Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Kvantificering af protein interaktions netværk dynamik ved hjælp af Multiplexed Co-Immunopræcipitation

Published: August 21, 2019 doi: 10.3791/60029
Automatic Translation
1,2, 3,4, 5, 6,7,8, 1,2,9
1Center for Integrative Brain Research, Seattle Children's Research Institute, 2Graduate Program in Neuroscience, University of Washington, 3Department of Cancer Immunology and Virology, Dana-Farber Cancer Institute, Department of Medicine, Harvard Medical School, 4Broad Institute of Harvard and MIT, 5Department of Mathematics, University of Houston, 6Department of Molecular Microbiology and Immunology, School of Medicine, University of Missouri, 7Department of Surgery, School of Medicine, University of Missouri, 8Department Bioengineering, College of Engineering, University of Missouri, 9Department of Pediatrics, University of Washington

Summary

Kvantitativ multiplex Immunoprecipitation (QMI) bruger flow cytometri til følsom påvisning af forskelle i den overflod af målrettede protein-protein interaktioner mellem to prøver. QMI kan udføres ved hjælp af en lille mængde biomateriale, kræver ikke genetisk manipulerede Tags, og kan tilpasses til alle tidligere definerede protein interaktion netværk.

Abstract

Dynamiske protein-protein interaktioner kontrol cellulære adfærd, fra motilitet til DNA-replikation til at signalere transduktion. Det er imidlertid teknisk vanskeligt at overvåge dynamiske interaktioner mellem flere proteiner i et protein interaktions netværk. Her præsenterer vi en protokol for kvantitativ multiplex Immunopræcipitation (QMI), som giver mulighed for kvantitativ vurdering af fold ændringer i protein interaktioner baseret på relative fluorescens målinger af proteiner i delte komplekser detekteret af eksponerede Overflade epitoper (fiskene). I QMI, protein komplekser fra celle lysater er immunoprecipitated på mikrosfærer, og derefter probed med et mærket antistof for et andet protein for at kvantificere den overflod af fiskene. Immunopræcipitation antistoffer er konjugeret til forskellige MagBead spektral regioner, som tillader et flow flowcytometer at differentiere flere parallelle immunopræcipitationer og samtidig kvantificere mængden af Probe antistof forbundet med hver. QMI kræver ikke genetisk mærkning og kan udføres ved hjælp af minimal biomaterialet sammenlignet med andre immunopræcipitation metoder. QMI kan tilpasses til enhver defineret gruppe af interagerende proteiner, og har hidtil været brugt til at karakterisere signalering netværk i T-celler og neuronal glutamat synapser. Resultater har ført til ny hypotese generation med potentielle diagnostiske og terapeutiske anvendelser. Denne protokol indeholder instruktioner til at udføre QMI, fra den oprindelige antistof panel udvælgelse til at køre assays og analysere data. Den indledende samling af en QMI-analyse omfatter screening antistoffer til at generere et panel, og empirisk bestemmelse af en passende lysis buffer. Det efterfølgende reagens præparat omfatter kovalent tilkobling af chromatinimmunpræcipitation antistoffer mod magbeads og biotinylerende Probe antistoffer, så de kan mærkes med en streptavidin-konjugeret fluorophore. For at køre analysen blandes lysat med magbeads natten over, og derefter opdeles perler og inkuberet med forskellige Probe antistoffer, og derefter en fluoroforet etiket og læses af flowcytometri. To statistiske tests udføres for at identificere fiskene, der afviger betydeligt mellem eksperimentelle forhold, og resultaterne visualiseres ved hjælp af Heatmaps eller node-Edge diagrammer.

Introduction

Dynamisk protein-protein interaktioner udgør de molekylære signalering kaskader og motile sædceller strukturer, der er det funktionelle grundlag for de fleste cellulære fysiologi1. Disse processer er ofte afbildet som lineære signalerings veje, der skifter mellem stabile tilstande baseret på enkelte indgange, men eksperimentelle og modellerings data viser tydeligt, at de fungerer som integrerede netværk2,3, 4. i tilfælde af G-proteiner har forskellige receptorer ofte evnen til at aktivere det samme G-protein, og en enkelt receptor kan også aktivere mere end én type g-protein5,6. For at det relativt lille antal G protein klasser specifikt moduere en bred vifte af cellulære funktioner såsom synaptisk transmission, hormon regulering, og celle migration, celler skal både integrere og differentiere disse signaler4 , 5. dokumentation har vist, at dette signal specificitet for G-proteiner såvel som andre primært er afledt på grundlag af finjusterede protein-protein interaktioner og deres tidsmæssige dynamik1,3, 4 , 5 , 6 , 7. da signalerings netværk består af dynamiske protein komplekser med flere indgange, udgange og feedback-sløjfer, har en enkelt forstyrrelse mulighed for at ændre den samlede homeostatiske balance i en celles fysiologi4 ,7. Det er nu almindeligt aftalt, at signalering skal undersøges fra et netværk perspektiv for bedre at forstå, hvordan integrationen af flere indgange styrer diskrete cellulære funktioner i sundhed og sygdom7,8, 9,10,11,12,13. I lyset af dette, kvantitative multiplex Immunoprecipitation (QMI) blev udviklet til at indsamle medium-gennemløb, kvantitative data om fold ændringer i dynamiske protein interaktion netværk.

QMI er en antistof baseret analyse, hvor celle lysat inkuberet med et panel af immunopræcipitation antistoffer, der er kovalent koblet til magnetiske perler, der indeholder forskellige forhold af fluorescerende farvestoffer. At have specifikke antistoffer koblet til forskellige magnetiske perle klasser giver mulighed for samtidige Co-immunoprecipitation af flere målproteiner fra det samme lysat. Efter immun præcipitation (IP) inkuberet magnetiske perler med et sekund, fluorophore-konjugeret Probe-antistof (eller biotinyleret antistof i forbindelse med fluorophore-konjugeret streptavidin). Co-associationer mellem de proteiner, der genkendes af hvert IP-antistof-Probe-antistofpar eller fiskene (proteiner i delte komplekser, der påvises ved eksponerede overflade epitoper), detekteres derefter ved flowcytometri og kan kvantitativt sammenlignes mellem forskellige prøvebetingelser14. Illustrationerne i figur 1 viser de trin, der er forbundet med at køre en QMI-analyse, herunder et diagram af magnetiske perler med immunopræcipiterede protein komplekser mærket med fluorescently konjugeret Probe antistoffer (figur 1C).

Følsomheden af QMI afhænger af den proteinkoncentration af lyset i forhold til antallet af magnetiske perler, der anvendes til immunoprecipitation, og opnåelse af en opløsning til at opdage 10% fold ændringer kræver kun en lille mængde af udgangsmateriale i forhold til andre Co-IP-metoder14,15. For eksempel svarer mængden af udgangsmateriale, der anvendes i QMI, til det, der kræves til en sandwich enzym-forbundet ImmunoSorbent assay (ELISA), men der påvises flere interaktioner i en enkelt QMI-analyse. QMI assays ved hjælp af 20 IPs og 20 sonde mål er blevet udført ved hjælp af 1-5 x 105 primære T-celler isoleret fra en 4 mm hudbiopsi, P2 synaptosomale præparater fra en 3 mm koronal del af mus præfrontal cortex, eller 3 x 106 kulturperler mus primære kortikale neuroner14,16,17. Denne følsomhed gør QMI nyttig til analyse af celler eller væv med begrænset tilgængelighed, såsom kliniske prøver.

QMI kan tilpasses til enhver tidligere defineret protein interaktion netværk (forudsat at antistoffer er tilgængelige), og til dato er blevet udviklet til at analysere T-celle antigen receptor (TCR) signalosome og en delmængde af proteiner på glutamaterge synapser i neuroner 17 , 18. i studier af T-celle receptor signalering blev QMI først brugt til at identificere stimulations inducerede ændringer i fiskene, og derefter til at skelne autoimmune patienter fra en kontrolgruppe, detektere endogene autoimmune signalering og til sidst at generere en hypotese, der involverer et ubalanceret sygdoms associeret under netværk af interaktioner14. For nylig blev det samme QMI-panel anvendt til at bestemme, at thymocyt-selektion bestemmes af kvantitative snarere end kvalitative forskelle i TCR-associeret protein signalering19. I neuroner blev QMI brugt til at beskrive input-specifik omorganisering af et protein interaktions netværk for forskellige typer indgangssignaler på en måde, der understøtter nye modeller af synaptisk plasticitet17. Desuden, denne synaptisk QMI panel blev brugt til at identificere forskelle i syv musemodeller af autisme, klynge modellerne i undergrupper baseret på deres fiskene biosigna turer, og præcist hypotese en fælles molekylære underskud, der tidligere var ukendt i en af modellerne16. En lignende fremgangsmåde kan bruges til at screene for andre undergrupper, der kan reagere på forskellige lægemidler behandlinger, eller tildele narkotika til specifikke Responsive undergrupper. QMI har potentielle anvendelser i diagnostik, patient sub-Typing, og narkotika udvikling, ud over grundlæggende videnskab.

For at samle et QMI-antistof panel beskrives de indledende antistof screenings-og udvælgelses protokoller i afsnit 1 nedenfor. Når der er identificeret antistof paneler, er der i punkt 2 beskrevet protokoller for konjugering af de valgte antistoffer mod magnetiske perler for IP og for biotinylering af de valgte Probe antistoffer. Protokollen for at køre QMI-analysen på celle-eller vævs lysater er beskrevet i punkt 3. Endelig, da et enkelt eksperiment kan generere ~ 5 x 105 individuelle datapoint, instruktioner og edb-koder til at hjælpe med databehandling, analyse og visualisering er angivet i afsnit 4. En oversigt over arbejdsprocessen, der er beskrevet i afsnit 2-4, er vist i figur 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. analyse design

  1. Forberedelse af kandidat antistof
    1. For hvert protein af interesse, Vælg 3 til 5 antistoffer til skærmen. Når det er muligt, skal du bruge monoklonale antistoffer, der genkender forskellige epitoper. Også omfatte et ikke-specifikt kontrol-antistof.
    2. For at fjerne Tris, udføre buffer udveksling ved at tilføje antistoffet til en 30 kDa spin filter, spinning ned til sin mindste volumen, tilføje 500 μL fosfat-bufferet saltvand (PBS), og gentage 3 gange. For at fjerne Carrier proteiner, udføre antistof rensning i henhold til producentens protokol (Se tabel over materialer til specifik rensning anbefaling).
      Bemærk: Dette gøres, fordi Carrier proteiner og buffere med gratis Amin grupper (såsom Tris) vil reagere med COOH grupper og slukke den efterfølgende perle kobling og biotinylation reaktioner. Sørg for, at alle antistoffer er renset (ingen bære proteiner) og i en buffer, der er fri for primære aminer (dvs. ingen Tris).
    3. Par hvert antistof til carboxylat modificeret latex (CML) perler som beskrevet af Davis og Schrum20. For at bevare antistoffet, skalerer du ned af perle koblings reaktioner med op til 1/5 (dvs. 3,6 x 106 perler med 10 μl 0,2-1 mg/ml antistof).
    4. Beregn perle tal ved hjælp af en hemocytometer (typisk ~ 108/ml) og opbevares ved 4 °c. Perler har været opbevaret i over et år og anvendes med succes i QMI assays, men opbevaringstid eller udløbsdatoer er ikke blevet formelt fastlagt. NaN3 i B/S-bufferen forebygger bakterievækst.
    5. Biotinylat en del af hvert antistof (Se afsnit 2,2 nedenfor). Opbevares ved 4 °C.
    6. Bekræft effektiv CML-perle kobling og nøjagtig tælling ved farvning af 1 x 105 perler med et PE-konjugeret antistof reaktivt til de arter, hvor antistoffet blev forhøjet og læst på et flow cytometer.
    7. Bekræft antistofbiotinylering med prik blot ved hjælp af streptavidin-HRP.
    8. Når laboratoriet har genereret reagenser, der vides at være effektive, skal du bruge disse reagenser som positive kontroller i bekræftelses reaktioner i trin 1.1.5 og 1.1.6.
  2. Antistof screening af IP-FCM (immunopræcipitation påvist ved flowcytometri)
    1. Træffe beslutning om et passende screening-lysat. Til dette og alle andre præ-QMI screening trin (alt inkluderet i dette afsnit 1: assay design), skal du ikke bruge biosamples med begrænset tilgængelighed. I stedet, vælge en sammenlignelig kontrolmateriale såsom dværg mus væv, cellelinjer, eller normale menneskelige donor væv, der ikke er en begrænsende ressource.
      Bemærk: det er ikke trivielt at vælge en lysis-buffer til denne analyse, og det diskuteres i afsnit 1,5: valg af vaskemiddel samt i det næstsidste afsnit i diskussionsafsnittet. Standard lyse buffere har en base på 150 mM NaCl, 50 mM tris (pH 7,4), 10 mM natriumfluorid, 2 mM natriumorthovanadat, og proteasehæmmere og fosfatasehæmmer cocktails. Rengøringsmidler, der er kompatible med QMI, omfatter 1% NP-40, 1% digitonin, 0,1-1% Triton X-100 og 0,5-1% deoxycholate14,16,17,18,19,21.
    2. Beregn den totale mængde lysat, der skal anvendes for hver IP, med 10 μL for hver kombination af IP-sonde, der skal screenes. Hvis screening X Probe antistoffer og ved hjælp af en IgG kontrol, hver IP vil bruge (X + 1) * (10 μL) * (1,1 for pipetteringsfejl); X + 1 skal være til regnskab for den påkrævede IgG-Probe kontrol. For eksempel, i en 3x3 antistof skærm, hver IP skal bruge 44 ul. Husk at inkludere et IgG IP-kontrolelement (se eksempel på screening setup i figur 2).
    3. Beregn det CML-perle nummer, der skal anvendes. Hvis du screenes X-Probe antistoffer, skal du bruge [(X + 1) * 5 X 104 perler]. Ideelt set vil 5.000 perler per brønd resultere i > 2000 perler pr godt bliver læst af flow cytometer. For eksempel, i en 3 x 3 antistof skærm, hver IP skal bruge 20.000 perler, som er ca 0,66 μL af tilberedt CML perle bestand fra trin 1.1.3 (perler skal først kvantificeres ved hjælp af en hemocytometer for at sikre nøjagtighed).
    4. Der inkubaterer mængden af lysat fra trin 1.2.2 med mængden af hver CML-perle, der skal screenes fra trin 1.2.3, natten over ved 4 °C med rotation for at forhindre, at perlerne afregnes. Typisk udføre inkubationer i første kolonne af en 96-brønd PCR plade, og hætte med PCR tube Strip caps.
    5. Spin ned CML perler på 3.200 x g for 1 min og fjerne lysat af en enkelt, hurtig svirpe af pladen over vasken. En lille hvid pellet skal være synlig i bunden af hver brønd både før og efter flicking.
    6. CML-perlerne opslæmmes i et volumen af FlyP-buffer på 20 μL for hvert perle-sonde-par. for X-Probe antistoffer anvendes (X + 1) * (20 μL) * (1,1 for pipetteringsfejl), svarende til trin 1.2.2. For en 3 x 3 skærm, resuspension i 88 μL FlyP buffer. FlyP buffer er 100 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7,4, 1% BSA, 0,01% NaN3.
    7. Distribuer hver IP på tværs af (X + 1) brønde af en 96-brønd PCR plade, hvor X er antallet af sonde antistoffer, der screenes, ved hjælp af 20 μL/brønd. Figur 2 A viser et eksempel på en screening opsætning.
    8. Vask yderligere 2 gange med 200 μL FlyP-buffer pr. brønd. Drej pladen som i trin 1.2.5, og svip pladen for at fjerne vaskebufferen efter hver vask. Pellets vil være meget lille, men bør være synlige efter hver vask.
    9. For hvert biotinyleret antistof, der skal screenes, beregnes det samlede volumen som (Y + 1) * 1,1 * 50 μL, hvor Y er antallet af IP-antistoffer, der screenes. Fortyndet antistof til en arbejds koncentration i dette volumen af FlyP buffer, typisk begyndende med 1:100 fortynding af en 0,5 mg/mL bestand.
    10. Fordel hvert fortyndet antistof ned hver kolonne af 96 brønd pladen, og sørg CML perler er resuspenderet.
    11. Inkubér ved 4 °C i 1 time, enten med rotation eller pipettering med 15 minutters intervaller for at sikre, at CML-perlerne forbliver i suspension.
    12. Vask 3x i 200 μL FlyP buffer, for hver vask centrifuge og fjern lysat som i trin 1.2.5.
    13. Alle CML-perler opslæmmes i 50 μL 1:200 Streptavidin-PE i FlyP-buffer.
    14. Inkuber ved 4 °C i mørke i 30 minutter.
    15. Vask 3x i 200 μL FlyP buffer, for hver vask centrifuge og fjern lysat som i trin 1.2.5.
    16. Resuspension i 200 μL FlyP buffer, og derefter køre på et flow cytometer.
  3. Valg af antistoffer til at inkludere i assay
    1. Gate på størrelse ved hjælp af FSC-h vs SSC-h, og eliminere form ved hjælp af FSC-h vs FSC-A.
    2. Opret histogrammer af PE fluorescens intensitet og overlejrer begge IgG-kontroller (IgG-vulst-test sonde, test perle-IgG-sonde) på testede par (figur 2).
    3. Kig efter en perle-sonde par, der giver klart signal over støj (figur 2B). Derudover er det ikke ideelt at bruge det samme antistof til både perle og sonde. Differential epitop anerkendelse maksimerer chancerne for at observere interaktioner, fordi nogle epitoper kan være blokeret i visse protein komplekser. Hvis der ikke er nogen acceptable muligheder, Gentag skærm med yderligere antistoffer.
  4. Bekræftelse af antistof specificitet
    1. For at sikre antistof specificitet for de tilsigtede mål, skal du bruge en lysprøve, hvor målet er blevet slået ud; f. eks. en Knockout-mus eller en RNAi-cellelinje. Alternativt kan du bruge lysat fra en målnegativ cellelinje, hvor målproteinet er kunstigt udtrykt.
    2. Udføre IP-FCM som beskrevet i trin 1,2, ændre for at passe til eksperimentet.
  5. Valg af vaskemiddel
    1. Da vaske-og rengøringsmidler er kritiske i SAMIP-eksperimenter, tester empirisk forskellige variationer for at sikre, at analysen har størst sandsynlighed for at opdage ændringer. For at starte skal du vælge et relativt lille panel af interaktioner (4-8), der vides at ændre i en given tilstand og/eller er af særlig interesse for dit studie.
    2. Ved hjælp af ikke-fluorescerende, antistof-konjugeret CML-perler lavet til indledende skærme, udføre IP-FCM som beskrevet i 1,2 ved hjælp af varierede lysis buffer vaske betingelser. Vaskemiddel skærme kan udføres med vaskemiddel som den eneste variabel, eller med forskellige celle betingelser for hvert vaskemiddel. Brug altid IgG-kontroller til både perler og sonder, da rengøringsmidler lejlighedsvis producerer uventet baggrund i nogle IP-Probe kombinationer.
    3. Baseret på MFI ' erne fra skærmen, vælge et vaskemiddel, der optimerer signalet for fiskene af interesse. Det er sandsynligt, at der skal laves nogle kompromiser22.

2. multiplex reagens præparat

  1. Magnetisk perle kobling
    1. Ved hjælp af den magnetiske perle region kort, skal du vælge perle regioner til at bruge i et mønster, der minimerer risikoen for kryds detektering. Magnetisk perle typisk smøre op og til højre, så undgå perle regioner, der er diagonalt tilstødende. Perler fra alle andre kolonner af perle diagrammet vist på Luminex hjemmeside anbefales (https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/).
    2. Det bære frie antistof forberedes ved 0,1 mg/mL i PBS (som i 1.1.2) i 250 μL. opbevares på is til senere brug.
    3. Vortex magnetiske perler omfattende, og derefter alikvot 250 μl i en rav mikrocentrifuge tube (for at beskytte perler fra foto blegning).
    4. Magnetisk adskille magnetiske perler til 60 s og fjerne supernatanten.
    5. Tilsæt 250 μL MES-buffer (50 mM MES pH 6,0, 1 mM EDTA), vortex, magnetisk separat for 60 s, og Fjern supernatanten. Gentag og resuspender magnetiske perler i 200 μL MES buffer.
    6. Tilsæt 40 μL af MES til en 2 mg engangs tube af sulfo-NHS for at lave en 50 mg/mL bestand.
    7. Tilsæt 25 μL frisklavet sulfo-NHS til de magnetiske perler. Vortex.
    8. Tilsæt 25 μL 50 mg/mL frisk opløst EDAC [1-ethyl-3-( -3-dimethylaminopropyl) carbodiimidhydrochlorid, også kaldet EDC] i MES-buffer. Vortex.
    9. Dæk og ryst på en vortexer med en slangeholder fastgørelse i 20 minutter ved stuetemperatur, 1000 rpm.
    10. Magnetisk separat for 60 s og Fjern supernatanten.
    11. Resuspension i 500 μL PBS, vortex, magnetisk separat for 60 s og Fjern supernatanten. Gentag.
    12. Resuspension i 250 μL antistof opløsning fra trin 2.1.2. Vortex.
    13. Inkuber 2 timer ved stuetemperatur med omrystning på en vortexer ved 1000 rpm.
    14. Tilsæt 500 μL PBS til de magnetiske perler, vortex, magnetisk adskilt for 60 s, og Fjern supernatanten.
    15. Tilsæt 750 μL blokerende/Storage (B/S) buffer (1% BSA i PBS pH 7,4, 0,01% NaN3). Dæk og Inkuber 30 min ved stuetemperatur, 1000 rpm.
    16. Magnetisk separat for 60 s og Fjern supernatanten. Resuspension i 100 μL B/S buffer.
    17. Opbevares ved 4 °C. Perler har været opbevaret i over et år og anvendes med succes i QMI assays, men opbevaringstid eller udløbsdatoer er ikke blevet formelt fastlagt. NaN3 i B/S-bufferen skal forhindre bakterievækst.
    18. Valider magnetisk perle kobling ved farvning ~ 0,25 μL af koblede magnetiske perler med en fluorescerende anti-Host art sekundær og læsning på et flow cytometer, som i trin 1.1.5.
  2. Biotinylering
    1. Sørg for, at antistoffer er i PBS uden bære protein.
    2. Den totale μg antistof beregnes som biotinyleret (100-200 μg anbefales til brug i multiplex, 25-50 μg anbefales til screening).
    3. Forbered frisk 10 mM sulfo-NHS-biotin (kan gøres ved at tilføje 224 μL ddH2O til en 1 mg No-vejer rør).
    4. Tilsæt 1 μL 10 mM sulfo-NHS-biotin pr. 25 μg antistof, vortex eller pipette op og ned for at blande.
    5. Inkuber ved stuetemperatur i 1 time.
    6. Inkuber ved 4 °C i 1 time.
    7. Brug et 30 kDa-spin filter til at fjerne ubundet biotin og standse reaktionen. Tilsæt 500 μL PBS, og drej kolonnen, indtil minimums volumenet er nået. Tilsæt 500 μL ekstra PBS og Gentag for 3 totale buffer udvekslinger.
    8. Beregn koncentrationen ved at måle absorbansen på 1-2 μL på et spektrofotometer, og Bring derefter antistofkoncentrationen til 0,5 mg/mL.
    9. Opbevares ved 4 °C.

3. kvantitativ multiplex chromatinimmunpræcipitation

  1. Plade layout
    Bemærk: denne analyse virker bedst, når den udføres ved hjælp af 96-brønd plader og 2-4 prøvebetingelser.
    1. Udfør altid passende kontrol (dvs. stimulerede v. ustimulerede celler) på samme plade for at påvise ændringer mellem forholdene. Distribuer hver prøve vandret over pladen, og brug hver kolonne til et andet Probe-antistof. Et sæt tekniske replikater for hver sonde skal køres umiddelbart efter det første sæt. Se figur 3 for et eksempel.
    2. Dokumentér omhyggeligt plade layoutet for at lette nøjagtig indlæsning og analyse af plader.
  2. Prøveforberedelse & immunopræcipitation (dag 1)
    1. Lyse væv eller celler i passende vaskemiddel med proteasehæmmere-og fosfatasehæmmere og inkubere på is i 15 min. Vær forsigtig med at holde lysningen koldt hele tiden.
      Bemærk: den nøjagtige mængde af angivelse af biomateriale og lysat proteinkoncentrationen skal bestemmes empirisk, og nogle eksempler på tidligere anvendte prøver er anført i tredje afsnit af indledningen. Generelt, i intervallet 200 μL af 2 mg/mL protein pr prøve har været en succes i fortiden for 20 IP og 20 sonde mål, men ideelle input for hvert antistof panel og celle eller væv type skal bestemmes empirisk.
    2. Drej ned ved 4 °C i 15 min ved 16.000 x g for at fjerne membraner og snavs; Opbevar supernatanten som lysat.
    3. Udføre en BCA analyse eller lignende at bestemme proteinkoncentrationer, og derefter normalisere proteinkoncentrationen mellem prøver. Hvis du bruger celler, begynder med et tilsvarende antal celler pr. betingelse, og normalisering er valgfri.
    4. Forbered en Master magnetisk perle blanding, der indeholder ~ 250 magnetiske perler af hver klasse pr brønd i analysen. Juster perle tallene efter dataanalyse, så i fremtiden assays et gennemsnit på 110 perler af hver klasse vil blive læst per brønd.
      Bemærk: eksempel beregning: (ny perle volumen) = [(Run gennemsnit)/110] * (tidligere perle volumen). Perle volumener bør justeres på denne måde omkring hver 8 kørsler eller efter behov. Typisk anvendes 3-4 μL af hver magnetisk perle (fremstillet som ovenfor) til et 2-plade eksperiment.
    5. Vask den magnetiske perle mix 2x i FlyP buffer med magnetisk adskillelse, og derefter gensuspendere i FlyP buffer. Til resuspension anvendes 10 μL pr. prøve pr. plade. FlyP buffer er 100 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7,4, 1% BSA, 0,01% NaN3.
    6. Efter grundig vortexning af den magnetiske perle blanding, alikvot 10 μl i iskold mikrocentrifuge glas (et rør pr prøve). Tilsæt lige volumener af lysat (med normaliserede koncentrationer) til hvert rør for immunoprecipitation.
    7. Aliquot den lysate-magnetiske perle blanding i et rør for hver plade, der køres; f. eks. for et 2-plade eksperiment, opdele lysatet i to rør. Placer rør på en rotator ved 4 °C natten over for immunopræcipitation, dækket for at holde ud lys.
  3. Kørsel af analysen (dag 2)
    1. Start med lysate-magnetiske perle rør til plade #1. Brug en magnetisk vulst rack til at fjerne lysat fra de magnetiske perler, og reserve lysat til fremtidig analyse. Vask perler 2x i 500 μL iskold FlyP buffer. Hold rør altid på is eller ved 4 °C.
    2. Beregn ophængs volumen som (antal sonder) * (2 tekniske replikater) * (25 μL pr. brønd) * (1,1 for pipetteringsfejl). Resuspendere IPs i beregnet volumen af iskold FlyP buffer.
    3. Efter grundig opsuspension af magnetiske perler ved skånsom pipettering, fordeles 25 μL pr. brønd over en flad bund 96 brønd plade, på is.
    4. I en anden 96-brønd plade fortyndes de fortyndede biotinylerede Probe antistoffer til 2x arbejds koncentration (arbejds koncentrationen er typisk 1:100 eller 1:200, empirisk bestemt) i FlyP-buffer, således at deres rækkefølge svarer til kolonnerne på pladens layout (Se figur 3 ). Det endelige volumen af sonde antistoffer i arbejds koncentrationen vil være 50 μL pr. brønd, så mængden af hvert 2x antistof, der tilberedes, skal være (25 μL) * (antal biologiske prøver) * (2 tekniske replikater) * (1,1 for pipetteringsfejl).
    5. Brug en multikanals pipette til at distribuere 25 μL af hver Probe-antistof fortynding til den magnetiske perle-holdige analyse plade.
    6. Ryst på en vandret plade shaker for at blande og resuspendere de magnetiske perler, og derefter inkubere ved 4 °C i 1 time, ryster ved 450 rpm i mørke.
    7. Vask 3x med FlyP-buffer på en magnetisk plade skive ved 4 °C.
    8. De magnetiske perler opslæmmes i 50 μL 1:200 Streptavidin-PE.
    9. Ryst for at blande og resuspendere perler, og derefter inkubere ved 4 °C i 30 min, ryster ved 450 rpm i mørke.
    10. Vask 3x med FlyP-buffer på en magnetisk plade skive ved 4 °C.
    11. Resuspension i 125 μL FlyP buffer.
    12. Ryst i 1 min ved 900 rpm til grundigt at resuspendere perler.
    13. Køre på køle strøm flowcytometer (Se diagram i figur S1). Brug indstillingen "High RP1 Target" i flow-flowcytometer-softwaren og en stop-tilstand på 1.000 perler pr. region (hvilket i høj grad over skyder det antal, der skal være i enhver individuel brønd for at forhindre, at maskinen stopper for tidligt) og prøvevolumen på 80 μL.
    14. Pause den køre halvvejs igennem og resuspendere perlerne for at forhindre afregning.
    15. Eksporter datafiler i. XML-format.
    16. Gentag processen for de resterende plader, startende ved trin 3.3.1.

4. data analyse

Bemærk: ANC-koden er designet til at sammenligne to betingelser fra N = 4 eksperimenter, hver med 2 tekniske replikater for hver betingelse. For eksempel stimuleres celler fire uafhængige gange, QMI køres på fire forskellige dage på kontrol (ustimuleret) og stimulerede celler, med tekniske replikater som ovenfor, og dataanalyse provenuet som beskrevet nedenfor.

  1. Adaptiv ikke-parametrisk med justerbar Alpha cutoff (ANC)
    1. Åbn MATLAB, og Indstil Active Directory til en mappe, der indeholder ANC-programkomponenterne, og de. XML-filer, der eksporteres fra flow-cytometer.
    2. Udfyld "ANC-input"-filen for at afspejle detaljerne i det eksperimentelle design. Eksempelfilen, der indgår i den supplerende fil , er udfyldt på forhånd for at køre eksempeldataene, også angivet.
    3. Kør programmet, som vil skrive en. csv-fil i Active Directory. Filen rapporter fiskene, der er væsentligt forskellige, på en falsk positiv (alpha) niveau af 0,05, mellem kontrol og eksperimentelle betingelser, i alle 4 eksperimentelle replikater, eller mindst 3/4 replikater.
    4. Bemærkning» ANC hits «, som defineres som fiskene med signifikante forskelle i mindst 3 eksperimentelle replikater, repræsenteret som 3/4 ∩ 4/4 i filen, til brug i trin 4.3.1.
  2. Vægtet korrelations netværksanalyse23 (CNA)
    1. Paste-transponere kolonnetitlerne på datafilens output fra MATLAB, som slutter i "_MFI. CSV "i den første række i et nyt Excel-ark. Tilføj kolonnerne "eksperiment" for eksperiment nummer, og "behandling", til eksperimentel behandling, eller andre variabler, der skal analyseres. Gem denne fil som "træk. csv".
    2. Åbn R Studio, og Indstil arbejdsmappen til en mappe, der indeholder "_MFI. CSV "og" træk. CSV "-filer.
    3. Opstille den R befalinger nemlig angivet i den kommenterede befale fil og den nærmere i den instruks inkluderet hos den filer. WCNA moduler væsentligt korreleret med hver eksperimentel træk er output som en grafisk fil, og korrelationen mellem hver interaktion IPi_ProbeJ med hvert modul er output som en. csv-fil.
    4. Bemærk ' CNA hits, ' som er defineret som interaktioner med modul medlemskab (MM) > 0,7 og p < 0,05 for medlemskab i et modul, der blev identificeret som signifikant korreleret med den eksperimentelle variabel af interesse, til brug i trin 4.3.1.
  3. Positive ' hits ' & visualisering
    1. For hver interaktion i "3/4 ∩ 4/4 hits" listen i ANC output fil (fra trin 4.1.4), identificere, hvis denne interaktion er også en "CNA hit" ved at kontrollere CNA output-fil (Se trin 4.2.6). Opret en ny kolonne, der angiver, om hver ANC hit er også en CNA hit.
    2. Beregn den gennemsnitlige log2 fold ændre værdi for hver ANC ∩ CNA hit ved at gennemsnit de værdier, som er angivet i ANC output regneark "_hits. csv" fra trin 4.1.3. Konverter værdier til log2 fold ændring før gennemsnit. For interaktioner, der var signifikante i kun 3/4 replikater, slette værdien outlier.
    3. Lav et regneark med hver ANC ∩ CNA hit opført som en IP i en kolonne, en sonde i den anden kolonne, og fold ændre værdien i den tredje kolonne. Brug dette regneark til at oprette et node-Edge-diagram i Cytoscape ved at importere filen som et netværk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Antistof screening
Figur 2 B viser resultaterne af en skærm for proteinet Connexin36. De fleste IP_probe kombinationer giver ikke signal over IgG-kontrolelementer. IP med det monoklonale antistof 1E5 og sonde med enten 1E5 eller polyklonal antistof 6200 producerer et højre Skift i perle fordelingen sammenlignet med IgG-kontroller. Her blev IP 1E5 og Probe 6200poly udvalgt til at undgå at bruge det samme antistof som IP og sonde, både for at reducere sandsynligheden for, at et ikke-specifikt protein blev anerkendt af to uafhængige antistoffer, og for at øge chancen for at opdage Co-foreninger ved hjælp af forskellige epitoper. Det er bedst at vælge en IP_probe kombination med mindst 1-2 log højere MFI sammenlignet med IgG kontrol, men lejlighedsvis par producerer svagere MFI'er, der er konsekvent skelnes fra kontrol kan anvendes, hvis der ikke er identificeret alternativer. Figur 2 C viser en specificitet validering eksperiment for 1E5-6200poly kombination. Lysate fra 293 celler transficeret med en Connexin36 plasmid produceret en ~ 1,5-log drejningen skift i perle fordelingen, mens utransfected celler overlappede med IgG kontrol. Ved bekræftelse af specificiteten af et par, negativ kontrol lysere fra en knockout dyr eller cellelinje uden målet protein bør have en MFI svarende til IgG kontroller.

Perle kobling
En typisk magnetisk perle kobling kvalitetskontrol reaktion vil give en MFI 3-4 logs over baggrunden, når farvet med et sekundært antistof konjugeret til en fluoroforet med et lysstyrke indeks mellem 3 og 5 (såsom PE eller FITC). Figur 4 viser en typisk kvalitetskontrol reaktion, der sammenligner konjugering af en ny magnetisk perle sammenlignet med den ældre batch, der udskiftes.

Data analyse
I hvert eksperiment sammenligner ANC fluorescens fordelingerne af hver magnetisk perle klasse i hver brønd (dvs. alle mulige IP_Probe kombinationer) mellem en brugerdefineret kontrol og eksperimentel tilstand. Det tildeler en p-værdi til hver kombination, der afspejler sandsynligheden for, at perlerne er blevet udtaget fra identiske populationer baseret på kolomogrov-Shmirnov (K-S) statistik. Programmet beregner derefter den K-S p-værdi, der kræves for at producere en falsk positiv hastighed på 0,05 ved at korrigere for flere sammenligninger og regnskabsmæssig for teknisk variation (forskelle mellem de tekniske replikater). IP_probe kombinationer (fiskene), hvis K-S test p-værdi falder til under den beregnede cut-off i alle fire eksperimenter, eller mindst 3/4 eksperimenter (3/4 ∩ 4/4) er identificeret. Da p-værdi cut-offs varierer afhængigt af disse forskellige niveauer af strenghed, lejlighedsvis fiskene vil blive identificeret i 4/4, men ikke 3/4 ∩ 4/4, så separate lister beregnes. For detaljerede ANC-ligninger, se (Smith et al. 2016). 14 detaljer om wcna analyse og resultater drøftes grundigt af Langfelder et al.23

Data præsentation
ANC og CNA23 analyser udføres for at identificere fiskene, at både (1) viser signifikant fold ændringer mellem eksperimentelle forhold i mindst 3/4 af kørsler og (2) tilhører en CNA-modul, der er korreleret med den eksperimentelle variabel. Disse høj-tillid fiskene, der er identificeret ved to uafhængige statistiske tilgange er omtalt som ANC ∩ CNA fiskene. Disse interaktioner kan visualiseres som et node-Edge-diagram ved hjælp af open source-software Cytoscape (figur 5a) eller som en heatmap ved hjælp af R-kode og analyse instruktioner, der indgår i det supplerende materiale (figur 5b ).

Figure 1
Figur 1 . Oversigt over kvantitativ multiplex Immunopræcipitation. a) tidligere screenet antistoffer er kovalent koblet til forskellige klasser af magnetiske perler i separate reaktioner. (b) om natten er protein komplekser immunopræcipiteret ved hjælp af en blanding af de antistof-koblede magnetiske perler. c) Co-immunopræcipiterede proteiner er mærket med et Probe-antistof og en fluorophore. d) magnetiske perler og mærkede protein komplekser drives gennem et køle flow flowcytometer for at kvantificere relative mængder af proteiner, der forekommer i delte komplekser. Se figur S1 for skematiske detaljer om brugerdefineret køling. e) flowcytometer Manager-softwaren adskiller magbeads efter klasse og (f) viser fluorescens histogrammer fra hver perle region. (g) data eksporteres som. XML-filer og analyseres af to uafhængige statistiske tilgange. Kun fiskene, der identificeres ved begge analyser, rapporteres ved hjælp af heatmap-og node-Edge-diagram visualiseringer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 . Connexin 36 antistof screening ved hjælp af IP-FCM. (a) IP-FCM blev udført på Mouse Brain lysat ved hjælp af en 4x4 panel af connexin 36 (Cx36) CML perler og sonder. Lysate var immunoprecipiteret med hver CML-perle i en separat række af pladen. Efter skylningen blev hver perle fordelt over sin række, så der kan tilsættes et Probe-antistof pr. kolonne. (b) de fleste antistof kombinationer viser intet signal (orange) over IgG-baggrund (grå, blå). 1E5 IP med 6200Poly sonde viser acceptabelt positivt signal. 1E5 perle/Probe og 6200Poly perle/sonde par hver viser acceptable signal, men det er ikke ideelt at bruge det samme antistof til både perle og sonde. Differential epitop anerkendelse maksimerer chancerne for at observere interaktioner, fordi nogle epitoper kan være blokeret i visse protein komplekser. 6200Poly-perlen med 1E5-sonden giver det stærkeste signal og blev valgt til at bruge i multiplex-analysen afventer specificitets bekræftelse. (c) IP-FCM ved hjælp af parret med Cx36 antistoffer udvalgt fra screening blev udført på lysatet af 293t celler transficeret med Cx36 og ikke-transficeret kontrol. Der er klart signal fra de Cx36-transfected celler, men de ikke-transfected celler er ikke skelnes fra IgG perle/sonde kontrol. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 . Eksempel plade layout. En 4-Condition multiplex er sat op i en 96-brønd plade. Prøver 1-4 indlæses i fortløbende rækker (hver biologisk prøve repræsenteret her af en anden farve), og tekniske replikater indlæses i samme rækkefølge i de følgende 4 rækker. Der anvendes én sonde pr. kolonne. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 . En typisk kvalitetskontrol reaktion, der sammenlignede konjugationen af en ny Magperat sammenlignet med den ældre batch, der udskiftes. Perlen giver en MFI 2-4 logs over baggrunden, og den nye batch har en MFI svarende til den gamle batch. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 . QMI identificerer synaptiske fiskene, der ændrer i størrelsesorden efter 5 minutter af NMDA stimulation i dyrkede kortikale neuroner. En QMI eksperiment sammenlignede NMDA stimuleret vs. ustimuleret (ACSF Control) neuroner. Fiskene, der blev identificeret ved både ANC-og CNA-analyser, præsenteres. (a) i et node-Edge diagram fremstillet ved hjælp af open source software Cytoscape, knudepunkter angiver antistof målene (proteiner), der blev inkluderet som IPS og sonder i QMI panel. Kanterne repræsenterer ANC ∩ CNA fiskene, med farven og tykkelsen af kanten indikerer retningen og størrelsen af folden-ændring mellem NMDA behandling og kontrol. Fiskene, der ikke ændres mellem NMDA og kontrolbetingelser er ikke inkluderet i figuren. b) et heatmap, der produceres i R ved hjælp af heatmap. 2-funktionen repræsenterer den samme ANC ∩ CNA fiskene. ComBAT-normaliseret, log2 MFI-værdier normaliseret efter række til at konto for data, der spænder ~ 3 logs, og den relative MFI for hver eksperimentel replikat er viser at demonstrere den relative størrelse og konsistens af hver rapporterede fiskene. De data og den kode, der kræves for at gengive disse tal, er medtaget i den supplerende fil. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplementary Figure 1
Figur S1: diagrammer over brugerdefineret køling af flowcytometri-systemet. Flow cytometer's array Reader skal opbevares ved stuetemperatur, men den nedre del (mikropladen) skal være nedkølet for at opretholde fiskene under analysen. Se tabellen over materialer til modeloplysninger om flow flowcytometer og sandwich prep køleskab, der anvendes. a) de øvre bilag og beholdere til opbevaring af madvarer blev fjernet fra et køleskab i sandwich tilberedningen. Mikropladen platformen blev placeret på metal understøtninger betød at holde plastik mad opbevaringsbeholdere. Plastikhuset på mikropladen platformen blev fjernet for at gøre det fit. En brugerdefineret plexiglas-platform blev bygget med målinger vist i (b) for at dække den øvre åbning af køleskabet. Plexiglasset blev isoleret med 1/2 "skum isolering skåret til at matche størrelsen af plexiglas, og forseglet hullet med isolerende tape. Et hul blev derefter boret gennem plexiglasset for at tillade, at prøve nålen fra flowcytometer assay Reader fik adgang til mikropladens platform, når den blev forlænget. En sort koblingsanordning, der oprindeligt blev skruet ind i toppen af mikropladen platformen blev fjernet, og skruet tilbage i mikropladen platform fra over Plexiglass, som hjalp i tilpasningen. En dør i Plexiglass dækslet giver brugeren adgang til mikropladen, når den er forlænget ud af enheden. Bemærk, at strømmen flowcytometer software vil advare brugeren om, at pladen bæreren er for kold, men brugeren kan tilsidesætte advarslen og køre afkølet QMI eksperimenter. c) fotografi af det samlede system. (d) detalje af forreste højre hjørne, som tegnet i (a), viser samling af plexiglas dæksel og isolering. e) detaljerne i prøve kanylen, som er justeret over hullerne. (f) detalje af den barberede del af isoleringen, der tillader luftgennemstrømning under enheden. g) detaljer om den åbne låge, der viser den nedenstående platform for flow flowcytometer-mikropladen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplementary File
Supplerende fil. Data og kode, der kræves for at gengive disse tal. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

QMI-analysen kræver betydelige investeringer i udvikling af antistof paneler, udstyr og reagenser, men når analysen er etableret, kan man indsamle højdimensionale data, der observerer protein interaktions netværk, når de reagerer på eksperimentelt kontrollerede Stimuli. Teknisk set kræver QMI omhyggelig pipettering og sporing af prøve-og antistof brønd placeringer. Omhyggeligt mærkning af analyse plader er nyttig, som gør en detaljeret skabelon af godt steder på papiret, som derefter gemmes til dataanalyse. Betydningen af at holde perlerne og lysat kulde på alle tidspunkter, herunder i flow flowcytometer mikroplast bærer (Se figur S1 for brugerdefinerede køling instruktioner) kan ikke overvurderes. Protein interaktioner vil hurtigt dissociere ved stuetemperatur, og tidlige forsøg på at bruge en uændret, rumtemperatur flow flowcytometer sluttede med identifikationen af mange temperatur-labile interaktioner, men ikke dem, der ændres med den tilsigtede Stimulation.

QMI er en antistof-baseret assay, så den første udvælgelse af antistoffer er kritisk. Monoklonale eller rekombinante antistoffer bør anvendes, når det er muligt, for at reducere variabiliteten i resultaterne. Polyclonals viser Lot-to-Lot variation, men peptidbaserede polyclonals til en kort epitop synes at være relativt stabile over tid. Drift kan minimeres ved at købe store partier af antistoffer; Dette giver også mulighed for brugerdefinerede-ordrer af Carrier-fri antistoffer, som udelukker behovet for at rense antistoffer ved hjælp af melon gel og spin kolonner, og den tilhørende antistof tab.

Det er også vigtigt at bemærke, at fordi påvisning af et signal er afhængig af tilgængelige epitoper, manglen på et signal ikke nødvendigvis indikerer manglen på en interaktion, en begrænsning, der er fælles med andre protein interaktion metoder. 14 når der registreres et signal, er det endvidere umuligt utvetydigt at oplyse, om protein interaktionen er direkte (en interaktion med b) eller indirekte (en interaktion med X og Y, som derefter interagerer med b), hvilket er grunden til, at de observerede interaktioner er omtales som fiskene i stedet for protein-protein interaktioner (PPI), hvilket kan indebære direkte binding. En begrænsning af alle antistof-baserede metoder, der bør holdes i tankerne, er, at tilsætning af antistoffer kan forstyrre eller stabilisere protein komplekser. En anden begrænsning ved brug af flowcytometri i stedet for vestlige blots er, at størrelses information for at bekræfte antistof specificitet ikke er tilgængelig. For at overvinde denne begrænsning anvendes IgG-kontroller til screening af hvert antistofpar, og specificiteten bekræftes med knock-out-eller Knock-in-cellelinjer eller dyr, før der fortsættes med QMI-eksperimenter (afsnit 1,4).

IgG-kontrolelementer bruges ikke i QMI-analysen, fordi hver IgG producerer et andet niveau af baggrunds signal, hvilket gør det umuligt at kende den korrekte baggrundsværdi, der skal trækkes fra. For eksempel, hvis IP (X) _probe IgG giver en MFI af 100 og IP IgG_probe Y giver en MFI af 200, hvilken baggrundsværdi skal trækkes fra IP X_probe Y? Tilsvarende, nogle gange uopdagede interaktioner (f. eks IP X Probe Z) vil have en lavere MFI end de uspecifikke IgG interaktioner. For at begrænse denne begrænsning af ikke at kende den absolutte MFI signal, fiskene er ikke rapporteret udelukkende for at blive opdaget over en vilkårlig baggrundsniveau. I stedet, kun fiskene at ændre som reaktion på en given stimulation er rapporteret. Mens høj MFI kan være forårsaget af uspecifik støj, ville denne støj ikke forventes at ændre med stimulation. Desuden blev en portion (10-20%) af tilstands afhængige interaktioner observeret er generelt bekræftet af en anden metode, typisk IP-vestlig. Denne bekræftelse svarer til at bekræfte resultaterne af RNA-sekvensering med høj gennemløb med RT-PCR og er beregnet til at øge tilliden til QMI-resultater.

Udtryks effekter, der påvirker QMI-resultater, kan ikke udelukkes uden yderligere tests, fordi QMI ikke skelner mellem forhøjede absolutte niveauer af et protein og øget homo-multimerisering af et protein. For at minimere usikkerhed om ekspression kan eksperimenter udføres ved hjælp af akutte behandlingsforhold med korte tidshorisonter, der minimerer potentielle ændringer i protein ekspressions niveauerne. Andre metoder er nødvendige for at udelukke udtryks effekter i kroniske behandlingsforhold eller primære patientprøver.

Det er vigtigt at vælge en passende lysis-buffer til QMI. For svagt af et vaskemiddel kan efterlade membraner intakt og holde sammen proteiner, der ikke er i kompleks, mens for stærk et vaskemiddel kan ødelægge protein komplekser. Yderligere faktorer såsom tilstedeværelsen af calcium eller dets chelatorer kan dramatisk påvirke fiskene og bør nøje overvejes, før screening antistoffer til at omfatte i en QMI panel. For IP-vestlige eksperimenter, er lysis betingelser normalt optimeret for hver fiskene fra sag til sag, men de bedste betingelser for påvisning af en enkelt fiskene kan ikke oversætte til andre fiskene i samme proteinnetværk22. Valg af vaskemiddel præsenterer et dilemma mellem kylling og æg, idet der er behov for en lyse buffer til at screene antistof kandidater, men et panel af antistoffer er nødvendigt for at screene for en passende lyse buffer. Selvom det ikke er en perfekt løsning, kan man vælge et lille panel af perler og sonder, som er af særlig interesse og/eller har kendte foreninger eller dissociationer som reaktion på en stimulus, og teste deres opførsel under forskellige lyse forhold på CML perler oprindeligt anvendt til screening af antistoffer (trin 1.1.3). Et ideelt rengøringsmiddel bør give mulighed for både pålidelig påvisning af fiskene og rekapitulation af kendt fysiologisk protein adfærd (Association/dissociation) med en given stimulus. Hvis der er nogen bekymring for, at et vaskemiddel ikke helt solubilize membraner, en negativ kontrol antistof kan tilsættes, der ville kun give signal, hvis to proteiner var forbundet med membran24. Når der vælges passende lyse buffere, kan ændringer i selv svage interaktioner-såsom dem mellem en kinase og substrat-påvises pålideligt (f. eks. TCR-LCK)14.

Tidligere arbejde med QMI i neuroner og T-celler har begge omhyggeligt bekræftet tidligere Fund for at øge tilliden til validiteten af QMI resultater, og genereret nye hypoteser, der førte til opdagelser om signaltransduktion og sygdoms veje. I fremtiden kan QMI tilpasses til andre protein interaktions netværk og udvides op til 500 proteiner med de nuværende mikrosphere klasser til rådighed. Brug af QMI til at studere, hvordan netværk af multi-protein komplekser ændrer sig som respons på stimuli, da de kontrollerer cellulære processer, har potentialet til at give vigtig indsigt i både sundhed og sygdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker at anerkende Tessa Davis for vigtige bidrag til QMI assay udvikling, og nuværende og tidligere medlemmer af Smith og Schrum Labs for teknisk vejledning og intellektuelle input. Dette arbejde blev finansieret af NIMH Grants R01 MH113545 og r00 MH 102244.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well flat bottomed plates Bio Rad 171025001
96-well PCR plates VWR 82006-704
Bioplex 200 System with HTF Bio Rad 171000205 modiefied to keep partially refrigerated, see Figure S1 for details
Bio-Plex Pro Wash Station Bio Rad 30034376
BSA Sigma
CML beads Invitrogen C37481
EDTA Sigma E6758
EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin Thermo Scientific A39256
MagPlex Microspheres Luminex MC12xxx-01 xxx is the 3 digit bead region
Melon Gel IgG Spin Purification Kit Thermo Scientific 45206 used for antibody purification
MES Sigma M3671
Microplate film, non-sterile USA Scientific 2920-0000
Phosphotase inhibitor cocktail #2 Sigma P5726
Protease inhibitor cocktail Sigma P8340
Sandwich Prep Refrigerator Norlake SMP 36 15 for custom refrigeration of Bioplex 200
Sodium fluoride Sigma 201154
Sodium orthovanadate Sigma 450243
Streptavidin-PE BioLegend 405204
Sulfo NHS Thermo Scientific A39269
Tris Fisher Scientific BP152

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pawson, T., Nash, P. Protein-protein interactions define specificity in signal transduction. Genes and Development. 14 (9), 1027-1047 (2000).
  2. Rodríguez-Jorge, O., et al. Cooperation between T cell receptor and Toll-like receptor 5 signaling for CD4. Science Signaling. 12 (577), (2019).
  3. Bugaj, L. J., et al. Cancer mutations and targeted drugs can disrupt dynamic signal encoding by the Ras-Erk pathway. Science. 361 (6405), (2018).
  4. Pawson, T. Dynamic control of signaling by modular adaptor proteins. Current Opinion in Cell Biology. 19 (2), 112-116 (2007).
  5. Hamm, H. E. The many faces of G protein signaling. Journal of Biological Chemistry. 273 (2), 669-672 (1998).
  6. Lohse, M. J., Hofmann, K. P. Spatial and Temporal Aspects of Signaling by G-Protein-Coupled Receptors. Molecular Pharmacology. 88 (3), 572-578 (2015).
  7. Eltschinger, S., Loewith, R. TOR Complexes and the Maintenance of Cellular Homeostasis. Trends in Cell Biology. 26 (2), 148-159 (2016).
  8. Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (2), 99-111 (2005).
  9. Komarova, N. L., Zou, X., Nie, Q., Bardwell, L. A theoretical framework for specificity in cell signaling. Molecular Systems Biology. 1, 23 (2005).
  10. Schrum, A. G., Gil, D. Robustness and Specificity in Signal Transduction via Physiologic Protein Interaction Networks. Clinical and Experimental Pharmacology. 2 (3), (2012).
  11. De Las Rivas, J., Fontanillo, C. Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks. PLoS Computational Biology. 6 (6), 1000807 (2010).
  12. Ron, D., Walter, P. Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (7), 519-529 (2007).
  13. Bogdan, A. R., Miyazawa, M., Hashimoto, K., Tsuji, Y. Regulators of Iron Homeostasis: New Players in Metabolism, Cell Death, and Disease. Trends in Biochemical Sciences. 41 (3), 274-286 (2016).
  14. Smith, S. E., et al. Multiplex matrix network analysis of protein complexes in the human TCR signalosome. Science Signaling. 9 (439), 7 (2016).
  15. Schrum, A. G., et al. High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry. Science's STKE. 2007 (389), (2007).
  16. Brown, E. A., et al. Clustering the autisms using glutamate synapse protein interaction networks from cortical and hippocampal tissue of seven mouse models. Molecular Autism. 9 (1), 48 (2018).
  17. Lautz, J. D., Brown, E. A., Williams VanSchoiack, A. A., Smith, S. E. P. Synaptic activity induces input-specific rearrangements in a targeted synaptic protein interaction network. Journal of Neurochemistry. 146 (5), 540-559 (2018).
  18. Smith, S. E., et al. Signalling protein complexes isolated from primary human skin-resident T cells can be analysed by Multiplex IP-FCM. Experimental Dermatology. 23 (4), 272-273 (2014).
  19. Neier, S. C., et al. The early proximal αβ TCR signalosome specifies thymic selection outcome through a quantitative protein interaction network. Science Immunology. 4 (32), (2019).
  20. Davis, T. R., Schrum, A. G. IP-FCM: immunoprecipitation detected by flow cytometry. Journal of Visualized Expiriments. (46), (2010).
  21. Smith, S. E., et al. IP-FCM measures physiologic protein-protein interactions modulated by signal transduction and small-molecule drug inhibition. PLoS One. 7 (9), 45722 (2012).
  22. Lautz, J., et al. Activity-dependent changes in synaptic protein complex composition are consistent in different detergents despite differential solubility. BioRXiv. , (2019).
  23. Langfelder, P., Horvath, S. WGCNA: an R package for weighted correlation network analysis. BMC Bioinformatics. 9, 559 (2008).
  24. Schrum, A. G., Gil, D., Turka, L. A., Palmer, E. Physical and functional bivalency observed among TCR/CD3 complexes isolated from primary T cells. Journal of Immunology. 187 (2), 870-878 (2011).

Tags

Biokemi IP-FCM proteomics protein interaktion signalering immunopræcipitation QMI
Kvantificering af protein interaktions netværk dynamik ved hjælp af Multiplexed Co-Immunopræcipitation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brown, E. A., Neier, S. C.,… More

Brown, E. A., Neier, S. C., Neuhauser, C., Schrum, A. G., Smith, S. E. P. Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation. J. Vis. Exp. (150), e60029, doi:10.3791/60029 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter