Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Количественная оценка динамики взаимодействия белков с использованием мультиплексного со-иммунопрециации

Published: August 21, 2019 doi: 10.3791/60029
Automatic Translation
1,2, 3,4, 5, 6,7,8, 1,2,9
1Center for Integrative Brain Research, Seattle Children's Research Institute, 2Graduate Program in Neuroscience, University of Washington, 3Department of Cancer Immunology and Virology, Dana-Farber Cancer Institute, Department of Medicine, Harvard Medical School, 4Broad Institute of Harvard and MIT, 5Department of Mathematics, University of Houston, 6Department of Molecular Microbiology and Immunology, School of Medicine, University of Missouri, 7Department of Surgery, School of Medicine, University of Missouri, 8Department Bioengineering, College of Engineering, University of Missouri, 9Department of Pediatrics, University of Washington

Summary

Количественный мультиплекс иммунопрецитификации (ЗМИ) использует поток цитометрии для чувствительного обнаружения различий в изобилии целевых белково-белковых взаимодействий между двумя образцами. ЗМИ может быть выполнена с использованием небольшого количества биоматериала, не требует генетически модифицированных тегов, и может быть адаптирована для любой ранее определенной сети взаимодействия белка.

Abstract

Динамические белково-белковые взаимодействия контролируют клеточное поведение, от подвижности до репликации ДНК и сигнала трансдукции. Однако, мониторинг динамических взаимодействий между несколькими белками в сети взаимодействия белка технически трудно. Здесь мы представляем протокол количественного мультиплексного иммунопрециционного протеина (ЗМИ), который позволяет количественно оценивать изменения складов в белковых взаимодействиях на основе относительных измерений флуоресценции белков в общих комплексах, обнаруженных exposed Поверхностные эпитопы (PiSCES). В ЗМИ белковые комплексы из клеточных лисатов иммунопронифицируются на микросферы, а затем исследуются с помеченным антителом для другого белка, чтобы количественно оставить PiSCES. Иммунопрефференционные антитела спрягаются с различными спектральными областями MagBead, что позволяет цитометро потока дифференцировать несколько параллельных иммунопрециций и одновременно количественно количество антител зонда, связанных с каждым из них. ЗМИ не требует генетической маркировки и может быть выполнена с использованием минимального биоматериала по сравнению с другими методами иммунопреципции. ЗМИ может быть адаптирован атлетировал для любой определенной группы взаимодействующих белков, и до сих пор использовался для характеристики сигнальных сетей в Т-клетках и нейрональных синапсах глутамата. Результаты привели к порождению новых гипотез с потенциальным диагностическим и терапевтическим применением. Этот протокол включает в себя инструкции для выполнения ЗМИ, от первоначального выбора панели антител до беговых анализов и анализа данных. Первоначальная сборка асссея ЗМИ включает скрининговых антител для создания панели и эмпирически определение соответствующего буфера лиза. Последующий препарат реагента включает в себя ковалентно екосочетание иммунопрецитификации антител к MagBeads, и биотинилатации антител зонда, чтобы они могли быть помечены стрептавидин-конъюгированный фторофор. Для запуска асса, lysate смешивается с MagBeads ночь, а затем бисер делятся и инкубируются с различными антителами зонда, а затем флюорофор этикетки, и читать поток цитометрии. Для выявления PiSCES, которые значительно различаются между экспериментальными условиями, проводятся два статистических теста, и результаты визуализироваться с помощью тепловых карт или диаграмм узла.

Introduction

Динамические белково-белковые взаимодействия представляют собой молекулярные сигнальные каскады имотил-структуры, которые являются функциональной основой большинства клеточной физиологии 1. Эти процессы часто изображаются как линейные сигнальные пути, которые переключаются между устойчивыми состояниями на основе одного ввода, но экспериментальные и модельные данные ясно показывают, что они функционируют как интегрированные сети2,3, 4. В случае G белков, различные рецепторы часто имеют возможность активировать тот же белок G, и один рецептор может также активировать более одного типа белка G5,6. Для того, чтобы относительно небольшое количество классов белка G специально модулировать широкий спектр клеточных функций, таких как синаптическая передача, гормональная регуляция, и миграция клеток, клетки должны как интегрировать и дифференцировать эти сигналы4 , 5. Доказательства показали, что эта специфичность сигнала, для G белков, а также другие, в первую очередь происходит на основе тонко настроенных белково-белковых взаимодействий и их височной динамики1,3, 4 , 5 , 6 , 7. Поскольку сигнальные сети состоят из динамических белковых комплексов с несколькими входными данными, выходами и циклами обратной связи, одно возмущение имеет возможность изменить общий гомеостатический баланс физиологии клетки4 ,7. В настоящее время широко ели, что сигнализация должна быть рассмотрена с точки зрения сети, с тем чтобы лучше понять, как интеграция нескольких входов контролирует дискретные клеточные функции в области здравоохранения и болезни7,8, 9,10,11,12,13. В свете этого, Количественный мультиплекс иммунопреципсии (ЗМИ) был разработан для сбора средней пропускной связи, количественные данные об изменениях раза в динамических сетей взаимодействия белка.

ЗМИ является антитела основе анализ, в котором клеточный лизат инкубируется с панелью иммунопрецит антител, которые ковалентно связаны с магнитными бусинами, содержащими различные соотношения флуоресцентных красителей. Наличие специфических антител в сочетании с отдельными классами магнитного биса позволяет одновременно со-иммунопрецитировать несколько белков-мишеней из одного и того же лизата. После иммунопреципиции (IP), магнитные бусы инкубируются со вторым, фторофор-конъюгированных антитела зонда (или биотинилаповые антитела в сочетании с фторофором-конъюгированный стрептавидин). Со-ассоциации между белками, распознаемыми каждой антител-зондом IP, или PiSCES (белки в общих комплексах, обнаруженных открытыми поверхностными эпитопами), затем обнаруживаются цитометрией потока и могут быть количественно сопоставлены между различными условия выборки14. Иллюстрации на рисунке 1 показывают шаги, участвующие в запуске анализом ЗМИ, в том числе диаграмму магнитных бусин с иммунопромизированными белковыми комплексами, помеченными флуоресцентно спряженных антителами зонда (рисунок1C).

Чувствительность ЗМИ зависит от концентрации белка лизата относительно количества магнитных бусин, используемых для иммунопрециционности, и достижение разрешения для обнаружения 10% раз изменения требует лишь небольшое количество исходного материала по сравнению с другими методы совместного IP14,15. Например, количество исходного материала, используемого в ЗМИ, аналогично тому, которое требуется для сэндвича Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA), но несколько взаимодействий обнаруживаются в одном анализе ЗМИ. Анализы с использованием 20 IPs и 20 целей зонда были выполнены с использованием 1-5 х 105 первичных Т-клеток, изолированных от биопсии кожи 4 мм, Синаптосомные препараты P2 из 3 мм корональной секции мыши префронтальной коры, или 3 х 106 культивированных мышей первичной корковых нейронов14,16,17. Эта чувствительность делает ЗМИ полезным для анализа клеток или тканей с ограниченной доступностью, таких как клинические образцы.

ЗМИ может быть адаптирована для любой ранее определенной сети взаимодействия белков (при условии, что антитела доступны), и на сегодняшний день была разработана для анализа Т-клеточного рецептора антигена (TCR) сигналосомы и подмножество белков на глутаматергических синапсов в нейронах 17 Лет , 18. В исследованиях Сигнализирующих рецепторов Т-клеток, ЗМИ был впервые использован для выявления вызванных стимуляцией изменений в PiSCES, а затем, чтобы отличить аутоиммунных пациентов от контрольной группы, обнаружить эндогенные аутоиммунные сигнализации, и, наконец, для создания гипотеза, связанная с несбалансированной болезнью, связанной с подсетью взаимодействий14. Совсем недавно, та же панель ЗМИ была использована для определения того, что выбор тимоцита определяется количественными, а не качественными различиями в TCR-ассоциированного белка сигнализации19. В нейронах, ЗМИ был использован для описания входной конкретной перестановки сети взаимодействия белка для различных типов входных сигналов таким образом, который поддерживает вновь возникающих моделей синаптической пластичности17. Кроме того, эта синаптическая панель ЗМИ была использована для выявления различий в семи моделях мыши аутизма, кластера моделей в подгруппы на основе их PiSCES биоподписей, и точно предположить общий молекулярный дефицит, который был ранее непризнанным в одной из моделей16. Аналогичный подход можно было бы использовать для проверки других подгрупп, которые могли бы реагировать на различные методы лечения наркомании, или назначать лекарства конкретным адаптивным подгруппам. В дополнение к фундаментальной науке, помимо фундаментальной науки, у компании «МИ» есть потенциальное применение в области диагностики, субтипирования пациентов и разработки лекарственных средств.

Для того чтобы собрать панель антитела зМИ, начальные протоколы скрининга антител и выбора описаны в разделе 1, ниже. После выявления панелей антител в разделе 2 описаны протоколы спряжения выбранных антител к магнитным бусинам для ИС и биотинилации выбранных антител зонда. Протокол для запуска анализа ЗМИ на лисаты клеток или тканей описан в разделе 3. Наконец, поскольку один эксперимент может генерировать отдельные точки данных в размере 5 х 10 5, в разделе 4 предусмотрены инструкции и компьютерные коды для оказания помощи в обработке данных, анализе и визуализации. Обзор рабочего процесса, описанного в разделах 2-4, показан на рисунке 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Ассаи дизайн

  1. Препарат антитела кандидата
    1. Для каждого интересуемого белка выберите от 3 до 5 антител для проверки. Когда это возможно, используйте моноклональные антитела, которые распознают различные эпитопы. Также включите одно неспецифическое антитело управления.
    2. Чтобы удалить Tris, выполните буферный обмен, добавив антитела к 30 kDa спин-фильтр, спиннинг до минимального объема, добавив 500 злител фосфат-буферных солив (PBS), и повторять 3 раза. Чтобы удалить белки носителя, выполняйте очистку антител в соответствии с протоколом производителя (см. Таблицу Материалов для конкретной рекомендации по очистке).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это делается потому, что белки и буферы носителей со свободными группами амина (такие как Tris) будут реагировать с группами COOH и утолять последующие реакции соединения бисера и биотиниляции. Убедитесь, что все антитела очищены (без переносимых белков) и в буфере, свободном от первичных аминов (т.е. нет Tris).
    3. Пара каждого антитела к карбоксилат модифицированный латекс (CML) бусы, как описано Дэвис и Шрум20. Для сохранения антител, смазать вниз бисера сцепления реакций до 1/5 (т.е., 3,6 х 106 бусин с 10 л 0,2-1 мг/мл антитела).
    4. Оцените цифры бисины с помощью гемоцитометра (обычно 108/мл) и храните при 4 градусах Цельсия. Бусы хранятся в течение года и успешно используются в анализах ЗМИ, но срок годности или срок годности не были официально установлены. NaN3 в буфере B/S предотвращает рост бактерий.
    5. Биотинилат часть каждого антитела (см. раздел 2.2 ниже). Хранить при 4 градусах по Цельсию.
    6. Подтвердите эффективное соединение шарика CML и точный подсчет путем окрашивания 1 х 105 шариков с PE-конъюгированных антител реактивной к виду, в котором антитела были подняты и чтения на поток цитометра.
    7. Подтвердите биоинфиниляцию антител точечной подоплеки с помощью стрептавидидина-HRP.
    8. После того, как лаборатория создала реагенты, которые, как известно, являются эффективными, используйте эти реагенты в качестве положительного контроля в подтверждение реакции в шагах 1.1.5 и 1.1.6.
  2. Скрининг антител IP-FCM (иммунопрецит, обнаруженный цитометрией потока)
    1. Принять решение о соответствующем скрининговом лизате. Для этого и всех других предварительных этапов скрининга (все, что включено в этот раздел 1: Анализ Дизайн), не используйте биопробы с ограниченной доступностью. Вместо этого выберите сопоставимый контрольный материал, такой как ткань мыши дикого типа, клеточные линии или нормальная донорская ткань человека, которая не является ограничивающим ресурсом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор буфера lysis для этого асссе не тривиальны, и обсуждается в разделе 1.5: Отбор детергента, а также в предпоследнем абзаце раздела Обсуждение. Стандартные буферы лисиса имеют базу 150 мМ NaCl, 50 мм Трис (pH 7.4), 10 мМ фторид натрия, 2 ММ ортованадат, протеазы и ингибиторы фосфатазы коктейли. Детергенты совместимы с ЗМИ включают 1% NP-40, 1% Digitonin, 0,1-1% Тритон X-100, и 0,5-1% дезоксихолита14,16,17,18,19,21.
    2. Рассчитайте общий объем lysate, который будет использоваться для каждого IP, используя 10 Зл для каждой комбинации IP-зонда для проверки. Если скрининг X зонд антител и с помощью одного управления IgG, каждый IP будет использовать (X '1) ( (10 л) (1,1 для трубачной ошибки); Х-1 должен учитывать необходимый контроль зонда IgG. Например, на экране антител 3x3 каждый IP должен использовать 44 ul. Не забудьте включить IP-контроль IgG (см. пример настройки скрининга на рисунке 2).
    3. Рассчитайте номер cML биса, который будет использоваться. Если вы скрининг X зонд антител, используйте (X'1) 5 х 104 бусины. В идеале, 5000 шариков на хорошо приведет к йgt;2,000 шариков на хорошо читается цитометр потока. Например, на экране антител 3 x 3 каждый IP должен использовать 20 000 шариков, что составляет примерно 0,66 л подготовленных запасов шариков CML со ступени 1.1.3 (бусы должны сначала быть количественно с помощью гемоцитометра для обеспечения точности).
    4. Инкубировать объем lysate от шага 1.2.2 с объемом каждого шарика CML, который будет экранирован от шага 1.2.3, на ночь при 4 c с вращением для того чтобы предотвратить шарики от устанавливать. Как правило, выполнять инкубации в первой колонке 96-хорошо ПЦР пластины, и крышка с ПЦР прокладки прокладки.
    5. Спин вниз CML бусы на 3200 х г в течение 1 мин и удалить лизат одним, быстрым щелчком пластины над раковиной. Крошечные белые гранулы должны быть видны в нижней части каждого хорошо как до, так и после щелчка.
    6. Resuspend CML шарики в объеме буфера FlyP, чтобы равняться 20 зл для каждой пары бисера зонда; для антител зонда X, используйте (X'1) ( 20 л) (1,1 для ошибки трубачки), подобно шагу 1.2.2. Для экрана 3 x 3, повторно приостановите в 88 зл. FlyP буфер 100 мМ NaCl, 50 мм Tris рН 7,4, 1% BSA, 0,01% NaN3.
    7. Распределите каждый IP-адрес по скважинам 96-угольной пластины ПЦР, где X является числом проверяемых антител зонда, используя 20 Л/ну. Рисунок 2 На примере настройки скрининга.
    8. Вымойте 2 дополнительных раза, используя 200 л буфера FlyP на скважину. Спин пластины, как в шаге 1.2.5 и Флик пластины для удаления мыть буфера после каждой стирки. Пеллеты будут очень маленькими, но должны быть видны после каждой стирки.
    9. Для каждого биотиниляционного антитела, подаренного, вычислите общий объем как (Y-1) - 1,1 и 50 л, где Y является числом ис.п. антител, скринингуенных. Разбавить антитела к рабочей концентрации в этом объеме буфера FlyP, как правило, начиная с 1:100 разбавления 0,5 мг/мл запасов.
    10. Распределите каждое разбавленное антитела вниз каждый столбец пластины 96 хорошо, и обеспечить CML шарики resuspended.
    11. Инкубировать при 4 градусах по 1 ч, либо с вращением или пайпеткой с интервалом 15 минут, чтобы обеспечить, чтобы CML шарики оставались в подвеске.
    12. Вымойте 3x в 200 л буфера FlyP, для каждой центрифуги стирки и удалить лизат, как в шаге 1.2.5.
    13. Отдохните все шарики CML в 50 л 1:200 Стрептавидин-PE в буфере FlyP.
    14. Инкубировать при 4 градусах по Цельсию в темноте в течение 30 мин.
    15. Вымойте 3x в 200 л буфера FlyP, для каждой центрифуги стирки и удалить лизат, как в шаге 1.2.5.
    16. Повторно едкните в 200 зл буфера FlyP, а затем запустить на поток цитометра.
  3. Выбор антител для включения в ассай
    1. Ворота на размер с помощью FSC-H против SSC-H, и устранить дублеты с помощью FSC-H против FSC-A.
    2. Генерировать гистограммы интенсивности ФЛуоресценции PE и наложения обоих элементов управления IgG (IgG бис-тест зонд, тест бис-IgG зонд) на испытания пар (Рисунок 2).
    3. Ищите бисо-зонд пара, которая дает четкий сигнал над шумом(Рисунок 2B). Кроме того, это не идеально, чтобы использовать те же антитела для биса и зонда. Дифференциальное распознавание эпитопов максимизирует шансы наблюдения за взаимодействиями, поскольку некоторые эпитопы могут быть окклюзии в некоторых белковых комплексах. Если нет приемлемых вариантов, повторите экран с дополнительными антителами.
  4. Подтверждение специфики антител
    1. Для обеспечения специфичности антител для намеченных целей используйте образец лизата, в котором цель была выбита; например, мышь нокаута или линия ячейки РНК. Кроме того, используйте лизат из целевой отрицательной клеточной линии, в которой был искусственно выражен целевой белок.
    2. Выполните IP-FCM, как описано в шаге 1.2, изменяя в соответствии с экспериментом.
  5. Отбор детергента
    1. Поскольку моющие средства имеют решающее значение в экспериментах по совместному IP, эмпирически тестируют различные вариации, чтобы убедиться, что анализ имеет максимальную вероятность обнаружения изменений. Для начала выберите относительно небольшую панель взаимодействий (4-8), которые, как известно, меняются в данном состоянии и/или представляют особый интерес для вашего исследования.
    2. Используя нефлуоресцентные, антитела-конъюгированные cML бусы, сделанные для начальных экранов, выполнять IP-FCM, как описано в 1.2 с использованием разнообразных условий моющего средства буфера лисиса. Экраны детергента могут быть выполнены с моющим средством в качестве единственной переменной, или с различными условиями клеток для каждого моющего средства. Всегда используйте элементы управления IgG как для бисера, так и для зондов, так как моющие средства иногда производят неожиданный фон в некоторых комбинациях IP-зондов.
    3. На основе МФО с экрана, выбрать моющее средство, которое оптимизирует сигнал для PiSCES интереса. Вполне вероятно, что некоторые компромиссы должны быть сделаны22.

2. Подготовка реагента Multiplex

  1. Соединение магнитного биса
    1. Используя карту области магнитного биса, выберите области биса для использования в шаблоне, который сводит к минимуму риск перекрестного обнаружения. Магнитный бис обычно смазать и вправо, так что избегайте биса регионов, которые по диагонали смежных. Рекомендуется бисер из любой другой колонки диаграммы бисера, показанной на веб-сайте Luminex (https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/).
    2. Подготовьте антитела без переносчиков на уровне 0,1 мг/мл в PBS (как в 1.1.2) в 250 зЛ. Держите на льду для последующего использования.
    3. Вихрь магнитные бусы широко, а затем aliquot 250 зл в янтарь микроцентрифуг трубки (для защиты бисера от фотоотбелевания).
    4. Магнитно отдельные магнитные бусы на 60 с и удалить супернатант.
    5. Добавьте 250 кл. буфера МЧС (50 мМ ММ MES pH 6.0, 1 mM EDTA), вихрь, магнитно отделяющийся на 60 с, и удалите супернатант. Повторите и повторно магнитные бусы в 200 зл буфера MES.
    6. Добавьте 40 мг МЧС к 2 мг одноразовой трубки Sulfo-NHS, чтобы сделать 50 мг/мл бульона.
    7. Добавьте 25 л свежеприготовленных Sulfo-NHS к магнитным бусинкам. Вихрь.
    8. Добавьте в буфер МЧС 25 л 50 мг/мл свежерастворенного EDAC No1-этил-3-(-3-диметиламинопропил) карбодиимидного гидрохлорида, также называемого EDC. Вихрь.
    9. Накройте крышкой и встряхните на вихре с трубкой-держащей креплением в течение 20 минут при комнатной температуре, 1000 об/мин.
    10. Магнитно отделить на 60 с и удалить супернатант.
    11. Повторно езбитая в 500 Л PBS, вихрь, магнитно отделяется на 60 с и удалите супернатант. Повторите.
    12. Повторное в 250 л раствора антител от шага 2.1.2. Вихрь.
    13. Инкубировать 2 ч при комнате темп с тряской на вихре при 1000 об/мин.
    14. Добавьте 500 л PBS к магнитным бусинкам, вихрю, магнитно отделяем на 60 s, и удалите супернатант.
    15. Добавить 750 qL блокирования / хранения (B / S) буфер (1% BSA в PBS рН 7,4, 0,01% NaN3). Накрыть крышкой и инкубировать 30 мин при температуре в комнате, 1000 об/мин.
    16. Магнитно отделить на 60 с и удалить супернатант. Повторное действие в 100 кл.л буфера B/S.
    17. Хранить при 4 градусах по Цельсию. Бусы хранятся в течение года и успешно используются в анализах ЗМИ, но срок годности или срок годности не были официально установлены. NaN3 в буфере B/S должен предотвратить рост бактерий.
    18. Проверить магнитное соединение шарика путем окрашивания 0,25 л соединенных магнитных бусин оков с флуоресцентными анти-хост видов вторичной и чтения на цитометр потока, как и в шаге 1.1.5.
  2. Биотинилаация
    1. Убедитесь, что антитела находятся в PBS без белка перевозчика.
    2. Рассчитайте общее количество мкг антител, которые будут биоинтиниляции (100-200 мкг рекомендуется для использования в мультиплексе, 25-50 мкг рекомендуется для скрининга).
    3. Приготовьте свежий 10 мМ сульфо-NHS-биотин (можно сделать, добавив 224 л дДГ2O в трубку без взвешивания 1 мг).
    4. Добавьте 1 кЛ 10 мМ сульфо-NHS-биотина на 25 мкг антител, вихря или пипетки вверх и вниз, чтобы смешать.
    5. Инкубировать при температуре номера 1 ч.
    6. Инкубировать при 4 градусах по Цельсию на 1 ч.
    7. Используйте 30 kDa спин-фильтр, чтобы удалить несвязанный биотин и остановить реакцию. Добавьте 500 л PBS и закрутите столбец до тех пор, пока не будет достигнут минимальный объем. Добавьте 500 кл дополнительных PBS и повторите для 3 общих буферных обменов.
    8. Оцените концентрацию путем измерения абсорбции 1-2 л на спектрофотометре, а затем довести концентрацию антител до 0,5 мг/мл.
    9. Хранить при 4 градусах по Цельсию.

3. Количественный мультиплекс иммунопреципсии

  1. Планировка плиты
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот анализ лучше всего работает при выполнении с использованием 96-колодец пластин и 2-4 образцов условий.
    1. Всегда запускайте соответствующие элементы управления (т.е. стимулируемые против нестимулированных клеток) на одной пластине для обнаружения изменений между условиями. Распределите каждый образец горизонтально по пластине и используйте каждый столбец для различных антител зонда. Набор технических повторов для каждого зонда должен быть запущен сразу после первого набора. Нарисунке рисунок 3 можно например.
    2. Тщательно задокументируйте макет пластины, чтобы облегчить точную загрузку пластини и анализ.
  2. Подготовка образцов и иммунопрецит (День 1)
    1. Лисы ткани или клетки в соответствующих моющих средств с протеазой и ингибиторами фосфатазы и инкубировать на льду в течение 15 минут. Позаботьтесь, чтобы держать лизат холодным во все времена.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Точное количество указаний биоматериала и лизат ной концентрации белка должны быть эмпирически определены, и некоторые примеры ранее использованных образцов перечислены в третьем пункте введения. В целом, в диапазоне 200 кЛ 2 мг/мл белка на образец был успешным в прошлом для 20 IP и 20 целей зонда, но идеальные входы для каждой панели антител и типа клеток или ткани должны быть определены эмпирически.
    2. Спин вниз при 4 градусах по Цельсию в течение 15 мин при 16 000 х г для удаления мембран и мусора; держать супернатант, как lysate.
    3. Выполните BCA анализ или аналогичные для определения концентрации белка, а затем нормализовать концентрацию белка между образцами. При использовании клеток, начните с равного количества клеток на состояние и нормализации является необязательным.
    4. Подготовьте мастер магнитной смеси шарика, который содержит 250 магнитных бусин каждого класса в хорошо в ходе асссе. Отрегулируйте номера шарика после анализа данных так, чтобы в будущем анализы в среднем 110 бусин каждого класса будут читаться в скважине.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пример расчета: (Новый объем биса) Объемы биса должны корректироваться таким образом примерно каждые 8 пробежек или по мере необходимости. Как правило, 3-4 л каждого магнитного биса (подготовленного как указано выше) используются для 2-плитного эксперимента.
    5. Вымойте магнитную смесь биса 2x в буфере FlyP с магнитным разделением, а затем повторно в буфере FlyP. Для повторной приостановки используйте 10 л л на образец на тарелку. FlyP буфер 100 мМ NaCl, 50 мм Tris рН 7,4, 1% BSA, 0,01% NaN3.
    6. После тщательного вихря магнитной смеси бисера, aliquot 10 qL в ледяные микроцентрифугные трубки (одна трубка на образец). Добавьте равные объемы лизата (с нормализованными концентрациями) к каждой трубке для иммунопрецициции.
    7. Aliquot лизатно-магнитной смеси биса в одну трубку для каждой пластины запускаются; например, для 2-плитного эксперимента разделите лизат на две трубки. Поместите трубки на ротатор при температуре 4 градусов цельсия на ночь для иммунопрецицитария, покрытые, чтобы не допустить света.
  3. Запуск асссе (День 2)
    1. Начните с лисат-магнитных трубок биса для плиты #1. Используйте магнитную стойку шарика для удаления лисата из магнитных бусин, и резерва lysate для будущего анализа. Вымойте бисер 2x в 500 л ледяного буфера FlyP. Держите трубки всегда на льду или при 4 градусах Цельсия.
    2. Рассчитайте объем повторной подвески как (количество зондов) ( 2 технических репликации) Resuspend IPs в расчетном объеме ледяного буфера FlyP.
    3. После тщательной повторной приостановки магнитных бусин нежных пипеток, распределить 25 л на хорошо через плоским дном 96 хорошо пластины, на льду.
    4. В другой 96-колодчатой пластине, разбавлять биоинтинилатированные антитела зонда до 2x рабочей концентрации (рабочая концентрация, как правило, 1:100 или 1:200, эмпирически определяется) в буфере FlyP так, что их порядок соответствует столбцов на макет елейной пластины (см. Рисунок Рисунок 3 ). Окончательный объем зондовых антител в рабочей концентрации составит 50 л на скважину, поэтому объем каждого 2x подготовленных антител должен быть (25 кЛ)
    5. Используйте многоканальный пипетку для распределения 25 зл и разбавления антитела каждого зонда в магнитно-содержащую доску.
    6. Встряхните на горизонтальной пластине шейкер, чтобы смешать и resuspend магнитные бусы, а затем инкубировать при 4 c в течение 1 ч, встряхивая при 450 об/мин в темноте.
    7. Вымойте 3x с буфером FlyP на магнитной пластине шайбу при 4 градусах Цельсия.
    8. Приостановите действие магнитных бусин в 50 л от 1:200 Стрептавидидин-ПЭ.
    9. Встряхните, чтобы смешать и resuspend бисер, а затем инкубировать при 4 кв кв в течение 30 минут, встряхивая при 450 об/мин в темноте.
    10. Вымойте 3x с буфером FlyP на магнитной пластине шайбу при 4 градусах Цельсия.
    11. Повторное действие в 125 зл буфера FlyP.
    12. Встряхните в течение 1 мин при 900 об/мин, чтобы тщательно переприопроизнять бусы.
    13. Запуск на цитометре охлажденных потоков (см. диаграмму на рисунке S1). Используйте "высокую цель RP1" настройки в потоке цитометра программного обеспечения, и стоп-условие 1000 бусин в регионе (значительно превышение числа, которое должно быть в любом отдельном колодце, чтобы предотвратить машину от остановки преждевременно) и объем выборки 80 Л.
    14. Приостановить запустить половину пути через и resuspend бусы, чтобы предотвратить урегулирование.
    15. Экспортные файлы данных в формате .xml.
    16. Повторите процесс для остальных пластин, начиная с шага 3.3.1.

4. Анализ данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Код АНК был разработан для сравнения двух условий из экспериментов N и 4, каждое из которых имеет 2 технических повтора для каждого состояния. Например, клетки стимулируются четыре независимых раза, ЗМИ работает в четыре разных дня на контроль (нестимулированных) и стимулированных клеток, с техническими репликациями, как указано выше, и анализ данных продолжается, как описано ниже.

  1. Адаптивный непараметрический с регулируемым альфа-отсечением (ANC)
    1. Откройте MATLAB и установите активный каталог в папку, содержащую компоненты программы ANC и файлы .xml, экспортированные из цитометра потока.
    2. Заполните файл "ANC ввода", чтобы отразить детали экспериментального дизайна. Пример файла, включенного в дополнительный файл, был предварительно заполнен для запуска также предоставленных данных примера.
    3. Запустите программу, которая напишет файл .csv в активный каталог. Файл сообщает PiSCES, которые значительно отличаются, на ложноположительном (альфа) уровне 0,05, между контрольными и экспериментальными условиями, во всех 4 экспериментальных репликациях, или по крайней мере 3/4 репликации.
    4. Обратите внимание на "ANC хитов", которые определяются как PiSCES со значительными различиями, по крайней мере 3 экспериментальных реплик, представленных как 3 /4 '4'4 в файле, для использования в шаге 4.3.1.
  2. Анализ взвешенной корреляции сети23 (CNA)
    1. Вставьте-переносите заголовки столбцов вывода файла данных Matlab, заканчивающиеся в "МФИ. CSV" в первый ряд нового листа Excel. Добавьте столбцы "эксперимент" для числа экспериментов и "лечение", для экспериментального лечения или любых других переменных, которые должны быть проанализированы. Сохранить этот файл как "traits.csv".
    2. Откройте студию R и установите рабочий каталог в папку, содержащую «МФТИ. CSV" и "TRAITS. CSV" файлы.
    3. Выполнить команды R, как указано в прокомментированный файл команды и подробно в инструкции, включенные в файлы. Модули WCNA, значительно коррелированные с каждой экспериментальной чертой, выходят как графический файл, и корреляция каждого взаимодействия IPi'ProbeJ с каждым модулем выводится как файл .csv.
    4. Обратите внимание, "CNA хитов", которые определяются как взаимодействия с модулем членства (MM) 0,7 и стр lt; 0,05 для членства в модуле, который был определен как значительно коррелирует с экспериментальной переменной интереса, для использования в шаге 4.3.1.
  3. Положительные «хиты» и визуализация
    1. Для каждого взаимодействия в списке "3/4" 4/4 хитов в выходном файле ANC (от шага 4.1.4) определите, является ли это взаимодействие также «ударом CNA» путем проверки выходного файла CNA (см. шаг 4.2.6). Создайте новую колонку, которая указывает, является ли каждый удар ANC также хитом CNA.
    2. Рассчитайте среднее значение изменения2 раза для каждого удара ANC и CNA, усреднев значения, приведенные в таблице вывода ANC "Hits.csv" с шага 4.1.3. Преобразуйте значения для изменения2 раз перед усреднением. Для взаимодействий, которые были значительными только в 3/4 репликации, удалите значение выброса.
    3. Сделайте электронную таблицу с каждым попаданием ANC CNA, указанным в виде IP в одной колонке, зондом во второй колонке и значением изменения складки в третьей колонке. Используйте эту таблицу для создания диаграммы узла края в Cytoscape путем импорта файла в качестве сети.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Скрининг антител
Рисунок 2 B показывает результаты экрана для белка Connexin36. Большинство комбинаций IP-зондов не производят сигнала над элементами управления IgG. IP с моноклональным антителом 1E5 и зондом с 1E5 или поликлональным антителом 6200 производит сдвиг вправо в распределении биса по сравнению с контролем IgG. Здесь, IP 1E5 и зонд 6200poly были выбраны, чтобы избежать использования того же антитела, как IP и зонд, как уменьшить вероятность неспецифического белка признается двумя независимыми антителами, и увеличить вероятность обнаружения со-ассоциаций с использованием различных эпитопов. Лучше всего выбрать комбинацию IP-зонда с по крайней мере 1-2 журнал выше МФО по сравнению с IgG управления, но иногда пары производства слабых МФО, которые последовательно различаются от элементов управления могут быть использованы, если нет альтернативы определены. Рисунок 2 C показывает эксперимент проверки специфичности для комбинации 1E5-6200poly. Лисат из 293 клеток, трансфицированных плазмидой Connexin36, произвел сдвиг в правой области в 1,5-журнального свопа, в то время как нетрансинфицированные клетки перекрывались с элементами управления IgG. При подтверждении специфики пары, отрицательный контроль lysate от нокаута животных или клеточной линии без целевого белка должны иметь МФО похож на igG контроля.

Бисо-скупость
Типичная магнитная реакция контроля качества соединения магнитного бисера даст MFI 3-4 журналов выше фона, когда окрашенные со вторичным антителом спряженных к флюорофору с индексом яркости между 3 и 5 (например, PE или FITC). На рисунке 4 показана типичная реакция контроля качества, сравнивая спряжение нового магнитного бисера по сравнению со старой заменой партии.

Анализ данных
В каждом эксперименте АНК сравнивает распределение флуоресценции каждого класса магнитного бусины в каждом колодце (т.е. все возможные комбинации IP-зонда) между пользовательским управлением и экспериментальным состоянием. Он присваивает p-значение для каждой комбинации, которая отражает вероятность того, что бусы были отобраны из одинаковых популяций на основе статистики Коломогрова-Шмирнова (K-S). Затем программа вычисляет значение K-S p, необходимое для получения ложно-положительной ставки 0,05 путем корректировки для нескольких сравнений и учета технической изменчивости (различия между техническими репликациями). Определены комбинации IP-зондов (PiSCES), чей тест K-S p-value опускается ниже расчетного отсечения во всех четырех экспериментах, или, по крайней мере, 3/4 эксперимента (3/4'4/4). Так как p-значение отсечения отличаются в зависимости от этих различных уровней строгости, иногда PiSCES будут определены в 4/4, но не 3'4 '4'4, так что отдельные списки рассчитываются. Подробные уравнения АНК см. (Smith et al. 2016). 14 Подробная информация об анализе и результатах WCNA подробно обсуждается Лангфельдером идр.

Презентация данных
Анализы ANC и CNA23 проводятся для определения PiSCES, которые показывают значительные изменения складских площадок между экспериментальными условиями по крайней мере в 3/4 трассах и (2) принадлежат к модулю CNA, который коррелирует с экспериментальной переменной. Эти высокодоверные PiSCES, которые определяются двумя независимыми статистическими подходами, называются ANC-CNA PiSCES. Эти взаимодействия могут быть визуализированы как узел края диаграммы с помощью программного обеспечения с открытым исходным кодом Cytoscape(Рисунок 5)или в качестве тепловой карты с помощью R-кода и анализа инструкции, включенные в дополнительный материал (Рисунок 5b ).

Figure 1
Рисунок 1 . Обзор Количественного Мультиплекс иммунопрецисции. () Ранее проверенные антитела ковалентно соединены с различными классами магнитных бусин в отдельных реакциях. (b) Ночью белковые комплексы иммунопромизированы с помощью смеси магнитных бусинок, связанных с антителами. (c) Соиммунопромированные белки помечены антителом зонда и фторфором. (d) Магнитные бусы и помеченные белковые комплексы проходят через цитометр охлажденных потоков для количественной оценки относительного количества белков, происходящих в общих комплексах. См Рисунок S1 для схематических деталей пользовательского охлаждения. (e) Поток цитометра менеджер программного обеспечения отделяет MagBeads по классу и (f) отображает флуоресценции гистограммы от каждого региона шарика. (g) Данные экспортируются в виде файлов .xml и анализируются двумя независимыми статистическими подходами. Только PiSCES, выявленные в обоих анализах, сообщаются с помощью визуализаций диаграмм ыного и узла. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2 . Connexin 36 скрининг антител с использованием IP-FCM. (a ) IP-FCM был выполнен на мышином мозге lysate с помощью 4x4 панели Connexin 36 (Cx36) CML бусы и зонды. Лисат был иммунопроцирован с каждым ХМЛ бисиной в отдельном ряду пластины. После стихов каждая биса была распределена по своей строке, так что один зонд антитела могут быть добавлены в столбец. (b) Большинство комбинаций антител не показывают сигнала (оранжевый) на фоне IgG (серый, синий). IP-версия 1E5 с зондом 6200Poly показывает приемлемый положительный сигнал. 1E5 бис /зонд и 6200Полибиби/зонд пары каждый показать приемлемый сигнал, но это не идеально, чтобы использовать то же антитела для биса и зонда. Дифференциальное распознавание эпитопов максимизирует шансы наблюдения за взаимодействиями, поскольку некоторые эпитопы могут быть окклюзии в некоторых белковых комплексах. 6200Poly бисиня с зондом 1E5 дает сильный сигнал и был выбран для использования в мультиплекс анализ до подтверждения специфики. (c) IP-FCM с использованием пары антител Cx36, отобранных из скрининга, был выполнен на лизате 293T-клеток, трансфицированных cx36 и нетрансфицированных контроля. Существует четкий сигнал от Cx36-транс-инфицированных клеток, но не-транс-инфицированных клеток неотличимы от IgG бис/зонд управления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3 . Пример макета пластины. Мультиплекс с 4-кондицией установлен в 96-хорошей пластине. Образцы 1-4 загружаются в последовательные ряды (каждый биологический образец представлен здесь другим цветом), а технические репликации загружаются в том же порядке в следующих 4 рядах. На одну колонку используется один зонд. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4 . Типичная реакция контроля качества, сравнивая спряжение нового MagBead по сравнению со старой заменой партии. Бисом дает МФО 2-4 журналов выше фона, и новая партия имеет МФО похож на старый пакет. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5 . ЗМИ определяет синаптические PiSCES, которые изменяются в величине после 5 минут стимуляции NMDA в культивированных корковых нейронов. Эксперимент зМИ сравнил NMDA стимулировали против нестимулированных (контроль ACSF) нейронов. Представлены PiSCES, которые были выявлены как анализами АНК, так и CNA. () В узловой края диаграммы производится с использованием программного обеспечения с открытым исходным кодом Cytoscape, узлы указывают на антитела целей (белки), которые были включены в качестве IPs и зондов в панели ЗМИ. Края представляют ANC-CNA PiSCES, с цветом и толщиной края, указывающими направление и величину складных изменений между обработкой NMDA и контролем. В цифру не включены PiSCES, которые не изменились между NMDA и условиями контроля. (b) Тепловая карта, произведенная в R с использованием функции Heatmap.2, представляет ту же функцию ANC и CNA PiSCES. ComBAT-нормализованные значения2 МФО нормализуются по строке для учета данных, охватывающих 3 журнала, а относительная МФО для каждой экспериментальной репликации показывает относительную величину и последовательность каждого сообщенного PiSCES. Данные и код, необходимые для воспроизведения этих цифр, включены в дополнительный файл. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Supplementary Figure 1
Рисунок S1: Диаграммы пользовательского охлаждения системы цитометрии потока. Считыватель массива цитометра потока должен храниться при комнатной температуре, но нижняя часть (микроплитная платформа) должна быть охлаждена для поддержания PiSCES во время анализа. Смотрите таблицу материалов для модели информации о потоке цитометра и сэндвич prep холодильник используется. () Верхние вложения и контейнеры для хранения продуктов питания были удалены из холодильника подготовки бутерброда. Платформа микроплиты была помещена на металлические опоры, предназначенные для хранения пластиковых контейнеров для хранения продуктов питания. Пластиковый корпус платформы микроплиты был удален, чтобы сделать его пригодным. Пользовательские оргстекла платформа была построена с измерениями показано в (б) для покрытия верхнего отверстия холодильника. Плексиглас был изолирован с 1 / 2 "пены изоляции сократить в соответствии с размером плексигласа, и запечатал разрыв с изоляционной лентой. Отверстие было затем пробурено через плексиглас, чтобы образец иглы из потока цитометра анализ читателя для доступа к платформе микроплиты при продлении. Черное устройство соединения, которое было первоначально привинчены в верхней части платформы микроплиты был удален, и привинчены обратно в микроплиту платформы сверху плексигласа, который помогал в выравнивании. Дверь в крышке plexiglass обеспечивает доступ к микроплите носителя, когда она вытянута из устройства. Обратите внимание, что программное обеспечение цитометра потока будет предупреждать пользователя о том, что носитель пластины слишком холоден, но пользователь может переопределить предупреждение и запустить охлажденные эксперименты по ЗМИ. (c) Фотография собранной системы. (d) Деталь переднего правого угла, как нарисовано в (a), показывая агрегат крышки плексигласа и изоляции. (e) Деталь образца иглы выровнены над отверстиями. (f) Деталь бритого вниз раздел изоляции, который позволяет поток воздуха под устройством. (g) Деталь открытой двери, показывающая цитометр цитометра платформы ниже. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Supplementary File
Дополнительный файл. Данные и код, необходимые для воспроизведения этих цифр. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Анализ ЗМИ требует значительных инвестиций в разработку антител панели, оборудование и реагенты, но как только анализ установлен, можно собирать высокомерные данные наблюдения белковых сетей взаимодействия, как они реагируют на экспериментально контролируемых Стимулы. Технически, ЗМИ требует тщательного пипетки и отслеживания образцов и антител хорошо местах. Тщательная маркировка анализ пластин полезно, как делает подробный шаблон хорошо местах на бумаге, которая затем сохраняется для анализа данных. Важность сохранения бисера и лисата холодной во все времена, в том числе в потоке цитометра микроплиты перевозчика (см. Рисунок S1 для пользовательских инструкций охлаждения) не может быть завышена. Белковые взаимодействия быстро разъединяются при комнатной температуре, а ранние попытки использования неизмененного цитометра потока комнатной температуры закончились идентификацией многих температурно-лабильных взаимодействий, но не тех, которые изменились с предназначенным Стимуляции.

ЗМИ является антитела основе ассе, так что первоначальный выбор антител имеет решающее значение. Моноклональные или рекомбинантные антитела следует использовать по возможности для уменьшения изменчивости результатов. Поликлоналы показывают много-к-много изменения, но пептид основе поликлоналов на короткий эпитоп, кажется, относительно стабильна с течением времени. Дрифт можно свести к минимуму, покупая большие партии антител; это также позволяет для заказных антител без перевозчика, что исключает необходимость очистки антител с помощью дыни гель и спина столбцов, и связанные с потерей антител.

Важно также отметить, что, поскольку обнаружение сигнала зависит от доступных эпитопов, отсутствие сигнала не обязательно указывает на отсутствие взаимодействия, ограничение, которое является общим для других методологий взаимодействия белка. 14 Далее, когда сигнал обнаружен, невозможно однозначно определить погоду взаимодействия белка является прямым (A взаимодействует с B) или косвенным (A взаимодействует с X и Y, которые затем взаимодействуют с B), поэтому наблюдаемые взаимодействия называют PiSCES, а не белково-белковые взаимодействия (PPI), которые могут подразумевать прямое связывание. Ограничение всех антител на основе методов, которые следует иметь в виду, что добавление антител может нарушить или стабилизировать белковые комплексы. Еще одно ограничение использования цитометрии потока, а не западные помарки является то, что размер информации для подтверждения антитела специфичность не доступна. Чтобы преодолеть это ограничение, igG элементы управления используются в скрининге каждой пары антител, и специфика подтверждается нокаутом или стук в клеточных линий или животных, прежде чем приступить к экспериментам ЗМИ (раздел 1.4).

Элементы управления IgG не используются в анализе ЗМИ, потому что каждый IgG производит различный уровень фонового сигнала, что делает невозможным узнать правильное фоновое значение для вычитания. Например, если IP (X) зонд IgG дает МФО 100 и IP IgG'probe Y дает МФО 200, какое фоновое значение должно быть вычтено из IP X'probe Y? Аналогичным образом, иногда невыявленные взаимодействия (например, зонд IP X) будут иметь более низкую МФО, чем неспецифические взаимодействия IgG. Для учета этого ограничения не зная абсолютного сигнала МФО, PiSCES не сообщается исключительно для обнаружения выше произвольного фонового уровня. Вместо этого, только PiSCES, которые меняются в ответ на данную стимуляцию, сообщается. Хотя высокий УММ может быть вызван неспецифическим шумом, этот шум не будет меняться при стимуляции. Кроме того, часть (10-20%) наблюдаемых взаимодействий, зависящих от условий, обычно подтверждаются вторым методом, как правило, IP-западным. Это подтверждение аналогично подтверждению результатов секвенирования РНК высокой пропускной способностью с RT-PCR и призвано повысить достоверность результатов ЗМИ.

Экспрессионные эффекты, влияющие на результаты ЗМИ, не могут быть исключены без дополнительных тестов, потому что ЗМИ не проводит различия между повышенным абсолютным уровнем белка и повышенной гомо-мультимеризацией белка. Чтобы свести к минимуму неопределенность в отношении экспрессии, эксперименты могут быть выполнены с использованием острых условий лечения с короткими сроками, которые сводят к минимуму потенциальные изменения в уровнях экспрессии белка. Другие методы необходимы, чтобы исключить экспрессионные эффекты в хронических условиях лечения или первичных образцов пациента.

Очень важно выбрать подходящий буфер лиза для ЗМИ. Слишком слабый моющего средства может оставить мембраны нетронутыми и держать вместе белки, которые не находятся в комплексе, в то время как слишком сильное моющее средство может уничтожить белковые комплексы. Дополнительные факторы, такие как наличие кальция или его хелаторов может резко повлиять на PiSCES и должны быть тщательно рассмотрены перед скринингом антител, чтобы включить в панель ЗМИ. Для IP-западных экспериментов, условия lysis обычно оптимизированы для каждого PiSCES на индивидуальной основе, но лучшие условия для обнаружения одного PiSCES не могут перевести на другие PiSCES в той же сети белка22. Детергент выбор представляет курица и яйцо дилемма, в том, что лисис буфер атследует для проверки антител кандидатов, но группа антител необходимо для проверки соответствующего буфера лиза. Хотя это и не идеальное решение, можно выбрать небольшую панель бисера и зондов, которые представляют особый интерес и / или известных ассоциаций или диссоциаций в ответ на стимул, и тестирование их поведения в различных условиях лиза на CML бусы первоначально используется для скрининга антител (шаг 1.1.3). Идеальное моющее средство должно обеспечить как надежное обнаружение PiSCES, так и перепросмотр известного физиологического белкового поведения (ассоциация/диссоциация) с заданным стимулом. Если есть какие-либо опасения, что моющее средство не полностью растворить мембраны, отрицательный контроль антитела могут быть добавлены, что бы только дать сигнал, если два белка были связаны мембраны24. При выборе соответствующих буферов лисиса изменения даже в слабых взаимодействиях, таких как между киназой и субстратом, могут быть надежно обнаружены (например, TCR-LCK)14.

Предыдущая работа с использованием ЗМИ в нейронах и Т-клеток как тщательно подтвердили предыдущие выводы для того, чтобы повысить уверенность в достоверности результатов ЗМИ, и порожденных новых гипотез, которые привели к открытиям о трансдукции сигнала и болезни путей. В будущем, ЗМИ может быть адаптирована к другим сетям взаимодействия белков и расширена до 500 белков с текущими классами микросферы доступны. Использование ЗМИ для изучения того, как изменяются сети мультибелковых комплексов в ответ на раздражители, поскольку они контролируют клеточные процессы, имеет потенциал для получения важных сведений как о здоровье, так и о болезнях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют конфликта интересов раскрыть.

Acknowledgments

Авторы хотели бы отметить Тесса Дэвис за важный вклад в развитие исследования ЗМИ, а также нынешних и бывших членов лабораторий Смита и Шрума за техническое руководство и интеллектуальный вклад. Эта работа финансировалась NIMH гранты R01 MH113545 и R00 MH 102244.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well flat bottomed plates Bio Rad 171025001
96-well PCR plates VWR 82006-704
Bioplex 200 System with HTF Bio Rad 171000205 modiefied to keep partially refrigerated, see Figure S1 for details
Bio-Plex Pro Wash Station Bio Rad 30034376
BSA Sigma
CML beads Invitrogen C37481
EDTA Sigma E6758
EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin Thermo Scientific A39256
MagPlex Microspheres Luminex MC12xxx-01 xxx is the 3 digit bead region
Melon Gel IgG Spin Purification Kit Thermo Scientific 45206 used for antibody purification
MES Sigma M3671
Microplate film, non-sterile USA Scientific 2920-0000
Phosphotase inhibitor cocktail #2 Sigma P5726
Protease inhibitor cocktail Sigma P8340
Sandwich Prep Refrigerator Norlake SMP 36 15 for custom refrigeration of Bioplex 200
Sodium fluoride Sigma 201154
Sodium orthovanadate Sigma 450243
Streptavidin-PE BioLegend 405204
Sulfo NHS Thermo Scientific A39269
Tris Fisher Scientific BP152

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pawson, T., Nash, P. Protein-protein interactions define specificity in signal transduction. Genes and Development. 14 (9), 1027-1047 (2000).
  2. Rodríguez-Jorge, O., et al. Cooperation between T cell receptor and Toll-like receptor 5 signaling for CD4. Science Signaling. 12 (577), (2019).
  3. Bugaj, L. J., et al. Cancer mutations and targeted drugs can disrupt dynamic signal encoding by the Ras-Erk pathway. Science. 361 (6405), (2018).
  4. Pawson, T. Dynamic control of signaling by modular adaptor proteins. Current Opinion in Cell Biology. 19 (2), 112-116 (2007).
  5. Hamm, H. E. The many faces of G protein signaling. Journal of Biological Chemistry. 273 (2), 669-672 (1998).
  6. Lohse, M. J., Hofmann, K. P. Spatial and Temporal Aspects of Signaling by G-Protein-Coupled Receptors. Molecular Pharmacology. 88 (3), 572-578 (2015).
  7. Eltschinger, S., Loewith, R. TOR Complexes and the Maintenance of Cellular Homeostasis. Trends in Cell Biology. 26 (2), 148-159 (2016).
  8. Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (2), 99-111 (2005).
  9. Komarova, N. L., Zou, X., Nie, Q., Bardwell, L. A theoretical framework for specificity in cell signaling. Molecular Systems Biology. 1, 23 (2005).
  10. Schrum, A. G., Gil, D. Robustness and Specificity in Signal Transduction via Physiologic Protein Interaction Networks. Clinical and Experimental Pharmacology. 2 (3), (2012).
  11. De Las Rivas, J., Fontanillo, C. Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks. PLoS Computational Biology. 6 (6), 1000807 (2010).
  12. Ron, D., Walter, P. Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (7), 519-529 (2007).
  13. Bogdan, A. R., Miyazawa, M., Hashimoto, K., Tsuji, Y. Regulators of Iron Homeostasis: New Players in Metabolism, Cell Death, and Disease. Trends in Biochemical Sciences. 41 (3), 274-286 (2016).
  14. Smith, S. E., et al. Multiplex matrix network analysis of protein complexes in the human TCR signalosome. Science Signaling. 9 (439), 7 (2016).
  15. Schrum, A. G., et al. High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry. Science's STKE. 2007 (389), (2007).
  16. Brown, E. A., et al. Clustering the autisms using glutamate synapse protein interaction networks from cortical and hippocampal tissue of seven mouse models. Molecular Autism. 9 (1), 48 (2018).
  17. Lautz, J. D., Brown, E. A., Williams VanSchoiack, A. A., Smith, S. E. P. Synaptic activity induces input-specific rearrangements in a targeted synaptic protein interaction network. Journal of Neurochemistry. 146 (5), 540-559 (2018).
  18. Smith, S. E., et al. Signalling protein complexes isolated from primary human skin-resident T cells can be analysed by Multiplex IP-FCM. Experimental Dermatology. 23 (4), 272-273 (2014).
  19. Neier, S. C., et al. The early proximal αβ TCR signalosome specifies thymic selection outcome through a quantitative protein interaction network. Science Immunology. 4 (32), (2019).
  20. Davis, T. R., Schrum, A. G. IP-FCM: immunoprecipitation detected by flow cytometry. Journal of Visualized Expiriments. (46), (2010).
  21. Smith, S. E., et al. IP-FCM measures physiologic protein-protein interactions modulated by signal transduction and small-molecule drug inhibition. PLoS One. 7 (9), 45722 (2012).
  22. Lautz, J., et al. Activity-dependent changes in synaptic protein complex composition are consistent in different detergents despite differential solubility. BioRXiv. , (2019).
  23. Langfelder, P., Horvath, S. WGCNA: an R package for weighted correlation network analysis. BMC Bioinformatics. 9, 559 (2008).
  24. Schrum, A. G., Gil, D., Turka, L. A., Palmer, E. Physical and functional bivalency observed among TCR/CD3 complexes isolated from primary T cells. Journal of Immunology. 187 (2), 870-878 (2011).

Tags

Биохимия Выпуск 150 IP-FCM протеомика взаимодействие белков сигнализация иммунопреципция ЗМИ
Количественная оценка динамики взаимодействия белков с использованием мультиплексного со-иммунопрециации
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brown, E. A., Neier, S. C.,… More

Brown, E. A., Neier, S. C., Neuhauser, C., Schrum, A. G., Smith, S. E. P. Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation. J. Vis. Exp. (150), e60029, doi:10.3791/60029 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter