Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

קוונפיקציה של אינטראקציה חלבון ברשת דינמיקה באמצעות ריבוב ושות-Immunoprecipitation

Published: August 21, 2019 doi: 10.3791/60029
Automatic Translation
1,2, 3,4, 5, 6,7,8, 1,2,9
1Center for Integrative Brain Research, Seattle Children's Research Institute, 2Graduate Program in Neuroscience, University of Washington, 3Department of Cancer Immunology and Virology, Dana-Farber Cancer Institute, Department of Medicine, Harvard Medical School, 4Broad Institute of Harvard and MIT, 5Department of Mathematics, University of Houston, 6Department of Molecular Microbiology and Immunology, School of Medicine, University of Missouri, 7Department of Surgery, School of Medicine, University of Missouri, 8Department Bioengineering, College of Engineering, University of Missouri, 9Department of Pediatrics, University of Washington

Summary

כמותית מולטיפלקס Immunoprecipitation (QMI) משתמשת cy, לנסות לגילוי רגיש של הבדלים בשפע של אינטראקציות חלבונים בחלבון ממוקדות בין שתי דגימות. QMI ניתן לבצע באמצעות כמות קטנה של ביומטריה, אינו דורש תגים מהונדסים גנטית, והוא יכול להיות מותאם עבור כל רשת בעבר הגדרת חלבון אינטראקציה.

Abstract

אינטראקציות חלבון חלבונים דינאמיות שולטות בהתנהגות התאית, מתנועתיות ועד לשכפול דנ א לסימני התמרה. עם זאת, מעקב אחר אינטראקציות דינמיות בין מספר חלבונים ברשת אינטראקציה חלבון היא קשה מבחינה טכנית. כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור כמותיים מולטיפלקס Immunoprecipitation (QMI), המאפשר הערכה כמותית של שינויי מקפלים באינטראקציות חלבונים המבוססות על מדידות זריחה יחסית של חלבונים במערכות משותפות שזוהו על ידי חשופים אפיסקופים מפני השטח (דגים). ב QMI, מכלולי חלבון מ-lysates תא הם immunoprecipitated על מיקרוספירות, ולאחר מכן נחקר עם נוגדן בתווית עבור חלבון שונה כדי לכמת את השפע של דגים. נוגדנים Immunoprecipitation מובחנות אזורים ספקטרליים שונים, אשר מאפשר cytometer זרם להבדיל immunoprecipitations מקבילים מרובים ובמקביל לכמת את כמות נוגדן בדיקה הקשורים לכל. QMI אינו דורש תיוג גנטי ניתן לבצע באמצעות ביומטריה מינימלית לעומת שיטות immunoprecipitation אחרות. QMI יכול להיות מותאם עבור כל קבוצה מוגדרת של שימוש בחלבונים, ולכן יש עד כה שימש לאפיון רשתות איתות בתאי T ו-הסינפסות העצבית גלוטמט. התוצאות הובילו ליצירת השערה חדשה עם יישומים פוטנציאליים אבחון וטיפולי. פרוטוקול זה כולל הוראות לבצע qmi, מן הבחירה הראשונית הפאנל הנוגדן דרך להפעיל בחני וניתוח נתונים. ההרכבה הראשונית של שיטת QMI כרוכה בסינון נוגדנים ליצירת פאנל, וקביעת מאגר פירוק מתאים. ההכנה הכימית הבאה כוללת מצמד מimmunoprecipitation נוגדנים לחרוזי מאגי, ונוגדנים ביולוגיים מבוססי ביוטילוטינג כך שהם יכולים להיות מסומנים על-ידי fluorophore streptavidin. כדי להפעיל את הבדיקה, ליפוסט מעורבב עם מאגחרוזים בן לילה, ולאחר מכן חרוזים מחולקים מודבטים עם נוגדנים בדיקה שונים, ולאחר מכן תווית fluorophore ולקרוא על-ידי cy, הזרמת לנסות. שני בדיקות סטטיסטיות מתבצעות כדי לזהות את הדגים שונים באופן משמעותי בין התנאים הניסיוניים, והתוצאות מתדמיינו באמצעות מפות חום או דיאגרמות קצה הצומת.

Introduction

אינטראקציות חלבונים בחלבון חלבון מהוות מבני איתות מולקולריים ומבנים מורצפת המהווים את הבסיס התפקודי של רוב הפיזיולוגיה התאית1. תהליכים אלה מתוארים לעתים קרובות כמסלולים איתות ליניארי העוברים בין מצבים יציבים המבוססים על תשומות יחיד, אבל נתונים ניסיוניים ומידול מראים בבירור שהם מתפקדים כרשתות משולבות2,3, 4. במקרה של G חלבונים, קולטנים שונים לעתים קרובות יש את היכולת להפעיל את אותו חלבון G, ו קולטן יחיד יכול גם להפעיל יותר מסוג אחד של g חלבון5,6. על מנת מספר קטן יחסית של שיעורי חלבון G לווסת במיוחד מגוון רחב של פונקציות סלולריות כגון שידור סינפטית, רגולציה הורמונלי, ואת הגירה התא, תאים חייבים להשתלב ולהבחין אותות אלה4 , 5. ראיות הראו כי האות הזה ספציפיות, עבור החלבונים של G, כמו גם אחרים, נגזר בעיקר על בסיס של אינטראקציות חלבון חלבונים מכוונים דק ודינמיקה הטמפורלית שלהם1,3, ד , מיכל 5 , מיכל בן 6 , 7. מכיוון רשתות איתות מורכבות של מכלולי חלבון דינאמי עם מספר תשומות, תפוקות, ולולאות משוב, הזדמנות בודדת יש את ההזדמנות לשנות את המאזן הכולל הומסטטי של הפיזיולוגיה של התא4 ,7. כעת מוסכם באופן נרחב כי האיתות צריך להיבדק מנקודת מבט של רשת כדי להבין טוב יותר כיצד השילוב של תשומות מרובות שולט בפונקציות הסלולר הדיסקרטית בבריאות ובמחלות7,8, . תשע,עשר,11,12,13 לאור זה, כמותית מולטיפלקס Immunoprecipitation (QMI) פותחה כדי לאסוף תפוקה בינונית, נתונים כמותיים על שינויים לקפל ברשתות מגע דינמי של חלבון.

QMI הוא שיטת נוגדן מבוססת שבו ליפוסט התא הוא מודבטים עם פאנל של נוגדנים immunoprecipitation כי הם מצמידים מגנטי חרוזים מגנטיים המכילים יחסי צבע שונים של צבעי פלורסנט. לאחר נוגדנים ספציפיים מצמידים לכיתות שונות חרוז מגנטי מאפשר בו co-immunoprecipitation של מספר חלבונים מטרה מתוך ליפוסט זהה. לאחר immunoprecipitation (IP), חרוזים מגנטיים הם מודבטים עם שנייה, fluorophore מעלה באוב נוגדן בדיקה (או נוגדן biotinylated בשילוב עם fluorophore מצועם streptavidin). שיתוף אסוציאציות בין החלבונים המוכרים על ידי כל נוגדן IP בדיקה הצמד, או דגים (חלבונים במערכות משותפות שזוהו על ידי אפיסקופים חשופים משטח), מזוהים אז על ידי הזרמת cy, וניתן לכמת בהשוואה בין שונות תנאים לדוגמה14. איורים באיור 1 להראות את השלבים המעורבים בהפעלת שיטת qmi, כולל דיאגרמה של חרוזים מגנטיים עם immunoprecipitated מתחמי חלבון המסומנים על ידי פלואור בדיקה בדיקת נוגדנים (איור 1ג).

הרגישות של QMI תלוי בריכוז החלבון של ליפוסט ביחס למספר חרוזים מגנטיים המשמשים לimmunoprecipitation, והשגת החלטה לזהות 10% מקפלים שינויים דורש רק כמות קטנה של חומר התחלתי לעומת אחרים שיתוף IP שיטות14,15. לדוגמה, כמות חומר ההתחלה שנעשה בו שימוש QMI דומה לזה הנדרש עבור כריך חיסוני מקושר אנזים (אליסה), אבל אינטראקציות מרובות מזוהים בתוך שיטת QMI אחת. Qmi בחני באמצעות 20 IPs ו 20 מטרות המחקר בוצעו באמצעות 1-5 x 105 הראשי T תאים מבודדים מתוך 4 ביופסיה העור, P2 synaptosomal ההכנות מ 3 מ"מ בסעיף ילתית של קליפת העכבר הקדם, או 3 x 106 העכבר הראשי העיקרי , נוירונים, מ,מאוד. רגישות זו גורמת QMI שימושי ניתוח של תאים או רקמה עם זמינות מוגבלת, כגון דגימות קליניות.

QMI יכול להיות מותאם עבור כל רשת האינטראקציה הקודמת שהוגדרו חלבון (בתנאי שנוגדנים זמינים), ועד היום פותחה כדי לנתח את קולטן האנטיגן של תא T (TCR) מערכת המשנה של חלבונים ב glutamatergic הסינפסות בנוירונים מיכל בן 17 , 18. במחקרים של האיתות קולטן תא T, qmi השתמשו לראשונה לזהות שינויים גירוי המושרה בדגים, ולאחר מכן כדי להבחין חולים אוטואימוניות מקבוצת שליטה, לזהות מאותת אוטואימוניות אנדוסוגני, ולבסוף כדי ליצור השערה מעורבים רשת משנה לא מאוזנת הקשורה למחלה של אינטראקציות14. לאחרונה, את אותו פאנל QMI שימש כדי לקבוע כי thymocyte הבחירה נקבעת על ידי כמותית ולא הבדלים איכותניים ב-TCR-המשויך חלבון איתות19. בנוירונים, QMI שימש לתאר הסדר מחדש הקלט של רשת אינטראקציה חלבון עבור סוגים שונים של אותות קלט באופן התומך מודלים חדשים המתעוררים של הפלסטיות הסינפטית17. בנוסף, זה הפאנל QMI סינפטית שימש כדי לזהות הבדלים שבעה מודלים של העכבר אוטיזם, אשכול את המודלים לקבוצות משנה על בסיס הביוחתימות שלהם דגים, ובמדויק ההשערה גרעון מולקולרי משותף כי היה בעבר לא מוכר באחד מדגמי16. גישה דומה יכולה לשמש לצורך המסך עבור קבוצות מסחר אחרות שעלולות להגיב לטיפולי סמים שונים, או להקצות תרופות לקבוצות מסוימות המגיבים לתגובה. QMI יש יישומים פוטנציאליים באבחון, משנה הקלדה החולה, פיתוח סמים, בנוסף למדע בסיסי.

כדי להרכיב פאנל נוגדן QMI, הקרנת נוגדנים ראשונית ופרוטוקולי בחירה מתוארים בסעיף 1, להלן. לאחר לוחות נוגדנים מזוהים, פרוטוקולים עבור בניינים של נוגדנים שנבחרו לחרוזים מגנטיים עבור IP, ו עבור biotinylation של נוגדנים בדיקה שנבחרו, מתוארים בסעיף 2. הפרוטוקול להפעלת הערך QMI בתאים או ברקמות מתואר בסעיף 3. לבסוף, מאחר שניסוי בודד יכול להפיק ~ 5 x 105 נקודות נתונים בודדות, הוראות וקודי מחשב כדי לסייע בעיבוד נתונים, ניתוח והדמיה מסופקים בסעיף 4. מבט כולל על זרימת העבודה המתוארת בסעיפים 2-4 מוצג באיור 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. עיצוב שיטת התכנון

  1. הכנת נוגדן המועמד
    1. עבור כל חלבון של עניין, לבחור 3 כדי 5 נוגדנים למסך. במידת האפשר, השתמשו בנוגדנים חד-שבטיים המכירים באפיסקופים שונים. כלול גם נוגדן אחד שאינו ספציפי לפקד.
    2. כדי להסיר טריס, לבצע חילופי מאגר על ידי הוספת נוגדן למסנן 30 kDa ספין, מסתחרר למטה לנפח המינימלי שלה, הוספת 500 μL של מלוחים באגירה פוספט (PBS), ו חוזר 3 פעמים. כדי להסיר את החלבונים הנושא, לבצע טיהור נוגדנים בהתאם לפרוטוקול של היצרן (ראה טבלת חומרים להמלצה מסוימת של טיהור).
      הערה: זה נעשה בגלל חלבונים הנושא ומאגרים עם קבוצות אמין חינם (כגון טריס) יגיב עם הקבוצות COOH ולהרוות את צימוד חרוז הבאים ותגובות biotinylation. ודא כי כל הנוגדנים מטוהרים (אין חלבונים הספק) ובמאגר ללא אמינים הראשי (כלומר, לא טריס).
    3. זוג כל נוגדן שונה carboxylate אוחר לייטקס (CML) חרוזים כפי שמתואר על ידי דיוויס ו Schrum20. כדי לשמר את הנוגדן, לשנות את היקף תגובות צימוד חרוז על ידי עד 1/5 (כלומר, 3.6 x 106 חרוזים עם 10 μl של 0.2-1 מ"ג/mL נוגדן).
    4. הערכת מספרי חרוזים באמצעות הטקיטומטר (בדרך כלל~ 10/mL) ולאחסן ב-4 ° c. חרוזים אוחסנו במשך יותר משנה ובשימוש בהצלחה QMI assays, אבל חיי מדף או תאריכי תפוגה לא הוקמו רשמית. נאן3 במאגר B/S מונע צמיחה חיידקית.
    5. בbiotinylate אוחר חלק של כל נוגדן (ראה סעיף 2.2 להלן). חנות ב -4 ° c.
    6. אשר את הצימוד האפקטיבי CML חרוז וספירה מדויקת על ידי כתמים 1 x 105 חרוזים עם נוגדן PE מצוכני תגובתי למינים בהם הנוגדן הועלה וקרא על cytometer זרימה.
    7. לאשר ביוקטילציה נוגדן על ידי כתם בנקודה באמצעות streptavidin-HRP.
    8. לאחר המעבדה יצרה ריאגנטים כי ידועים להיות יעילים, להשתמש אלה ריאגנטים כמו פקדים חיוביים בתגובות אישור בשלבים 1.1.5 ו 1.1.6.
  2. הקרנת נוגדנים על ידי IP-FCM (immunoprecipitation שאותרו על ידי זרם cy, לנסות)
    1. החליטו על הקרנת מעגל מתאימה. בשביל זה וכל הפעולות האחרות לסינון טרום QMI (כל דבר הכלול בסעיף זה 1: עיצוב שיטת), אין להשתמש בדגימות biosamples בזמינות מוגבלת. במקום זאת, בחר בחומר שליטה דומה, כגון רקמת עכבר מסוג wildtype, קווי תאים או רקמה רגילה של תורם אנושי שאינו משאב מגביל.
      הערה: בחירת מאגר פירוק לצורך מיון זה אינה טריוויאלית, והיא נדונה בסעיף 1.5: בחירת חומרי ניקוי, כמו גם בפיסקה הפנסופית של המקטע ' דיון '. מאגרי הליזה הסטנדרטיים יש בסיס של 150 מ"מ היאנול, 50 mM טריס (pH 7.4), 10 מ"מ נתרן פלואוריד, 2 מ"מ מילימטר נתרן, ו פרוטאז ו פוספאטואז מעכבי קוקטיילים. חומרי ניקוי התואמים ל-qmi כוללים 1% NP-40, 1% דיגיטלי, 0.1-1% טריטון X-100, ו-0.5-1% ביטול המרה14,16,17,18,19,21.
    2. חישוב הנפח הכולל של lysate לשמש כל IP, באמצעות 10 μL עבור כל שילוב IP-בדיקה להיות מוקרן. אם הקרנת X בדיקה נוגדנים ושימוש אחד IgG בקרה, כל IP ישתמש (X +1) * (10 μL) * (1.1 עבור שגיאה pipetting); X + 1 מהווה חשבון עבור בקרת הבדיקה הדרושה של IgG. לדוגמה, במסך נוגדן 3x3, כל IP צריך להשתמש 44 ul. זכור לכלול בקרת IgG IP (ראה לדוגמה הגדרת הקרנה באיור 2).
    3. חשב את מספר חרוז ה-CML שישמש. אם אתם מהקרנה נוגדנים X הבדיקה, השתמש [(X +1) * 5 X 104 חרוזים]. באופן אידיאלי, 5,000 חרוזים לכל טוב יהיה התוצאה > 2000 חרוזים לכל טוב להיות לקרוא על ידי cytometer הזרימה. למשל, ב 3 x 3 מסך נוגדן, כל IP צריך להשתמש 20,000 חרוזים, שהוא כ 0.66 μL של הכין מלאי חרוז CML משלב 1.1.3 (חרוזים צריך להיות הראשון כימות באמצעות הומוציטוטומטר כדי להבטיח דיוק).
    4. מקרין את הנפח של ליפוסט משלב 1.2.2 עם הנפח של כל חרוז CML להיות מוקרן משלב 1.2.3, לילה ב 4 ° c עם סיבוב כדי למנוע חרוזים להתיישב. בדרך כלל, לבצע incubations בעמודה הראשונה של לוחית ה-PCR 96-ובכן, וכובע עם כמוסות רצועת צינור PCR.
    5. ספין למטה מחרוזות CML ב 3,200 x g עבור 1 דקות ולהסיר להוריד ידי אחד, מהיר הצליף של צלחת מעל הכיור. גלולה לבנה זעירה צריך להיות גלוי בתחתית של כל באר גם לפני ואחרי הצליף.
    6. השהה מחדש CML חרוזים בנפח של מאגר FlyP שווה 20 μL עבור כל מחרוזת חרוז-לחקור; עבור השימוש בנוגדנים X, השתמש (X + 1) * (20 μL) * (1.1 עבור שגיאת ליטוף), בדומה לשלב 1.2.2. עבור מסך 3 x 3, השהה מחדש ב-88 μL של מאגר FlyP. מאגר FlyP הוא 100 mM הנאל, 50 mM Tris pH 7.4, 1% BSA, 0.01% NaN3.
    7. הפץ כל IP לאורך (X + 1) בארות של צלחת 96-היטב PCR, כאשר X הוא מספר נוגדנים בדיקה להיות מוקרן, באמצעות 20 μL/טוב. איור 2 הצגה של הגדרת הקרנה לדוגמה.
    8. לשטוף 2 פעמים נוספות באמצעות 200 μL של מאגר FlyP לכל טוב. ספין הצלחת כמו בשלב 1.2.5 ו קפיצי את הצלחת להסיר את המאגר לשטוף לאחר כל לשטוף. כדורי יהיה קטן מאוד, אבל צריך להיות גלוי לאחר כל כביסה.
    9. עבור כל נוגדן biotinylated להיות מוקרן, לחשב את הנפח הכולל כמו (Y + 1) * 1.1 * 50 μL, כאשר Y הוא מספר נוגדנים IP הוקרן. לדלל נוגדן ריכוז עבודה בנפח זה של מאגר FlyP, בדרך כלל מתחיל עם 1:100 דילול של 0.5 mg/mL מניות.
    10. הפץ כל נוגדן מדולל למטה כל עמודה של 96 צלחת הבאר, ולהבטיח חרוזים CML הם מושעה מחדש.
    11. דגירה ב 4 ° צ' עבור 1 h, עם סיבוב או ליטוף ב 15 דקות במרווחי זמן כדי להבטיח חרוזים CML להישאר בהשעיה.
    12. שטוף 3x ב 200 μL של מאגר FlyP, עבור כל צנטריפוגה לשטוף ולהסיר lysate כמו בשלב 1.2.5.
    13. השהה מחדש את כל חרוזי CML ב-50 μL של 1:200 Streptavidin-PE במאגר FlyP.
    14. מודטה ב -4 ° c בחשכה במשך 30 דקות.
    15. שטוף 3x ב 200 μL של מאגר FlyP, עבור כל צנטריפוגה לשטוף ולהסיר lysate כמו בשלב 1.2.5.
    16. השהה מחדש ב-200 μL של מאגר FlyP ולאחר מכן הפעל על cytometer זרימה.
  3. בחירה באפשרות ' נוגדנים לכלילה ' בשיטת הבחירה
    1. שער בגודל באמצעות FSC-H vs-H, ולחסל doublets באמצעות FSC-H vs FSC-A.
    2. צור היסטגרמות של עוצמת הקרינה של PE ושכבת-על הן בקרות IgG (בדיקה IgG חרוז לבדוק, מבחן חרוז-IgG בדיקה) על זוגות נבדק (איור 2).
    3. חפש זוג חרוז-בדיקה שנותן אות ברור מעל רעש (איור 2ב). בנוסף, זה לא אידיאלי להשתמש באותו נוגדן עבור חרוז וגם לחקור. זיהוי אפירופה דיפרנציאלי מגדיל את הסיכויים להתבוננות באינטראקציות, מכיוון שחלק מהאפיסקופים עלולים להיות מפוספסים במערכות חלבונים מסוימות. אם אין אפשרויות מקובלות, חזור על המסך עם נוגדנים נוספים.
  4. אישור של נוגדנים ספציפיות
    1. כדי להבטיח ספציפיות של נוגדנים עבור המטרות המיועדות, השתמש במדגם ליפוסט שבו היעד הופל; לדוגמה, עכבר מנוקאאוט או קו תא RNAi. לחילופין, השתמש בליפוסט מתוך קו תא שלילי-יעד שבו חלבון היעד התבטא באופן מלאכותי.
    2. לבצע IP-FCM כפי שמתואר בשלב 1.2, שינוי כדי להתאים את הניסוי.
  5. אבקת בחירה
    1. כמו חומרי ניקוי הם קריטיים בניסויים שיתוף IP, בדיקה מדעית וריאציות שונות כדי להבטיח כי השינוי יש סבירות מקסימלית של גילוי שינויים. כדי להתחיל, לבחור פאנל קטן יחסית של אינטראקציות (4-8) כי ידועים לשנות בתנאי נתון ו/או הם מעניין במיוחד למחקר שלך.
    2. באמצעות שאינם פלורסנט, מעלה נוגדנים CML חרוזים שנעשו עבור מסכי הראשונית, לבצע IP-FCM כפי שמתואר בשנת 1.2 באמצעות מגוון לפירוק מאגר התנאים ניקוי. מסכי ניקוי ניתן לבצע עם תכשיר ניקוי כמשתנה היחיד, או עם תנאי תא שונים עבור כל ניקוי. תמיד להשתמש בפקדים IgG עבור החרוזים והגששים, מאז חומרי ניקוי מדי פעם לייצר רקע בלתי צפוי בכמה שילובים IP-בדיקה.
    3. בהתבסס על MFIs מהמסך, לבחור כביסה הממטבת את האות של מזל דגים. סביר להניח שיהיה צורך להתפשר על22.

2. הכנת מולטיפלקס

  1. מצמד חרוזים מגנטי
    1. באמצעות מפת אזור החרוזים המגנטי, בחר אזורי חרוז לשימוש בתבנית המקטינה את הסיכון לזיהוי צולב. חרוז מגנטי בדרך כלל למרוח למעלה וימינה, כך להימנע אזורי חרוז הסמוכים באלכסון. חרוזים מכל טור אחר של דיאגרמת חרוז המוצגת באתר לומיקס מומלצים (https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/).
    2. הכינו את הנוגדן ללא ספק ב 0.1 מ"ג/mL ב-PBS (כמו ב-1.1.2) ב 250 μL. שמור על קרח לשימוש מאוחר יותר.
    3. מערבולת מגנטית חרוזים בהרחבה, ולאחר מכן סדרת מחלקים 250 μl לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה ענבר (כדי להגן על חרוזים מ photobleaching לבנה).
    4. חרוזים מגנטיים נפרדים עבור 60 s ולהסיר את הסופרנטאנט.
    5. הוסף 250 μL של מאגר MES (50 mM MES-pH 6.0, 1 מ"מ EDTA), מערבולת, נפרד מגנט עבור 60 s, ולהסיר את הסופרנטאנט. חזור והשהה מחדש חרוזים מגנטיים ב-200 μL של מאגר MES.
    6. הוסף 40 μL של MES ל 2 מ ג של שפופרת יחיד לשימוש של Sulfo-כמובן כדי לבצע מלאי mg/mL של 50.
    7. הוסף 25 μL של סולפו-מטפל טרי על החרוזים המגנטיים. ערבולת.
    8. הוסף 25 μL של 50 מ"ג/mL טרי מומס [1-אתיל-3-( -3-dimethylaminopropyl) קרבודיאימיד הידרוכלוריד, המכונה גם EDAC] ב-MES מאגר. ערבולת.
    9. לכסות ולטלטל על וורטקר עם אביזר החזקת שפופרת עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר, 1000 סל ד.
    10. נפרדים ממגנטים עבור 60 s ולהסיר את הסופרנטאנט.
    11. השהה מחדש ב-500 μL של PBS, מערבולת, נפרד באופן מגנט עבור 60 s ולהסיר את הסופרנטאנט. חזור על.
    12. השהה מחדש ב-250 μL של פתרון נוגדן משלב 2.1.2. ערבולת.
    13. דגירה 2 h ב temp בחדר עם טלטול על vortexer ב 1000 סל ד.
    14. הוסף 500 μL של PBS לחרוזים מגנטיים, מערבולת, נפרד מגנטית עבור 60 s, ולהסיר את supernatant.
    15. הוסף 750 μL של חסימת/אחסון (B/S) מאגר (1% BSA ב-PBS pH 7.4, 0.01% נאן3). כיסוי ו-דגירה 30 דקות בחדר temp, 1000 סל ד.
    16. נפרדים ממגנטים עבור 60 s ולהסיר את הסופרנטאנט. השהה מחדש ב-100 μL של מאגר B/S.
    17. חנות ב -4 ° c. חרוזים אוחסנו במשך יותר משנה ובשימוש בהצלחה QMI assays, אבל חיי מדף או תאריכי תפוגה לא הוקמו רשמית. נאן3 במאגר B/S צריך למנוע צמיחה חיידקית.
    18. אימות צימוד חרוזים מגנטי על ידי צביעת ~ 0.25 μL של בשילוב חרוזים מגנטיים עם מינים אנטי-מארחים פלורסנט משני וקריאה על cytometer כמו בשלב 1.1.5.
  2. ביוטילציה
    1. תוודא שנוגדנים נמצאים ב-PBS. ללא חלבון מוביל
    2. חישוב הסכום μg של נוגדן להיות biotinylated (100-200 μg מומלץ לשימוש במגה-פלקס, 25-50 μg מומלץ להקרנה).
    3. להכין טרי 10 מ"מ sulfo-ביוטין (ניתן לעשות על ידי הוספת 224 μL של ddH2O ל 1 mg ללא שקילה צינור).
    4. הוסף 1 μL של 10 מ"מ מילימטר sulfo-ביוטין לכל 25 μg של נוגדן, מערבולת או פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב.
    5. . מיכל החום של החדר בשעה 1
    6. מודטה ב -4 ° c עבור 1 h.
    7. השתמש במסנן טווח של 30 kda כדי להסיר ביוטין לא מאוגד ולהפסיק את התגובה. הוסף 500 μL של PBS וסובב את העמודה עד שיגיע לאמצעי האחסון המינימלי. הוסף 500 μL של PBS נוסף וחזור על 3 החלפת מאגר כולל.
    8. הערכת ריכוז על ידי מדידת ספיגה של 1-2 μL על ספקטרוסקופיה, ולאחר מכן להביא את הריכוז נוגדן 0.5 mg/mL.
    9. חנות ב -4 ° c.

3. מimmunoprecipitation לקולנוע כמותי

  1. מבנה לוח
    הערה: שיטת עבודה זו פועלת בדרך הטובה ביותר כאשר מבוצעת באמצעות 96-הצלחות לוחיות הרישוי ו2-4 התנאים
    1. הפעל תמיד פקדים מתאימים (כלומר, מוסטימולציה של תאים ממריצים) על אותה צלחת, כדי לזהות שינויים בין התנאים. הפץ כל דוגמה אופקית לאורך הצלחת, והשתמש בכל עמודה עבור נוגדן בדיקה שונה. סט של משכפל טכני עבור כל בדיקה יש להפעיל מיד לאחר הסט הראשון. ראה איור 3 לדוגמה.
    2. תעד בקפידה את פריסת הצלחת כדי להקל על טעינת וניתוח מדויקים של הצלחת.
  2. הכנה לדוגמה & immunoprecipitation (יום 1)
    1. Lyse רקמה או תאים בניקוי המתאים עם פרוטאז ו פוספספטאז מעכבי ו-דגירה על הקרח עבור 15 דקות. שמרו על הקור הצונן כל הזמן.
      הערה: בפיסקה השלישית של המבוא, יש לקבוע בדיוק את הכמות המדויקת של ריכוז החומר הניתן לשימוש בחלבונים והתרכזות בחלבון. באופן כללי, בטווח של 200 μL של 2 mg/mL חלבון לכל מדגם כבר הצליח בעבר 20 IP ו 20 מטרות הבדיקה, אבל התשומות האידיאלי עבור כל פאנל נוגדן תא או סוג רקמות יש לקבוע אמפירי.
    2. ספין למטה ב 4 ° צ' עבור 15 דקות ב 16,000 x g כדי להסיר ממברנות ופסולת; לשמור על הסופרנטאנט כליפוסט.
    3. בצע שיטת BCA או דומה לקביעת ריכוזי חלבונים, ולאחר מכן הנרמל את ריכוז החלבון בין הדגימות. בשעת שימוש בתאים, התחילו במספר שווה של תאים לכל תנאי ונורמליזציה היא אופציונלית.
    4. הכינו תמהיל חרוזים מגנטי מאסטר המכיל ~ 250 חרוזים מגנטיים של כל מחלקה בכל טוב בתוך השיטת. כוונן את מספרי החרוזים לאחר ניתוח נתונים כך שבעשור העתידי נאמר ממוצע של 110 חרוזים של כל מחלקה ייקרא בהתאם.
      הערה: חישוב לדוגמה: (נפח חרוז חדש) = [(ממוצע הפעלה)/110] * (כמות החרוז הקודמת). יש לכוונן אמצעי אחסון של חרוז באופן זה על כל 8 רצפים או לפי הצורך. בדרך כלל, 3-4 μL של כל חרוז מגנטי (מוכן לעיל) משמשים לניסוי של 2 צלחות.
    5. לשטוף את שילוב חרוז מגנטי 2x במאגר FlyP עם הפרדה מגנטית, ולאחר מכן להשעות מחדש במאגר FlyP. עבור השעיה מחדש, השתמש 10 μL לכל מדגם לכל צלחת. מאגר FlyP הוא 100 mM הנאל, 50 mM Tris pH 7.4, 1% BSA, 0.01% NaN3.
    6. לאחר ביסודיות והורטקסלערבב מגנטי חרוז, סדרת מחלקים 10 μl לתוך צינורות קרח קר מיקרוצנטריפוגה (שפופרת אחת לכל מדגם). הוסף כמויות שוות של ליפוסט (עם ריכוזים מנורמל) לכל צינור לimmunoprecipitation.
    7. מחלקים את התערובת ליפוסט-מגנטית לתוך צינור אחד עבור כל צלחת לרוץ; לדוגמה לניסוי של 2 צלחות, פצל את הליפוסט לשתי שפופרות. מניחים צינורות על מסובבי ב 4 ° c לילה לimmunoprecipitation, מכוסה לשמור על האור.
  3. הפעלת המנה (יום 2)
    1. התחל עם שפופרות ליפוסט-מגנטית ל#1 צלחת. השתמשו במדף חרוזים מגנטי כדי להסיר את הליפוסט מהחרוזים המגנטיים, והזמינו משמורת לניתוח עתידי. שטוף חרוזים 2x ב 500 μL של מאגר FlyP קר קרח. שמרו על צינוריות צינורות תמיד בקרח או ב -4 ° c.
    2. חישוב השעיה מחדש כמו (מספר של הבדיקות) * (2 משכפל טכני) * (25 μL לכל טוב) * (1.1 עבור שגיאת ליטוף). השהה מחדש את IPs בנפח מחושב של מאגר FlyP קר-קרח.
    3. לאחר השעיית מחדש ביסודיות חרוזים מגנטיים על ידי ליטוף עדין, לפזר 25 μL לכל טוב על פני התחתית שטוח 96 צלחת היטב, על קרח.
    4. בצלחת שונים 96-באר, לדלל נוגדנים בדיקה biotinylated כדי 2x העבודה הריכוז (עבודה ריכוז הוא בדרך כלל 1:100 או 1:200, הקבועים באופן אמפירי) במאגר FlyP כך הסדר שלהם תואם את העמודות על הלוח לוחית (ראה איור 3 ). הנפח הסופי של נוגדנים בדיקה בריכוז העבודה יהיה 50 μL לכל טוב, כך הנפח של כל נוגדן 2x מוכן צריך להיות (25 μL) * (מספר דגימות ביולוגיות) * (2 משכפל טכני) * (1.1 עבור שגיאת ליטוף).
    5. השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי לפזר 25 μL של כל נוגדן בדיקה לתוך לוחית מגנטית המכילה את הצלחת.
    6. לנער על שייקר צלחת אופקית כדי לערבב ולהשעות את החרוזים מגנטי, ולאחר מכן הדגירה ב 4 ° צ' עבור 1 h, רועד ב 450 סל ד בחושך.
    7. לשטוף את 3x עם מאגר FlyP על מנקה לוחית מגנטית ב 4 ° c.
    8. השהה מחדש את החרוזים המגנטיים ב-50 μL של 1:200 Streptavidin-PE.
    9. לנער כדי לערבב ולהשעות חרוזים מחדש, ולאחר מכן דגירה ב 4 ° צ' עבור 30 דקות, רועד ב 450 סל ד בחושך.
    10. לשטוף את 3x עם מאגר FlyP על מנקה לוחית מגנטית ב 4 ° c.
    11. השהה מחדש ב-125 μL של מאגר FlyP.
    12. טלטל עבור 1 דקות ב 900 סל ד כדי להשהות מחדש ביסודיות חרוזים.
    13. לרוץ על הזרם בקירור cytometer (ראה דיאגרמה באיור S1). השתמש "high RP1 target" ההגדרה בתוכנה cytometer ותנאי עצירה של 1,000 חרוזים לאזור (מאוד חטיאים ירי את המספר שצריך להיות כל הטוב בודדים כדי למנוע את המחשב להפסיק בטרם עת) ו לדוגמה נפח של 80 μl.
    14. להשהות את הריצה במחצית הדרך ולהשעות מחדש את החרוזים כדי למנוע התיישבו.
    15. יצא קבצי נתונים בתבנית. xml.
    16. חזור על התהליך עבור הצלחות הנותרות, החל משלב 3.3.1.

4. ניתוח נתונים

הערה: קוד אנק נועד להשוות בין שני תנאים מ N = 4 ניסויים, כל אחד עם 2 משכפל טכני עבור כל תנאי. לדוגמה, התאים ממריצים ארבע פעמים עצמאיות, QMI מופעל בארבעה ימים שונים על השליטה (לא מגורה) ותאים ממריצים, עם משכפל טכני כמתואר לעיל, וניתוח נתונים מתקדם כמפורט להלן.

  1. מסתגלת לא פרמטרית עם חיתוך אלפא מתכוונן (אנק)
    1. פתח את MATLAB והגדר את הספריה הפעילה לתיקיה המכילה את רכיבי התוכנית של אנק ואת קבצי ה-. xml המיוצאים מהציטומטר הזורם.
    2. מלאו את הקובץ "אנק קלט" כדי לשקף את פרטי העיצוב הניסיוני. הקובץ לדוגמה שנכלל בקובץ המשלים התמלא מראש כדי להפעיל את הנתונים לדוגמה, שסופקו גם כן.
    3. הפעל את התוכנית, שתכתוב קובץ. csv בספריה הפעילה. הקובץ מדווח על הדגים שונים באופן משמעותי, ברמה חיובית (אלפא) שקרית של 0.05, בין התנאים הניסיוניים והניסיוני, בכל 4 המשכפלת הניסויית, או לפחות 3/4 משכפל.
    4. הערה "כניסות", אשר מוגדרות כדגים עם הבדלים משמעותיים לפחות 3 משכפל ניסיוני, מיוצג 3/4 ∩ 4/4 בקובץ, לשימוש בשלב 4.3.1.
  2. ניתוח רשת מיתאם משוקלל23 (cna)
    1. הדבק-בצע חילוף של כותרות העמודות של פלט קובץ הנתונים על-ידי Matlab מסתיימת ב-"_ MFI. CSV "לשורה הראשונה של גיליון חדש של excel. הוסף את העמודות "ניסוי" עבור מספר הניסוי, "טיפול", לטיפול ניסיוני או כל משתנה אחר שיש לנתח. שמור קובץ זה כ-"תכונות. csv".
    2. פתח את סטודיו R והגדר את ספריית העבודה לתיקיה המכילה את המילה "_ MFI". CSV "ו" תכונות. CSV "קבצים.
    3. הפעל את פקודות R כפי שמצוין בקובץ הפקודה ' הערות ' ואת הפרטים המפורטים בהוראות הכלולות בקבצים. מודולי WCNA מתואמים באופן משמעותי עם כל תכונה ניסיונית הם פלט כקובץ גרפי, ואת הקורלציה של כל אינטראקציה IPאני_ בדיקהJ עם כל מודול הוא פלט כמו קובץ csv.
    4. הערה ' כניסות CNA ', המוגדרות כאינטראקציות עם חברות מודול (MM) > 0.7 ו-p < 0.05 עבור חברות במודול שזוהה בקורלציה משמעותית עם המשתנה ניסיוני של ריבית, לשימוש בשלב 4.3.1.
  3. הדמיה & חיובית של ' להיטים '
    1. עבור כל אינטראקציה ברשימה "3/4 ∩ 4/4 צפיות" בקובץ הפלט של אנק (משלב 4.1.4), לזהות אם האינטראקציה היא גם "CNA hit" על ידי בדיקת קובץ הפלט CNA (ראה שלב 4.2.6). צור עמודה חדשה המציינת אם כל להיט של האנק הוא גם להיט CNA.
    2. חשב את ערך השינוי הממוצעשל יומן הרישום עבור כל להיט ∩ cna על ידי ממוצע הערכים שניתנו בגיליון האלקטרוני של הפלט של אנק "_ כניסות. csv" משלב 4.1.3. המרת ערכים ליומן רישום של2 שינויים בקיפול לפני חישוב ממוצע. לאינטראקציות שהיו משמעותיות רק ב-3/4 משכפל, מחק את הערך החיצוני.
    3. לעשות גיליון אלקטרוני עם כל להיט ∩ CNA הרשומה כתובת IP בעמודה אחת, לווין בעמודה השנייה, ואת ערך שינוי הקיפול בעמודה השלישית. השתמש בגיליון אלקטרוני זה כדי ליצור דיאגרמה מקצה הצומת ב-ציטוסקייפ על-ידי ייבוא הקובץ כרשת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הקרנת נוגדנים
איור 2 B מציג את תוצאות המסך עבור חלבון Connexin36. רוב השילובים IP_probe מייצרים לא אות מעל פקדי IgG. IP עם הנוגדן המונשבטיים 1E5 ולבדוק עם או 1E5 או נוגדנים פוליבטיים 6200 מייצרת משמרת ימניים בהתפלגות חרוז לעומת שולטת IgG. כאן, IP 1E5 ו לחקור 6200poly נבחרו כדי להימנע משימוש באותו נוגדן כמו IP ובדיקה, הן כדי להפחית את ההסתברות של חלבון שאינו ספציפי להיות מוכר על ידי שני נוגדנים עצמאיים, כדי להגדיל את הסיכוי לזהות שיתוף אסוציאציות באמצעות אפיסקופים שונים. עדיף לבחור שילוב IP_probe עם לפחות 1-2 MFI גבוה יותר לעומת הפקדים IgG, אבל מדי פעם זוגות לייצר Mfi חלש כי הם להבדיל בעקביות מן הפקדים ניתן להשתמש אם לא מזוהים חלופות. איור 2 C מציג ניסוי מסוים באימות עבור השילוב של 1E5-6200poly. ליפוסט מ 293 תאים לאחר המעבר עם Connexin36 פלמיד הפיק משמרת הימניים של ~ 1.5-log בהתפלגות חרוז, בעוד תאים בלתי מבוקר חופפים עם הפקדים IgG. כאשר מאשרים את הספציפיות של זוג, שליטה שלילית לאחר מחיה מהממת או קו התא ללא חלבון היעד צריך MFI דומה לפקדים IgG.

מצמד חרוזים
אופייני בקרת חרוזים מגנטי באיכות התגובה ייתן מ3-4 MFI היומנים מעל הרקע כאשר מוכתם נוגדן משני מצודדים כדי fluorophore עם אינדקס בהירות בין 3 ו 5 (כגון PE או FITC). איור 4 מראה תגובת בקרת איכות טיפוסית השוואת הקוניוגציה של חרוז מגנטי חדש בהשוואה לאצווה הישנה להיות מוחלף.

ניתוח מידע
בכל ניסוי, אנק משווה את ההפצות הפלואורסצנטית של כל מחלקת חרוזים מגנטית בכל הבאר (כלומר כל שילובי IP_Probe אפשריים) בין בקרה המוגדר על-ידי המשתמש לבין מצב ניסיוני. הוא מקצה ערך pלכל שילוב המשקף את ההסתברות שהחרוזים נדגמו מאוכלוסיות זהות בהתבסס על סטטיסטיקת קולאוגמוב-שירנוב (K-S). לאחר מכן, התוכנית מחשבת את ה-K-S p-value הנדרש כדי לייצר שיעור חיובי-false של 0.05 על ידי תיקון עבור השוואות מרובות וחשבונאות לשונות טכניות (הבדלים בין העותקים הטכניים). IP_probe שילובים (דגים) אשר K-S מבחן-ערך נופל מתחת לגזור מחושב בכל ארבעת הניסויים, או לפחות 3/4 ניסויים (3/4 ∩ 4/4) מזוהים. מאחר שהקיצוץ בערך pמשתנה בהתאם לרמות השונות הללו, לפעמים הדגים יזוהו ב-4/4 אך לא 3/4 ∩ 4/4, כך מחושבים רשימות נפרדות. למשוואות מפורטות של משוואות אנק, ראו (Smith ואח '. 2016). 14 פרטים על ניתוח WCNA והתוצאות נדונו ביסודיות על ידי לאנגדר ואח '23

מצגת נתונים
הניתוחים של אנק ו-CNA23 מתבצעים כדי לזהות את הדגים ששניהם (1) מראים שינויי קיפול משמעותיים בין התנאים הניסיוניים ב-3/4 לפחות של רצפים ו-(2) שייכים למודול cna התואם למשתנה הניסיוני. אלה דגים בעלי ביטחון גבוה, כי הם מזוהים על ידי שתי גישות סטטיסטיות עצמאיות הם המכונה אנק ∩ CNA דגים. אינטראקציות אלה יכולות להיות מדמיינו כדיאגרמה של קצה הצומת באמצעות תוכנת הקוד הפתוח ציטוסקייפ (איור 5א) או כמפת החום באמצעות הוראות R והניתוח הכלול בחומר המשלים (איור 5b ).

Figure 1
איור 1 . סקירה של מולטיפלקס Immunoprecipitation. (א) נוגדנים הוקרן בעבר מצמידים בצורה מסודרת למחלקות שונות של חרוזים מגנטיים בתגובות נפרדות. (ב) לילה, מתחמי חלבונים מimmunoprecipitated באמצעות תערובת של החרוזים מצמידים נוגדן בשילוב. (ג) חלבונים Co-immunoprecipitated מתויגים על ידי נוגדן בדיקה ו fluorophore. (ד) חרוזים מגנטיים ומתחמי חלבון המסומנים מופעל באמצעות cytometer זרימת קירור כמויות יחסיות של חלבונים המתרחשים מתחמים משותפים. ראה איור S1 עבור פרטים סכמטית של קירור מותאם אישית. (ה) התוכנה מנהל cytometer זרם מפריד מחרוזות לפי מחלקה ו (f) מציג היסטלגרמות פלואורסצנטית מכל אזור חרוז. (g) נתונים מיוצאים כקבצי. xml ומנותח על-ידי שתי גישות סטטיסטיות עצמאיות. רק דגים המזוהים בשני הניתוחים מדווחים באמצעות מפת החום והפריטים החזותיים בדיאגרמת קצה הצומת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2 . קונשין 36 מסנן נוגדנים באמצעות IP-FCM. (א) IP-fcm בוצע על המוח העכבר ליפוסט באמצעות פאנל 4x4 של קונשין 36 (Cx36) מחרוזות cml וברגשים. ליפוסט היה immunoprecipitated עם כל חרוז CML בשורה נפרדת של הצלחת. לאחר שוטף, חרוז כל היה מופץ על פני שורה, כך נוגדן בדיקה אחד ניתן להוסיף לכל עמודה. (ב) רוב שילובי הנוגדנים מראים שאין אות (כתום) על הרקע igg (אפור, כחול). ה-IP של 1E5 עם הגשוש 6200Poly מראה אות חיובי קביל. 1E5 חרוז/בדיקה 6200Poly חרוז/לבדוק זוגות כל להראות אות קביל, אבל זה לא אידיאלי להשתמש בנוגדן אותו עבור גם חרוז ו לחקור. זיהוי אפירופה דיפרנציאלי מגדיל את הסיכויים להתבוננות באינטראקציות, מכיוון שחלק מהאפיסקופים עלולים להיות מפוספסים במערכות חלבונים מסוימות. 6200Poly חרוז עם הבדיקה 1E5 נותן את האות החזק ביותר נבחר להשתמש בתוך השימוש במגה-מפלקס לאישור ספציפיות. (ג) IP-fcm באמצעות זוג נוגדנים Cx36 שנבחרו מתוך ההקרנה בוצע על הליפוסט של תאים 293t מנוכר עם Cx36 ושלא העברה בקרות. יש אות ברור מן התאים Cx36-transfected אבל התאים הלא מבוקר הם זהים מ IgG חרוז/בדיקה בקרה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3 . מיתאר לוחית דוגמה. מערכת 4 תנאים מוגדרת. בצלחת 96 דגימות 1-4 טעונות בשורות רצופות (כל דוגמה ביולוגית המיוצגת כאן על-ידי צבע שונה), ומשכפל טכני נטען באותו סדר ב-4 השורות הבאות. בדיקה אחת משמשת בכל עמודה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4 . תגובת בקרת איכות טיפוסית השוואת הקוניוגציה של MagBead חדש לעומת האצווה הישנה להיות מוחלף. חרוז מעניק 2-4 MFI היומנים מעל הרקע, ואת האצווה החדשה יש MFI דומה לזה של האצווה הישנה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5 . QMI מזהה דגים סינפטיים כי שינוי בסדר גודל אחרי 5 דקות של גירוי NMDA בנוירונים בקליפת המוח התרבותית. ניסוי QMI בהשוואה NMDA מגורה נגד מעורר גירוי (ACSF שליטה) נוירונים. מוצגים דגים שזוהו על-ידי הניתוחים של אנק ו-CNA. (א) בדיאגרמת קצה צומת המיוצר באמצעות תוכנת קוד פתוח ציטוסקייפ, הצמתים מציינים את יעדי הנוגדן (חלבונים) שנכללו כמו שב ס וזונדים בפאנל qmi. הקצוות מייצגים את הדגים אנק ∩ CNA, עם הצבע והעובי של הקצה המציין את הכיוון ואת הגודל של שינוי קיפול בין טיפול NMDA ושליטה. דגים שלא השתנו בין NMDA לתנאי השליטה אינם נכללים באיור. (ב) מפת חום המופקת ב-R באמצעות מפת החום. 2 הפונקציה מייצגת את אותו אנק ∩ Cna דגים. ערכי mfi ללוחמה ברצף מנורמעים על-ידי שורה לצורך התחשבות בנתונים המשתרעים על-פי שלושה יומני רישום, ו-mfi היחסי עבור כל שכפול ניסיוני מופיע כדי להדגים את הגודל והעקביות היחסיים של כל אחד מהדגים שדווחו. הנתונים והקוד הנדרשים לשכפול נתונים אלה נכללים בקובץ המשלים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Supplementary Figure 1
איור S1: דיאגרמות של קירור מותאם אישית של מערכת הזרימה cy,. הקורא המערך של cytometer הזרם חייב להישמר בטמפרטורת החדר, אבל החלק התחתון (פלטפורמת המיקרופלטה) חייב להיות בקירור כדי לשמור על הדגים במהלך הניתוח. לראות את הטבלה של חומרים לקבלת מידע אודות מודל של זרימת cytometer וכריך הכנה מקרר בשימוש. (א) את הקבצים המצורפים העליונים ואת פחי אחסון המזון הוסרו ממקרר הכנה סנדוויץ. הפלטפורמה המיקרופלטה הונחה על תמיכות מתכת שנועדו להחזיק את פחי אחסון המזון הפלסטי. הדיור הפלסטי של פלטפורמת המיקרופלטה הוסר כדי להתאים אותו. פלטפורמת פלקסיגלס מותאמת אישית נבנתה עם מדידות המוצגות ב (ב) כדי לכסות את הפתח העליון של המקרר. פלקסיגלס היה מבודד עם 1/2 "קצף בידוד לחתוך כדי להתאים את גודל הפלקסיגלס, וחתם את הפער עם קלטת בידוד. חור היה לאחר מכן קדח דרך פלקסיגלס כדי לאפשר את המחט לדוגמה מתוך הקורא שיטת הזרימה cytometer כדי לגשת לפלטפורמת אימונולוגיה כאשר הוארך. מכשיר צימוד שחור שנדפק במקור לתוך החלק העליון של פלטפורמת המיקרו-לוחית הוסר, ודפק בחזרה לתוך פלטפורמת המיקרופלטה ממעל לפלקסיגלס, שסייע ביישור. דלת במכסה הפלקסיגלס מאפשרת גישה למשתמש למנשא המיקרופלטה כאשר היא מורחבת מתוך היחידה. שים לב כי תוכנת הזרימה cytometer יתריע המשתמש כי המוביל צלחת קר מדי, אבל המשתמש יכול לעקוף את האזהרה ולהפעיל ניסויים QMI מקורר. (ג) צילום של המערכת התאספו. (ד) פירוט של הפינה הימנית הקדמית, כפי שצוירה ב-(א), מראה הרכבה של כיסוי פלקסיגלס ובידוד. (ה) פירוט של המחט לדוגמה המיושרת מעל החורים. (ו) פירוט של קטע הבידוד המגולף המאפשר זרימת אוויר מתחת ליחידה. (ז) פרט לדלת הפתוחה המציגה את פלטפורמת המיקרו-מיקרומטר של הזרימה למטה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Supplementary File
קובץ משלים. נתונים וקוד הנדרשים לשכפול נתונים אלה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השקאת QMI דורש השקעה ניכרת בפיתוח פאנל הנוגדן, ציוד ריאגנטים, אבל ברגע שהנתון נקבע, ניתן לאסוף נתונים בעלי ממדים גבוהים התבוננות ברשתות אינטראקציה חלבון כפי שהם מגיבים ניסויים בשליטת גירויים. מבחינה טכנית, QMI דורש ליטוף זהיר ומעקב של דגימת ומיקומים היטב נוגדן. תיוג בזהירות של לוחיות הנתונים הוא שימושי, כפי שהופך תבנית מפורטת של מיקומים היטב על נייר, אשר נשמר לאחר מכן עבור ניתוח נתונים. החשיבות של שמירה על חרוזים וליפוסט קר כל הזמן, כולל בזרם cytometer מיקרופלייט המנשא (ראה איור S1 עבור הוראות קירור מותאם אישית) לא ניתן לציין יתר. אינטראקציות חלבונים במהירות לנתק בטמפרטורת החדר, וניסיונות מוקדמים לשימוש שאינו משתנה, טמפרטורת החדר זרימת cytometer הסתיים עם זיהוי של טמפרטורות רבות-האינטראקציות labile, אבל לא אלה שהשתנו עם מיועד גירוי.

QMI היא שיטת נוגדן מבוססת, כך הבחירה הראשונית של נוגדנים הוא קריטי. יש להשתמש בכל הניתן כדי להקטין את השונות בתוצאות. Polyclonals להראות הרבה הרבה וריאציה, אבל פפטיד מבוססי polyclonals לאפירופה קצר נראה להיות יציב יחסית לאורך זמן. הסחף יכול להיות ממוזער על ידי רכישת אצוות גדולות של נוגדנים; הדבר גם מאפשר הזמנות מותאמות אישית של נוגדנים ללא ספק המונע את הצורך לטהר נוגדנים באמצעות מלון ג'ל ועמודות ספין, ואת אובדן הנוגדן המשויך.

חשוב גם לציין כי מכיוון שזיהוי אות מתבססת על האפיסקופים הזמינים, היעדר אות אינו מעיד בהכרח על חוסר באינטראקציה, מגבלה הנפוצה בשיטות אחרות לאינטראקציה עם חלבונים. 14 עוד, כאשר האות מזוהה, זה בלתי אפשרי המצב הבלתי משמעי מזג האוויר האינטראקציה החלבון הוא ישיר (אינטראקציה עם b) או עקיף (אינטראקציה עם X ו-Y, אשר לאחר מכן אינטראקציה עם b), ולכן האינטראקציות שנצפו הם המכונה דגים במקום אינטראקציות חלבון חלבון (PPI), אשר עשוי לרמוז על כריכה ישירה. מגבלה של כל שיטות מבוססות נוגדן כי יש לזכור כי התוספת של נוגדנים עלול לשבש או לייצב מכלולי חלבון. הגבלה נוספת של שימוש cy, הזרמת הזרימה ולא הכלים המערבי הוא מידע גודל כדי לאשר את הנוגדנים ספציפיות אינו זמין. כדי להתגבר על מגבלה זו, בקרת IgG משמשים בהקרנה כל זוג נוגדן, וספציפיות הוא אישר עם נוק אאוט או להקיש בשורות התא או בעלי חיים לפני שתמשיך עם ניסויים QMI (סעיף 1.4).

פקדים IgG אינם משמשים בתוך התיקון QMI כי כל IgG מייצרת רמה שונה של אות הרקע, מה שהופך אותו בלתי אפשרי לדעת את ערך הרקע הנכון כדי להחסיר. לדוגמה, אם IP (X) _ בדיקה IgG מעניקה MFI של 100 ו-IP IgG_probe Y נותן MFI של 200, איזה ערך רקע צריך להיות מופחתים IP X_probe Y? באופן דומה, לפעמים אינטראקציות שאינן מזוהות (למשל, IP X בדיקה Z) יהיה MFI נמוך יותר מאשר אינטראקציות IgG ספציפי. כדי להתחשב במגבלה זו של אי ידיעת האות MFI המוחלט, הדגים אינם מדווחים אך ורק על היותו מזוהה מעל רמת רקע שרירותית. במקום זאת, מדווחים רק הדגים שמשתנים בתגובה לגירוי מסוים. בעוד MFI גבוה יכול להיגרם על ידי רעש לא ספציפי, רעש זה לא צפוי להשתנות עם גירוי. בנוסף, חלק (10-20%) של אינטראקציות תלויות תנאים מאושרות בדרך כלל על-ידי שיטה שניה, בדרך כלל IP-מערבית. אישור זה הוא אנלוגי לאישור תוצאות רצף RNA התפוקה הגבוהה עם RT-PCR והוא נועד כדי להגביר את התוצאות QMI ביטחון.

תופעות ביטוי המשפיעים על תוצאות QMI לא ניתן לשלול ללא בדיקות נוספות, כי QMI אינו מבחין בין רמות מוחלטות מוגברת של חלבון וגדל הומו-multimerization של חלבון. כדי למזער את חוסר הוודאות לגבי הביטוי, ניתן לבצע ניסויים באמצעות תנאי טיפול חריפים עם צירי זמן קצרים המזזער שינויים פוטנציאליים ברמות ביטוי החלבונים. שיטות אחרות נדרשות כדי לשלול את תופעות הביטוי בתנאי טיפול כרוניים או דגימות מטופלים ראשוניים.

זה חיוני כדי לבחור מאגר פירוק המתאים QMI. חלש מדי של חומרי ניקוי יכול להשאיר קרום שלם ולהחזיק ביחד חלבונים שאינם מורכבים, בעוד חזק מדי ניקוי יכול להרוס מכלולי חלבון. גורמים נוספים, כגון נוכחות של סידן או הכלמונים, יכולים להשפיע באופן דרמטי על הדגים ויש לשקול בזהירות לפני הקרנת נוגדנים שיכללו בפאנל QMI. בניסויים של IP-מערביים, תנאי הפירוק ממוטבים בדרך כלל לכל אחד מדגים על בסיס מקרה אחר, אך התנאים הטובים ביותר לגילוי דגים בודדים עשויים לא לתרגם לדגים אחרים באותה רשת חלבונים22. בחירת חומרי ניקוי מציגה דילמה עוף ביצה, בכך מאגר לפירוק צריך למסך מועמדים הנוגדן, אבל פאנל של נוגדנים נדרש כדי למסך עבור מאגר פירוק המתאים. בעוד לא פתרון מושלם, ניתן לבחור פאנל קטן של חרוזים וזונדים כי הם בעלי עניין מיוחד ו/או יש להכיר אסוציאציות או הפסקות בתגובה לגירוי, ובדיקת ההתנהגות שלהם בתנאי פירוק שונים על חרוזי CML שמשת בתחילה לסינון נוגדנים (שלב 1.1.3). חומר ניקוי אידיאלי צריך לאפשר הן זיהוי אמין של דגים ולכידה של התנהגות החלבון הידוע הפיזי (התאגדות/דיסוציאציה) עם גירוי נתון. אם יש חשש כי כביסה אינה מסיסות לחלוטין הקרומים, נוגדן שליטה שלילי ניתן להוסיף כי רק לתת אות אם שני חלבונים קושרו על ידי קרום24. כאשר מאגרי הליזה המתאימים נבחרים, שינויים באינטראקציות אף חלשות-כגון אלה שבין קינאז ומצע-ניתן לזהות באופן אמין (למשל TCR-LCK)14.

העבודה הקודמת באמצעות QMI בנוירונים ותאי T יש שניהם אישר בקפידה ממצאים קודמים כדי להגביר את הביטחון בתוקף של תוצאות QMI, ושנוצר השערות חדשות שהובילו תגליות על התמרה אותות ומסלולים המחלה. בעתיד, QMI יכול להיות מותאם לרשתות אחרות אינטראקציה חלבונים והתרחב עד 500 חלבונים עם מחלקות מיקרוספירה הנוכחי זמין. באמצעות QMI ללמוד כיצד רשתות של מתחמי מולטי חלבון שינוי תגובה גירויים כפי שהם שליטה תהליכים סלולריים יש את הפוטנציאל להניב תובנות חשובות הן בריאות והן מחלות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין קונפליקטים של עניין לגלות.

Acknowledgments

המחברים רוצים להכיר את טסה דיוויס לתרומות חשובות לפיתוח שיטת QMI, וחברים נוכחיים ולשעבר של מעבדות סמית ' ו-Schrum להדרכה טכנית ולקלט אינטלקטואלי. עבודה זו ממומנת על ידי NIMH מענקים R01 MH113545 ו R00 MH 102244.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well flat bottomed plates Bio Rad 171025001
96-well PCR plates VWR 82006-704
Bioplex 200 System with HTF Bio Rad 171000205 modiefied to keep partially refrigerated, see Figure S1 for details
Bio-Plex Pro Wash Station Bio Rad 30034376
BSA Sigma
CML beads Invitrogen C37481
EDTA Sigma E6758
EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin Thermo Scientific A39256
MagPlex Microspheres Luminex MC12xxx-01 xxx is the 3 digit bead region
Melon Gel IgG Spin Purification Kit Thermo Scientific 45206 used for antibody purification
MES Sigma M3671
Microplate film, non-sterile USA Scientific 2920-0000
Phosphotase inhibitor cocktail #2 Sigma P5726
Protease inhibitor cocktail Sigma P8340
Sandwich Prep Refrigerator Norlake SMP 36 15 for custom refrigeration of Bioplex 200
Sodium fluoride Sigma 201154
Sodium orthovanadate Sigma 450243
Streptavidin-PE BioLegend 405204
Sulfo NHS Thermo Scientific A39269
Tris Fisher Scientific BP152

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pawson, T., Nash, P. Protein-protein interactions define specificity in signal transduction. Genes and Development. 14 (9), 1027-1047 (2000).
  2. Rodríguez-Jorge, O., et al. Cooperation between T cell receptor and Toll-like receptor 5 signaling for CD4. Science Signaling. 12 (577), (2019).
  3. Bugaj, L. J., et al. Cancer mutations and targeted drugs can disrupt dynamic signal encoding by the Ras-Erk pathway. Science. 361 (6405), (2018).
  4. Pawson, T. Dynamic control of signaling by modular adaptor proteins. Current Opinion in Cell Biology. 19 (2), 112-116 (2007).
  5. Hamm, H. E. The many faces of G protein signaling. Journal of Biological Chemistry. 273 (2), 669-672 (1998).
  6. Lohse, M. J., Hofmann, K. P. Spatial and Temporal Aspects of Signaling by G-Protein-Coupled Receptors. Molecular Pharmacology. 88 (3), 572-578 (2015).
  7. Eltschinger, S., Loewith, R. TOR Complexes and the Maintenance of Cellular Homeostasis. Trends in Cell Biology. 26 (2), 148-159 (2016).
  8. Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (2), 99-111 (2005).
  9. Komarova, N. L., Zou, X., Nie, Q., Bardwell, L. A theoretical framework for specificity in cell signaling. Molecular Systems Biology. 1, 23 (2005).
  10. Schrum, A. G., Gil, D. Robustness and Specificity in Signal Transduction via Physiologic Protein Interaction Networks. Clinical and Experimental Pharmacology. 2 (3), (2012).
  11. De Las Rivas, J., Fontanillo, C. Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks. PLoS Computational Biology. 6 (6), 1000807 (2010).
  12. Ron, D., Walter, P. Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (7), 519-529 (2007).
  13. Bogdan, A. R., Miyazawa, M., Hashimoto, K., Tsuji, Y. Regulators of Iron Homeostasis: New Players in Metabolism, Cell Death, and Disease. Trends in Biochemical Sciences. 41 (3), 274-286 (2016).
  14. Smith, S. E., et al. Multiplex matrix network analysis of protein complexes in the human TCR signalosome. Science Signaling. 9 (439), 7 (2016).
  15. Schrum, A. G., et al. High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry. Science's STKE. 2007 (389), (2007).
  16. Brown, E. A., et al. Clustering the autisms using glutamate synapse protein interaction networks from cortical and hippocampal tissue of seven mouse models. Molecular Autism. 9 (1), 48 (2018).
  17. Lautz, J. D., Brown, E. A., Williams VanSchoiack, A. A., Smith, S. E. P. Synaptic activity induces input-specific rearrangements in a targeted synaptic protein interaction network. Journal of Neurochemistry. 146 (5), 540-559 (2018).
  18. Smith, S. E., et al. Signalling protein complexes isolated from primary human skin-resident T cells can be analysed by Multiplex IP-FCM. Experimental Dermatology. 23 (4), 272-273 (2014).
  19. Neier, S. C., et al. The early proximal αβ TCR signalosome specifies thymic selection outcome through a quantitative protein interaction network. Science Immunology. 4 (32), (2019).
  20. Davis, T. R., Schrum, A. G. IP-FCM: immunoprecipitation detected by flow cytometry. Journal of Visualized Expiriments. (46), (2010).
  21. Smith, S. E., et al. IP-FCM measures physiologic protein-protein interactions modulated by signal transduction and small-molecule drug inhibition. PLoS One. 7 (9), 45722 (2012).
  22. Lautz, J., et al. Activity-dependent changes in synaptic protein complex composition are consistent in different detergents despite differential solubility. BioRXiv. , (2019).
  23. Langfelder, P., Horvath, S. WGCNA: an R package for weighted correlation network analysis. BMC Bioinformatics. 9, 559 (2008).
  24. Schrum, A. G., Gil, D., Turka, L. A., Palmer, E. Physical and functional bivalency observed among TCR/CD3 complexes isolated from primary T cells. Journal of Immunology. 187 (2), 870-878 (2011).

Tags

ביוכימיה סוגיה 150 IP-FCM פרוטאומניקס אינטראקציית חלבונים איתות immunoprecipitation QMI
קוונפיקציה של אינטראקציה חלבון ברשת דינמיקה באמצעות ריבוב ושות-Immunoprecipitation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brown, E. A., Neier, S. C.,… More

Brown, E. A., Neier, S. C., Neuhauser, C., Schrum, A. G., Smith, S. E. P. Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation. J. Vis. Exp. (150), e60029, doi:10.3791/60029 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter