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Biochemistry

Quantifizierung der Protein-Interaktionsnetzwerkdynamik mit Multiplex-Co-Immunopräzipitation

Published: August 21, 2019 doi: 10.3791/60029
Automatic Translation
1,2, 3,4, 5, 6,7,8, 1,2,9
1Center for Integrative Brain Research, Seattle Children's Research Institute, 2Graduate Program in Neuroscience, University of Washington, 3Department of Cancer Immunology and Virology, Dana-Farber Cancer Institute, Department of Medicine, Harvard Medical School, 4Broad Institute of Harvard and MIT, 5Department of Mathematics, University of Houston, 6Department of Molecular Microbiology and Immunology, School of Medicine, University of Missouri, 7Department of Surgery, School of Medicine, University of Missouri, 8Department Bioengineering, College of Engineering, University of Missouri, 9Department of Pediatrics, University of Washington

Summary

Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI) verwendet Durchflusszytometrie zum empfindlichen Nachweis von Unterschieden in der Häufigkeit gezielter Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen zwei Proben. QMI kann mit einer kleinen Menge an Biomaterial durchgeführt werden, erfordert keine gentechnisch veränderten Tags und kann für jedes zuvor definierte Protein-Interaktionsnetzwerk angepasst werden.

Abstract

Dynamische Protein-Protein-Wechselwirkungen steuern das zelluläre Verhalten, von der Beweglichkeit über die DNA-Replikation bis hin zur Signaltransduktion. Die Überwachung dynamischer Wechselwirkungen zwischen mehreren Proteinen in einem Protein-Interaktionsnetzwerk ist jedoch technisch schwierig. Hier stellen wir ein Protokoll für quantitative Multiplex-Immunpräzipitation (QMI) vor, das eine quantitative Bewertung von Faltenveränderungen in Protein-Wechselwirkungen auf der Grundlage relativer Fluoreszenzmessungen von Proteinen in Shared Complexes ermöglicht, die von Exposed Oberflächenepitope (PiSCES). In QMI werden Proteinkomplexe aus Zelllysaten auf Mikrosphären immunpräzipiert und dann mit einem markierten Antikörper für ein anderes Protein untersucht, um die Fülle von PiSCES zu quantifizieren. Immunpräzipitationsantikörper werden mit verschiedenen MagBead-Spektralregionen konjugiert, was es einem Durchflusszytometer ermöglicht, mehrere parallele Immunpräzipitationen zu unterscheiden und gleichzeitig die Menge der mit jedem zugeordneten Sondenantikörper zu quantifizieren. QMI erfordert keine genetische Kennzeichnung und kann mit minimalem Biomaterial im Vergleich zu anderen Immunpräzipitationsmethoden durchgeführt werden. QMI kann für jede definierte Gruppe von interagierenden Proteinen angepasst werden und wurde bisher verwendet, um Signalnetzwerke in T-Zellen und neuronalen Glutamatsynapsen zu charakterisieren. Die Ergebnisse haben zu einer neuen Hypothesengenerierung mit potenziellen diagnostischen und therapeutischen Anwendungen geführt. Dieses Protokoll enthält Anweisungen zur Durchführung von QMI, von der ersten Auswahl des Antikörper-Panels bis hin zum Ausführen von Assays und der Analyse von Daten. Die erste Montage eines QMI-Assays umfasst das Screening von Antikörpern zur Erzeugung eines Panels und empirisch die Bestimmung eines geeigneten Lysepuffers. Die anschließende Reagenzpräparation umfasst kovalente Kopplung von Immunpräzipitationsantikörpern an MagBeads und Biotinylatations-Sondenantikörpern, so dass sie durch ein streptavidinkonjugiertes Fluorophor gekennzeichnet werden können. Um den Test durchzuführen, wird Lysat über Nacht mit MagBeads gemischt, und dann werden Perlen geteilt und mit verschiedenen Sondenantikörpern und dann einem Fluorophor-Etikett und durch Durchflusszytometrie gelesen. Zwei statistische Tests werden durchgeführt, um PiSCES zu identifizieren, die sich zwischen den versuchslichen Bedingungen erheblich unterscheiden, und die Ergebnisse werden mithilfe von Heatmaps oder Knotenkantendiagrammen visualisiert.

Introduction

Dynamische Protein-Protein-Wechselwirkungen bilden die molekularen Signalkaskaden und motilen Strukturen, die die funktionelle Basis der meisten zellulärenPhysiologie1 sind. Diese Prozesse werden oft als lineare Signalwege dargestellt, die zwischen stationären Zuständen auf der Grundlage einzelner Eingänge wechseln, aber experimentelle und modellierungsdaten zeigen deutlich, dass sie als integrierte Netzwerke funktionieren2,3, 4. Im Falle von G-Proteinen haben verschiedene Rezeptoren oft die Fähigkeit, das gleiche G-Protein zu aktivieren, und ein einzelner Rezeptor kann auch mehr als einen Typ von G-Protein5,6aktivieren. Damit die relativ kleine Anzahl von G-Proteinklassen gezielt eine Vielzahl zellulärer Funktionen wie synaptische Übertragung, Hormonregulation und Zellmigration modulieren kann, müssen die Zellen diese Signale integrieren und differenzieren4 , 5. Es hat sich gezeigt, dass diese Signalspezifität sowohl für G-Proteine als auch für andere in erster Linie auf der Grundlage fein abgestimmter Protein-Protein-Wechselwirkungen und ihrer zeitlichen Dynamik abgeleitet wird1,3, 4 , 5 , 6 , 7. Da Signalnetze aus dynamischen Proteinkomplexen mit mehreren Ein-, Ausgängen und Rückkopplungsschleifen bestehen, hat eine einzige Störung die Möglichkeit, das gesamte panostatische Gleichgewicht der Physiologie einer Zelle zu verändern4 ,7. Es besteht inzwischen weitgehend Einigkeit darüber, dass die Signalisierung aus netzwerkischer Sicht untersucht werden sollte, um besser zu verstehen, wie die Integration mehrerer Eingänge diskrete zelluläre Funktionen in Gesundheit und Krankheit steuert7,8, 9,10,11,12,13. Vor diesem Hintergrund wurde quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI) entwickelt, um quantitative Daten über Faltenänderungen in dynamischen Proteininteraktionsnetzwerken zu sammeln.

QMI ist ein Antikörper-basierter Assay, bei dem Zelllysat mit einem Panel von Immunpräzipitationsantikörpern inkubiert wird, die kovalent mit magnetischen Perlen gekoppelt sind, die unterschiedliche Verhältnisse von fluoreszierenden Farbstoffen enthalten. Mit spezifischen Antikörpern gekoppelt, um verschiedene magnetische Perlenklassen ermöglicht die gleichzeitige Co-Immunpräzipitation mehrerer Zielproteine aus dem gleichen Lysat. Nach der Immunpräzipitation (IP) werden magnetische Perlen mit einem zweiten, fluorophorkonjugierten Sondenantikörper (oder biotinytem Antikörper in Verbindung mit fluorophorkonjugiertem Streptavidin) inkubiert. Die Koverbindungen zwischen den Proteinen, die von jedem IP-Antikörper-Sonden-Antikörperpaar oder PiSCES (Proteine in gemeinsamen Komplexen, die von exponierten Oberflächenepitopen nachgewiesen werden), werden dann durch Durchflusszytometrie nachgewiesen und können quantitativ zwischen verschiedenen Probenbedingungen14. Abbildungen in Abbildung 1 zeigen die Schritte, die bei der Durchführung eines QMI-Tests erforderlich sind, einschließlich eines Diagramms von magnetischen Perlen mit immunpräzipierten Proteinkomplexen, die durch fluoreszierend konjugierte Sondenantikörper gekennzeichnet sind (Abbildung 1C).

Die Sensitivität von QMI hängt von der Proteinkonzentration des Lysats im Verhältnis zur Anzahl der magnetischen Perlen ab, die für Immunpräzipitation verwendet werden, und die Erreichung einer Auflösung zum Nachweis von 10% Faltenänderungen erfordert im Vergleich zu anderen Co-IP-Methoden14,15. Beispielsweise ist die Menge des in QMI verwendeten Ausgangsmaterials ähnlich wie die Menge, die für einen Sandwich-Enzym-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) erforderlich ist, aber mehrere Wechselwirkungen werden in einem einzigen QMI-Test nachgewiesen. QMI-Assays mit 20 IPs und 20 Sondenzielen wurden mit 1-5 x 105 primären T-Zellen durchgeführt, die aus einer 4 mm Hautbiopsie isoliert wurden, P2-Synaptosomalpräparaten aus einem 3 mm koronalen Abschnitt des präfrontalen Kortex der Maus oder 3 x 106 kultivierte Mausprimär- kortikale Neuronen14,16,17. Diese Empfindlichkeit macht QMI nützlich für die Analyse von Zellen oder Geweben mit begrenzter Verfügbarkeit, wie z. B. klinische Proben.

QMI kann für jedes zuvor definierte Protein-Interaktionsnetzwerk angepasst werden (vorausgesetzt, dass Antikörper verfügbar sind), und wurde bisher entwickelt, um das T-Zell-Antigenrezeptor (TCR)-Signalososom und eine Teilmenge von Proteinen an glutamatergen Synapsen in Neuronen zu analysieren. 17 , 18. In Studien zur T-Zell-Rezeptor-Signalisierung wurde QMI zunächst verwendet, um stimulationsinduzierte Veränderungen in PiSCES zu identifizieren und dann Autoimmunpatienten von einer Kontrollgruppe zu unterscheiden, endogene Autoimmunsignale zu erkennen und schließlich eine Hypothese mit einem unausgewogenen krankheitsassoziierten Subnetz von Wechselwirkungen14. In jüngerer Zeit wurde das gleiche QMI-Panel verwendet, um zu bestimmen, dass die Thymoseexzesse durch quantitative und nicht durch qualitative Unterschiede in der TCR-assoziierten Proteinsignalisierung19bestimmt wird. In Neuronen wurde QMI verwendet, um die eingangsspezifische Neuanordnung eines Protein-Interaktionsnetzwerks für verschiedene Arten von Eingangssignalen in einer Weise zu beschreiben, die neu entstehende Modelle der synaptischen Plastizitätunterstützt 17. Zusätzlich wurde dieses synaptische QMI-Panel verwendet, um Unterschiede in sieben Mausmodellen von Autismus zu identifizieren, die Modelle auf Basis ihrer PiSCES-Biosignaturen in Untergruppen zu bündeln und genau ein gemeinsames molekulares Defizit zu vermuten, das zuvor nicht erkannt wurde. in einem der Modelle16. Ein ähnlicher Ansatz könnte verwendet werden, um andere Untergruppen zu überprüfen, die auf verschiedene medikamentöse Behandlungen reagieren könnten, oder Medikamente bestimmten reaktionsfähigen Untergruppen zuzuweisen. QMI hat neben der Grundlagenforschung auch mögliche Anwendungen in der Diagnostik, der Patienten-Subtypisierung und der Arzneimittelentwicklung.

Um ein QMI-Antikörperpanel zusammenzustellen, werden die ersten Antikörper-Screening- und Selektionsprotokolle in Abschnitt 1 unten beschrieben. Sobald Antikörper-Panels identifiziert sind, werden in Abschnitt 2 Protokolle für die Konjugation der ausgewählten Antikörper zu magnetischen Perlen für IP und zur Biotinylierung der ausgewählten Sondenantikörper beschrieben. Das Protokoll zum Ausführen des QMI-Assays auf Zell- oder Gewebelysaten wird in Abschnitt 3 beschrieben. Da ein einzelnes Experiment 5 x 105 einzelne Datenpunkte generieren kann, werden Anweisungen und Computercodes zur Unterstützung der Datenverarbeitung, -analyse und -visualisierung in Abschnitt 4 bereitgestellt. Eine Übersicht über den in den Abschnitten 2-4 beschriebenen Workflow ist in Abbildung 1dargestellt.

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Protocol

1. Assay-Design

  1. Kandidaten-Antikörper-Vorbereitung
    1. Wählen Sie für jedes Protein von Interesse 3 bis 5 Antikörper zum Abschirmen aus. Verwenden Sie nach Möglichkeit monoklonale Antikörper, die verschiedene Epitope erkennen. Enthalten auch einen unspezifischen Kontrollantikörper.
    2. Um Tris zu entfernen, führen Sie den Pufferaustausch durch, indem Sie den Antikörper zu einem 30 kDa-Spinfilter hinzufügen, sich auf sein minimales Volumen drehen, 500 l Phosphat-gepufferte Salin (PBS) hinzufügen und 3-mal wiederholen. Um Trägerproteine zu entfernen, führen Sie die Antikörperreinigung gemäß dem Herstellerprotokoll durch (siehe Tabelle der Materialien für spezifische Reinigungsempfehlungen).
      HINWEIS: Dies geschieht, weil Trägerproteine und Puffer mit freien Amingruppen (wie Tris) mit COOH-Gruppen reagieren und die nachfolgenden Perlenkopplungs- und Biotinylierungsreaktionen abschrecken. Stellen Sie sicher, dass alle Antikörper gereinigt werden (keine Trägerproteine) und in einem Puffer frei von primären Aern (d. h. keine Tris).
    3. Koppeln Sie jeden Antikörper an Carboxylat modifizierte Latexperlen (CML) wie von Davis und Schrum20beschrieben. Um den Antikörper zu erhalten, skalieren Sie die Perlenkupplungsreaktionen um bis zu 1/5 (d. h. 3,6 x 106 Perlen mit 10 l 0,2-1 mg/ml Antikörper).
    4. Schätzen Sie die Perlenzahlen mit einem Hämozytometer (in der Regel 108/ml) und lagern Sie sie bei 4 °C. Perlen werden seit über einem Jahr gelagert und erfolgreich in QMI-Assays verwendet, aber Haltbarkeit oder Ablaufdaten wurden nicht offiziell festgelegt. NaN3 im B/S-Puffer verhindert das Bakterienwachstum.
    5. Biotinylat einen Teil jedes Antikörpers (siehe Abschnitt 2.2 unten). Bei 4 °C lagern.
    6. Bestätigen Sie die effektive CML-Perlenkopplung und genaue Zählung, indem Sie 1 x 105 Perlen mit einem PE-konjugierten Antikörper färben, der auf die Art reaktiv ist, bei der der Antikörper angehoben wurde, und auf einem Durchflusszytometer lesen.
    7. Bestätigen Sie die Antikörperbiotinylierung durch Punktblot mit Streptavidin-HRP.
    8. Sobald das Labor Reagenzien erzeugt hat, von denen bekannt ist, dass sie wirksam sind, verwenden Sie diese Reagenzien als positive Kontrollen in Bestätigungsreaktionen in den Schritten 1.1.5 und 1.1.6.
  2. Antikörper-Screening durch IP-FCM (Immunpräzipitation durch Durchflusszytometrie nachgewiesen)
    1. Entscheiden Sie sich für ein geeignetes Screening-Lysat. Verwenden Sie für diesen und alle anderen Vor-QMI-Screening-Schritte (alles, was in diesem Abschnitt 1: Assay Design enthalten ist) keine Biosamples mit begrenzter Verfügbarkeit. Wählen Sie stattdessen ein vergleichbares Kontrollmaterial wie Wildtyp-Mausgewebe, Zelllinien oder normales menschliches Spendergewebe, das keine einschränkende Ressource ist.
      ANMERKUNG: Die Auswahl eines Lysepuffers für diesen Test ist nicht trivial und wird in Abschnitt 1.5: Waschmittelauswahl sowie im vorletzten Absatz des Abschnitts Diskussion erläutert. Standardlysepuffer haben eine Basis von 150 mM NaCl, 50 mM Tris (pH 7.4), 10 mM Natriumfluorid, 2 mM Natriumorthovanadate sowie Protease- und Phosphatase-Inhibitor-Cocktails. Mit QMI kompatible Waschmittel sind 1% NP-40, 1% Digitonin, 0,1-1% Triton X-100 und 0,5-1% Desoxycholat14,16,17,18,19,21.
    2. Berechnen Sie das Gesamtvolumen des Lysats, das für jede IP-Ip verwendet werden soll, wobei 10 l für jede zu prüfende IP-Sonden-Kombination verwendet werden. Wenn X-Sonden-Antikörper untersucht werden und ein IgG-Steuerelement verwendet wird, verwendet jede IP (X+1) * (10 l) * (1,1 für Pipettierfehler); X+1 ist für die erforderliche IgG-Sondensteuerung zu berücksichtigen. In einem 3x3-Antikörper-Bildschirm sollte beispielsweise jede IP 44 ul verwenden. Denken Sie daran, ein IgG-IP-Steuerelement einzuschließen (siehe Beispiel-Screening-Setup in Abbildung 2).
    3. Berechnen Sie die zu verwendende CML-Perlennummer. Wenn Sie X-Sonden-Antikörper untersuchen, verwenden Sie [(X+1) * 5 x 104 Perlen]. Im Idealfall führen 5.000 Perlen pro Brunnen dazu, dass >2.000 Perlen pro Gut durch das Durchflusszytometer gelesen werden. In einem 3 x 3 Antikörper-Bildschirm sollte z. B. jede IP 20.000 Perlen verwenden, was etwa 0,66 l des vorbereiteten CML-Perlenbestands ab Schritt 1.1.3 entspricht (Perlen sollten zuerst mit einem Hämozytometer quantifiziert werden, um die Genauigkeit zu gewährleisten).
    4. Inkubieren Sie das Lysatvolumen ab Schritt 1.2.2 mit dem Volumen jeder CML-Perle, die ab Schritt 1.2.3 abgeschirmt werden soll, über Nacht bei 4 °C mit Rotation, um zu verhindern, dass sich Perlen absetzen. Führen Sie in der Regel Inkubationen in der ersten Spalte einer 96-Well-PCR-Platte und Kappe mit PCR-Rohrstreifenkappen durch.
    5. CML-Perlen bei 3.200 x g für 1 min abdrehen und Lysat durch ein einzelnes, schnelles Flicken der Platte über das Waschbecken entfernen. Ein winziges weißes Pellet sollte an der Unterseite jedes Brunnens sowohl vor als auch nach dem Flicken sichtbar sein.
    6. CML-Perlen in einem Volumen des FlyP-Puffers auf 20 L für jedes Perlen-Sonden-Paar resuspendieren; für X-Sonden-Antikörper verwenden Sie (X+1) * (20 l) * (1.1 für Pipettierfehler), ähnlich wie Schritt 1.2.2. Für einen 3 x 3-Bildschirm in 88 L FlyP-Puffer resuspendieren. FlyP Puffer ist 100 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7,4, 1% BSA, 0,01% NaN3.
    7. Verteilen Sie jede IP über (X+1) Brunnen einer 96-Well-PCR-Platte, wobei X die Anzahl der untersuchten Prüfkörper der Sonde ist, wobei 20 L/Well verwendet werden. Abbildung 2 A zeigt ein Beispiel-Screening-Setup.
    8. Waschen Sie 2 zusätzliche Male mit 200 L FlyP-Puffer pro Bohrgut. Drehen Sie die Platte wie in Schritt 1.2.5 und flicken Sie die Platte, um den Waschpuffer nach jeder Wäsche zu entfernen. Pellets werden extrem klein sein, sollten aber nach jeder Wäsche sichtbar sein.
    9. Berechnen Sie für jeden zu überprüfenden biotinylierten Antikörper das Gesamtvolumen als (Y+1) * 1,1 * 50 l, wobei Y die Anzahl der zu gesiegelten IP-Antikörper ist. Verdünnung des Antikörpers auf eine Arbeitskonzentration in diesem Volumen des FlyP-Puffers, typischerweise beginnend mit 1:100 Verdünnung eines 0,5 mg/ml-Bestands.
    10. Verteilen Sie jeden verdünnten Antikörper in jeder Spalte der 96-Well-Platte, und stellen Sie sicher, dass CML-Perlen resuspendiert werden.
    11. Bei 4 °C für 1 h inkubieren, entweder mit Drehung oder Pipettierung in 15 min Abständen, um sicherzustellen, dass CML-Perlen in Suspension bleiben.
    12. Waschen Sie 3x in 200 l FlyP Puffer, für jede Waschzentrifuge und entfernen Lysat wie in Schritt 1.2.5.
    13. Setzen Sie alle CML-Perlen in 50 l von 1:200 Streptavidin-PE im FlyP-Puffer aus.
    14. Bei 4 °C im Dunkeln 30 min inkubieren.
    15. Waschen Sie 3x in 200 l FlyP Puffer, für jede Waschzentrifuge und entfernen Lysat wie in Schritt 1.2.5.
    16. Resuspend ieren Sie in 200 L FlyP-Puffer, und führen Sie dann auf einem Durchflusszytometer.
  3. Die Wahl von Antikörpern, die in den Assay aufgenommen werden sollen
    1. Tor auf Größe mit FSC-H gegen SSC-H, und beseitigen Doublets mit FSC-H gegen FSC-A.
    2. Generieren Sie Histogramme der PE-Fluoreszenzintensität und überlagern Sie beide IgG-Steuerungen (IgG-Perlentestsonde, Test-Bead-IgG-Sonde) auf getestete Paare (Abbildung 2).
    3. Suchen Sie nach einem Perlen-Sonden-Paar, das ein klares Signal über Rauschen gibt (Abbildung 2B). Darüber hinaus ist es nicht ideal, den gleichen Antikörper für Perle und Sonde zu verwenden. Die Differential-Epitoperkennung maximiert die Chancen, Wechselwirkungen zu beobachten, da einige Epitope in bestimmten Proteinkomplexen verfliegt sein können. Wenn keine akzeptablen Optionen vorhanden sind, wiederholen Sie den Bildschirm mit zusätzlichen Antikörpern.
  4. Bestätigung der Antikörper-Spezifität
    1. Um die Antikörperspezifität für die beabsichtigten Ziele zu gewährleisten, verwenden Sie eine Lysatprobe, bei der das Ziel ausgeschlagen wurde; z. B. eine Knockout-Maus oder eine RNAi-Zelllinie. Alternativ können Sie Lysat aus einer zielnegativen Zelllinie verwenden, in der das Zielprotein künstlich exprimiert wurde.
    2. Führen Sie IP-FCM wie in Schritt 1.2 beschrieben aus und ändern Sie dies, um dem Experiment zu entsprechen.
  5. Waschmittelauswahl
    1. Da Detergenzien in Co-IP-Experimenten kritisch sind, testen Sie empirisch verschiedene Variationen, um sicherzustellen, dass der Test die maximale Wahrscheinlichkeit hat, Veränderungen zu erkennen. Wählen Sie zunächst ein relativ kleines Panel von Interaktionen (4-8), von denen bekannt ist, dass sie sich in einer bestimmten Bedingung ändern und/oder für Ihre Studie von besonderem Interesse sind.
    2. Mit den nicht fluoreszierenden, antikörperkonjugierten CML-Perlen für Erstbildschirme führen IP-FCM, wie in 1.2 beschrieben, unter Verwendung unterschiedlicher Lysepuffer-Waschmittelbedingungen durch. Waschmittelsiebe können mit Reinigungsmittel als einziger Variable oder mit unterschiedlichen Zellbedingungen für jedes Reinigungsmittel durchgeführt werden. Verwenden Sie immer IgG-Steuerungen für Perlen und Sonden, da Detergenzien gelegentlich in einigen IP-Probe-Kombinationen unerwarteten Hintergrund erzeugen.
    3. Wählen Sie auf der Grundlage der MFIs vom Bildschirm ein Reinigungsmittel, das das Signal für die PiSCES von Interesse optimiert. Es ist wahrscheinlich, dass einige Kompromisse gemacht werden müssen22.

2. Multiplex-Reagenz-Präparat

  1. Magnetische Perlenkupplung
    1. Wählen Sie mithilfe der magnetischen Perlenbereichskarte Perlenregionen aus, die in einem Muster verwendet werden sollen, das das Risiko einer Kreuzerkennung minimiert. Magnetische Perle in der Regel verschmieren nach oben und nach rechts, so vermeiden Sie Perlenbereiche, die diagonal angrenzend sind. Perlen aus jeder anderen Spalte des Perlendiagramms, das auf der Luminex-Website angezeigt wird, werden empfohlen (https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/).
    2. Bereiten Sie den trägerfreien Antikörper bei 0,1 mg/ml in PBS (wie in 1.1.2) in 250 l vor. Für die spätere Anwendung auf Eis halten.
    3. Vortex magnetische Perlen ausgiebig, und dann aliquot 250 l in einem Bernstein Mikrozentrifugenrohr (zum Schutz der Perlen vor Photobleichungen).
    4. Magnetisch getrennte Magnetperlen für 60 s und entfernen Sie den Überstand.
    5. Fügen Sie 250 l MES-Puffer (50 mM MES pH 6,0, 1 mM EDTA), Wirbel, magnetisch getrennt für 60 s, und entfernen Sie den Überstand. Wiederholen und resuspendieren Sie magnetische Perlen in 200 l MES-Puffer.
    6. Fügen Sie 40 l MES zu einem 2 mg Einwegrohr von Sulfo-NHS hinzu, um einen 50 mg/ml-Bestand herzustellen.
    7. Fügen Sie den Magnetperlen 25 L frisch zubereiteten Sulfo-NHS hinzu. wirbel.
    8. Fügen Sie 25 l von 50 mg/ml frisch gelöstem EDAC [1-ethyl-3-(-3-dimethylaminopropyl)-Carbodiimidhydrochlorid, auch EDC genannt] in den MES-Puffer. wirbel.
    9. Bedecken und schütteln Sie an einem Wirbelmiteinem mit einem Rohrhalteaufsatz für 20 min bei Raumtemperatur, 1000 U/min.
    10. Magnetisch für 60 s getrennt und den Überstand entfernen.
    11. In 500 l PBS, Wirbel, magnetisch für 60 s trennen und den Überstand entfernen. wiederholen.
    12. Resuspend in 250 l Antikörperlösung ab Schritt 2.1.2. wirbel.
    13. Inkubieren Sie 2 h im Zimmer Temp mit Schütteln auf einem Wirbel bei 1000 Rpm.
    14. Fügen Sie den magnetischen Perlen 500 l PBS, Wirbel, magnetisch getrennt für 60 s, und entfernen Sie den Überstand.
    15. Fügen Sie 750 L Blockierungs-/Speicherpuffer (B/S) hinzu (1% BSA in PBS pH 7.4, 0.01% NaN3). Abdeckung und inkubieren 30 min bei Raumtemperatur, 1000 Rpm.
    16. Magnetisch für 60 s getrennt und den Überstand entfernen. Resuspend in 100 L B/S Puffer.
    17. Bei 4 °C lagern. Perlen werden seit über einem Jahr gelagert und erfolgreich in QMI-Assays verwendet, aber Haltbarkeit oder Ablaufdaten wurden nicht offiziell festgelegt. NaN3 im B/S-Puffer sollte das Bakterienwachstum verhindern.
    18. Validieren Sie die magnetische Perlenkopplung, indem Sie gekoppelte magnetisch perlen mit einer fluoreszierenden Anti-Wirt-Art verfärben und auf einem Durchflusszytometer lesen, wie in Schritt 1.1.5.
  2. Biotinylierung
    1. Stellen Sie sicher, dass Antikörper in PBS ohne Trägerprotein sind.
    2. Berechnen Sie die Gesamtmenge an zu biotinylierten Antikörpern (100-200 g empfohlen für die Verwendung im Multiplex, 25-50 g für das Screening empfohlen).
    3. Bereiten Sie frisches 10 mM Sulfo-NHS-Biotin vor (kann durch Hinzufügen von 224 l ddH2O zu einem 1 mg No-Weigh-Rohr erfolgen).
    4. Fügen Sie 1 l von 10 mM Sulfo-NHS-Biotin pro 25 g Antikörper, Wirbel oder Pipette nach oben und unten hinzu, um sie zu mischen.
    5. Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 h.
    6. Bei 4 °C für 1 h inkubieren.
    7. Verwenden Sie einen 30 kDa Spin-Filter, um ungebundenes Biotin zu entfernen und die Reaktion zu stoppen. Fügen Sie 500 L PBS hinzu und drehen Sie die Spalte, bis das minimale Volumen erreicht ist. Fügen Sie 500 L zusätzliche PBS hinzu und wiederholen Sie dies für 3 Gesamtpufferwechsel.
    8. Schätzen Sie die Konzentration, indem Sie die Absorptionsfähigkeit von 1-2 l auf einem Spektralphotometer messen, und bringen Sie dann die Antikörperkonzentration auf 0,5 mg/ml.
    9. Bei 4 °C lagern.

3. Quantitative Multiplex-Immunpräzipitation

  1. Plattenlayout
    HINWEIS: Dieser Test funktioniert am besten, wenn er mit 96-Well-Platten und 2-4 Probenbedingungen durchgeführt wird.
    1. Führen Sie immer geeignete Kontrollen (d. h. stimulierte v. stimulierte Zellen) auf derselben Platte aus, um Veränderungen zwischen den Bedingungen zu erkennen. Verteilen Sie jede Probe horizontal über die Platte, und verwenden Sie jede Säule für einen anderen Sondenantikörper. Eine Reihe technischer Replikationen für jeden Testpunkt sollte unmittelbar nach dem ersten Satz ausgeführt werden. Siehe Abbildung 3 für ein Beispiel.
    2. Dokumentieren Sie sorgfältig das Plattenlayout, um eine genaue Plattenbeladung und -analyse zu ermöglichen.
  2. Probenvorbereitung & Immunpräzipitation (Tag 1)
    1. LyseGewebe oder Zellen in geeigneten Waschmitteln mit Protease- und Phosphatase-Inhibitoren und 15 min auf Eis brüten. Achten Sie darauf, das Lysat jederzeit kalt zu halten.
      ANMERKUNG: Die genaue Menge der Angabe der Biomaterial- und Lysatproteinkonzentration muss empirisch bestimmt werden, und einige Beispiele für zuvor verwendete Proben sind im dritten Absatz der Einführung aufgeführt. Im Allgemeinen war im Bereich von 200 l von 2 mg/ml Protein pro Probe in der Vergangenheit für 20 IP und 20 Sondenziele erfolgreich, aber ideale Inputs für jedes Antikörperpanel und jeden Zell- oder Gewebetyp müssen empirisch bestimmt werden.
    2. Drehen Sie bei 4 °C für 15 min bei 16.000 x g, um Membranen und Schmutz zu entfernen; als Lysat überstand zu halten.
    3. Führen Sie einen BCA-Assay oder ähnliches durch, um Proteinkonzentrationen zu bestimmen, und normalisieren Sie dann die Proteinkonzentration zwischen den Proben. Wenn Sie Zellen verwenden, beginnen Sie mit einer gleichen Anzahl von Zellen pro Bedingung, und die Normalisierung ist optional.
    4. Bereiten Sie eine magnetische Master-Perlenmischung vor, die im Test 250 magnetische Perlen jeder Klasse pro Brunnen enthält. Passen Sie die Perlenzahlen nach der Datenanalyse so an, dass in zukünftigen Assays durchschnittlich 110 Perlen jeder Klasse pro Brunnen gelesen werden.
      HINWEIS: Beispielberechnung: (Neues Perlenvolumen) = [(Durchschnitt ausführen) / 110] * (vorheriges Perlenvolumen). Perlenvolumina sollten auf diese Weise etwa alle 8 Durchläufe oder nach Bedarf angepasst werden. Typischerweise werden 3-4 l jeder magnetischen Perle (wie oben vorbereitet) für ein 2-Platten-Experiment verwendet.
    5. Waschen Sie die magnetische Perle 2x im FlyP-Puffer mit magnetischer Trennung, und setzen Sie dann im FlyP-Puffer wieder ab. Für die Resuspension 10 l pro Probe pro Platte verwenden. FlyP Puffer ist 100 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7,4, 1% BSA, 0,01% NaN3.
    6. Nach gründlicher Wirbelung der magnetischen Perlenmischung, aliquot 10 l in eiskalte Mikrozentrifugenröhren (ein Rohr pro Probe). Fügen Sie jedem Rohr für Immunpräzipitation gleiche Mengen Ansaugen von Lysat (mit normalisierten Konzentrationen) hinzu.
    7. Aliquot das lysat-magnetische Perlengemisch in einem Rohr für jede Platte, die ausgeführt wird; z.B. für ein 2-Platten-Experiment, teilen Sie das Lysat in zwei Röhren. Legen Sie Die Rohre bei 4 °C über Nacht auf einen Rotator, um immunitititizipiert zu werden, um Licht fernzuhalten.
  3. Ausführen des Assays (Tag 2)
    1. Beginnen Sie mit den lysat-magnetischen Perlenrohren für Platte #1. Verwenden Sie ein magnetisches Perlengestell, um Lysat aus den magnetischen Perlen zu entfernen, und reservieren Sie Lysat für zukünftige Analysen. Waschen Sie Perlen 2x in 500 l eiskalten FlyP-Puffer. Rohre immer auf Eis oder bei 4 °C aufbewahren.
    2. Berechnen Sie das Resuspensionsvolumen als (Anzahl der Sonden) * (2 technische Replikationen) * (25 l pro Bohrstand) * (1,1 für Pipettierfehler). Resuspend IPs in berechnetem Volumen des eiskalten FlyP-Puffers.
    3. Nach gründlicher Aufhebens von Magnetperlen durch sanftes Pipettieren, verteilen Sie 25 L pro Brunnen über eine flache 96-Well-Platte auf Eis.
    4. In einer anderen 96-Well-Platte, verdünnt biotinylierte Sondenantikörper gegen 2x Arbeitskonzentration (Arbeitskonzentration ist in der Regel 1:100 oder 1:200, empirisch bestimmt) in FlyP Puffer, so dass ihre Reihenfolge entspricht den Säulen auf dem Plattenlayout (siehe Abbildung 3 ). Das Endvolumen der Sondenantikörper bei der Arbeitskonzentration beträgt 50 l pro Bohrkörper, so dass das Volumen jedes 2x-Antikörpers (25 l) * (Anzahl biologischer Proben) * (2 technische Replikationen) * (1,1 für Pipettierfehler) betragen sollte.
    5. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 25 l jeder Sonden-Antikörperverdünnung in die magnetische, perlenhaltige Assayplatte zu verteilen.
    6. Schütteln Sie auf einem horizontalen Plattenshaker, um die magnetischen Perlen zu mischen und wieder aufzuhängen, und tauchen Sie dann bei 4 °C für 1 h ein, schütteln Sie bei 450 Umdrehungen pro Minute im Dunkeln.
    7. 3x mit FlyP-Puffer auf einer magnetischen Plattenscheibe bei 4 °C waschen.
    8. Setzen Sie die magnetischen Perlen in 50 l von 1:200 Streptavidin-PE aus.
    9. Schütteln, um Perlen zu mischen und wieder aufzuhängen, und dann bei 4 °C für 30 min inkubieren, schütteln bei 450 Umdrehungen im Dunkeln.
    10. 3x mit FlyP-Puffer auf einer magnetischen Plattenscheibe bei 4 °C waschen.
    11. Resuspend in 125 L FlyP-Puffer.
    12. Schütteln Sie für 1 min bei 900 Rpm, um Perlen gründlich wieder aufzuhängen.
    13. Laufen auf gekühlten Durchflusszytometer (siehe Diagramm in Abbildung S1). Verwenden Sie die Einstellung "hohes RP1-Ziel" in der Durchfluss-Zytometer-Software und eine Stoppbedingung von 1.000 Perlen pro Region (erheblich überschießen die Zahl, die in jedem einzelnen Brunnen sein sollte, um zu verhindern, dass die Maschine vorzeitig anhält) und Probenvolumen von 80 l.
    14. Halten Sie den Lauf auf halbem Weg an und setzen Sie die Perlen wieder aus, um eine Abgewöhnung zu verhindern.
    15. Exportieren Sie Datendateien im .xml-Format.
    16. Wiederholen Sie den Vorgang für die verbleibenden Platten, beginnend mit Schritt 3.3.1.

4. Datenanalyse

HINWEIS: Der ANC-Code wurde entwickelt, um zwei Bedingungen aus N = 4 Experimenten zu vergleichen, die jeweils zwei technische Replikationen für jede Bedingung haben. Zum Beispiel werden Zellen vier unabhängige Zeiten stimuliert, QMI wird an vier verschiedenen Tagen auf Kontrolle (unstimuliert) und stimulierten Zellen ausgeführt, mit technischen Replikationen wie oben, und die Datenanalyse verläuft wie unten beschrieben.

  1. Adaptive nicht-parametrische mit einstellbarem Alpha-Cutoff (ANC)
    1. Öffnen Sie MATLAB, und legen Sie das Aktive Verzeichnis auf einen Ordner fest, der die ANC-Programmkomponenten und die aus dem Durchflusszytometer exportierten XML-Dateien enthält.
    2. Füllen Sie die Datei "ANC-Eingabe" aus, um die Details des experimentellen Entwurfs widerzuspiegeln. Die in Supplementary File enthaltene Beispieldatei wurde vorgefüllt, um die Ebenfalls bereitgestellten Beispieldaten auszuführen.
    3. Führen Sie das Programm aus, das eine CSV-Datei in das Active Directory schreibt. Die Datei meldet PiSCES, die sich bei einem falsch positiven (Alpha)-Niveau von 0,05, zwischen Kontroll- und Versuchsbedingungen, in allen 4 experimentellen Replikationen oder mindestens 3/4 Replikationen erheblich unterscheiden.
    4. Anmerkung 'ANC-Treffer', die als PiSCES mit signifikanten Unterschieden in mindestens 3 experimentellen Replikationen definiert sind, dargestellt als 3/4-4/4 in der Datei, zur Verwendung in Schritt 4.3.1.
  2. Gewichtete Korrelationsnetzwerkanalyse23 (CNA)
    1. Die Spaltentitel der von Matlab ausgegebenen Datendatei mit der Endung "_MFI" transponieren. CSV" in die erste Zeile eines neuen Excel-Blatts. Fügen Sie die Spalten "Experiment" für die Experimentnummer und "Behandlung" für die experimentelle Behandlung oder andere zu analysierende Variablen hinzu. Speichern Sie diese Datei als "traits.csv".
    2. Öffnen Sie R studio, und legen Sie das Arbeitsverzeichnis auf einen Ordner fest, der das "_MFI" enthält. CSV" und "TRAITS. CSV"-Dateien.
    3. Führen Sie die R-Befehle aus, wie in der kommentierten Befehlsdatei angegeben, und führen Sie die in den Anweisungen in den Dateien enthaltenen Anweisungen aus. Die WCNA-Module, die erheblich mit jedem experimentellen Merkmal korreliert sind, werden als Grafikdatei ausgegeben, und die Korrelation jeder Interaktion IPi_ProbeJ mit jedem Modul wird als CSV-Datei ausgegeben.
    4. Hinweis 'CNA-Treffer', die als Interaktionen mit Modulmitgliedschaft (MM) > 0,7 und p < 0,05 für die Mitgliedschaft in einem Modul definiert sind, das als signifikant mit der experimentellen Variablen von Interesse korreliert identifiziert wurde, für die Verwendung in Schritt 4.3.1.
  3. Positive 'Treffer' & Visualisierung
    1. Identifizieren Sie für jede Interaktion in der AnC-Ausgabedatei (ab Schritt 4.1.4) ob diese Interaktion auch ein "CNA-Treffer" ist, indem Sie die CNA-Ausgabedatei überprüfen (siehe Schritt 4.2.6). Erstellen Sie eine neue Spalte, die angibt, ob jeder ANC-Treffer auch ein CNA-Treffer ist.
    2. Berechnen Sie den durchschnittlichen Änderungswert für das Protokoll 2-fache für jeden ANC- CNA-Treffer, indem Sie die in der ANC-Ausgabetabelle "_Hits.csv" angegebenen Werte aus Schritt 4.1.3 mittelisieren. Konvertieren Sie Werte in Protokoll2 Falten änderung vor der Mittelung. Löschen Sie bei Interaktionen, die nur in 3/4 Replikationen signifikant waren, den Ausreißerwert.
    3. Erstellen Sie eine Kalkulationstabelle mit jedem ANC-CNA-Treffer, der als IP in einer Spalte aufgeführt ist, einem Prüfpunkt in der zweiten Spalte und dem Faltenänderungswert in der dritten Spalte. Verwenden Sie diese Kalkulationstabelle, um ein Knotenkantendiagramm in Cytoscape zu erstellen, indem Sie die Datei als Netzwerk importieren.

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Representative Results

Antikörper-Screening
Abbildung 2 B zeigt die Ergebnisse eines Bildschirms für das Protein Connexin36. Die meisten IP_probe-Kombinationen erzeugen kein Signal über IgG-Steuerungen. IP mit dem monoklonalen Antikörper 1E5 und Sonde mit entweder 1E5 oder dem polyklonalen Antikörper 6200 erzeugt eine Rechtsverschiebung in der Perlenverteilung im Vergleich zu IgG-Steuerungen. Hier wurden IP 1E5 und Sonde 6200poly ausgewählt, um die Verwendung desselben Antikörpers wie IP und Sonde zu vermeiden, um sowohl die Wahrscheinlichkeit zu verringern, dass ein unspezifisches Protein von zwei unabhängigen Antikörpern erkannt wird, als auch um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, verschiedenen Epitopen. Es ist am besten, eine IP_probe-Kombination mit mindestens 1-2 Log höherem MFI im Vergleich zu IgG-Steuerelementen zu wählen, aber gelegentlich können Paare verwendet werden, die schwächere MFIs erzeugen, die konsistent von Steuerelementen unterschieden werden, wenn keine Alternativen identifiziert werden. Abbildung 2 C zeigt ein Spezifitätsvalidierungsexperiment für die Kombination 1E5-6200poly. Lysat aus 293 Zellen, die mit einem Connexin36-Plasmid transfiziert wurden, erzeugte eine Verschiebung nach rechts in der Perlenverteilung von 1,5 Log, während sich nicht transfizierte Zellen mit den IgG-Steuerelementen überlappten. Bei der Bestätigung der Spezifität eines Paares sollte negatives Kontrolllysat aus einem Knockout-Tier oder einer Zelllinie ohne das Zielprotein ein MFI ähnlich den IgG-Kontrollen aufweisen.

Perlenkupplung
Eine typische magnetische Perlenkupplung Qualitätskontrolle Reaktion gibt eine MFI 3-4 Protokolle über dem Hintergrund, wenn mit einem sekundären Antikörper konjugiert zu einem Fluorophor mit einem Helligkeitsindex zwischen 3 und 5 (wie PE oder FITC). Abbildung 4 zeigt eine typische Qualitätskontrollreaktion, die die Konjugation einer neuen magnetischen Perle mit der älteren, ersetzten Charge vergleicht.

Datenanalyse
In jedem Experiment vergleicht ANC die Fluoreszenzverteilungen jeder magnetischen Perlenklasse in jedem Brunnen (d. h. alle möglichen IP_Probe-Kombinationen) zwischen einer benutzerdefinierten Steuerung und einem experimentellen Zustand. Es weist jeder Kombination einen p-Wert zu, der die Wahrscheinlichkeit widerspiegelt, dass die Perlen aus identischen Populationen auf der Grundlage von Kolomogrov-Shmirnov (K-S)-Statistiken abgetastet wurden. Das Programm berechnet dann den K-S p-Wert, der erforderlich ist, um eine falsch-positive Rate von 0,05 zu erzeugen, indem es für mehrere Vergleiche korrigiert und technische Variabilität berücksichtigt (Unterschiede zwischen den technischen Replikationen). IP_probe-Kombinationen (PiSCES), deren K-S-Test-p-Wert in allen vier Experimenten unter den berechneten Cut-off fällt, oder mindestens 3/4-Experimente (3/4-4-4/4) identifiziert. Da sich die p-Wert-Cut-offs je nach diesen unterschiedlichen Stringenzstufen unterscheiden, werden gelegentlich PiSCES in 4/4, aber nicht in 3/4- 4/4 identifiziert, so dass separate Listen berechnet werden. Ausführliche ANC-Gleichungen finden Sie unter (Smith et al. 2016). 14 Details zur WCNA-Analyse und -Ergebnisse werden von Langfelder etal.

Datendarstellung
ANC- und CNA 23-Analysen werden durchgeführt, um PiSCES zu identifizieren, die sowohl (1) signifikante Faltenänderungen zwischen experimentellen Bedingungen in mindestens 3/4 der Durchläufe aufweisen als auch (2) zu einem CNA-Modul gehören, das mit der experimentellen Variable korreliert. Diese hochvertrauensreichen PiSCES, die durch zwei unabhängige statistische Ansätze identifiziert werden, werden als ANC- CNA-PiSCES bezeichnet. Diese Wechselwirkungen können als Knotenkantendiagramm mit der Open-Source-Software Cytoscape (Abbildung 5a) oder als Heatmap unter Verwendung des R-Codes und der Analyseanweisungen im Ergänzungsmaterial visualisiert werden (Abbildung 5b ).

Figure 1
Abbildung 1 . Übersicht über quantitative Multiplex-Immunpräzipitation. (a) Zuvor gescreente Antikörper sind kovalent an verschiedene Klassen magnetischer Perlen in getrennten Reaktionen gekoppelt. (b) Über Nacht werden Proteinkomplexe mit einer Mischung aus den Antikörper-gekoppelten Magnetperlen immunisiert. (c) Koimmunpräzipitierte Proteine werden durch einen Sondenantikörper und ein Fluorophor gekennzeichnet. (d) Magnetische Perlen und markierte Proteinkomplexe werden durch ein gekühltes Durchflusszytometer geführt, um relative Mengen an Proteinen zu quantifizieren, die in gemeinsamen Komplexen vorkommen. Siehe Abbildung S1 für schematische Details der benutzerdefinierten Kühlung. (e) Die Durchflusszytometer-Manager-Software trennt MagBeads nach Klasse und (f) zeigt Fluoreszenzhistogramme aus jeder Perlenregion an. (g) Daten werden als .xml-Dateien exportiert und von zwei unabhängigen statistischen Ansätzen analysiert. Nur PiSCES, die durch beide Analysen identifiziert werden, werden mithilfe von Heatmap- und Knoten-Kanten-Diagramm-Visualisierungen gemeldet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2 . Connexin 36 Antikörper-Screening mit IP-FCM. (a) IP-FCM wurde auf Maus-Gehirnlysat mit einem 4x4 Panel von Connexin 36 (Cx36) CML-Perlen und Sonden durchgeführt. Lysat wurde mit jeder CML-Perle in einer separaten Reihe der Platte immunpräzipiert. Nach dem Waschen wurde jede Perle über ihre Zeile verteilt, so dass pro Spalte ein Prüfkörper hinzugefügt werden kann. (b) Die meisten Antikörperkombinationen zeigen kein Signal (orange) über dem IgG-Hintergrund (grau, blau). Die 1E5 IP mit der 6200Poly Sonde zeigt ein akzeptables positives Signal. Die Perlen-/Sondenpaare 1E5 und 6200Poly zeigen jeweils ein akzeptables Signal, aber es ist nicht ideal, denselben Antikörper sowohl für Perle als auch für Sonde zu verwenden. Die Differential-Epitoperkennung maximiert die Chancen, Wechselwirkungen zu beobachten, da einige Epitope in bestimmten Proteinkomplexen verfliegt sein können. Die 6200Poly Perle mit der 1E5-Sonde gibt das stärkste Signal und wurde für die Verwendung im Multiplex-Assay bis zur Spezifitätsbestätigung ausgewählt. (c) IP-FCM unter Verwendung des aus dem Screening ausgewählten Cx36-Antikörperpaares wurde an dem Lysat von 293T-Zellen durchgeführt, die mit Cx36 transfiziert wurden und nicht transfizierte Kontrollen. Es gibt ein klares Signal von den Cx36-transfizierten Zellen, aber die nicht transfizierten Zellen sind nicht von IgG-Perlen-/Sondensteuerungen zu unterscheiden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3 . Beispielplattenlayout. Ein 4-Bedingungsmultiplex wird in einer 96-Well-Platte aufgestellt. Die Proben 1-4 werden in aufeinander folgenden Zeilen geladen (jede biologische Probe wird hier durch eine andere Farbe dargestellt), und technische Repliken werden in der gleichen Reihenfolge in den folgenden 4 Zeilen geladen. Pro Spalte wird ein Prüfpunkt verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4 . Eine typische Qualitätskontrollreaktion, die die Konjugation eines neuen MagBead mit der älteren, ersetzten Charge vergleicht. Die Perle gibt ein MFI 2-4 Protokolle über dem Hintergrund, und die neue Charge hat ein MFI ähnlich dem der alten Charge. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5 . QMI identifiziert synaptische PiSCES, die sich nach 5 Minuten NMDA-Stimulation in kultivierten kortikalen Neuronen in ihrer Größe verändern. Ein QMI-Experiment verglich NMDA stimulierte vs. unstimulierte (ACSF-Kontrolle) Neuronen. Es werden PiSCES vorgestellt, die sowohl durch ANC- als auch durch CNA-Analysen identifiziert wurden. (a) In einem Knoten-Edge-Diagramm, das mit der Open-Source-Software Cytoscape erstellt wurde, geben die Knoten die Antikörperziele (Proteine) an, die als IPs und Sonden im QMI-Panel enthalten waren. Die Kanten stellen ANC- CNA-PiSCES dar, wobei die Farbe und Dicke der Kante die Richtung und Größe des Klappwechsels zwischen NMDA-Behandlung und -Steuerung angibt. PiSCES, die sich zwischen nMDA und den Kontrollbedingungen nicht geändert haben, sind in der Abbildung nicht enthalten. (b) Eine Heatmap, die in R mit der Heatmap.2-Funktion erstellt wird, stellt die gleiche ANC-CNA-PiSCES dar. ComBAT-normalisierte, protokoll2 MFI-Werte werden nach Zeile normalisiert, um Daten zu berücksichtigen, die sich über 3 Protokolle erstrecken, und das relative MFI für jede experimentelle Replikation zeigt die relative Größe und Konsistenz jedes gemeldeten PiSCES. Die Daten und der Code, die zur Reproduktion dieser Zahlen erforderlich sind, sind in der Zusatzdateienthalten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Supplementary Figure 1
Abbildung S1: Diagramme der kundenspezifischen Kühlung des Durchflusszytometriesystems. Der Arrayleser des Durchflusszytometers muss bei Raumtemperatur gehalten werden, aber der untere Teil (die Mikroplattenplattform) muss gekühlt werden, um PiSCES während der Analyse zu erhalten. Siehe Tabelle der Materialien für Modellinformationen über Durchflusszytometer und Sandwich-Vorbereitung Kühlschrank verwendet. (a) Die oberen Anbaugeräte und Lebensmittelbehälter wurden aus einem Sandwich-Vorbereitungskühlschrank entfernt. Die Mikroplattenplattform wurde auf den Metallstützen platziert, die die Kunststoff-Lebensmittellagerbehälter aufnehmen sollten. Das Kunststoffgehäuse der Mikroplattenplattform wurde entfernt, um es fit zu machen. Eine benutzerdefinierte Plexiglasplattform wurde mit Denmaßen in (b) gebaut, um die obere Öffnung des Kühlschranks abzudecken. Das Plexiglas wurde mit einer 1/2" Schaumdämmung isoliert, die der Größe des Plexiglases entspricht, und versiegelte den Spalt mit Isolierband. Ein Loch wurde dann durch das Plexiglas gebohrt, damit die Probennadel des Durchflusszytometer-Assaylesers auf die Mikroplattenplattform zugreifen kann, wenn sie verlängert wird. Eine schwarze Kupplungsvorrichtung, die ursprünglich in die Oberseite der Mikroplattenplattform eingeschraubt wurde, wurde entfernt und von oben in die Mikroplattenplattform zurückgeschraubt, was bei der Ausrichtung half. Eine Tür in der Plexiglasabdeckung ermöglicht dem Benutzer den Zugriff auf den Mikroplattenträger, wenn er aus dem Gerät heraus verlängert wird. Beachten Sie, dass die Durchflusszytometer-Software den Benutzer warnt, dass der Plattenträger zu kalt ist, der Benutzer jedoch die Warnung überschreiben und gekühlte QMI-Experimente ausführen kann. (c) Foto des montierten Systems. (d) Detail der vorderen rechten Ecke, wie in (a) gezeichnet, zeigt die Montage der Plexiglasabdeckung und Isolierung. (e) Detail der Probennadel, die über den Löchern ausgerichtet ist. (f) Detail des abrasierten Isolationsabschnitts, der luftdurchströmt unter dem Gerät ermöglicht. (g) Detail der offenen Tür, die die darunter stehende Mikroplattenplattform des Durchflusszytometers anzeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Supplementary File
Ergänzende Datei. Daten und Code, die zur Reproduktion dieser Zahlen erforderlich sind. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Der QMI-Test erfordert erhebliche Investitionen in die Entwicklung von Antikörperplatten, Ausrüstungen und Reagenzien, aber sobald der Assay etabliert ist, kann man hochdimensionale Daten sammeln, die Protein-Interaktionsnetzwerke beobachten, während sie auf experimentell kontrollierte Reize. Technisch gesehen erfordert QMI eine sorgfältige Pipettierung und Verfolgung von Proben- und Antikörperbrunnenstandorten. Die sorgfältige Beschriftung der Assay-Platten ist nützlich, ebenso wie eine detaillierte Vorlage von Brunnenpositionen auf Papier, die dann für die Datenanalyse gespeichert wird. Die Bedeutung der Kühlung der Perlen und des Lysats zu jeder Zeit, auch im Durchflusszytometer-Mikroplattenträger (siehe Abbildung S1 für benutzerdefinierte Kälteanweisungen), kann nicht überbewertet werden. Proteinwechselwirkungen werden sich bei Raumtemperatur schnell auflösen, und frühe Versuche, ein unverändertes Raumtemperatur-Zytometer zu verwenden, endeten mit der Identifizierung vieler temperatur-labiler Wechselwirkungen, aber nicht solche, die sich mit dem beabsichtigten anregung.

QMI ist ein Antikörper-basierter Assay, daher ist die anfängliche Auswahl von Antikörpern entscheidend. Monoklonale oder rekombinante Antikörper sollten nach Möglichkeit verwendet werden, um die Variabilität der Ergebnisse zu reduzieren. Polyklonale zeigen eine Lot-to-Lot-Variation, aber Peptid-basierte Polyklonale zu einem kurzen Epitop scheinen im Laufe der Zeit relativ stabil zu sein. Drift kann durch den Kauf großer Chargen von Antikörpern minimiert werden; Dies ermöglicht auch kundenspezifische Bestellungen von trägerfreien Antikörpern, die die Notwendigkeit der Reinigung von Antikörpern mit Melongel und Spinsäulen und den damit verbundenen Antikörperverlust ausschließen.

Es ist auch wichtig zu beachten, dass, da die Erkennung eines Signals auf verfügbare Epitope angewiesen ist, das Fehlen eines Signals nicht notwendigerweise auf das Fehlen einer Interaktion hindeutet, eine Einschränkung, die mit anderen Proteininteraktionsmethoden üblich ist. 14 Wenn ein Signal erkannt wird, ist es nicht möglich, das Wetter eindeutig zu beschriften, dass die Proteininteraktion direkt (A interagiert mit B) oder indirekt ist (A interagiert mit X und Y, die dann mit B interagieren), weshalb die beobachteten Wechselwirkungen als PiSCES bezeichnet werden, anstatt Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPI), was eine direkte Bindung implizieren kann. Eine Einschränkung aller Antikörper-basierten Methoden, die im Auge behalten werden sollten, ist, dass die Zugabe von Antikörpern Proteinkomplexe stören oder stabilisieren kann. Eine weitere Einschränkung der Verwendung von Durchflusszytometrie anstelle von westlichen Blots ist, dass Größeninformationen zur Bestätigung der Antikörperspezifität nicht verfügbar sind. Um diese Einschränkung zu überwinden, werden IgG-Kontrollen verwendet, um jedes Antikörperpaar zu untersuchen, und die Spezifität wird mit Knock-out- oder Knock-in-Zelllinien oder Tieren bestätigt, bevor qmI-Experimente durchgeführt werden (Abschnitt 1.4).

IgG-Steuerelemente werden im QMI-Test nicht verwendet, da jedes IgG ein anderes Hintergrundsignal erzeugt, was es unmöglich macht, den richtigen Hintergrundwert zu subtrahieren. Wenn z. B. IP (X)_probe IgG ein MFI von 100 und IP IgG_probe Y ein MFI von 200 ergibt, welcher Hintergrundwert von IP X_probe Y subtrahiert werden soll? In ähnlicher Weise haben manchmal unentdeckte Interaktionen (z. B. IP X-Sonde Z) ein niedrigeres MFI als die unspezifischen IgG-Interaktionen. Um diese Einschränkung der Nichtkenntnis des absoluten MFI-Signals zu berücksichtigen, werden PiSCES nicht nur gemeldet, weil sie über einer beliebigen Hintergrundebene erkannt werden. Stattdessen werden nur PiSCES gemeldet, die sich als Reaktion auf eine bestimmte Stimulation ändern. Obwohl hohe MFI durch unspezifisches Rauschen verursacht werden können, wäre nicht zu erwarten, dass sich dieses Rauschen mit stimulation ändern würde. Darüber hinaus wird ein Teil (10-20%) der beobachteten bedingungsabhängigen Wechselwirkungen werden in der Regel durch eine zweite Methode bestätigt, in der Regel IP-Western. Diese Bestätigung ist analog zur Bestätigung der RNA-Sequenzierungsergebnisse mit hohem Durchsatz mit RT-PCR und soll das Vertrauen der QMI-Ergebnisse erhöhen.

Expressionseffekte, die die QMI-Ergebnisse beeinflussen, können ohne zusätzliche Tests nicht ausgeschlossen werden, da QMI nicht zwischen erhöhten absoluten Konzentrationen eines Proteins und einer erhöhten Homo-Multimerisierung eines Proteins unterscheidet. Um die Unsicherheit in Bezug auf die Expression zu minimieren, können Experimente mit akuten Behandlungsbedingungen mit kurzen Zeitskalen durchgeführt werden, die potenzielle Veränderungen der Proteinexpression minimieren. Andere Methoden sind erforderlich, um Expressionseffekte bei chronischen Behandlungsbedingungen oder primären Patientenproben auszuschließen.

Es ist wichtig, einen geeigneten Lysepuffer für QMI auszuwählen. Zu schwach von einem Waschmittel kann Membranen intakt lassen und Proteine zusammenhalten, die nicht komplex sind, während ein zu starkes Reinigungsmittel Proteinkomplexe zerstören kann. Zusätzliche Faktoren wie das Vorhandensein von Kalzium oder seinen Chelatoren können PiSCES dramatisch beeinflussen und sollten sorgfältig geprüft werden, bevor Antikörper untersucht werden, um sie in ein QMI-Panel aufzunehmen. Für IP-Western-Experimente werden lysebedingungen in der Regel von Fall zu Fall für jeden PiSCES optimiert, aber die besten Bedingungen für den Nachweis eines einzelnen Fisches können sich nicht auf andere PiSCES im selben Proteinnetzwerk übersetzen22. Die Auswahl von Reinigungsmitteln stellt ein Hähnchen-ei-Dilemma dar, da ein Lysepuffer benötigt wird, um Antikörperkandidaten zu überprüfen, aber ein Gremium von Antikörpern benötigt wird, um einen geeigneten Lysepuffer zu überprüfen. Obwohl es sich nicht um eine perfekte Lösung handelt, kann man ein kleines Panel aus Perlen und Sonden auswählen, die von besonderem Interesse sind und/oder als Reaktion auf einen Stimulus bekannte Assoziationen oder Dissoziationen haben, und ihr Verhalten unter verschiedenen Lysebedingungen auf den CML-Perlen testen. ursprünglich für das Screening von Antikörpern verwendet wurden (Schritt 1.1.3). Ein ideales Waschmittel sollte sowohl einen zuverlässigen Nachweis von PiSCES als auch eine Rekapitulation des bekannten physiologischen Proteinverhaltens (Assoziation/Dissoziation) mit einem gegebenen Stimulus ermöglichen. Wenn es Bedenken gibt, dass ein Reinigungsmittel Membranen nicht vollständig verlaugen, kann ein Negativkontrollantikörper hinzugefügt werden, der nur dann Signal geben würde, wenn zwei Proteine durch Membran24verbunden wären. Wenn geeignete Lysepuffer ausgewählt werden, können Veränderungen auch schwacher Wechselwirkungen - wie die zwischen Einer Kinase und Substrat - zuverlässig erkannt werden (z.B. TCR-LCK)14.

Frühere Arbeiten mit QMI in Neuronen und T-Zellen haben sowohl sorgfältig bestätigte frühere Ergebnisse, um das Vertrauen in die Gültigkeit der QMI-Ergebnisse zu erhöhen, und neue Hypothesen, die zu Entdeckungen über Signaltransduktion und Krankheitswege geführt. In Zukunft kann QMI an andere Protein-Interaktionsnetzwerke angepasst und mit den aktuellen Mikrosphärenklassen auf bis zu 500 Proteine erweitert werden. Mit HILFE von QMI, um zu untersuchen, wie sich Netzwerke von Multiproteinkomplexen als Reaktion auf Reize verändern, während sie zelluläre Prozesse steuern, hat das Potenzial, wichtige Einblicke in Gesundheit und Krankheit zu liefern.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Acknowledgments

Die Autoren möchten Tessa Davis für wichtige Beiträge zur ENTWICKLUNG von QMI-Assay und aktuelle und ehemalige Mitglieder der Smith- und Schrum-Labore für technische Beratung und intellektuellen Input würdigen. Diese Arbeit wurde durch NIMH-Zuschüsse R01 MH113545 und R00 MH 102244 finanziert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well flat bottomed plates Bio Rad 171025001
96-well PCR plates VWR 82006-704
Bioplex 200 System with HTF Bio Rad 171000205 modiefied to keep partially refrigerated, see Figure S1 for details
Bio-Plex Pro Wash Station Bio Rad 30034376
BSA Sigma
CML beads Invitrogen C37481
EDTA Sigma E6758
EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin Thermo Scientific A39256
MagPlex Microspheres Luminex MC12xxx-01 xxx is the 3 digit bead region
Melon Gel IgG Spin Purification Kit Thermo Scientific 45206 used for antibody purification
MES Sigma M3671
Microplate film, non-sterile USA Scientific 2920-0000
Phosphotase inhibitor cocktail #2 Sigma P5726
Protease inhibitor cocktail Sigma P8340
Sandwich Prep Refrigerator Norlake SMP 36 15 for custom refrigeration of Bioplex 200
Sodium fluoride Sigma 201154
Sodium orthovanadate Sigma 450243
Streptavidin-PE BioLegend 405204
Sulfo NHS Thermo Scientific A39269
Tris Fisher Scientific BP152

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References

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Biochemie Ausgabe 150 IP-FCM Proteomik Proteininteraktion Signalisierung Immunpräzipation QMI
Quantifizierung der Protein-Interaktionsnetzwerkdynamik mit Multiplex-Co-Immunopräzipitation
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Brown, E. A., Neier, S. C., Neuhauser, C., Schrum, A. G., Smith, S. E. P. Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation. J. Vis. Exp. (150), e60029, doi:10.3791/60029 (2019).

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