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Biochemistry

Quantificação da dinâmica da rede de interação protéica utilizando co-imunoprecipitação multiplexada

Published: August 21, 2019 doi: 10.3791/60029
Automatic Translation
1,2, 3,4, 5, 6,7,8, 1,2,9
1Center for Integrative Brain Research, Seattle Children's Research Institute, 2Graduate Program in Neuroscience, University of Washington, 3Department of Cancer Immunology and Virology, Dana-Farber Cancer Institute, Department of Medicine, Harvard Medical School, 4Broad Institute of Harvard and MIT, 5Department of Mathematics, University of Houston, 6Department of Molecular Microbiology and Immunology, School of Medicine, University of Missouri, 7Department of Surgery, School of Medicine, University of Missouri, 8Department Bioengineering, College of Engineering, University of Missouri, 9Department of Pediatrics, University of Washington

Summary

A imunoprecipitação quantitativa Multiplex (QMI) utiliza citometria de fluxo para detecção sensível de diferenças na abundância de interações proteína-proteína direcionadas entre duas amostras. O QMI pode ser realizado usando uma pequena quantidade de biomaterial, não requer Tags geneticamente projetadas e pode ser adaptado para qualquer rede de interação protéica previamente definida.

Abstract

Interações proteína-proteína dinâmicas controlam o comportamento celular, da motilidade à replicação do DNA para a transdução do sinal. No entanto, o monitoramento de interações dinâmicas entre múltiplas proteínas em uma rede de interação protéica é tecnicamente difícil. Aqui, apresentamos um protocolo para imunoprecipitação multiplex quantitativa (QMI), que permite a avaliação quantitativa de alterações de dobra em interações protéicas com base em medições de fluorescência relativa de proteínas em complexos compartilhados detectados por expostos Epítopos de superfície (PiSCES). Em QMI, os complexos proteicos de lysates da pilha são Immunoprecipitated em microspheres, e então sondado com um anticorpo etiquetado para uma proteína diferente a fim quantificar a abundância de PiSCES. Os anticorpos da imunoprecipitação são conjugados às regiões espectrais diferentes de magbead, que permite que um citômetro do fluxo diferencie ligações paralelos múltiplos e quantifique simultaneamente a quantidade de anticorpo da ponta de prova associado com cada um. O QMI não necessita de marcação genética e pode ser realizado utilizando um biomaterial mínimo em comparação com outros métodos de imunoprecipitação. O QMI pode ser adaptado para qualquer grupo definido de proteínas interagindo, e até agora tem sido usado para caracterizar redes de sinalização em células T e sinapses neuronais de glutamato. Os resultados conduziram à geração nova da hipótese com aplicações diagnósticas e terapêuticas potenciais. Este protocolo inclui instruções para executar o QMI, desde a seleção inicial do painel de anticorpos até a execução de ensaios e análise de dados. A montagem inicial de um ensaio QMI envolve a triagem de anticorpos para gerar um painel, e empiricamente determinando um tampão de Lise apropriado. A preparação subsequente do reagente inclui anticorpos covalentemente do immunoprecipitação do acoplamento aos magbeads, e anticorpos biotinylating da ponta de prova assim que podem ser etiquetados por um fluorophore streptavidin-conjugado. Para executar o ensaio, o lisado é misturado com magbeads durante a noite, e então os grânulos são divididos e incubados com anticorpos diferentes da ponta de prova, e então uma etiqueta do fluoróforo, e lidos pelo fluxo cytometry. Dois testes estatísticos são realizados para identificar peixes que diferem significativamente entre as condições experimentais, e os resultados são visualizados usando Heatmaps ou diagramas de borda de nó.

Introduction

As interações proteína-proteína dinâmicas constituem as cascatas de sinalização molecular e as estruturas motile que são a base funcional da maioria de fisiologia celular1. Esses processos são frequentemente representados como vias de sinalização lineares que alternam entre Estados estáveis com base em entradas simples, mas os dados experimentais e de modelagem mostram claramente que funcionam como redes integradas2,3, 4. no caso das proteínas g, diferentes receptores geralmente têm a capacidade de ativar a mesma proteína g, e um único receptor também pode ativar mais de um tipo de proteína g5,6. Para que o número relativamente pequeno de classes de proteína G Module especificamente uma vasta gama de funções celulares, como transmissão sináptica, regulação hormonal e migração celular, as células devem integrar e diferenciar esses sinais4 , 5. evidências mostraram que esta especificidade do sinal, para as proteínas G, bem como outras, é derivada principalmente com base em interações proteína-proteína finamente ajustadas e sua dinâmica temporal1,3, 4. º , 5. º , 6 anos de , 7. porque as redes de sinalização são compostas de complexos proteicos dinâmicos com múltiplas entradas, saídas e loops de feedback, uma única perturbação tem a oportunidade de alterar o equilíbrio homeostático geral da fisiologia de uma célula4 ,7. É agora amplamente acordado que a sinalização deve ser examinada a partir de uma perspectiva de rede, a fim de entender melhor como a integração de múltiplas entradas controla funções celulares discretas na saúde e na doença7,8, 9,10,11,12,13. À luz disto, a imunoprecipitação multiplex quantitativa (QMI) foi desenvolvida para reunir dados quantitativos de média taxa de transferência de mudanças em redes dinâmicas de interação protéica.

QMI é um ensaio anticorpo-baseado em que o lisado da pilha é incubado com um painel de anticorpos da imunoprecipitação que são acoplados covalentemente aos grânulos magnéticos que contêm relações distintas de tinturas fluorescentes. Ter anticorpos específicos acoplados às classes magnéticas distintas do grânulo permite a coimunoprecipitação simultânea de proteínas alvo múltiplas do mesmo lysate. Depois da imunoprecipitação (IP), os grânulos magnéticos são incubados com um segundo, anticorpo da ponta de prova conjugado fluorophore (ou anticorpo biotinylated conjuntamente com o streptavidin conjugado fluorophore). As coassociações entre as proteínas reconhecidas por cada par de anticorpos de anticorpo-sonda IP, ou peixes (proteínas em complexos compartilhados detectados por epítopos de superfície expostos), são então detectadas por citometria de fluxo e podem ser comparadas quantitativamente entre diferentes condições da amostra14. As ilustrações na Figura 1 mostram as etapas envolvidas na execução de um ensaio QMI, incluindo um diagrama de grânulos magnéticos com complexos proteicos imunoprecipitados marcados por anticorpos fluorescentamente conjugados da sonda (Figura 1C).

A sensibilidade do QMI depende da concentração proteica do lisado em relação ao número de grânulos magnéticos utilizados para a imunoprecipitação, e alcançar uma resolução para detectar 10% de alterações de dobra requer apenas uma pequena quantidade de material de partida em comparação com outros métodos de co-IP14,15. Por exemplo, a quantidade de material de partida usada em QMI é similar àquela exigida para um ensaio enzima-lig ImmunoSorbent do sanduíche (ELISA), mas as interações múltiplas são detectadas em um único ensaio de QMI. Os ensaios de QMI que usam 20 IPs e 20 alvos da ponta de prova foram executados usando 1-5 x 105 pilhas de T preliminares isoladas de uma biópsia da pele de 4 milímetros, de preparações synaptosomal P2 de uma seção coronal de 3 milímetros do córtice pré-frontal do rato, ou 3 x 106 cultivaram o rato preliminar neurônios corticais14,16,17. Esta sensibilidade faz QMI útil para a análise das pilhas ou do tecido com disponibilidade limitada, tal como amostras clínicas.

QMI pode ser adaptado para toda a rede previamente definida da interação da proteína (contanto que os anticorpos estão disponíveis), e até agora foi desenvolvido para analisar o signalosome do receptor do antígeno da pilha de T (TCR) e um subconjunto das proteínas em sinapses glutamatérgico nos neurônios 17 anos de , 18. em estudos de sinalização de receptores de células T, o QMI foi usado pela primeira vez para identificar alterações induzidas por estimulação em peixes e, em seguida, para distinguir pacientes autoimunes de um grupo controle, detectar sinalização autoimune endógena e, finalmente, gerar uma hipótese envolvendo uma subrede associada à doença desequilibrada das interações14. Mais recentemente, o mesmo painel de QMI foi usado para determinar que a seleção do anti-thymocyte está determinada por diferenças quantitativas um pouco do que qualitativas na sinalização TCR-associada19da proteína. Nos neurônios, o QMI foi usado para descrever o rearranjo de entrada específica de uma rede de interação protéica para tipos distintos de sinais de entrada de uma forma que suporta modelos recém-emergentes de plasticidade sináptica17. Adicionalmente, este painel de QMI sináptica foi usado para identificar diferenças em sete modelos do rato do autismo, aglomerar os modelos em subgrupos baseados em suas bioassinaturas de PiSCES, e supor exatamente um deficit molecular compartilhado que fosse previamente não reconhecido em um dos modelos16. Uma abordagem semelhante pode ser usada para a tela de outros subgrupos que possam responder a diferentes tratamentos medicamentoso, ou atribuir medicamentos a subgrupos responsivos específicos. O QMI tem potenciais aplicações em diagnósticos, subtipagem de pacientes e desenvolvimento de fármacos, além da ciência básica.

Para montar um painel de anticorpos QMI, os protocolos iniciais de triagem e seleção de anticorpos estão descritos na seção 1, abaixo. Uma vez identificados os painéis de anticorpos, os protocolos de conjugação dos anticorpos selecionados para os grânulos magnéticos para IP e para a biotinilação dos anticorpos de sonda selecionados estão descritos na seção 2. O protocolo para a execução do ensaio QMI em lisados celulares ou teciduais é descrito na seção 3. Finalmente, uma vez que um único experimento pode gerar ~ 5 x 105 DataPoints individuais, instruções e códigos de computador para auxiliar no processamento de dados, análise e visualização são fornecidos na seção 4. Uma visão geral do fluxo de trabalho descrito nas seções 2-4 é mostrada na Figura 1.

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Protocol

1. projeto do ensaio

  1. Preparação do anticorpo do candidato
    1. Para cada proteína de interesse, escolha 3 a 5 anticorpos para a tela. Quando possível, use anticorpos monoclonais que reconhecem epítopos diferentes. Inclua também um anticorpo de controle não específico.
    2. Para remover Tris, realize a troca do amortecedor adicionando o anticorpo a um filtro da rotação de 30 kDa, girando para baixo a seu volume mínimo, adicionando 500 μL de soro-tampão fosfato (PBS), e repetindo 3 vezes. Para remover proteínas do portador, realize a purificação do anticorpo de acordo com o protocolo do fabricante (veja a tabela de materiais para a recomendação específica da purificação).
      Nota: isto é feito porque as proteínas do portador e os bufferes com grupos livres da amina (tais como Tris) reagirão com grupos de COOH e saciar as reações subseqüentes do acoplamento e do biotinilação do grânulo. Assegure-se de que todos os anticorpos sejam purificados (sem proteínas transportadoras) e em um tampão livre de aminas primárias (ou seja, sem Tris).
    3. Acople cada anticorpo aos grânulos modificados carboxilato do látex (CML) como descrito por Davis e por Schrum20. Para conservar o anticorpo, escale para baixo as reações do acoplamento do grânulo por até 1/5 (isto é, 3,6 x 106 grânulos com 10 μl do anticorpo 0.2-1 mg/ml).
    4. Estimar números de talão usando um hemocitômetro (tipicamente ~ 108/ml) e armazenar a 4 ° c. Os grânulos foram armazenados por mais de um ano e usados com sucesso em ensaios de QMI, mas a vida de prateleira ou datas de expiração não foram formalmente estabelecidas. NaN3 no buffer B/S impede o crescimento bacteriano.
    5. Biotinilato uma porção de cada anticorpo (ver secção 2,2 abaixo). Conservar a 4 ° c.
    6. Confirme o acoplamento eficaz do grânulo de CML e a contagem exata manchando 1 x 105 grânulos com um anticorpo PE-conjugado reactivo às espécies em que o anticorpo foi levantado e lendo em um cytometer do fluxo.
    7. Confirme a biotinilação do anticorpo pelo Borrão do ponto usando streptavidin-HRP.
    8. Uma vez que o laboratório gerou reagentes que são conhecidos por ser eficaz, use esses reagentes como controles positivos em reações de confirmação nas etapas 1.1.5 e 1.1.6.
  2. Triagem de anticorpos por IP-FCM (imunoprecipitação detectada por citometria de fluxo)
    1. Decida em um lisado apropriado da seleção. Para isso e todas as outras etapas de triagem pré-QMI (qualquer coisa incluída nesta seção 1: projeto de ensaio), não use biosamples com disponibilidade limitada. Em vez disso, escolha um material de controle comparável, como o tecido do mouse tipo selvagem, as linhas celulares ou o tecido de doador humano normal que não é um recurso limitante.
      Nota: a escolha de um tampão de Lise para este ensaio não é trivial, e é discutida na seção 1,5: seleção de detergente, bem como no penúltimo parágrafo da seção discussão. Os tampões padrão do lysis têm uma base de 150 milímetros de NaCl, de 50 milímetros tris (pH 7,4), de 10 milímetros de fluoreto do sódio, de 2 milímetros de orthovanadate do sódio, e de cocktail do inibidor da protease e da fosfatase. Os detergentes compatíveis com QMI incluem 1% NP-40, 1% digitonin, 0.1-1% Triton X-100, e 0.5-1% desoxicolato14,16,17,18,19,21.
    2. Calcule o volume total de lisado a ser usado para cada IP, usando 10 μL para cada combinação de sonda IP a ser rastreada. Se a triagem de anticorpos X sonda e usando um controle de IgG, cada IP usará (X + 1) * (10 μL) * (1,1 para o erro de pipetagem); X + 1 é a consideração para o controle exigido da ponta de prova de IgG. Por exemplo, em uma tela de anticorpo 3x3, cada IP deve usar 44 UL. Lembre-se de incluir um controle IP de IgG (Veja exemplo de configuração de triagem na Figura 2).
    3. Calcule o número de cordão CML a ser usado. Se você estiver selecionando anticorpos de sonda X, use [(X + 1) * 5 x 104 Beads]. Idealmente, 5.000 grânulos por poço resultará em > 2000 grânulos por bem sendo lido pelo cytometer do fluxo. Por exemplo, em uma tela do anticorpo 3 x 3, cada IP deve usar 20.000 grânulos, que é aproximadamente 0,66 μl do estoque preparado do grânulo de CML da etapa 1.1.3 (os grânulos devem primeiramente ser quantificados usando um hemocitômetro para assegurar a exatidão).
    4. Incubar o volume de lisado da etapa 1.2.2 com o volume de cada grânulo de CML a ser selecionado da etapa 1.2.3, durante a noite em 4 ° c com rotação para impedir que os grânulos se fixem. Tipicamente, realize incubações na primeira coluna de uma placa do PCR 96-well, e tampão com tampões de tira do tubo do PCR.
    5. Gire para baixo grânulos de CML em 3.200 x g por 1 minuto e remova o lisado por um único, flicking rápido da placa sobre o dissipador. Uma pelota branca minúscula deve ser visível na parte inferior de cada poço antes e depois de flicking.
    6. Ressuspender os grânulos de CML em um volume de buffer FlyP para igual a 20 μL para cada par de sonda de talão; para anticorpos X Probe, use (X + 1) * (20 μL) * (1,1 para erro de pipetagem), semelhante ao passo 1.2.2. Para uma tela de 3 x 3, Ressuspender em 88 μL de buffer FlyP. FlyP buffer é 100 mM NaCl, 50 mM TRIS pH 7,4, 1% BSA, 0, 1% NaN3.
    7. Distribua cada IP através de (X + 1) poços de uma placa do PCR 96-well, onde X seja o número de anticorpos da ponta de prova que estão sendo selecionados, usando 20 μL/poço. Figura 2 A mostra um exemplo de configuração de triagem.
    8. Lave 2 vezes adicionais usando 200 μL de tampão FlyP por poço. Gire a placa como no passo 1.2.5 e mexa a placa para remover o tampão de lavagem após cada lavagem. As pelotas serão extremamente pequenas, mas devem ser visíveis após cada lavagem.
    9. Para cada anticorpo biotinylated a ser selecionado, calcule o volume total como (Y + 1) * 1,1 * 50 μL, onde Y é o número de anticorpos do IP que estão sendo selecionados. Diluir o anticorpo a uma concentração de trabalho neste volume de amortecedor de FlyP, começando tipicamente com 1:100 diluição de um estoque de 0,5 mg/mL.
    10. Distribua cada anticorpo diluído para baixo cada coluna da placa do poço 96, e assegure-se de que os grânulos de CML estejam ressuscipended.
    11. Incubar a 4 ° c durante 1 h, com rotação ou pipetagem a intervalos de 15 min para garantir que as esferas de CML permaneçam em suspensão.
    12. Lave 3x em 200 μL de tampão FlyP, para cada centrifugador de lavagem e remova o lisado como no passo 1.2.5.
    13. Ressuscita todos os grânulos de CML em 50 μL de 1:200 streptavidin-PE no tampão de FlyP.
    14. Incubar a 4 ° c no escuro durante 30 min.
    15. Lave 3x em 200 μL de tampão FlyP, para cada centrifugador de lavagem e remova o lisado como no passo 1.2.5.
    16. Ressuspender em 200 μL de tampão FlyP e, em seguida, executar em um citometro de fluxo.
  3. Escolhendo anticorpos para incluir no ensaio
    1. Portão em tamanho usando FSC-H vs SSC-H, e eliminar doublets usando FSC-H vs FSC-A.
    2. Gerar histogramas de intensidade de fluorescência de PE e sobrepor ambos os controles de IgG (sonda de teste do grânulo de IgG, teste de sonda de bead-IgG) para pares testados (Figura 2).
    3. Procure um par de sonda de talão que dê sinal claro sobre o ruído (Figura 2B). Adicionalmente, não é ideal usar o mesmo anticorpo para o grânulo e a ponta de prova. O reconhecimento diferencial do epítopo maximiza as chances de observar interações, pois alguns resumos podem ser oclusados em determinados complexos proteicos. Se não existirem opções aceitáveis, repita a tela com anticorpos adicionais.
  4. Confirmação da especificidade do anticorpo
    1. Para garantir a especificidade dos anticorpos para os alvos pretendidos, utilize uma amostra de lisado em que o alvo tenha sido eliminado; por exemplo, um mouse Knockout ou uma linha de célula RNAi. Alternativamente, use lisado de uma linha celular alvo-negativa na qual a proteína alvo foi expressa artificialmente.
    2. Execute IP-FCM conforme descrito na etapa 1,2, modificando para ajustar o experimento.
  5. Seleção de detergente
    1. Como os detergentes são críticos em experimentos de co-IP, teste empiricamente diferentes variações para garantir que o ensaio tem a máxima probabilidade de detectar alterações. Para começar, escolha um painel relativamente pequeno de interações (4-8) que são conhecidos por mudar em uma determinada condição e/ou são de particular interesse para o seu estudo.
    2. Usando os grânulos de CML não-fluorescentes, anticorpo-conjugados feitos para telas iniciais, executam o IP-FCM como descrito em 1,2 usando condições variadas do detergente do amortecedor do lysis. As telas detergentes podem ser executadas com detergente como a única variável, ou com as condições diferentes da pilha para cada detergente. Use sempre controles de IgG para grânulos e pontas de prova, desde que os detergentes produzem ocasionalmente o fundo inesperado em algumas combinações do IP-Probe.
    3. Com base nas IFM da tela, escolha um detergente que otimiza o sinal para os peixes de interesse. É provável que alguns compromissos terão de ser feitos22.

2. preparação do reagente multiplex

  1. Acoplamento magnético do grânulo
    1. Usando o mapa da região do cordão magnético, selecione as regiões do cordão para usar em um padrão que minimize o risco de detecção cruzada. O grânulo magnético mancha tipicamente acima e à direita, assim que evite as regiões do grânulo que são diagonalmente adjacentes. Os grânulos de todas as outras colunas do diagrama do talão mostrados no site da Luminex são recomendados (https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/).
    2. Prepare o anticorpo portador-livre em 0,1 mg/mL em PBS (como em 1.1.2) em 250 μL. Mantenha no gelo para o uso mais atrasado.
    3. Grânulos magnéticos do Vortex extensivamente, e então alíquota 250 μL em um tubo ambarino do microcentrifugador (para proteger grânulos do photobranqueamento).
    4. Magneticamente separar contas magnéticas para 60 s e remover o sobrenadante.
    5. Adicionar 250 μL de tampão MES (50 mM MES pH 6,0, 1 mM EDTA), vortex, magneticamente separado para 60 s, e remover o sobrenadante. Repita e ressuspender grânulos magnéticos em 200 μL de tampão de MES.
    6. Adicionar 40 μL de MES a 2 mg de tubo de uso único de sulfo-NHS para fazer um estoque de 50 mg/mL.
    7. Adicione 25 μL de sulfo-NHS recém-feito aos grânulos magnéticos. Vórtice.
    8. Adicionar 25 μL de 50 mg/mL de EDAC recentemente dissolvido [1-etil-3-( -3-dimethylaminopropyl) cloridrato de carbodiimida, também chamado de EDC] no tampão MES. Vórtice.
    9. Cubra e agite em um vortexer com um acessório do tubo-terra arrendada por 20 minutos na Temp do quarto, 1000 rpm.
    10. Magneticamente separado para 60 s e remover o sobrenadante.
    11. Resuspend em 500 μL de PBS, vortex, magneticamente separado para 60 s e retire o sobrenadante. Repetir.
    12. Ressuscitem em 250 μL de solução de anticorpos do passo 2.1.2. Vórtice.
    13. Incubar 2 h no temp do quarto com agitação em um vortexer em 1000 rpm.
    14. Adicione 500 μL de PBS aos grânulos magnéticos, vortex, magneticamente separados por 60 s, e retire o sobrenadante.
    15. Adicionar 750 μL de tampão de bloqueio/armazenamento (B/S) (1% BSA em PBS pH 7,4, 0, 1% NaN3). Cubra e incubar 30 min na temperatura ambiente, 1000 rpm.
    16. Magneticamente separado para 60 s e remover o sobrenadante. Resuspend em 100 μL de tampão B/S.
    17. Conservar a 4 ° c. Os grânulos foram armazenados por mais de um ano e usados com sucesso em ensaios de QMI, mas a vida de prateleira ou datas de expiração não foram formalmente estabelecidas. NaN3 no tampão B/S deve impedir o crescimento bacteriano.
    18. Valide o acoplamento magnético do grânulo manchando ~ 0,25 μL de grânulos magnéticos acoplados com uma espécie antihospedeiro fluorescente secundária e lendo em um cytometer do fluxo, como na etapa 1.1.5.
  2. Biotinilação
    1. Assegure-se de que os anticorpos estejam em PBS sem proteína transportadora.
    2. Calcule o μg total do anticorpo a ser biotinylated (100-200 μg recomendado para o uso no multiplex, 25-50 μg recomendado para a seleção).
    3. Prepare fresco 10 mM sulfo-NHS-biotina (pode ser feito adicionando 224 μL de ddH2o a um tubo de 1 mg sem pesar).
    4. Adicionar 1 μL de sulfo-NHS-biotina de 10 mM por 25 μg de anticorpo, vortex ou pipeta para cima e para baixo para misturar.
    5. Incubar na temperatura ambiente por 1 h.
    6. Incubar a 4 ° c durante 1 h.
    7. Use um filtro de rotação de 30 kDa para remover a biotina não acoplada e parar a reação. Adicione 500 μL de PBS e gire a coluna até que o volume mínimo seja atingido. Adicionar 500 μL de PBS adicional e repetir para 3 trocas de memória intermédia total.
    8. Calcule a concentração medindo a absorvência de 1-2 μL em um espectrofotômetro, e traga Então a concentração do anticorpo a 0,5 mg/mL.
    9. Conservar a 4 ° c.

3. imunoprecipitação multiplex quantitativa

  1. Layout da placa
    Nota: Este ensaio funciona melhor quando realizado utilizando placas 96-well e 2-4 condições da amostra.
    1. Sempre executar controles apropriados (ou seja, estimulado v. células não estimuladas) na mesma placa, a fim de detectar mudanças entre as condições. Distribua cada amostra horizontalmente em toda a placa e use cada coluna para um anticorpo de sonda diferente. Um conjunto de réplicas técnicas para cada sonda deve ser executado imediatamente após o primeiro conjunto. Consulte a Figura 3 para obter um exemplo.
    2. Documente com cuidado a disposição da placa para facilitar a carga e a análise exatas da placa.
  2. Preparação da amostra & imunoprecipitação (dia 1)
    1. Tecido de lyse ou células em detergente apropriado com inibidores da protease e fosfatase e incubar no gelo por 15 min. Tome cuidado para manter o lisado frio em todos os momentos.
      Nota: a quantidade exata de indicar a concentração da proteína do biomaterial e do lisado deve empiricamente ser determinada, e alguns exemplos de amostras previamente usadas são alistados no terceiro parágrafo da introdução. Em geral, na faixa de 200 μL de proteína de 2 mg/mL por amostra tem sido bem-sucedida no passado para 20 IP e 20 alvos de sonda, mas as entradas ideais para cada painel de anticorpos e tipo de célula ou tecido devem ser determinadas empiricamente.
    2. Gire para baixo em 4 ° c por 15 minutos em 16.000 x g para remover as membranas e os restos; manter sobrenadante como lisado.
    3. Realize um ensaio de BCA ou similar para determinar concentrações da proteína, e então normalizar a concentração da proteína entre amostras. Se estiver usando células, comece com um número igual de células por condição e a normalização é opcional.
    4. Prepare uma mistura mestra do grânulo magnético que contenha ~ 250 grânulos magnéticos de cada classe por o poço no ensaio. Ajuste os números do talão após a análise dos dados de modo que em ensaios futuros uma média de 110 contas de cada classe seja lida por bem.
      Nota: exemplo de cálculo: (novo volume do cordão) = [(média de execução)/110] * (volume anterior do talão). Os volumes do grânulo devem ser ajustados desta maneira sobre cada 8 funcionamentos ou como necessário. Tipicamente, 3-4 μL de cada grânulo magnético (preparado como acima) são usados para um experimento de 2 placas.
    5. Lave a mistura magnética do grânulo 2x no amortecedor de FlyP com separação magnética, e reressuscitem então no amortecedor do FlyP. Para a ressuscitpensão, use 10 μL por a amostra por a placa. FlyP buffer é 100 mM NaCl, 50 mM TRIS pH 7,4, 1% BSA, 0, 1% NaN3.
    6. Após completamente vortexing a mistura magnética do grânulo, alíquota 10 μL em tubos frios do microcentrifugador do gelo (um tubo por a amostra). Adicione volumes iguais de lisado (com concentrações normalizadas) a cada tubo para a imunoprecipitação.
    7. Aliquot a mistura do grânulo do lysate-magnético em um tubo para cada placa que está sendo funcionado; por exemplo, para um experimento de 2 placas, divida o lisado em dois tubos. Coloc os tubos em um rotator em 4 ° c durante a noite para a imunoprecipitação, coberto para manter para fora a luz.
  3. Execução do ensaio (dia 2)
    1. Comece com os tubos do grânulo do lysate-magnético para o #1 da placa. Use uma cremalheira magnética do grânulo para remover o lisado dos grânulos magnéticos, e para reservar o lisado para a análise futura. Lave os grânulos 2x em 500 μL de tampão FlyP gelado. Mantenha os tubos de tubos sempre no gelo ou a 4 ° c.
    2. Calcule o volume de ressuspensão como (número de sondas) * (2 repetições técnicas) * (25 μL por poço) * (1,1 para erro de pipetagem). Ressuspender IPs em volume calculado de buffer FlyP gelado.
    3. Depois de Ressuspender completamente os grânulos magnéticos por pipetagem suave, distribuir 25 μL por poço através de uma placa de poço de fundo plano 96, no gelo.
    4. Em uma placa 96-well diferente, diluir anticorpos biotinylated da ponta de prova à concentração de funcionamento 2x (a concentração de funcionamento é tipicamente 1:100 ou 1:200, determinada empiricamente) no amortecedor de FLYP de modo que sua ordem Combine as colunas no layout da placa (veja Figura 3 ). O volume final de anticorpos da sonda na concentração de trabalho será de 50 μL por poço, de modo que o volume de cada anticorpo 2x preparado deve ser (25 μL) * (número de amostras biológicas) * (2 repetições técnicas) * (1,1 para o erro de pipetagem).
    5. Use uma pipeta multicanal para distribuir 25 μL de cada diluição de anticorpo de sonda na placa de ensaio contendo talão magnético.
    6. Agitar em um agitador de placa horizontal para misturar e ressuspender os grânulos magnéticos e, em seguida, incubar a 4 ° c por 1 h, agitando a 450 rpm no escuro.
    7. Lave 3x com amortecedor FlyP em uma arruela de placa magnética em 4 ° c.
    8. Ressuscita os grânulos magnéticos em 50 μL de 1:200 streptavidin-PE.
    9. Agitar para misturar e ressuspender os grânulos e, em seguida, incubar a 4 ° c durante 30 min, agitando a 450 rpm no escuro.
    10. Lave 3x com amortecedor FlyP em uma arruela de placa magnética em 4 ° c.
    11. Resuspend em 125 μL de tampão FlyP.
    12. Agitar por 1 min a 900 rpm para Ressuspender completamente os grânulos.
    13. Executar no citometro de fluxo refrigerado (ver diagrama na Figura S1). Use a configuração "High RP1 Target" no software de citometro de fluxo e uma condição de parada de 1.000 contas por região (sobrepondo grandemente o número que deve estar em qualquer poço individual para impedir que a máquina pare prematuramente) e volume amostral de 80 μL.
    14. Pause a corrida meio caminho e ressuscitando as contas para evitar a liquidação.
    15. Exporte arquivos de dados no formato. xml.
    16. Repita o processo para as placas restantes, começando na etapa 3.3.1.

4. análise de dados

Nota: o código ANC foi projetado para comparar duas condições de N = 4 experimentos, cada um com 2 repetições técnicas para cada condição. Por exemplo, as células são estimuladas quatro vezes independentes, o QMI é executado em quatro dias diferentes no controle (não estimulado) e células estimuladas, com réplicas técnicas como acima, e a análise de dados prossegue conforme descrito abaixo.

  1. Não-paramétrico adaptável com corte alfa ajustável (ANC)
    1. Abra o MATLAB e defina o diretório ativo para uma pasta que contenha os componentes do programa ANC e os arquivos. xml exportados do citometro de fluxo.
    2. Preencha o arquivo "ANC Input" para refletir os detalhes do experimento. O arquivo de exemplo incluído no arquivo suplementar foi pré-preenchido para executar os dados de exemplo, também fornecidos.
    3. Execute o programa, que irá escrever um ficheiro. csv para o Active Directory. O arquivo relata peixes que são significativamente diferentes, em um nível falso positivo (alfa) de 0, 5, entre as condições de controle e experimentais, em todas as 4 repetições experimentais, ou pelo menos 3/4 repetições.
    4. Nota ' ANC hits ', que são definidos como peixes com diferenças significativas em pelo menos 3 repetições experimentais, representado como 3/4 ∩ 4/4 no arquivo, para uso na etapa 4.3.1.
  2. Análise da rede de correlação ponderada23 (CNA)
    1. Colar-transpor os títulos de coluna da saída do arquivo de dados pelo MATLAB terminando em "_ MFI. CSV "na primeira linha de uma nova folha de Excel. Adicionar as colunas "experimento" para o número do experimento, e "tratamento", para o tratamento experimental, ou quaisquer outras variáveis a serem analisadas. Guarde este ficheiro como "traits. csv".
    2. Abra o R Studio e defina o diretório de trabalho para uma pasta que contenha o "_ MFI. CSV "e" traços. CSV "arquivos.
    3. Execute os comandos R conforme indicado no arquivo de comando comentado e o detalhado nas instruções incluídas com os arquivos. Os módulos WCNA significativamente correlacionados com cada traço experimental são a saída como um arquivo gráfico, ea correlação de cada interação IPi_ ProbeJ com cada módulo é a saída como um arquivo. csv.
    4. Nota ' hits CNA ', que são definidos como interações com a associação do módulo (MM) > 0,7 e p < 0, 5 para a associação em um módulo que foi identificado como significativamente correlacionado com a variável experimental de interesse, para uso na etapa 4.3.1.
  3. Positivo ' hits ' & visualização
    1. Para cada interação na lista "3/4 ∩ 4/4 hits" no arquivo de saída ANC (da etapa 4.1.4), identifique se essa interação também é um "hit CNA" verificando o arquivo de saída CNA (consulte a etapa 4.2.6). Crie uma nova coluna que indique se cada hit do ANC também é um hit do CNA.
    2. Calcule o valor médio da mudança do log2 da dobra para cada batida do CNA do ANC ∩ pela média dos valores dados na folha de cálculo da saída ANC "_ hits. csv" da etapa 4.1.3. Converta valores para registrar2 vezes a alteração antes da média. Para interações que foram significativas em apenas 3/4 repetições, exclua o valor de outlier.
    3. Faça uma planilha com cada hit ANC ∩ CNA listado como um IP em uma coluna, uma sonda na segunda coluna e o valor de alteração de dobra na terceira coluna. Use esta planilha para criar um diagrama de aresta de nó no Cytoscape importando o arquivo como uma rede.

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Representative Results

Triagem de anticorpos
Figura 2 B mostra os resultados de uma tela para a proteína Connexin36. A maioria de combinações IP_probe não produzem nenhum sinal sobre controles de IgG. O IP com o anticorpo monoclonal 1E5 e a ponta de prova com o 1E5 ou o anticorpo Polyclonal 6200 produzem uma mudança rightward na distribuição do grânulo comparado aos controles de IgG. Aqui, IP 1E5 e sonda 6200poly foram selecionados para evitar o uso do mesmo anticorpo como IP e sonda, tanto para reduzir a probabilidade de uma proteína não específica sendo reconhecida por dois anticorpos independentes, e para aumentar a chance de detectar coassociações usando epítopos diferentes. É melhor escolher uma combinação IP_probe com pelo menos 1-2 log maior MFI em comparação com os controles de IgG, mas ocasionalmente pares produzindo MFIs mais fracos que são consistentemente distinguíveis de controles podem ser usados se não existem alternativas são identificadas. Figura 2 C mostra um experimento de validação de especificidade para a combinação 1E5-6200poly. O lysate das 293 pilhas transfected com um plasmídeo Connexin36 produziu um ~ 1,5-registra a mudança rightward na distribuição do grânulo, quando as pilhas untransfected sobrepostas com os controles de IgG. Ao confirmar a especificidade de um par, o lisado do controle negativo de um animal ou de uma linha celular do Knockout sem a proteína do alvo deve ter um MFI similar aos controles de IgG.

Acoplamento do grânulo
Uma reação típica do controle de qualidade do acoplamento do grânulo magnético dará um MFI 3-4 registra acima do fundo quando manchado com um anticorpo secundário conjugado a um fluoróforo com um índice do brilho entre 3 e 5 (tais como o PE ou o FITC). A Figura 4 mostra uma reação de controle de qualidade típica comparando a conjugação de um novo cordão magnético em comparação com o lote mais antigo sendo substituído.

Análise de dados
Em cada experimento, o ANC compara as distribuições de fluorescência de cada classe de cordão magnético em cada poço (ou seja, todas as combinações possíveis de IP_Probe) entre um controle definido pelo usuário e uma condição experimental. Ele atribui um valor de pa cada combinação que reflete a probabilidade de que as contas foram amostradas de populações idênticas com base em estatísticas de Kolomogrov-Shmirnov (K-S). O programa, em seguida, calcula o K-S p-valor necessário para produzir uma taxa de falso-positivo de 0, 5, corrigindo para comparações múltiplas e contabilização de variabilidade técnica (diferenças entre as repetições técnicas). IP_probe combinações (peixes) cujo valor- pde teste K-S cai abaixo do corte calculado em todos os quatro experimentos, ou pelo menos 3/4 experimentos (3/4 ∩ 4/4) são identificados. Desde que os Cut-offs do valor de pdiferem dependendo destes níveis diferentes de stringency, ocasionalmente peixes serão identificados em 4/4 mas não em 3/4 ∩ 4/4, assim que as listas separadas são calculadas. Para equações de ANC detalhadas, ver (Smith et al. 2016). 14 detalhes sobre a análise de WCNA e os resultados são discutidos minuciosamente por langfelder et al.23

Apresentação de dados
As análises ANC e CNA23 são realizadas para identificar peixes que ambos (1) mostram alterações significativas nas dobras entre as condições experimentais em pelo menos 3/4 de ensaios e (2) pertencem a um módulo de CNA que está correlacionado com a variável experimental. Estes peixes de alta confiança que são identificados por duas abordagens estatísticas independentes são referidos como ANC ∩ CNA PiSCES. Essas interações podem ser visualizadas como um diagrama de aresta de nó usando o software de código aberto Cytoscape (Figura 5a) ou como um mapa de calor usando o código R e as instruções de análise incluídas no material complementar (Figura 5b ).

Figure 1
Figura 1 . Visão geral da imunoprecipitação quantitativa multiplex. (a) os anticorpos previamente selecionados são acoplados covalentemente às classes diferentes de grânulos magnéticos em reações separadas. (b) durante a noite, os complexos proteicos são imunoprecipitados usando uma mistura das esferas magnéticas acopladas a anticorpos. (c) as proteínas co-Immunoprecipitated são etiquetadas por um anticorpo da ponta de prova e por um fluorophore. (d) os grânulos magnéticos e os complexos de proteínas rotulados são executados através de um citometro de fluxo refrigerado para quantificar quantidades relativas de proteínas que ocorrem em complexos compartilhados. Veja a Figura S1 para detalhes esquemáticos de refrigeração personalizada. (e) o software do gerente do citômetro do fluxo separa magbeads pela classe e (f) indica histogramas da fluorescência de cada região do grânulo. (g) os dados são exportados como arquivos. xml e analisados por duas abordagens estatísticas independentes. Somente peixes identificados por ambas as análises são relatados usando visualizações de diagrama de heatmap e node-Edge. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 . Triagem de anticorpos 36 connexin usando IP-FCM. (a) o IP-FCM foi executado no lisado do cérebro do rato usando um painel 4x4 de connexin 36 (Cx36) grânulos e pontas de prova de CML. O lysate foi immunoprecipitated com cada grânulo de CML em uma fileira separada da placa. Após Washes, cada grânulo foi distribuído através de sua fileira de modo que um anticorpo da ponta de prova possa ser adicionado por a coluna. (b) a maioria de combinações do anticorpo não mostram nenhum sinal (alaranjado) sobre o fundo de IgG (cinzento, azul). O IP 1E5 com a sonda 6200Poly mostra um sinal positivo aceitável. A 1E5 talão/sonda e 6200Poly talão/sonda pares cada mostrar sinal aceitável, mas não é ideal para usar o mesmo anticorpo para o talão e sonda. O reconhecimento diferencial do epítopo maximiza as chances de observar interações, pois alguns resumos podem ser oclusados em determinados complexos proteicos. O grânulo 6200Poly com a ponta de prova 1E5 dá o sinal o mais forte e foi escolhido para usar-se no ensaio multiplex que aguarda a confirmação da especificidade. (c) o IP-FCM usando o par de anticorpos Cx36 selecionados da seleção foi executado no lisado das pilhas 293T transfected com Cx36 e controles não-transfected. Há um sinal desobstruído das pilhas Cx36-transfected, mas as pilhas não-transfected são indistinguíveis dos controles do grânulo/Probe de IgG. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 . Exemplo de layout de placa. Um multiplex de 4 condições é configurado em uma placa 96-well. As amostras 1-4 são carregadas em linhas consecutivas (cada amostra biológica representada aqui por uma cor diferente), e as replicações técnicas são carregadas na mesma ordem nas 4 linhas a seguir. Uma sonda é usada por coluna. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 . Uma reação de controle de qualidade típica comparando a conjugação de um novo MagBead em comparação com o lote mais antigo que está sendo substituído. O talão dá um MFI 2-4 logs acima do fundo, e o novo lote tem um MFI semelhante ao do lote antigo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5 . QMI identifica peixes sinápticos que mudam de magnitude após 5 minutos de estimulação NMDA em neurônios corticais cultivados. Um experimento QMI comparou os neurônios NMDA estimulados versus não estimulados (controle de ACSF). Peixes que foram identificados por ambas as análises ANC e CNA são apresentados. (a) em um diagrama de aresta de nó produzido usando o software de código aberto Cytoscape, os nós indicam os alvos de anticorpos (proteínas) que foram incluídos como IPS e sondas no painel QMI. As bordas representam ANC ∩ CNA PiSCES, com a cor e espessura da aresta indicando a direção e magnitude da dobra-mudança entre o tratamento e controle de NMDA. Peixes que não alterem entre o NMDA e as condições de controle não estão incluídos na figura. (b) um heatmap produzido em R usando a função heatmap. 2 representa o mesmo ANC ∩ CNA PiSCES. ComBAT-normalizado, log2 MFI valores são normalizados por linha para a conta de dados que abrange ~ 3 logs, e o MFI relativo para cada repetição experimental é mostrar para demonstrar a magnitude relativa e consistência de cada peixes relatados. Os dados e o código necessários para reproduzir esses valores são incluídos no arquivo complementar. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Supplementary Figure 1
Figura S1: diagramas de refrigeração personalizada do sistema de citometria de fluxo. O leitor de matriz do cytometer do fluxo deve ser mantido na temperatura ambiente, mas a parcela mais baixa (a plataforma da microplaca) deve ser refrigerada para manter PiSCES durante a análise. Consulte a tabela de materiais para obter informações sobre o modelo de citometro de fluxo e frigorífico de preparação de sanduíche usado. (a) os anexos superiores e as caixas de armazenamento de alimentos foram removidos de um refrigerador de preparação de sanduíche. A plataforma do microplate foi coloc nas sustentações do metal significadas prender os escaninhos plásticos do armazenamento do alimento. A carcaça plástica da plataforma da microplaca foi removida para fazê-la caber. Uma plataforma personalizada do plexiglass foi construída com as medidas mostradas em (b) para cobrir a abertura superior do refrigerador. O plexiglass foi isolado com o corte da isolação da espuma de 1/2 "para combinar o tamanho do plexiglass, e selou a abertura com fita isolante. Um furo foi perfurado então através do plexiglass para permitir que a agulha da amostra do leitor do ensaio do citômetro do fluxo acesse a plataforma do microplate quando prolongada. Um dispositivo preto do acoplamento que fosse parafusado originalmente na parte superior da plataforma do microplate estêve removido, e parafusado para trás na plataforma do microplate de acima do plexiglass, que ajudada no alinhamento. Uma porta na tampa do plexiglass permite o acesso do usuário ao portador do microplate quando é estendido fora da unidade. Note que o software do citômetro do fluxo alertará o usuário que o portador da placa é demasiado frio, mas o usuário pode cancelar o aviso e executar experimentos refrigerados de QMI. (c) fotografia do sistema montado. (d) detalhe do canto direito dianteiro, como desenhado em (a), mostrando montagem de tampa de plexiglass e isolamento. (e) detalhe da agulha da amostra alinhada acima dos furos. (f) detalhe da seção raspada-para baixo do isolamento que permite o fluxo de ar a unidade. (g) detalhe da porta aberta que mostra a plataforma do microplate do citômetro do fluxo abaixo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Supplementary File
Arquivo suplementar. Dados e código necessários para reproduzir esses números. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

O ensaio QMI requer investimento substancial no desenvolvimento do painel de anticorpos, equipamentos e reagentes, mas uma vez que o ensaio é estabelecido, pode-se coletar dados de alta dimensão observando as redes de interação protéica à medida que respondem a Estímulos. Tecnicamente, o QMI requer pipetagem cuidadosa e rastreamento de locais de amostra e de poços de anticorpos. Etiquetar com cuidado as placas do ensaio é útil, como está fazendo um molde detalhado de posições do poço no papel, que é conservado então para a análise de dados. A importância de manter os grânulos e o lisado frios em todas as vezes, incluindo no portador do microplate do citômetro do fluxo (veja Figura S1 para instruções feitas encomenda do refrigeration) não pode ser exagerado. As interações protéicas dissociam-se rapidamente à temperatura ambiente, e as tentativas precoces de usar um citometro de fluxo de temperatura ambiente não modificada terminaram com a identificação de muitas interações temperatura-lábeis, mas não aquelas que mudaram com a Estimulação.

O QMI é um ensaio baseado em anticorpos, de modo que a seleção inicial de anticorpos é crítica. Anticorpos monoclonais ou recombinantes devem ser usados sempre que possível para reduzir a variabilidade nos resultados. Os polyclonais mostram a variação do lote-à-lote, mas os polyclonais peptide-baseados a um epítopo curto parecem ser relativamente estáveis sobre o tempo. Deriva pode ser minimizada através da compra de grandes lotes de anticorpos; Isto igualmente permite ordens personalizadas de anticorpos portador-livres que impossibilita a necessidade de purificar anticorpos usando o gel do melão e as colunas da rotação, e a perda associada do anticorpo.

Também é importante notar que, como a detecção de um sinal é dependente de epítopos disponíveis, a falta de um sinal não indica necessariamente a falta de uma interação, uma limitação que é comum com outras metodologias de interação protéica. 14 mais, quando um sinal é detectado, é impossível inequivocamente o tempo do estado a interação da proteína é direta (a interage com B) ou indireto (a interage com X e Y, que interagem então com b), que é porque as interações observadas são referidos como peixes em vez de interações proteína-proteína (PPI), que pode implicar ligação direta. Uma limitação de todos os métodos baseados em anticorpos que devem ser mantidos em mente é que a adição de anticorpos pode interromper ou estabilizar complexos proteicos. Outra limitação do uso de citometria de fluxo em vez de manchas ocidentais é que a informação de tamanho para confirmar a especificidade do anticorpo não está disponível. Para superar essa limitação, os controles de IgG são usados na triagem de cada par de anticorpos, e a especificidade é confirmada com knock-out ou Knock-in de linhas celulares ou animais antes de prosseguir com experimentos QMI (seção 1,4).

Os controles de IgG não são usados no ensaio QMI porque cada IgG produz um nível diferente de sinal de fundo, tornando impossível saber o valor de fundo correto para subtrair. Por exemplo, se IP (X) _ Probe IgG dá um IFM de 100 e IP IgG_probe Y dá um IFM de 200, qual valor de fundo deve ser subtraído de IP X_probe Y? Similarmente, as interações às vezes não detectadas (por exemplo, sonda Z do IP X) terão um MFI mais baixo do que as interações não específicas de IgG. Para dar conta desta limitação de não saber o sinal absoluto de IFM, peixes não são relatados unicamente por serem detectados acima de um nível de fundo arbitrário. Em vez disso, apenas peixes que mudam em resposta a uma determinada estimulação são relatados. Quando o MFI elevado puder ser causado pelo ruído não específico, este ruído não seria esperado mudar com estimulação. Além disso, uma porção (10-20%) de interações condição-dependentes observadas são geralmente confirmadas por um segundo método, tipicamente IP-ocidental. Esta confirmação é análoga à confirmação de resultados de sequenciamento de RNA de alta taxa de transferência com RT-PCR e destina-se a aumentar a confiança QMI resultados.

Efeitos de expressão influenciando os resultados de QMI não podem ser descartadas sem testes adicionais, porque o QMI não distingue entre níveis absolutos aumentados de uma proteína e aumento da Homo-multimerização de uma proteína. Para minimizar a incerteza quanto à expressão, os experimentos podem ser realizados usando condições agudas de tratamento com prazos curtos que minimizam possíveis alterações nos níveis de expressão protéica. Outros métodos são necessários para descartar efeitos de expressão em condições de tratamento crônico ou amostras de pacientes primários.

É vital selecionar um tampão apropriado do lysis para QMI. Demasiado fraco de um detergente pode deixar as membranas intactas e prender junto as proteínas que não são no complexo, quando demasiado forte um detergente puder destruir complexos da proteína. Fatores adicionais, como a presença de cálcio ou seus quelantes podem afetar dramaticamente peixes e devem ser cuidadosamente considerados antes de triagem de anticorpos para incluir em um painel QMI. Para experimentos IP-ocidentais, as condições de Lise geralmente são otimizadas para cada peixes em uma base caso a caso, mas as melhores condições para detectar um único PiSCES não podem traduzir para outros peixes na mesma rede de proteínas22. A seleção de detergente apresenta um dilema de galinha e ovo, em que um tampão de Lise é necessário para a tela de anticorpos candidatos, mas um painel de anticorpos é necessário para a tela para um tampão de Lise apropriado. Embora não seja uma solução perfeita, pode-se selecionar um pequeno painel de grânulos e sondas que são de particular interesse e/ou ter conhecido associações ou dissociações em resposta a um estímulo, e testando seu comportamento diferentes condições de Lise sobre os grânulos de CML utilizados inicialmente para a triagem de anticorpos (passo 1.1.3). Um detergente ideal deve permitir a deteção segura de peixes e a recapitulação do comportamento fisiológico conhecido da proteína (Associação/dissociação) com um estímulo dado. Se houver alguma preocupação de que um detergente não solubilizar totalmente as membranas, um anticorpo de controle negativo pode ser adicionado que só daria sinal se duas proteínas foram ligadas pela membrana24. Quando os tampões apropriados do lysis são selecionados, as mudanças em interações mesmo fracas-tais como aquelas entre uma quinase e um substrato-podem confiantemente ser detectadas (por exemplo TCR-LCK)14.

O trabalho anterior usando QMI nos neurônios e nas pilhas de T tem confirmado com cuidado resultados precedentes a fim aumentar a confiança na validez de resultados de QMI, e gerou as hipóteses novas que conduziram às descobertas sobre a transdução do sinal e as vias da doença. No futuro, o QMI pode ser adaptado a outras redes de interação protéica e expandido até 500 proteínas com as atuais classes de microesfera disponíveis. O uso do QMI para estudar como as redes de complexos Multiproteicos mudam em resposta a estímulos à medida que controlam os processos celulares tem o potencial de produzir insights importantes tanto na saúde quanto na doença.

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Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Acknowledgments

Os autores desejam reconhecer Tessa Davis para contribuições importantes para o desenvolvimento do ensaio QMI, e membros atuais e antigos dos laboratórios Smith e Schrum para orientação técnica e entrada intelectual. Este trabalho foi financiado por subsídios de NIMH R01 MH113545 e r00 MH 102244.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well flat bottomed plates Bio Rad 171025001
96-well PCR plates VWR 82006-704
Bioplex 200 System with HTF Bio Rad 171000205 modiefied to keep partially refrigerated, see Figure S1 for details
Bio-Plex Pro Wash Station Bio Rad 30034376
BSA Sigma
CML beads Invitrogen C37481
EDTA Sigma E6758
EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin Thermo Scientific A39256
MagPlex Microspheres Luminex MC12xxx-01 xxx is the 3 digit bead region
Melon Gel IgG Spin Purification Kit Thermo Scientific 45206 used for antibody purification
MES Sigma M3671
Microplate film, non-sterile USA Scientific 2920-0000
Phosphotase inhibitor cocktail #2 Sigma P5726
Protease inhibitor cocktail Sigma P8340
Sandwich Prep Refrigerator Norlake SMP 36 15 for custom refrigeration of Bioplex 200
Sodium fluoride Sigma 201154
Sodium orthovanadate Sigma 450243
Streptavidin-PE BioLegend 405204
Sulfo NHS Thermo Scientific A39269
Tris Fisher Scientific BP152

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References

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