Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Kwantificering van eiwit interactie netwerk dynamiek met Multiplexed co-immunoprecipitatie

Published: August 21, 2019 doi: 10.3791/60029
Automatic Translation
1,2, 3,4, 5, 6,7,8, 1,2,9
1Center for Integrative Brain Research, Seattle Children's Research Institute, 2Graduate Program in Neuroscience, University of Washington, 3Department of Cancer Immunology and Virology, Dana-Farber Cancer Institute, Department of Medicine, Harvard Medical School, 4Broad Institute of Harvard and MIT, 5Department of Mathematics, University of Houston, 6Department of Molecular Microbiology and Immunology, School of Medicine, University of Missouri, 7Department of Surgery, School of Medicine, University of Missouri, 8Department Bioengineering, College of Engineering, University of Missouri, 9Department of Pediatrics, University of Washington

Summary

Kwantitatieve multiplex Immunoprecipitation (QMI) gebruikt Flowcytometrie voor gevoelige detectie van verschillen in de overvloed van gerichte eiwit-eiwit interacties tussen twee monsters. QMI kan worden uitgevoerd met een kleine hoeveelheid biomateriaal, vereist geen genetisch gemanipuleerde Tags en kan worden aangepast voor elk eerder gedefinieerd proteïne-interactie netwerk.

Abstract

Dynamische eiwit-eiwit interacties beheersen cellulair gedrag, van beweeglijkheid tot DNA-replicatie tot signaaltransductie. Het monitoren van dynamische interacties tussen meerdere eiwitten in een proteïne-interactie netwerk is echter technisch moeilijk. Hier presenteren we een protocol voor kwantitatieve multiplex-immunoprecipitatie (QMI), dat kwantitatieve beoordeling van vouw veranderingen in eiwit interacties mogelijk maakt op basis van relatieve fluorescentie metingen van eiwitten in gedeelde complexen gedetecteerd door blootgestelde Oppervlakte epitopen (vissen). In QMI worden eiwitcomplexen van celllysates op microsferen immunoprecipitated en vervolgens gepropageerd met een gelabeld antilichaam voor een ander eiwit om de overvloed aan vissen te kwantificeren. Immunoprecipitation-antilichamen worden geconjugeerd aan verschillende MagBead-spectrale gebieden, waardoor een flow-cytometer meerdere parallelle immunoprecipitaties kan differentiëren en tegelijkertijd de hoeveelheid sonde-antilichamen die aan elk is gekoppeld, kwantificeren. QMI vereist geen genetische tagging en kan worden uitgevoerd met behulp van minimale biomateriaal in vergelijking met andere immunoprecipitatie-methoden. QMI kan worden aangepast voor elke gedefinieerde groep van de interactie eiwitten, en is tot nu toe gebruikt voor het karakteriseren van signalering netwerken in T-cellen en neuronale glutamaat synapsen. Resultaten hebben geleid tot nieuwe hypothese generatie met potentiële diagnostische en therapeutische toepassingen. Dit protocol bevat instructies voor het uitvoeren van QMI, vanaf de initiële selectie van het antilichaam-panel tot en met het uitvoeren van assays en het analyseren van gegevens. De initiële assemblage van een QMI-test omvat het screenen van antilichamen voor het genereren van een panel en het empirisch bepalen van een geschikte lysisbuffer. Het daaropvolgende reagens preparaat omvat covalent koppelen van immunoprecipitatie antilichamen tegen MagBeads, en biotinylating probe antilichamen, zodat ze kunnen worden gelabeld door een streptavidine-geconjugeerd fluorophore. Om de test uit te voeren, wordt lysaat 's nachts gemengd met magbeads, en vervolgens worden kralen verdeeld en geïntrigeerd met verschillende sonde-antilichamen, en vervolgens een de-label, en gelezen door flow cytometrie. Er worden twee statistische tests uitgevoerd om vissen te identificeren die significant verschillen tussen de experimentele omstandigheden, en de resultaten worden gevisualiseerd met behulp van Heatmaps of node-Edge diagrammen.

Introduction

Dynamische eiwit-eiwit interacties vormen de moleculaire signalering Cascades en beweeglijke structuren die de functionele basis van de meeste cellulaire fysiologie zijn1. Deze processen worden vaak afgebeeld als lineaire signalerings trajecten die schakelen tussen stabiele toestanden op basis van enkelvoudige ingangen, maar experimentele en modellerings gegevens tonen duidelijk aan dat ze functioneren als geïntegreerde netwerken2,3, 4. in het geval van G-eiwitten hebben verschillende receptoren vaak de mogelijkheid om hetzelfde g-eiwit te activeren, en een enkele receptor kan ook meer dan één type g-eiwit5,6activeren. Om het relatief kleine aantal G eiwit klassen specifiek te moduleren een breed scala van cellulaire functies zoals synaptische transmissie, hormoon regulatie, en Celmigratie, cellen moeten beide integreren en differentiëren deze signalen4 , 5. uit bewijsmateriaal is gebleken dat de specificiteit van dit signaal, zowel voor G-eiwitten als voor anderen, primair wordt afgeleid op basis van fijn afgestemde eiwit-eiwit interacties en hun temporele dynamiek1,3, 4 , 5 , 6 , 7. omdat signalerings netwerken bestaan uit dynamische eiwitcomplexen met meerdere ingangen, outputs en feedbacklussen, heeft één enkele perturbatie de mogelijkheid om het algemene homeostatische evenwicht van de Fysiologie van een cel te veranderen4 ,7. Het is nu algemeen overeengekomen dat signalering vanuit een netwerk perspectief moet worden onderzocht om beter te begrijpen hoe de integratie van meerdere ingangen discrete cellulaire functies regelt in gezondheid en ziekte7,8, 9,10,11,12,13. In het licht hiervan werd kwantitatieve multiplex Immunoprecipitation (QMI) ontwikkeld om middelmatige doorvoer te verzamelen, kwantitatieve gegevens over vouw veranderingen in dynamische proteïne-interactie netwerken.

QMI is een op antilichamen gebaseerde test waarbij cellysaat wordt geïnineerd met een panel van immunoprecipitatie-antilichamen die covalent zijn gekoppeld aan magnetische kralen met duidelijke verhoudingen van fluorescerende kleurstoffen. Het hebben van specifieke antilichamen gekoppeld aan verschillende magnetische kraal klassen zorgt voor gelijktijdige co-immunoprecipitatie van meerdere doel eiwitten uit hetzelfde lysaat. Na immunoprecipitatie (IP) worden magnetische kralen geïnfiltreerd met een tweede, fluorophore-geconjugeerd sonde antilichaam (of biotinyleerd antilichaam in combinatie met fluorophore-geconjugeerde streptavidin). Co-associaties tussen de eiwitten die worden herkend door elk IP-antilichaam-sonde antilichaam paar, of vissen (eiwitten in gedeelde complexen gedetecteerd door blootgestelde oppervlak Epitopes), worden vervolgens gedetecteerd door Flowcytometrie en kunnen kwantitatief worden vergeleken tussen verschillende voorwaarden14. Illustraties in Figuur 1 tonen de stappen die betrokken zijn bij het uitvoeren van een QMI-test, waaronder een diagram van magnetische parels met immunoprecipitated proteïne complexen gelabeld door fluorescently geconjugeerde sonde-antilichamen (Figuur 1C).

De gevoeligheid van QMI is afhankelijk van de eiwitconcentratie van het lysaat ten opzichte van het aantal magnetische kralen dat wordt gebruikt voor immunoprecipitatie, en het bereiken van een resolutie voor het detecteren van 10% vouw veranderingen vereist slechts een kleine hoeveelheid startmateriaal in vergelijking met andere Co-IP-methoden14,15. De hoeveelheid uitgangsmateriaal die wordt gebruikt in QMI is bijvoorbeeld vergelijkbaar met die welke vereist is voor een sandwich-enzym-linked ImmunoSorbent assay (ELISA), maar er worden meerdere interacties gedetecteerd in één QMI-test. QMI assays met behulp van 20 IPs en 20 sonde targets zijn uitgevoerd met behulp van 1-5 x 105 primaire T-cellen geïsoleerd uit een 4 mm huid biopsie, P2 synaptosomale preparaten uit een 3 mm coronale sectie van muis prefrontale cortex, of 3 x 106 gekweekte muis primaire corticale neuronen14,16,17. Deze gevoeligheid maakt QMI nuttig voor analyse van cellen of weefsel met beperkte beschikbaarheid, zoals klinische monsters.

QMI kan worden aangepast voor elk eerder gedefinieerd proteïne-interactie netwerk (op voorwaarde dat antilichamen beschikbaar zijn), en tot op heden is ontwikkeld om de T Cell antigen receptor (TCR) signalosome te analyseren en een subset van eiwitten bij glutamaterge synapsen in neuronen 17 , 18. in studies van T Cell receptor signalering werd QMI voor het eerst gebruikt om stimulatie veroorzaakte veranderingen in vissen te identificeren, en vervolgens om auto-immuunpatiënten van een controlegroep te onderscheiden, endogene auto-immuunsigna lering te detecteren en tot slot een hypothese met betrekking tot een onevenwichtige ziekte-geassocieerde subnetwerk van interacties14. Meer recentelijk werd hetzelfde QMI-panel gebruikt om te bepalen dat de selectie van thymocyte wordt bepaald door kwantitatieve, in plaats van kwalitatieve verschillen in TCR-geassocieerde proteïne-signalering19. In neuronen werd QMI gebruikt om input-specifieke herschikking van een proteïne-interactie netwerk te beschrijven voor verschillende typen ingangssignalen op een manier die nieuwe opkomende modellen van synaptische plasticiteit17ondersteunt. Bovendien, dit synaptische QMI panel werd gebruikt om de verschillen in zeven Muismodellen van autisme identificeren, cluster de modellen in subgroepen op basis van hun vissen biosignatures, en nauwkeurig veronderstellen een gedeeld moleculair tekort dat voorheen niet werd herkend in een van de modellen16. Een soortgelijke benadering kan worden gebruikt om te schermen voor andere subgroepen die kunnen reageren op verschillende medicamenteuze behandelingen, of om drugs toe te wijzen aan specifieke responsieve subgroepen. QMI heeft potentiële toepassingen in diagnostiek, het ondertypen van patiënten en de ontwikkeling van geneesmiddelen, naast de basiswetenschap.

Om een QMI-antilichaam paneel samen te stellen, worden de eerste antilichamen screening en selectie protocollen beschreven in sectie 1 hieronder. Wanneer antilichamen worden geïdentificeerd, worden de protocollen voor conjugatie van de geselecteerde antilichamen tegen magnetische kralen voor IP en voor biotinylatie van de geselecteerde antilichamen van de sonde beschreven in rubriek 2. Het protocol voor het uitvoeren van de QMI-test op cel-of weefsel lysaten wordt beschreven in rubriek 3. Ten slotte, omdat een enkel experiment kan genereren ~ 5 x 105 individuele data Points, instructies en computercodes om te helpen bij de verwerking van gegevens, analyse en visualisatie worden gegeven in sectie 4. Een overzicht van de werkstroom die wordt beschreven in secties 2-4 wordt weergegeven in Figuur 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ontwerp van de assay

  1. Voorbereiding van kandidaat-antilichamen
    1. Voor elk eiwit van belang, kies 3 tot en met 5 antilichamen op het scherm. Gebruik indien mogelijk monoklonale antilichamen die verschillende epitopes herkennen. Ook een niet-specifieke controle antilichamen bevatten.
    2. Om tris te verwijderen, voert u buffer uitwisseling uit door het antilichaam toe te voegen aan een 30 kDa-spin filter, te draaien tot het minimum volume, 500 μL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toe te voegen en 3 keer te herhalen. Om drager eiwitten te verwijderen, voert u de antilichaam zuivering uit volgens het Protocol van de fabrikant (Zie tabel van de materialen voor specifieke zuivering aanbeveling).
      Opmerking: dit wordt gedaan omdat drager eiwitten en buffers met vrije amine groepen (zoals tris) zullen reageren met COOH groepen en de daaropvolgende kraal koppeling en biotinylatie reacties moeten doven. Zorg ervoor dat alle antilichamen worden gezuiverd (geen drager eiwitten) en in een buffer zonder primaire amines (d.w.z. geen tris).
    3. Koppel elk antilichaam aan carboxylaat gemodificeerde latex (CML) kralen zoals beschreven door Davis en Schrum20. Om het antilichaam te sparen, moet u de kraal koppelings reacties met maximaal 1/5 (d.w.z. 3,6 x 106 parels met 10 μL van 0,2-1 mg/ml antilichaam) opschalen.
    4. Geschatte kraal nummers met behulp van een hemocytometer (meestal ~ 108/ml) en bewaren bij 4 °c. Kralen zijn opgeslagen voor meer dan een jaar en met succes gebruikt in QMI assays, maar houdbaarheid of vervaldata zijn niet formeel vastgesteld. NaN3 in de B/S buffer voorkomt bacteriële groei.
    5. Biotinylaat een deel van elk antilichaam (zie punt 2,2 hieronder). Bewaren bij 4 °C.
    6. Bevestig effectieve CML kraal koppeling en nauwkeurig tellen door kleuring 1 x 105 kralen met een PE-geconjugeerd antilichaam reactieve aan de soort waarin het antilichaam is opgegroeid en het lezen van een flow-cytometer.
    7. Bevestig antilichaam biotinylatie door dot Blot met behulp van streptavidin-HRP.
    8. Zodra het lab reagentia heeft gegenereerd waarvan bekend is dat ze effectief zijn, gebruikt u die reagentia als positieve controles in de bevestigings reacties in de stappen 1.1.5 en 1.1.6.
  2. Screening van antilichamen door IP-FCM (immunoprecipitatie gedetecteerd door flow cytometrie)
    1. Beslissen over een geschikte screening lysate. Voor deze en alle andere pre-QMI screening stappen (alles inbegrepen in deze sectie 1: assay ontwerp), gebruik geen biosamples met beperkte beschikbaarheid. Kies in plaats daarvan een vergelijkbaar controlemateriaal zoals wild type muis weefsel, cellijnen of normaal menselijk donor weefsel dat geen beperkende bron is.
      Opmerking: het kiezen van een lysisbuffer voor deze test is niet triviaal, en wordt besproken in paragraaf 1,5: detergenten selectie, evenals in de voorlaatste paragraaf van de discussie sectie. Standaard lysisbuffers hebben een basis van 150 mM NaCl, 50 mM tris (pH 7,4), 10 mM Natriumfluoride, 2 mM natrium orthovanadaat, en protease-en fosfatase-remmers cocktails. Detergenten die compatibel zijn met QMI zijn onder meer 1% NP-40, 1% digitonin, 0,1-1% Triton X-100 en 0,5-1% deoxycholaat14,16,17,18,19,21.
    2. Bereken het totale volume lysaat dat voor elk IP-adres moet worden gebruikt, met 10 μL voor elke te screenen IP-probe-combinatie. Bij het screenen van X-sonde-antilichamen en het gebruik van één IgG-regeling, zal elk IP-adres (X + 1) * (10 μL) * (1,1 voor Pipetteer fout) gebruiken; X + 1 is om rekening te kunnen maken met de vereiste IgG-sonde controle. Bijvoorbeeld, in een 3x3 antilichaam scherm, elk IP moet 44 ul gebruiken. Vergeet niet een IgG IP-besturingselement op te nemen (zie voorbeeld screening-instellingen in Figuur 2).
    3. Bereken het CML kraal nummer dat moet worden gebruikt. Als u X sonde-antilichamen screening, gebruik [(X + 1) * 5 X 104 kralen]. Idealiter zullen 5.000 kralen per well resulteren in > 2000 kralen per goed gelezen door de flow cytometer. Bijvoorbeeld, in een 3 x 3 antilichaam scherm, elk IP moet 20.000 kralen, die ongeveer 0,66 μL van bereide CML kraal voorraad uit stap 1.1.3 (kralen moeten eerst worden gekwantificeerd met behulp van een hemocytometer om nauwkeurigheid te garanderen).
    4. Inbroed het volume van lysaat van stap 1.2.2 met het volume van elke cml kraal te worden gescreend vanaf stap 1.2.3, 's nachts bij 4 ° c met rotatie om te voorkomen dat kralen te vestigen. Voer gewoonlijk incubaties uit in de eerste kolom van een 96-well PCR-plaat en dop met PCR-buisstrip doppen.
    5. Spin neer cml kralen bij 3.200 x g gedurende 1 minuut en verwijder lysaat door een enkele, snelle al vegend van de plaat over de gootsteen. Een kleine witte pellet moet zichtbaar zijn aan de onderkant van elk goed, zowel voor als na het flicking.
    6. Respendeer CML kralen in een volume FlyP buffer tot 20 μL voor elk paar van de kraal sonde; voor X-sonde-antilichamen, gebruik (X + 1) * (20 μL) * (1,1 voor Pipetteer fout), vergelijkbaar met stap 1.2.2. Voor een 3 x 3-scherm, respendeert u in 88 μL FlyP-buffer. FlyP-buffer is 100 mM NaCl, 50 mM tris pH 7,4, 1% BSA, 0,01% NaN3.
    7. Verdeel elk IP over (X + 1) putten van een 96-well PCR-plaat, waarbij X het aantal sonde-antilichamen is dat wordt gescreend met 20 μL/well. Figuur 2 A toont een voorbeeld screening Setup.
    8. Was 2 extra keer met behulp van 200 μL FlyP-buffer per put. Draai de plaat zoals in stap 1.2.5 en veeg de plaat om de wasbuffer na elke wasbeurt te verwijderen. Pellets zullen extreem klein zijn, maar moeten na elke wasbeurt zichtbaar zijn.
    9. Bereken het totale volume (Y + 1) * 1,1 * 50 μL, waarbij Y het aantal IP-antilichamen is dat wordt gescreend voor elk biotinyleerd antilichaam dat wordt vertoond Verdun antilichamen tegen een werkconcentratie in dit volume van de FlyP-buffer, meestal beginnend met 1:100 verdunning van een 0,5 mg/mL kolf.
    10. Verdeel elke verdunde antilichaam naar beneden elke kolom van de 96 goed plaat, en zorg ervoor dat CML kralen worden geresuspendeerd.
    11. Inincuberen bij 4 °C gedurende 1 uur, hetzij met rotatie of pipetteren met intervallen van 15 minuten om ervoor te zorgen dat CML kralen in suspensie blijven.
    12. Was 3x in 200 μL FlyP-buffer, voor elke wascentrifuge en verwijder lysaat zoals in stap 1.2.5.
    13. Respendeer alle CML kralen in 50 μL van 1:200 Streptavidin-PE in FlyP buffer.
    14. Inincuberen bij 4 °C in het donker gedurende 30 minuten.
    15. Was 3x in 200 μL FlyP-buffer, voor elke wascentrifuge en verwijder lysaat zoals in stap 1.2.5.
    16. Respendeer in 200 μL FlyP-buffer en loop vervolgens op een flow-cytometer.
  3. Het kiezen van antilichamen om op te nemen in assay
    1. Poort op maat met FSC-h VS SSC-H, en Elimineer dubbeltjes met FSC-H vs FSC-A.
    2. Genereer histogrammen van de intensiteit van de PE-fluorescentie en overlay beide IgG-besturingselementen (IgG-kraal test sonde, test kraal-IgG-sonde) op geteste paren (Figuur 2).
    3. Kijk voor een kraal-probe paar dat duidelijk signaal over lawaai geeft (Figuur 2B). Bovendien is het niet ideaal om hetzelfde antilichaam te gebruiken voor zowel kraal als sonde. Differentiële epitoop herkenning maximaliseert de kans op het observeren van interacties, omdat sommige epitopen kunnen worden verstopt in bepaalde eiwitcomplexen. Als er geen acceptabele opties zijn, herhaalt u het scherm met extra antilichamen.
  4. Bevestiging van de specificiteit van antilichamen
    1. Om de specificiteit van het antilichaam voor de beoogde doelstellingen te waarborgen, moet een lysaat monster worden gebruikt waarin het doelwit is uitgeschakeld; bijvoorbeeld een knock-outmuis of een RNAi-cellijn. U ook lysaat gebruiken uit een doelnegatieve cellijn waarin het doeleiwit kunstmatig is uitgedrukt.
    2. Voer IP-FCM uit zoals beschreven in stap 1,2, aanpassen aan het experiment.
  5. Reinigingsmiddel selectie
    1. Aangezien detergenten kritisch zijn in co-IP-experimenten, testen ze verschillende variaties empirisch om ervoor te zorgen dat de assay een maximale kans op het detecteren van veranderingen heeft. Om te beginnen, kies een relatief klein panel van interacties (4-8) waarvan bekend is dat ze veranderen in een bepaalde voorwaarde en/of zijn van bijzonder belang voor uw studie.
    2. Met behulp van de niet-fluorescerende, antilichaam geconjugeerde CML kralen gemaakt voor de eerste schermen, voer IP-FCM zoals beschreven in 1,2 met behulp van gevarieerde lysis buffer reinigingsmiddel condities. Detergenten schermen kunnen worden uitgevoerd met detergens als enige variabele, of met verschillende celcondities voor elk reinigingsmiddel. Gebruik altijd IgG-bedieningselementen voor zowel kralen als sondes, aangezien detergenten af en toe onverwachte achtergrond in sommige combinaties van IP-probe produceren.
    3. Op basis van de Mfi's van het scherm, kies een wasmiddel dat het signaal voor de vissen van belang optimaliseert. Het is waarschijnlijk dat er een aantal compromissen moet worden gesloten22.

2. multiplex reagens voorbereiding

  1. Magnetische kraal koppeling
    1. Selecteer met behulp van de magnetische kraal regiokaart, kraal gebieden te gebruiken in een patroon dat het risico van kruis detectie minimaliseert. Magnetische kraal meestal uitsmeren en naar rechts, dus vermijd kraal gebieden die diagonaal aangrenzend. Kralen van elke andere kolom van het kraal diagram getoond op de website van luminex worden aanbevolen (https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/).
    2. Bereid het drager vrije antilichaam voor op 0,1 mg/mL in PBS (zoals in 1.1.2) in 250 μL. Blijf op ijs voor later gebruik.
    3. Vortex magnetische kralen uitgebreid, en vervolgens aliquot 250 μL in een Amber micro centrifugebuis (om kralen te beschermen tegen fotobleaching).
    4. Magnetisch gescheiden magnetische kralen voor 60 s en verwijder het supernatant.
    5. Voeg 250 μL MES-buffer (50 mM MES pH 6,0, 1 mM EDTA), Vortex, magnetisch gescheiden voor 60 s, en verwijder het supernatant. Herhaal en rebreng magnetische parels in 200 μL MES-buffer.
    6. Voeg 40 μL MES toe aan een 2 mg buis van sulfo-NHS voor eenmalig gebruik om een 50 mg/mL kolf te maken.
    7. Voeg 25 μL vers gemaakte sulfo-NHS toe aan de magnetische kralen. Vortex.
    8. Voeg 25 μL van 50 mg/mL vers opgeloste EDAC [1-ethyl-3-( -3-Dimethylaminopropyl) Carbodiimide hydrochloride, ook wel EDC genoemd] toe aan de MES-buffer. Vortex.
    9. Bedek en schud op een vortexer met een buis houder voor 20 minuten bij kamertemperatuur, 1000 rpm.
    10. Magnetisch gescheiden voor 60 s en verwijder het supernatant.
    11. Respendeer in 500 μL PBS, Vortex, magnetisch gescheiden voor 60 s en verwijder het supernatant. Herhaal.
    12. Respenderen in 250 μL antilichaam oplossing uit stap 2.1.2. Vortex.
    13. Incuberen 2 uur bij kamertemperatuur met schudden op een vortexer bij 1000 rpm.
    14. Voeg 500 μL PBS toe aan de magnetische kralen, Vortex, magnetisch gescheiden voor 60 s, en verwijder het supernatant.
    15. Voeg 750 μL blokkering/opslag (B/S) buffer toe (1% BSA in PBS pH 7,4, 0,01% NaN3). Bedek en incuberen 30 min bij kamertemperatuur, 1000 rpm.
    16. Magnetisch gescheiden voor 60 s en verwijder het supernatant. Respenderen in 100 μL B/S buffer.
    17. Bewaren bij 4 °C. Kralen zijn opgeslagen voor meer dan een jaar en met succes gebruikt in QMI assays, maar houdbaarheid of vervaldata zijn niet formeel vastgesteld. NaN3 in de B/S buffer moet bacteriegroei voorkomen.
    18. Valideer magnetische kraal koppeling door kleuring ~ 0,25 μL van gekoppelde magnetische kralen met een fluorescerende anti-hostsoort secundair en lezing op een flow cytometer, zoals in stap 1.1.5.
  2. Biotinylation
    1. Zorg ervoor dat antilichamen zich in PBS bevinden zonder dragerproteïne.
    2. Bereken het totale aantal μg antilichamen als biotinyated (100-200 μg aanbevolen voor gebruik in multiplex, 25-50 μg aanbevolen voor screening).
    3. Bereid verse 10 mM sulfo-NHS-Biotine (kan worden gedaan door toevoeging van 224 μL ddH2O aan een 1 mg no-weeg buis).
    4. Voeg 1 μL 10 mM sulfo-NHS-Biotine toe per 25 μg antilichaam, Vortex of pipet op en neer om te mengen.
    5. Incuberen bij kamertemperatuur voor 1 uur.
    6. Incuberen bij 4 °C gedurende 1 uur.
    7. Gebruik een 30 kDa-spin filter om ongebonden Biotine te verwijderen en de reactie te stoppen. Voeg 500 μL PBS toe en draai de kolom om tot het minimum volume is bereikt. Voeg 500 μL extra PBS toe en herhaal dit voor 3 totale buffer uitwisselingen.
    8. Bereken de concentratie door de extinctie van 1-2 μL op een spectrofotometer te meten en breng de antilichaam concentratie vervolgens naar 0,5 mg/mL.
    9. Bewaren bij 4 °C.

3. kwantitatieve multiplex immunoprecipitatie

  1. Plaat indeling
    Opmerking: deze test werkt het best wanneer uitgevoerd met 96-well platen en 2-4 sample condities.
    1. Voer altijd passende controles (d.w.z. gestimuleerd v. ongestimuleerde cellen) op dezelfde plaat om veranderingen tussen de condities te detecteren. Verdeel elk monster horizontaal over de plaat en gebruik elke kolom voor een ander antilichaam van de sonde. Een set van technische replicaten voor elke sonde moet worden uitgevoerd onmiddellijk na de eerste set. Zie afbeelding 3 voor een voorbeeld.
    2. Documenteer zorgvuldig de plaat indeling om nauwkeurige plaat belasting en-analyse te vergemakkelijken.
  2. Monstervoorbereiding & immunoprecipitatie (dag 1)
    1. Lyse weefsels of cellen in geschikt reinigingsmiddel met protease-en fosfatase remmers en incuberen op ijs gedurende 15 minuten. Wees voorzichtig om het lysaat te allen tijde koud te houden.
      Opmerking: de precieze hoeveelheid van het vermelden van de eiwitconcentratie van biomateriaal en lysaat moet empirisch worden bepaald, en enkele voorbeelden van eerder gebruikte monsters zijn opgenomen in de derde alinea van de inleiding. Over het algemeen is in het bereik van 200 μL van 2 mg/mL eiwit per monster in het verleden succesvol geweest voor 20 IP-en 20-sonde targets, maar ideale ingangen voor elk antilichaam paneel en cel of weefseltype moeten empirisch worden bepaald.
    2. Spin naar beneden bij 4 °C gedurende 15 minuten bij 16.000 x g om membranen en puin te verwijderen; Bewaar supernatant als lysaat.
    3. Voer een BCA-assay of soortgelijke te bepalen eiwit concentraties, en vervolgens normaliseren eiwitconcentratie tussen monsters. Als u cellen gebruikt, begint u met een gelijk aantal cellen per voorwaarde en normalisering is optioneel.
    4. Bereid een Master magnetische kraal mix die ~ 250 magnetische kralen van elke klasse per put in de assay bevat. Pas de kraal nummers na de data-analyse, zodat in de toekomst assays een gemiddelde van 110 kralen van elke klasse zal worden gelezen per put.
      Opmerking: voorbeeld berekening: (nieuwe kraal volume) = [(run average)/110] * (vorige kraal volume). Kraal volumes moeten op deze manier worden aangepast over elke 8 runs of indien nodig. Typisch, 3-4 μL van elke magnetische kraal (bereid als hierboven) worden gebruikt voor een 2-plaat experiment.
    5. Was de magnetische kraal mix 2x in FlyP buffer met magnetische scheiding, en vervolgens respenderen in FlyP buffer. Gebruik voor resuspensie 10 μL per monster per plaat. FlyP-buffer is 100 mM NaCl, 50 mM tris pH 7,4, 1% BSA, 0,01% NaN3.
    6. Na grondig grondig van de magnetische kraal mix, aliquot 10 μL in ijskoude micro centrifugebuizen (één buis per monster). Voeg gelijke hoeveelheden lysaat (met genormaliseerde concentraties) toe aan elke buis voor immunoprecipitatie.
    7. Aliquot het lysaat-magnetische kraal mengsel in één buis voor elke plaat die wordt uitgevoerd; bijvoorbeeld voor een 2-plaat experiment, splitsen het lysaat in twee buizen. Plaats tubes op een Rotator bij 4 °C 's nachts voor immunoprecipitatie, bedekt om licht te houden.
  3. De test uitvoeren (dag 2)
    1. Begin met de lysate-magnetische kraal buizen voorplaat #1. Gebruik een magnetisch kraal rek om lysaat van de magnetische kralen te verwijderen en reserveer lysaat voor toekomstige analyse. Was kralen 2x in 500 μL ijskoude FlyP-buffer. Houd buizen buizen altijd op ijs of bij 4 °C.
    2. Bereken het volume van de resuspensie als (aantal sondes) * (2 technische replicaten) * (25 μL per put) * (1,1 voor Pipetteer fout). Respendeer IPs in het berekende volume van de ijskoude FlyP-buffer.
    3. Na grondig resuspende magnetische kralen door voorzichtig pipetteren, verdelen 25 μL per goed over een vlakke bodem 96 goed plaat, op ijs.
    4. In een andere 96-well plaat, verdunde biotinyleerd probe antilichamen tot 2x werkconcentratie (werkconcentratie is meestal 1:100 of 1:200, empirisch bepaald) in flyp buffer zodat de volgorde overeenkomt met de kolommen op de plaat indeling (Zie Figuur 3 ). Het laatste volume aan sonde-antilichamen bij de werkconcentratie is 50 μL per put, dus het volume van elk 2x antilichaam dat wordt bereid, dient te zijn (25 μL) * (aantal biologische monsters) * (2 technische replicaten) * (1,1 voor Pipetteer fouten).
    5. Gebruik een multikanaalspipet om 25 μL van elke verdunning van de sonde antilichamen in de magnetische kraal-bevattende test plaat te verdelen.
    6. Schud op een horizontale plaat Shaker om de magnetische kralen te mengen en te hervatten, en vervolgens te inbroeden bij 4 °C gedurende 1 uur, schudden bij 450 rpm in het donker.
    7. Was 3x met FlyP-buffer op een magnetische plaat ring bij 4 °C.
    8. Respendeer de magnetische kralen in 50 μL van 1:200 Streptavidin-PE.
    9. Schud om kralen te mengen en te remixen, en inincuberen bij 4 °C gedurende 30 minuten, schudden bij 450 rpm in het donker.
    10. Was 3x met FlyP-buffer op een magnetische plaat ring bij 4 °C.
    11. Respenderen in 125 μL FlyP-buffer.
    12. Schud gedurende 1 minuut bij 900 rpm om kralen grondig te hervatten.
    13. Uitvoeren op gekoelde flow-cytometer (Zie afbeelding in figuur S1). Gebruik de instelling ' High RP1 target ' in de flow cytometer-software en een stopvoorwaarde van 1.000 kralen per regio (het getal dat in een bepaald individu moet voorkomen dat de machine vroegtijdig stopt) en het monstervolume van 80 μL, wordt sterk overgeschoten.
    14. Pauzeer de run halverwege en hervat de kralen om te voorkomen dat ze worden bezinken.
    15. Exporteer gegevensbestanden in de. XML-indeling.
    16. Herhaal het proces voor de resterende platen, beginnend bij stap 3.3.1.

4. gegevensanalyse

Opmerking: de ANC-code is ontworpen om twee voorwaarden te vergelijken van N = 4-experimenten, elk met 2 technische replicaten voor elke aandoening. Bijvoorbeeld, cellen worden gestimuleerd vier onafhankelijke tijden, QMI wordt uitgevoerd op vier verschillende dagen op de controle (ongestimuleerd) en gestimuleerd cellen, met technische replicaten zoals hierboven, en data-analyse wordt voortgezet zoals hieronder beschreven.

  1. Adaptieve niet-parametrische met instelbare Alfa cutoff (ANC)
    1. Open MATLAB en stel de Active Directory in op een map met de onderdelen van het ANC-programma en de. XML-bestanden die worden geëxporteerd vanuit de flow cytometer.
    2. Vul het "ANC input" bestand in om de details van het experimentele ontwerp weer te geven. Het voorbeeldbestand dat in het aanvullende bestand is opgenomen, is vooraf ingevuld om de voorbeeldgegevens te kunnen uitvoeren, ook beschikbaar.
    3. Voer het programma uit, dat een CSV-bestand naar de Active Directory zal schrijven. Het bestand rapporteert vissen die significant verschillend zijn, op een vals positief (alpha) niveau van 0,05, tussen controle en experimentele omstandigheden, in alle 4 experimentele replicaten, of ten minste 3/4 replicaten.
    4. Opmerking ' ANC hits ', die worden gedefinieerd als vissen met aanzienlijke verschillen in ten minste 3 experimentele replicaten, weergegeven als 3/4 ∩ 4/4 in het bestand, voor gebruik in stap 4.3.1.
  2. Gewogen correlatie netwerk analyse23 (CNA)
    1. Plakken-Transponeer de kolomtitels van de uitvoer van het gegevensbestand door MATLAB eindigend in "_MFI. CSV "in de eerste rij van een nieuw Excel-blad. Voeg de kolommen "experiment" voor experiment nummer, en "behandeling", voor experimentele behandeling, of andere variabelen worden geanalyseerd. Sla dit bestand op als "Eigenschappen. csv".
    2. Open R Studio en stel de werkmap in op een map met de "_MFI. CSV "en" Eigenschappen. CSV "-bestanden.
    3. Voer de R-opdrachten uit zoals aangegeven in het becommentarieerde opdracht bestand en de gedetailleerde instructies in de bestanden. De wcna modules significant gecorreleerd met elke experimentele eigenschap zijn uitvoer als een grafisch bestand, en de correlatie van elke interactie IPi_probeJ met elke module wordt uitgevoerd als een CSV-bestand.
    4. Opmerking ' CNA hits, ' die worden gedefinieerd als interacties met module lidmaatschap (MM) > 0,7 en p < 0,05 voor lidmaatschap van een module die is geïdentificeerd als significant gecorreleerd met de experimentele variabele van belang, voor gebruik in stap 4.3.1.
  3. Positieve ' hits ' & visualisatie
    1. Voor elke interactie in de "3/4 ∩ 4/4 hits" lijst in het ANC uitvoerbestand (uit stap 4.1.4), identificeren als die interactie is ook een "CNA hit" door het controleren van de CNA output bestand (zie stap 4.2.6). Maak een nieuwe kolom die aangeeft of elke ANC-hit ook een CNA-hit is.
    2. Bereken de gemiddelde log2 -voudige veranderingswaarde voor elke ANC ∩ CNA hit door gemiddelden van de waarden in de ANC output spreadsheet "_hits. csv" uit stap 4.1.3. Converteer waarden naar Log2 fold verandering voor het gemiddelde. Voor interacties die significant waren in slechts 3/4 replicaties, verwijdert u de waarde uitschieter.
    3. Maak een spreadsheet met elke ANC ∩ CNA hit vermeld als een IP in één kolom, een sonde in de tweede kolom, en de fold verandering waarde in de derde kolom. Gebruik dit werkblad om een knooppunt randdiagram in Cytoscape te maken door het bestand als een netwerk te importeren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Screening van antilichamen
Figuur 2 B toont de resultaten van een scherm voor de proteïne Connexin36. De meeste IP_probe-combinaties produceren geen signaal over IgG-besturingselementen. IP met het monoklonaal antilichaam 1E5 en sonde met 1E5 of het polyklonale antilichaam 6200 produceert een rechts verschuiving in de kraal verdeling in vergelijking met IgG-besturingselementen. Hier werden IP 1E5 en Probe 6200poly geselecteerd om te voorkomen dat hetzelfde antilichaam als IP en sonde werd gebruikt, zowel om de waarschijnlijkheid te verkleinen dat een niet-specifiek eiwit wordt herkend door twee onafhankelijke antilichamen, en om de kans op het opsporen van co-associaties te vergroten met verschillende epitopes. Het is het beste om een IP_probe combinatie te kiezen met ten minste 1-2 log hogere MFI in vergelijking met IgG-besturingselementen, maar af en toe paren die zwakkere Mfi's produceren die consistent te onderscheiden zijn van besturingselementen, kunnen worden gebruikt als er geen alternatieven worden geïdentificeerd. Figuur 2 C toont een specificiteits validatie-experiment voor de 1E5-6200poly combinatie. Lysate van 293 cellen getransffecteerd met een Connexin36 plasmide produceerde een ~ 1,5-log de verschuiving in de kraal verdeling, terwijl niet-getransfunde cellen overlapt met de IgG-besturingselementen. Bij het bevestigen van de specificiteit van een paar moet negatieve controle lysaat uit een afdek dier of cellijn zonder het doeleiwit een MFI hebben die vergelijkbaar is met de IgG-besturingselementen.

Kraal koppeling
Een typische magnetische kraal koppeling kwaliteitscontrole reactie geeft een MFI 3-4 logs boven achtergrond wanneer gekleurd met een secundair antilichaam geconjugeerd aan een de met een helderheids index tussen 3 en 5 (zoals PE of FITC). Figuur 4 toont een typische kwaliteitscontrole reactie die de conjugatie van een nieuwe magnetische kraal vergelijkt met de oudere batch die wordt vervangen.

Data-analyse
In elk experiment vergelijkt ANC de fluorescentie verdelingen van elke magnetische kraal klasse in elke put (d.w.z. alle mogelijke IP_Probe combinaties) tussen een door de gebruiker gedefinieerd besturingselement en een experimentele toestand. Het wijst een p-waarde aan elke combinatie die de waarschijnlijkheid weerspiegelt dat de kralen zijn bemonsterd uit identieke populaties op basis van Kolomogrov-Shmirnov (K-S) statistieken. Het programma berekent vervolgens de K-S p-waarde die nodig is om een vals-positief percentage van 0,05 te produceren door te corrigeren voor meervoudige vergelijkingen en administratieve verwerking van technische variabiliteit (verschillen tussen de technische replicaten). IP_probe combinaties (vissen) waarvan K-S test p-waarde daalt tot onder de berekende cut-off in alle vier experimenten, of ten minste 3/4 experimenten (3/4 ∩ 4/4) worden geïdentificeerd. Aangezien de p-waarde cut-offs verschillen afhankelijk van deze verschillende niveaus van stringentie, af en toe zal vissen worden geïdentificeerd in 4/4 maar niet 3/4 ∩ 4/4, zodat aparte lijsten worden berekend. Voor gedetailleerde ANC-vergelijkingen, zie (Smith et al. 2016). 14 Details over WCNA analyse en resultaten worden grondig besproken door langfelder et al.23

Gegevens presentatie
ANC en CNA23 analyses worden uitgevoerd om vissen te identificeren die beide (1) significante vouw veranderingen vertonen tussen de experimentele omstandigheden in ten minste 3/4 van de runs en (2) behoren tot een CNA-module die is gecorreleerd met de experimentele variabele. Deze zeer betrouwbare vissen die worden geïdentificeerd door twee onafhankelijke statistische benaderingen worden aangeduid als ANC ∩ CNA vissen. Deze interacties kunnen worden gevisualiseerd als een diagram van de rand van een knooppunt met behulp van de open-source software Cytoscape (Figuur 5a) of als een heatmap met behulp van de R-code en analyse-instructies die zijn opgenomen in het aanvullende materiaal (Figuur 5b ).

Figure 1
Figuur 1 . Overzicht van kwantitatieve multiplex immunoprecipitatie. a) eerder gescreende antilichamen zijn covalent gekoppeld aan verschillende klassen van magnetische kralen in afzonderlijke reacties. b) 's nachts worden proteïne-complexen immunoprecipitated met een mengsel van de met antilichamen gekoppelde magnetische kralen. c) Co-immunoprecipitated eiwitten worden gelabeld door een probe-antilichaam en een fluorophore. d) magnetische kralen en gelabelde proteïne complexen worden door een gekoelde flow-cytometer uitgevoerd om relatieve hoeveelheden eiwitten te kwantificeren die zich in gedeelde complexen voordoen. Zie afbeelding S1 voor schematische Details van aangepaste koeling. e) de flow cytometer Manager software scheidt magbeads per klasse en (f) toont fluorescentie histogrammen van elke kraal regio. (g) gegevens worden geëxporteerd als. XML-bestanden en geanalyseerd door twee onafhankelijke statistische benaderingen. Alleen vissen geïdentificeerd door beide analyses worden gerapporteerd met behulp van heatmap en node-Edge diagram visualisaties. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2 . Connexin 36 antilichamen screening met behulp van IP-FCM. (a) IP-FCM werd uitgevoerd op muizenhersenen lysaat met behulp van een 4x4 panel van connexin 36 (Cx36) cml kralen en sondes. Lysaat werd immunoprecipitated met elke CML kraal in een aparte rij van de plaat. Na het wassen, elke kraal werd verdeeld over de rij, zodat één sonde antilichaam kan worden toegevoegd per kolom. b) de meeste antilichaam combinaties vertonen geen signaal (oranje) op de achtergrond van de IgG (grijs, blauw). De 1E5 IP met de 6200Poly sonde toont acceptabel positief signaal. De 1E5 kraal/probe en 6200Poly kraal/probe paren elke Toon aanvaardbaar signaal, maar het is niet ideaal om te gebruiken hetzelfde antilichaam voor zowel kraal en sonde. Differentiële epitoop herkenning maximaliseert de kans op het observeren van interacties, omdat sommige epitopen kunnen worden verstopt in bepaalde eiwitcomplexen. De 6200Poly kraal met de 1E5 sonde geeft het sterkste signaal en werd gekozen om te gebruiken in de multiplex assay in afwachting van specificiteit bevestiging. c) IP-FCM met gebruikmaking van het paar Cx36 antilichamen dat is geselecteerd uit de screening werd uitgevoerd op het Lysaat van 293t cellen met Cx36 en niet-getransfuneerde controles. Er is een duidelijk signaal van de Cx36-getransfunteerde cellen, maar de niet-getranssinfecteerde cellen zijn niet te onderscheiden van IgG kraal/probe besturingselementen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3 . Voorbeeld plaat indeling. Een 4-condition multiplex is ingesteld in een 96-well plate. Voorbeelden 1-4 worden in opeenvolgende rijen geladen (elk biologisch monster dat hier wordt vertegenwoordigd door een andere kleur), en technische replicaten worden in dezelfde volgorde in de volgende 4 rijen geladen. Eén sonde wordt per kolom gebruikt. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4 . Een typische kwaliteitscontrole reactie die de conjugatie van een nieuwe Magkraal vergelijkt met de oudere batch die wordt vervangen. De kraal geeft een MFI 2-4 logs boven de achtergrond, en de nieuwe batch heeft een MFI vergelijkbaar met die van de oude partij. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Figuur 5 . QMI identificeert synaptische vissen die veranderen in magnitude na 5 minuten van NMDA stimulatie in gekweekte corticale neuronen. Een QMI-experiment vergeleek NMDA-gestimuleerd versus ongestimuleerd (ACSF-controle) neuronen. Vissen die werden geïdentificeerd door zowel ANC als CNA-analyses worden gepresenteerd. (a) in een diagram aan de rand van een knooppunt dat wordt geproduceerd met behulp van de open source software Cytoscape, geven de knooppunten de antilichaam doelstellingen (eiwitten) aan die zijn opgenomen als IPS en probes in het QMI-paneel. De randen vertegenwoordigen ANC ∩ CNA vissen, met de kleur en dikte van de rand die de richting en de grootte van de fold-verandering tussen NMDA-behandeling en controle aangeeft. Vissen die niet veranderen tussen de NMDA en de controle omstandigheden zijn niet opgenomen in de figuur. b) een heatmap die in R wordt geproduceerd met behulp van de heatmap. 2-functie vertegenwoordigt dezelfde ANC ∩ CNA vissen. ComBAT-genormaliseerd, Log2 MFI-waarden worden per rij genormaliseerd voor gegevens die ~ 3-logboeken omvatten, en de relatieve MFI voor elke experimentele replicaat wordt weergegeven om de relatieve grootte en consistentie van elke gerapporteerde vissen aan te tonen. De gegevens en code die nodig zijn om deze cijfers te reproduceren, zijn opgenomen in het aanvullende dossier. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Supplementary Figure 1
Afbeelding S1: diagrammen van aangepaste koeling van het flowcytometry-systeem. De array lezer van de flow cytometer moet op kamertemperatuur worden gehouden, maar het onderste gedeelte (het microplaat platform) moet gekoeld worden om vissen tijdens de analyse te behouden. Zie de tabel met materialen voor modelinformatie over flow cytometer en Sandwich Prep koelkast gebruikt. a) de bovenste hulpstukken en Opslagbakken voor levensmiddelen werden uit een Sandwich Prep-koelkast verwijderd. Het microplaat platform werd geplaatst op de metalen dragers die bedoeld waren om de plastic voedsel Opslagbakken te houden. De kunststof behuizing van het microplaat platform werd verwijderd om het fit te maken. Een aangepast plexiglas platform werd gebouwd met de in (b) getoonde afmetingen om de bovenste opening van de koelkast te bedekken. De plexiglas werd geïsoleerd met 1/2 "schuim isolatie gesneden om te passen bij de grootte van de plexiglas, en verzegelde de kloof met isolerende tape. Vervolgens werd een gat door de plexiglas geboord om de monster naald van de flow cytometer-test lezer toegang te geven tot het microplaat-platform wanneer het wordt verlengd. Een zwarte koppelingsinrichting die oorspronkelijk in de bovenkant van het microplaat platform werd geschroefd, werd verwijderd en in het microplaat-platform van boven de plexiglas, die de uitlijning hielp, teruggeschroefd. Een deur in de afdekplaat van plexiglas geeft gebruikers toegang tot de microplaat Carrier wanneer deze uit het apparaat wordt verlengd. Merk op dat de flow cytometer software de gebruiker zal waarschuwen dat de plaat drager te koud is, maar de gebruiker kan de waarschuwing overschrijven en gekoelde QMI-experimenten uitvoeren. c) foto van het geassembleerde systeem. d) detail van de voorste rechterhoek, zoals getekend ondera), met de montage van een plexiglas afdekking en isolatie. e) detail van de monster naald uitgelijnd boven de gaten. f) detail van het geschoren gedeelte van de isolatie dat de luchtstroom onder de unit toelaat. g) detail van de open deur die het flow cytometer-microplaat platform hieronder weergeeft. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Supplementary File
Aanvullend bestand. Gegevens en code die nodig zijn om deze cijfers te reproduceren. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De QMI-test vereist substantiële investeringen in de ontwikkeling, apparatuur en reagentia van het antilichaam paneel, maar zodra de test is vastgesteld, kan men hoogdimensionale gegevens verzamelen die de proteïne-interactie netwerken observeren terwijl ze reageren op experimentaal gecontroleerde stimuli. Technisch vereist QMI zorgvuldige Pipetteer-en traceer controle van monster-en antilichaam goed locaties. Zorgvuldig labelen van de test platen is nuttig, zoals het maken van een gedetailleerd sjabloon van goed locaties op papier, die vervolgens wordt opgeslagen voor gegevensanalyse. Het belang om te allen tijde de kralen en het lysaat koud te houden, ook in de flow cytometer-drager (Zie afbeelding S1 voor aangepaste koel instructies) kan niet worden overschat. Eiwit interacties zullen snel dissociëren bij kamertemperatuur, en vroege pogingen tot het gebruik van een ongewijzigde, kamertemperatuur stroom cytometer eindigde met de identificatie van veel temperatuur-labile interacties, maar niet die die zijn veranderd met de beoogde Stimulatie.

QMI is een test op basis van antilichamen, dus de initiële selectie van antistoffen is van cruciaal belang. Monoklonaal of recombinant antilichamen moeten waar mogelijk worden gebruikt om de variabiliteit in de resultaten te verminderen. Polyclonals vertonen lot-to-lot variatie, maar peptide-gebaseerde polyclonals tot een korte epitoop lijken relatief stabiel na verloop van tijd. Drift kan worden geminimaliseerd door het kopen van grote batches van antilichamen; Dit maakt het ook mogelijk om Custom-orders van carrier-Free antilichamen die de noodzaak om antilichamen te zuiveren met behulp van meloen gel en spin kolommen, en de geassocieerde antilichaam verlies uitsluit.

Het is ook belangrijk op te merken dat, omdat het detecteren van een signaal afhankelijk is van beschikbare epitopen, het ontbreken van een signaal niet noodzakelijkerwijs duidt op het ontbreken van een interactie, een beperking die gebruikelijk is bij andere methoden voor eiwit interactie. 14 verder, wanneer een signaal wordt gedetecteerd, is het onmogelijk om ondubbelzinnig te verklaren weer de eiwit interactie is direct (een interactie met b) of indirect (een interactie met X en Y, die vervolgens interactie met b), dat is de reden waarom de waargenomen interacties zijn aangeduid als vissen in plaats van eiwit-eiwit interacties (PPI), wat directe binding kan impliceren. Een beperking van alle op antilichamen gebaseerde methoden die in gedachten moeten worden gehouden, is dat de toevoeging van antilichamen eiwitcomplexen kan verstoren of stabiliseren. Een andere beperking van het gebruik van Flowcytometrie in plaats van westerse blots is dat maat informatie om de specificiteit van antilichamen te bevestigen niet beschikbaar is. Om deze beperking te overwinnen, worden IgG-besturingselementen gebruikt bij het screenen van elk antilichaam paar, en specificiteit wordt bevestigd met knock-out of knock-in cellijnen of dieren voordat u doorgaat met QMI-experimenten (paragraaf 1,4).

IgG-besturingselementen worden niet gebruikt in de QMI-test omdat elke IgG een ander niveau van achtergrond signaal produceert, waardoor het onmogelijk is om de juiste achtergrondwaarde te kennen om af te trekken. Bijvoorbeeld, als IP (X) _probe IgG geeft een MFI van 100 en IP IgG_probe Y geeft een MFI van 200, welke achtergrondwaarde moet worden afgetrokken van IP X_probe Y? Evenzo zullen soms niet-gedetecteerde interacties (bijv. IP X probe Z) een lagere MFI hebben dan de niet-specifieke IgG-interacties. Om rekening te houden met deze beperking van het niet kennen van het absolute MFI-signaal, worden vissen niet alleen gerapporteerd voor detectie boven een willekeurig achtergrondniveau. In plaats daarvan worden alleen vissen die veranderen in reactie op een bepaalde stimulatie gerapporteerd. Hoewel hoge MFI kan worden veroorzaakt door niet-specifieke ruis, zou dit lawaai niet naar verwachting veranderen met stimulatie. Daarnaast is een portie (10-20%) van voorwaarde afhankelijke interacties waargenomen worden in het algemeen bevestigd door een tweede methode, meestal IP-Westers. Deze bevestiging is analoog aan het bevestigen van hoge doorvoer RNA sequentie resultaten met RT-PCR en is bedoeld om vertrouwen QMI resultaten te vergroten.

Expressie-effecten die invloed hebben op QMI-resultaten kunnen niet worden uitgesloten zonder aanvullende tests, omdat QMI geen onderscheid maakt tussen verhoogde absolute niveaus van een eiwit en verhoogde homo-multimerisatie van een eiwit. Om onzekerheid met betrekking tot expressie te minimaliseren, kunnen experimenten worden uitgevoerd met behulp van acute behandelings condities met korte tijdschema's die mogelijke veranderingen in eiwit uitdrukkings niveaus minimaliseren. Andere methoden zijn nodig om expressie-effecten in chronische behandelingsomstandigheden of primaire patiënt monsters uit te buiten.

Het is van vitaal belang om een geschikte lysisbuffer voor QMI te selecteren. Te zwak wasmiddel kan de membranen intact laten en de eiwitten in elkaar houden die niet complex zijn, terwijl een te sterk wasmiddel eiwitcomplexen kan vernietigen. Aanvullende factoren, zoals de aanwezigheid van calcium of de chelatoren ervan, kunnen de vissen drastisch beïnvloeden en moeten zorgvuldig worden overwogen voordat screening antilichamen in een QMI-panel worden opgenomen. Voor IP-westerse experimenten worden lysiscondities meestal per geval geoptimaliseerd voor elke vissen, maar de beste voorwaarden voor het detecteren van een enkele vissen kunnen niet vertalen naar andere vissen in hetzelfde eiwit netwerk22. Detergenten selectie presenteert een kip-en-ei dilemma, in dat een lysis buffer nodig is om te screen antilichamen kandidaten, maar een panel van antilichamen is nodig om te schermen voor een geschikte lysis buffer. Hoewel niet een perfecte oplossing, kan men een klein paneel van kralen en sondes die van bijzonder belang zijn en/of hebben bekende associaties of dissociaties in reactie op een stimulans te selecteren, en het testen van hun gedrag onder verschillende lysis voorwaarden op de CML kralen in eerste instantie gebruikt voor het screenen van antilichamen (stap 1.1.3). Een ideaal reinigingsmiddel moet zorgen voor zowel betrouwbare detectie van vissen en recapitulatie van bekend fysiologisch eiwit gedrag (associatie/dissociatie) met een bepaalde stimulus. Als er bezorgdheid is dat een wasmiddel de membranen niet volledig solubiliseert, kan een negatief controle-antilichaam worden toegevoegd dat alleen signaal zou geven als twee eiwitten werden gekoppeld door membraan24. Wanneer geschikte lysisbuffers worden geselecteerd, kunnen veranderingen in zelfs zwakke interacties, zoals die tussen een kinase en substraat, betrouwbaar worden gedetecteerd (bijv. TCR-LCK)14.

Vorige werk met behulp van QMI in neuronen en T-cellen heeft beide zorgvuldig bevestigde eerdere bevindingen om het vertrouwen in de geldigheid van QMI resultaten te vergroten, en gegenereerde nieuwe hypothesen die leidde tot ontdekkingen over signaaltransductie en ziekte trajecten. In de toekomst kan QMI worden aangepast aan andere proteïne-interactie netwerken en uitgebreid tot 500 eiwitten met de huidige sfeer-klassen beschikbaar. Met behulp van QMI te bestuderen hoe netwerken van multi-eiwitcomplexen veranderen in reactie op prikkels als ze controle cellulaire processen heeft het potentieel om belangrijke inzichten in zowel gezondheid en ziekte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs willen tessa Davis erkennen voor belangrijke bijdragen aan de ontwikkeling van QMI Assay, en aan huidige en voormalige leden van de laboratoria Smith en Schrum voor technische begeleiding en intellectuele input. Dit werk werd gefinancierd door NIMH subsidies R01 MH113545 en R00 MH 102244.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well flat bottomed plates Bio Rad 171025001
96-well PCR plates VWR 82006-704
Bioplex 200 System with HTF Bio Rad 171000205 modiefied to keep partially refrigerated, see Figure S1 for details
Bio-Plex Pro Wash Station Bio Rad 30034376
BSA Sigma
CML beads Invitrogen C37481
EDTA Sigma E6758
EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin Thermo Scientific A39256
MagPlex Microspheres Luminex MC12xxx-01 xxx is the 3 digit bead region
Melon Gel IgG Spin Purification Kit Thermo Scientific 45206 used for antibody purification
MES Sigma M3671
Microplate film, non-sterile USA Scientific 2920-0000
Phosphotase inhibitor cocktail #2 Sigma P5726
Protease inhibitor cocktail Sigma P8340
Sandwich Prep Refrigerator Norlake SMP 36 15 for custom refrigeration of Bioplex 200
Sodium fluoride Sigma 201154
Sodium orthovanadate Sigma 450243
Streptavidin-PE BioLegend 405204
Sulfo NHS Thermo Scientific A39269
Tris Fisher Scientific BP152

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pawson, T., Nash, P. Protein-protein interactions define specificity in signal transduction. Genes and Development. 14 (9), 1027-1047 (2000).
  2. Rodríguez-Jorge, O., et al. Cooperation between T cell receptor and Toll-like receptor 5 signaling for CD4. Science Signaling. 12 (577), (2019).
  3. Bugaj, L. J., et al. Cancer mutations and targeted drugs can disrupt dynamic signal encoding by the Ras-Erk pathway. Science. 361 (6405), (2018).
  4. Pawson, T. Dynamic control of signaling by modular adaptor proteins. Current Opinion in Cell Biology. 19 (2), 112-116 (2007).
  5. Hamm, H. E. The many faces of G protein signaling. Journal of Biological Chemistry. 273 (2), 669-672 (1998).
  6. Lohse, M. J., Hofmann, K. P. Spatial and Temporal Aspects of Signaling by G-Protein-Coupled Receptors. Molecular Pharmacology. 88 (3), 572-578 (2015).
  7. Eltschinger, S., Loewith, R. TOR Complexes and the Maintenance of Cellular Homeostasis. Trends in Cell Biology. 26 (2), 148-159 (2016).
  8. Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (2), 99-111 (2005).
  9. Komarova, N. L., Zou, X., Nie, Q., Bardwell, L. A theoretical framework for specificity in cell signaling. Molecular Systems Biology. 1, 23 (2005).
  10. Schrum, A. G., Gil, D. Robustness and Specificity in Signal Transduction via Physiologic Protein Interaction Networks. Clinical and Experimental Pharmacology. 2 (3), (2012).
  11. De Las Rivas, J., Fontanillo, C. Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks. PLoS Computational Biology. 6 (6), 1000807 (2010).
  12. Ron, D., Walter, P. Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (7), 519-529 (2007).
  13. Bogdan, A. R., Miyazawa, M., Hashimoto, K., Tsuji, Y. Regulators of Iron Homeostasis: New Players in Metabolism, Cell Death, and Disease. Trends in Biochemical Sciences. 41 (3), 274-286 (2016).
  14. Smith, S. E., et al. Multiplex matrix network analysis of protein complexes in the human TCR signalosome. Science Signaling. 9 (439), 7 (2016).
  15. Schrum, A. G., et al. High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry. Science's STKE. 2007 (389), (2007).
  16. Brown, E. A., et al. Clustering the autisms using glutamate synapse protein interaction networks from cortical and hippocampal tissue of seven mouse models. Molecular Autism. 9 (1), 48 (2018).
  17. Lautz, J. D., Brown, E. A., Williams VanSchoiack, A. A., Smith, S. E. P. Synaptic activity induces input-specific rearrangements in a targeted synaptic protein interaction network. Journal of Neurochemistry. 146 (5), 540-559 (2018).
  18. Smith, S. E., et al. Signalling protein complexes isolated from primary human skin-resident T cells can be analysed by Multiplex IP-FCM. Experimental Dermatology. 23 (4), 272-273 (2014).
  19. Neier, S. C., et al. The early proximal αβ TCR signalosome specifies thymic selection outcome through a quantitative protein interaction network. Science Immunology. 4 (32), (2019).
  20. Davis, T. R., Schrum, A. G. IP-FCM: immunoprecipitation detected by flow cytometry. Journal of Visualized Expiriments. (46), (2010).
  21. Smith, S. E., et al. IP-FCM measures physiologic protein-protein interactions modulated by signal transduction and small-molecule drug inhibition. PLoS One. 7 (9), 45722 (2012).
  22. Lautz, J., et al. Activity-dependent changes in synaptic protein complex composition are consistent in different detergents despite differential solubility. BioRXiv. , (2019).
  23. Langfelder, P., Horvath, S. WGCNA: an R package for weighted correlation network analysis. BMC Bioinformatics. 9, 559 (2008).
  24. Schrum, A. G., Gil, D., Turka, L. A., Palmer, E. Physical and functional bivalency observed among TCR/CD3 complexes isolated from primary T cells. Journal of Immunology. 187 (2), 870-878 (2011).

Tags

Biochemie uitgave 150 IP-FCM proteomics eiwit interactie signalering Immunoprecipitation QMI
Kwantificering van eiwit interactie netwerk dynamiek met Multiplexed co-immunoprecipitatie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brown, E. A., Neier, S. C.,… More

Brown, E. A., Neier, S. C., Neuhauser, C., Schrum, A. G., Smith, S. E. P. Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation. J. Vis. Exp. (150), e60029, doi:10.3791/60029 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter