterir. 1E5 boncuk/sonda ve 6200Poly boncuk/sonda çiftleri her biri kabul edilebilir sinyal gösterir, ancak hem boncuk hem de sonda için aynı antikor kullanmak ideal değildir. Diferansiyel epitop tanıma etkileşimleri gözlemleme şansını en üst düzeye çıkarır, çünkü bazı epitoplar bazı protein komplekslerinde tıkanmış olabilir. 1E5 sondası ile 6200Poly boncuk güçlü sinyal verir ve çokluk test spesifiklik onayı bekleyen kullanmak için seçildi. (c) IP-FCM, taramadan seçilen Cx36 antikorçiftini kullanarak Cx36 ve transfected olmayan kontrollerle transfected 293T hücrelerinin lysate'si üzerinde gerçekleştirildi. Cx36 transfected hücrelerden net sinyal vardır, ancak transfected olmayan hücreler IgG boncuk /sonda kontrollerinden ayırt edilemez. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3 . Örnek plaka düzeni. 4-koşul multipleks 96-iyi plaka ayarlanır. 1-4 arası örnekler ardışık satırlara yüklenir (her biyolojik örnek burada farklı bir renkle temsil edilir) ve teknik çoğaltmalar aşağıdaki 4 satırda aynı sırada yüklenir. Sütun başına bir sonda kullanılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4 . Yeni bir MagBead'ın çekimini değiştirilen eski partiyle karşılaştırıldığında karşılaştıran tipik bir kalite kontrol reaksiyonu. Boncuk arka plan üzerinde bir MFI 2-4 günlükleri verir ve yeni toplu eski toplu benzer bir MFI vardır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5 . QMI kültürlü kortikal nöronlarda NMDA stimülasyon 5 dakika sonra büyüklüğü değiştirmek sinaptik PiSCES tanımlar. Bir QMI deneyi NMDA uyarılmış vs uyarılmamış (ACSF kontrolü) nöronlar karşılaştırıldı. Hem ANC hem de CNA analizleri ile tanımlanan PiSCES sunulmaktadır. (a) Açık kaynak yazılımı Cytoscape kullanılarak üretilen bir düğüm kenarı diyagramında düğümler, QMI panelinde IP ve prob olarak dahil edilen antikor hedeflerini (proteinleri) gösterir. Kenarlar ANC-CNA PiSCES'i temsil eder, kenarın rengi ve kalınlığı NMDA işleme ve kontrolü arasındaki kıvrım değişiminin yönünü ve büyüklüğünü gösterir. NMDA ve kontrol koşulları arasında değişmemiş PiSCES rakama dahil değildir. (b) Heatmap.2 fonksiyonu kullanılarak R'de üretilen bir ısı haritası aynı ANC-CNA PiSCES'i temsil eder. ComBAT normalleştirilmiş, günlük2 MFI değerleri ~ 3 günlükleri kapsayan veriler için hesap satır tarafından normalize edilir ve her deneysel çoğaltma için göreli MFI bildirilen her PiSCES göreli büyüklüğü ve tutarlılığını göstermek için gösterilir. Bu rakamları çoğaltmak için gereken veri ve kod EkDosya'ya dahil edilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Supplementary Figure 1
Şekil S1: Akış sitometri sisteminin özel soğutma diyagramları. Akış sitometrenin dizi okuyucusu oda sıcaklığında tutulmalıdır, ancak analiz sırasında PiSCES'i korumak için alt kısmı (mikroplaka platformu) soğutulmalıdır. Kullanılan akış sitometre ve sandviç hazırlama buzdolabı hakkında model bilgileri için Malzemeler Tablosu'na bakın. (a) Üst ekler ve gıda saklama kutuları sandviç hazırlama buzdolabından çıkarıldı. Mikroplaka platformu plastik gıda depolama kutuları tutmak için metal destekler üzerine yerleştirildi. Mikroplaka platformunun plastik gövdesi sığması için kaldırıldı. Özel bir pleksiglas platform (b) buzdolabının üst açılış kapsayacak şekilde gösterilen ölçümleri ile inşa edilmiştir. Pleksiglas pleksiglas boyutumaç için kesilmiş 1/2 "köpük yalıtım ile izole edildi, ve yalıtım bant ile boşluğu mühürlü. Daha sonra pleksiglas aracılığıyla bir delik açılmıştır ve akış sitometre test okuyucudan numune iğnesinin uzadığında mikroplaka platformuna erişmesine izin verebilmiştir. Başlangıçta mikroplaka platformunun üst içine vidalı siyah bir kaplin cihazı kaldırıldı, ve mikroplaka platformu na geri vidalı pleksiglas yukarıdan, hangi hizalama yardımcı oldu. Pleksiglas kapaktaki bir kapı, ünitenin dışına uzattığında kullanıcının mikroplaka taşıyıcısına erişmesine izin verir. Akış sitometre yazılımıplaka taşıyıcı çok soğuk olduğunu kullanıcı uyaracaktır unutmayın, ancak kullanıcı uyarı geçersiz kılmak ve soğutulmuş QMI denemeler çalıştırabilirsiniz. (c) Monte edilen sistemin fotoğrafı. (d) Ön sağ köşedetay, olarak çizilmiş (a), pleksiglas kapak ve yalıtım montaj gösteren. (e) Deliklerin üzerinde hizalanmış örnek iğnenin ayrıntıları. (f) Ünite nin altında nakış akıtmaya izin veren yalıtımın tıraşlı bölümünün detayı. (g) Aşağıdaki akış sitometre mikroplaka platformlarını gösteren açık kapının detayı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Supplementary File
Ek Dosya. Bu rakamları çoğaltmak için gereken veri ve kod. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

QMI tahlili antikor paneli geliştirme, ekipman ve reaktifler için önemli bir yatırım gerektirir, ancak tahkikat kurulduktan sonra, deneysel olarak kontrol edilen yanıt olarak protein etkileşim ağlarını gözlemleyerek yüksek boyutlu veri toplayabilir Uyaran. Teknik olarak, QMI dikkatli pipetleme ve örnek ve antikor kuyu yerleri izleme gerektirir. Tahlil plakalarının dikkatle etiketlenmesi, kağıt üzerindeki iyi konumların ayrıntılı bir şablonu nun yapılması gibi, daha sonra veri analizi için kaydedilir. Akış sitometre mikroplaka taşıyıcısı da dahil olmak üzere boncukve lysate soğuk tutmak önemi (özel soğutma talimatları için Şekil S1 bakınız) abartılamaz. Protein etkileşimleri oda sıcaklığında hızla ayrılacaktır ve değiştirilmemiş, oda sıcaklığında akış sitometresi kullanmaya yönelik ilk girişimler, birçok sıcaklık-labile etkileşiminin tanımlanmasıyla sona erdi, ancak amaçlananla değişenler ile değil, Uyarım.

QMI antikor bazlı bir testtir, bu nedenle antikorların ilk seçimi çok önemlidir. Monoklonal veya rekombinant antikorlar sonuçlardaki değişkenliği azaltmak için mümkün olduğunca kullanılmalıdır. Poliklonlar lot-to-lot varyasyonu göstermek, ancak kısa bir epitop peptid bazlı poliklonallar zaman içinde nispeten kararlı gibi görünüyor. Drift antikorların büyük gruplar satın alarak en aza indirilebilir; bu aynı zamanda kavun jel ve spin sütunlar kullanarak antikorları arındırmak için ihtiyaç engelleyen taşıyıcı-free antikorların özel siparişleri için izin verir, ve ilişkili antikor kaybı.

Bir sinyali tespit etmek mevcut epitoplara dayandığı için, sinyal eksikliğinin diğer protein etkileşim metodolojileri ile ortak bir sınırlama olan etkileşim eksikliğini göstermemesi de önemlidir. 14 Ayrıca, bir sinyal algılandığında, protein etkileşiminin doğrudan (A B ile etkileşime giren) veya dolaylı olduğunu açıkça belirtmek mümkün değildir (A, daha sonra B ile etkileşime giren X ve Y ile etkileşime girilir), bu nedenle gözlenen etkileşimler doğrudan bağlanma anlamına gelebilir protein-protein etkileşimleri (ÜFE) yerine PiSCES olarak anılacaktır. Akılda tutulması gereken tüm antikor tabanlı yöntemlerin bir sınırlama antikorların eklenmesi bozabilir veya protein kompleksleri stabilize olmasıdır. Batı lekeleri yerine akış sitometrisi kullanmanın bir diğer sınırlaması da antikor özgüllüğünü doğrulamak için boyut bilgilerinin mevcut olmamasıdır. Bu sınırlamayı aşmak için, IgG kontrolleri her antikor çiftinin taranmasında kullanılır ve QMI deneylerine geçmeden önce knock-out veya knock-in hücre hatları veya hayvanlarla özgüllük doğrulanır (bölüm 1.4).

Her IgG farklı bir arka plan sinyali düzeyi ürettiğinden, IgG kontrolleri QMI tsede kullanılmaz, bu da çıkarmak için doğru arka plan değerini bilmeyi imkansız kılar. Örneğin, IP (X)_probe IgG 100 MFI ve IP IgG_probe Y 200 mfi veriyorsa, IP X_probe Y'den hangi arka plan değeri çıkarılmalıdır? Benzer şekilde, bazen tespit edilemeyen etkileşimler (örneğin, IP X probe Z) nonspesifik IgG etkileşimlerinden daha düşük bir MFI'ye sahip olacaktır. Mutlak MFI sinyalini bilmeme sınırlamasını hesaba katmak için, PiSCES yalnızca rasgele bir arka plan düzeyinin üzerinde algılandığı için bildirilmemiştir. Bunun yerine, yalnızca belirli bir uyarılmaya yanıt olarak değişen PiSCES bildirilir. Yüksek MFI nonspesifik gürültüden kaynaklansa da, bu gürültünün uyarılma ile değişmesi beklenmez. Buna ek olarak, bir kısmı (%10-20) gözlenen duruma bağlı etkileşimlerin genellikle ikinci bir yöntem ile doğrulanır, genellikle IP-western. Bu onay, rt-PCR ile yüksek iş vadeli RNA sıralama sonuçlarını doğrulamaya benzer ve güven QMI sonuçlarını artırmak içindir.

QMI sonuçlarını etkileyen ekspresyon etkileri ek testler olmadan göz ardı edilemez, çünkü QMI bir proteinin artan mutlak düzeyleri ile bir proteinin homo-multimerizasyonu arasında ayrım yapmaz. İfadeye ilişkin belirsizliği en aza indirmek için, protein ekspresyonu düzeylerindeki olası değişiklikleri en aza indiren kısa zaman ölçekli akut tedavi koşulları kullanılarak deneyler yapılabilir. Kronik tedavi koşullarında veya primer hasta örneklerinde ekspresyon etkilerini ekarte etmek için başka yöntemlere ihtiyaç vardır.

QMI için uygun bir lisis arabelleği seçmek çok önemlidir. Bir deterjan çok zayıf membranlar bozulmadan bırakabilir ve karmaşık olmayan proteinleri bir arada tutabilir, çok güçlü bir deterjan protein kompleksleri yok edebilir iken. Kalsiyum veya şelatör varlığı gibi ek faktörler PiSCES'i önemli ölçüde etkileyebilir ve antikorların bir QMI paneline dahil edilmesi için telemeden önce dikkatlice düşünülmelidir. IP-western deneyleri için, lysis koşulları genellikle her PiSCES için ayrı ayrı optimize edilir, ancak tek bir PiSCES'i tespit etmek için en iyi koşullar aynı protein ağındaki diğer PiSCES'e çevrilmeyebilir22. Deterjan seçimi, antikor adaylarını taramak için bir lisis tamponunun gerekli olduğu, ancak uygun bir lisis tamponunun taranması için bir antikor paneline ihtiyaç duyulduğu için tavuk ve yumurta ikilemi sunar. Mükemmel bir çözüm olmasa da, bir uyarıcıya yanıt olarak özel ilgi çeken ve/veya bilinen çağrışımlar veya ayrışmalar alabilen küçük bir boncuk ve sonda paneli seçebilir ve cml boncuklar üzerinde farklı lysis koşullarında davranışlarını test edebilirsiniz. başlangıçta antikorların taranması için kullanılır (adım 1.1.3). İdeal bir deterjan, pisces'in güvenilir bir şekilde saptanması ve bilinen fizyolojik protein davranışının (ilişki/ayrışma) belirli bir uyarıcı ile yeniden kapitülasyonuna olanak sağlayacaktır. Bir deterjan ın membranları tam olarak yatıştırmama endişesi varsa, negatif kontrol antikorları eklenebilir ve bu da sadece iki proteinin membran24ile bağlanması durumunda sinyal verir. Uygun lisis arabellekleri seçildiğinde, kizaz ve substrat arasındakiler gibi zayıf etkileşimlerde bile değişiklikler güvenilir bir şekilde tespit edilebilir (örn. TCR-LCK)14.

Nöronlarda ve T hücrelerinde QMI kullanılarak yapılan önceki çalışmalar, QMI sonuçlarının geçerliliğine olan güveni artırmak için önceki bulguları dikkatlice doğruladı ve sinyal iletimi ve hastalık yolları hakkında keşiflere yol açan yeni hipotezler üretti. Gelecekte, QMI diğer protein etkileşim ağlarına adapte edilebilir ve mevcut mikrosfer sınıfları ile 500 proteine kadar genişletilebilir. Hücresel süreçleri kontrol ederken çoklu protein komplekslerinin ağlarının uyaranlara tepki olarak nasıl değiştiğini incelemek için QMI'nin kullanılması, hem sağlık hem de hastalık hakkında önemli bilgiler verme potansiyeline sahiptir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların ifşa etmesi gereken çıkar çatışmaları yok.

Acknowledgments

Yazarlar QMI tahlil geliştirme önemli katkıları için Tessa Davis kabul etmek istiyorum, ve teknik rehberlik ve entelektüel giriş için Smith ve Schrum laboratuvarları mevcut ve eski üyeleri. Bu çalışma NIMH hibe R01 MH113545 ve R00 MH 102244 tarafından finanse edilmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well flat bottomed plates Bio Rad 171025001
96-well PCR plates VWR 82006-704
Bioplex 200 System with HTF Bio Rad 171000205 modiefied to keep partially refrigerated, see Figure S1 for details
Bio-Plex Pro Wash Station Bio Rad 30034376
BSA Sigma
CML beads Invitrogen C37481
EDTA Sigma E6758
EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin Thermo Scientific A39256
MagPlex Microspheres Luminex MC12xxx-01 xxx is the 3 digit bead region
Melon Gel IgG Spin Purification Kit Thermo Scientific 45206 used for antibody purification
MES Sigma M3671
Microplate film, non-sterile USA Scientific 2920-0000
Phosphotase inhibitor cocktail #2 Sigma P5726
Protease inhibitor cocktail Sigma P8340
Sandwich Prep Refrigerator Norlake SMP 36 15 for custom refrigeration of Bioplex 200
Sodium fluoride Sigma 201154
Sodium orthovanadate Sigma 450243
Streptavidin-PE BioLegend 405204
Sulfo NHS Thermo Scientific A39269
Tris Fisher Scientific BP152

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pawson, T., Nash, P. Protein-protein interactions define specificity in signal transduction. Genes and Development. 14, (9), 1027-1047 (2000).
  2. Rodríguez-Jorge, O., et al. Cooperation between T cell receptor and Toll-like receptor 5 signaling for CD4. Science Signaling. 12, (577), (2019).
  3. Bugaj, L. J., et al. Cancer mutations and targeted drugs can disrupt dynamic signal encoding by the Ras-Erk pathway. Science. 361, (6405), (2018).
  4. Pawson, T. Dynamic control of signaling by modular adaptor proteins. Current Opinion in Cell Biology. 19, (2), 112-116 (2007).
  5. Hamm, H. E. The many faces of G protein signaling. Journal of Biological Chemistry. 273, (2), 669-672 (1998).
  6. Lohse, M. J., Hofmann, K. P. Spatial and Temporal Aspects of Signaling by G-Protein-Coupled Receptors. Molecular Pharmacology. 88, (3), 572-578 (2015).
  7. Eltschinger, S., Loewith, R. TOR Complexes and the Maintenance of Cellular Homeostasis. Trends in Cell Biology. 26, (2), 148-159 (2016).
  8. Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, (2), 99-111 (2005).
  9. Komarova, N. L., Zou, X., Nie, Q., Bardwell, L. A theoretical framework for specificity in cell signaling. Molecular Systems Biology. 1, 23 (2005).
  10. Schrum, A. G., Gil, D. Robustness and Specificity in Signal Transduction via Physiologic Protein Interaction Networks. Clinical and Experimental Pharmacology. 2, (3), (2012).
  11. De Las Rivas, J., Fontanillo, C. Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks. PLoS Computational Biology. 6, (6), 1000807 (2010).
  12. Ron, D., Walter, P. Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, (7), 519-529 (2007).
  13. Bogdan, A. R., Miyazawa, M., Hashimoto, K., Tsuji, Y. Regulators of Iron Homeostasis: New Players in Metabolism, Cell Death, and Disease. Trends in Biochemical Sciences. 41, (3), 274-286 (2016).
  14. Smith, S. E., et al. Multiplex matrix network analysis of protein complexes in the human TCR signalosome. Science Signaling. 9, (439), 7 (2016).
  15. Schrum, A. G., et al. High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry. Science's STKE. 2007, (389), (2007).
  16. Brown, E. A., et al. Clustering the autisms using glutamate synapse protein interaction networks from cortical and hippocampal tissue of seven mouse models. Molecular Autism. 9, (1), 48 (2018).
  17. Lautz, J. D., Brown, E. A., Williams VanSchoiack, A. A., Smith, S. E. P. Synaptic activity induces input-specific rearrangements in a targeted synaptic protein interaction network. Journal of Neurochemistry. 146, (5), 540-559 (2018).
  18. Smith, S. E., et al. Signalling protein complexes isolated from primary human skin-resident T cells can be analysed by Multiplex IP-FCM. Experimental Dermatology. 23, (4), 272-273 (2014).
  19. Neier, S. C., et al. The early proximal αβ TCR signalosome specifies thymic selection outcome through a quantitative protein interaction network. Science Immunology. 4, (32), (2019).
  20. Davis, T. R., Schrum, A. G. IP-FCM: immunoprecipitation detected by flow cytometry. Journal of Visualized Expiriments. (46), (2010).
  21. Smith, S. E., et al. IP-FCM measures physiologic protein-protein interactions modulated by signal transduction and small-molecule drug inhibition. PLoS One. 7, (9), 45722 (2012).
  22. Lautz, J., et al. Activity-dependent changes in synaptic protein complex composition are consistent in different detergents despite differential solubility. BioRXiv. (2019).
  23. Langfelder, P., Horvath, S. WGCNA: an R package for weighted correlation network analysis. BMC Bioinformatics. 9, 559 (2008).
  24. Schrum, A. G., Gil, D., Turka, L. A., Palmer, E. Physical and functional bivalency observed among TCR/CD3 complexes isolated from primary T cells. Journal of Immunology. 187, (2), 870-878 (2011).
Multipleksed Co-İmmünopreyağış Kullanarak Protein Etkileşim Ağı Dinamiğinin Ölçülmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brown, E. A., Neier, S. C., Neuhauser, C., Schrum, A. G., Smith, S. E. P. Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation. J. Vis. Exp. (150), e60029, doi:10.3791/60029 (2019).More

Brown, E. A., Neier, S. C., Neuhauser, C., Schrum, A. G., Smith, S. E. P. Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation. J. Vis. Exp. (150), e60029, doi:10.3791/60029 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter