En minimalt invasiv læsion teknik for muskler iboende til Odontophore af Aplysia californica

Summary

Her præsenterer vi en protokol for minimalt invasiv kirurgisk lesioning af muskler iboende til fodring apparat af marine bløddyrs aplysia californica at forstå rollerne af disse muskler under fodring adfærd.

Abstract

Aplysia californica er et model system til at studere neurale kontrol af læring og adfærd. Dette dyr har et semi-åbent kredsløbssystem, hvilket gør det muligt at få adgang til mange af sine interne strukturer uden at forårsage nogen væsentlig skade. Mange manipulationer kan let udføres både in vivo og in vitro, hvilket gør det til en meget Tractable model til analyse af adfærd og neurale kredsløb. For bedre at forstå de funktioner af muskler i fodring grasper, har vi udviklet en teknik til at lesioning dem uden at åbne hoved kroppen hulrum af dyret eller beskadige de ydre lag af fodrings organet (dvs. den buccale masse). I denne teknik er fanger udløsende delvist everted, hvilket giver direkte adgang til muskulaturen. Denne procedure giver dyrene mulighed for at komme sig hurtigt og pålideligt. Dette har gjort det muligt at læsion de i7 muskler og sub-radular fibre, så vi kan vise, at begge muskler bidrager betydeligt til åbningen in vivo.

Introduction

Fodrings systemet af aplysia californica har en lang tradition for brug som et model system til forståelse af læring og hukommelse¹, motiveret adfærd^2,3, og samspillet mellem adfærd, biomekanik og neurale kontrol under fodring⁴. Det har meget tilgængelige neurale kredsløb, med et relativt lille antal store, identificerbare neuroner. Dyret har et halvåbent kredsløbssystem, hvilket gør det muligt at få adgang til mange af dets interne strukturer uden at forårsage betydelig skade. Det er også robust over for mange manipulationer både in vivo og in vitro, hvilket gør det til en meget Tractable model til analyse af adfærd og neurale kredsløb.

For at forstå de neurale mønstre, der giver anledning til fodring adfærd, er det vigtigt at beskrive den underliggende mekanik af den bløde struktur, der udgør fodrings organet, den buccale Mass⁴. Mens der har været arbejde gjort for at karakterisere de ydre muskler, der udgør den buccale masse⁵,⁶, de indre muskler i den underliggende struktur i den buccale masse, der styrer overfladen af grasper, den odontophore, er blevet stort set utilgængelige for in vivo forsøg. Selv om der har været in vitro-undersøgelser om funktioner af nogle af disse muskler^7,8, manglen på direkte adgang til disse muskler har gjort det vanskeligt at studere deres rolle i intakt, opfører dyr.

De fleste teknikker til elektrode implantation eller læsioner i aplysia eller lignende molluskart kræver, at kropsvæg åbnes^9,10,11,12. Åbning af krops væggen forårsager epitel skade, og indsnit skal være forsvarligt forseglet for at forhindre hemolymph undslippe. Der opstår endnu alvorligere vanskeligheder, når man forsøger at nå de indre muskler i den hule af Aplysia (muskler underliggende radulært overflade eller inden for odontophore): efter at have indtastet gennem de vigtigste kropshulrum, skal man derefter gå gennem nogle del af muskel væggen i den buccale masse for at få adgang til de indvendige strukturer (figur 1a). Denne akkumulerede skade og vanskeligheder med adgang har gjort tilgangen gennem konventionelle midler problematisk, fordi dyrene ikke genvinde godt fra disse operationer (af dyr med fuld eversioner, kun 17% genvundet enhver fodring evne, N = 12. Omkring 85% af ikke-everted dyr genvundet evnen til at fodre, N = 84).

Den i7 muskel, som er blevet karakteriseret som en radular opener⁸, er dybt inde i odontophore selv, yderligere komplicerende adgang. Den strækker sig mellemfoden af radular stilken (figur 1c) og undersiden af radularoverfladen, gennem et lumen i odontophore (figur 1c). På tre sider af de i7 muskler er vægge af muskler, og den fjerde væg består af radular stilk. Med henblik på en biomekanisk undersøgelse ville en væsentlig forringelse af nogen af disse strukturer kompromittere den normale funktion af fodrings apparatet. Vi udviklede en roman tilgang til at arbejde med odontophore ud gennem kæberne, og gennemføre operationen via et snit til den tynde, brusk radular overflade, der gjorde det muligt at læsion den i7 muskel, samt nyligt beskrevne fine muskelfibre, der Kør lige under radular overfladen, som vi refererer til som sub-radular fibre (figur 1c).

Figur 1: anatomisk oversigt. A) placeringen af den buccale masse inden for aplysia. (B) udvendig anatomi af odontophore. Overfladen af Radula og radular SAC er gule; muskler komponere odontophore er vist i rødt, baseret på deres faktiske farver. (C) sagittal sektion af odontophore, viser placeringen af sub-radular fibre (buet pink linje) og i7 muskel (lige pink linje). Tværsnit af i6 musklen er vist i mørkerød. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Protocol

Aplysia er hvirvelløse dyr og er derfor ikke underkastet iauc-godkendelse. For at minimere ubehag for dyr, sikre, at de er fuldt bedøvet før anvendelse af de kirurgiske teknikker, der er beskrevet nedenfor.

1. udvælgelse af dyr og bedøvelse

1. Vælg et aktivt dyr ved at tilbyde det tang og bekræfter, at bid intervaller er ikke større end mellem 3 og 5 s.
2. Bedøv dyret med 0,333 molær magnesiumchlorid (se tabel 1) ved indsprøjtning i nærheden af hovedet med en 18 G nål på en 60 mL sprøjte, således at den højeste koncentration af bedøvelsesmiddel vil være omkring den buccale masse.
   1. Vær forsigtig med at trænge ind i både den ydre epitelet og det inderste vævs lag med nålen. Sørg for, at injektionen er omtrent under rhinophore, halvvejs mellem rhinophore og foden, og nålen skal indtaste skråt, peger i retning af kæberne.
3. Efter 10 min, forsigtigt forsøge at indsætte en PIN i Gill og rhinophore, kontrollere, at disse ikke trække sig tilbage, for at sikre tilstrækkelig bedøvelsesmiddel.
4. Sørg for, at læberne og kæben af Slug er afslappet, således at odontophore kan blive eksponeret.
   Bemærk: Rynkning på læberne af figur 2a indikerer, at dyrets læber og kæbe ikke er tilstrækkeligt afslappet til, at den kirurgiske procedure kan udføres uden beskadigelse. De glatte, afslappede læber af figur 2b indikerer, at kæberne er helt afslappede.

Figur 2: spænding og afslapning i bedøvet Aplysia munde. (A) aplysia , der viser en høj grad af muskelspændinger omkring læberne. Dette korrelerer med kæbe spænding og kontra indikerer fortsætter med operationen. (B) aplysia med afslappede læber, der viser indersiden af kæberne (lysegrå). Farverne igen svarer til dem, der observeres i dyret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

5. Hvis et dyrs læber ikke er afslappet, injicere yderligere 30 mL magnesiumchlorid og vente yderligere 5 min. Hvis dette ikke resulterer i læbe afslapning, skal du returnere dem til en isoleret beholder med god vandgennemstrømning for at give dem mulighed for at komme sig (Se trin 4) og gå videre med et andet dyr.

2. eksponere Radulært overflade

1. Placer Slug, så hovedet hænger nedad, så den buccale masse til at bosætte sig mod kæberne.
2. Påfør tryk med tommelfingeren og pegefingeren for at skubbe den buccale masse mod kæberne, holde den buccale masse på plads.
3. Drej kæberne, så de er synlige. Samtidig opretholde presset på den buccale masse, således at Prow af buccale massen er synlig gennem kæberne. (Figur 3).

Figur 3: støtte den buccal masse mod indersiden af kæberne. Fingre understøtter den buccale masse, der er blevet skubbet op mod indersiden af kæberne, indtil spidsen af Prow kan ses. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

4. Arbejd forsigtigt spidserne af de stump pincet ind i tand kanten af odontophore og brug dem til at løfte radular overfladen gennem kæberne. Hvis kæberne ikke er tilstrækkeligt afslappede, skal du bruge pincet til forsigtigt at tage fat i kanten af kløft for at hjælpe denne proces.
   Forsigtig: Dette pres risikerer større skade på dyret.
5. Når overfladen er udsat, arbejde kæberne klart af den forreste del af radular overfladen hele vejen rundt omkredsen. Dette gør odontophore mindre tilbøjelige til at trække sig tilbage (figur 4). Sørg for, at ikke mere end halvdelen af væggene i odontophore er udsat.

Figur 4: delvis eversion af Odontophore. Radular overfladen er fuldt eksponeret, men siderne af odontophore er ikke afdækket, hvilket gør dette kun en delvis eversion. Yderligere eversion vil sandsynligvis resultere i skade på dyret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Bemærk: En fuld eversion af odontophore vil forårsage store muskelskader, hvorfra dyrene er meget langsom til at inddrive.

3. kirurgiske incisioner

1. Når radular overfladen er fuldt eksponeret, arrangere Slug under en dissektion rækkevidde for operationen.
   1. Alternativt kan du bruge et bredt gummibånd og en tredje hånd til at stabilisere kæberne og radulært overflade til operationen, især mens du lærer. Dette tilføjer dog tid og øget vævsskade til proceduren, hvilket gør det mindre ideelt på lang sigt.
2. Placer radularoverfladen, så den tætte side vender mod investigator.
3. Tag forsigtigt fat i radular-overfladen i nærheden af radular-basen, så en vandret fold dannes vinkelret på den anatomiske krølle. Brug fine saks til at skære gennem denne fold, hvilket gør et snit langs den anatomiske krølle (figur 5).

Figur 5: placering af incision til Radular overflade. A) radulært underlag med et snit. B) radular overflade med cirkler, der viser, hvor strengene af den bilaterale i7 muskel vedhæfte; punkterede linjer viser placeringen af de faldende muskler under radular overfladen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

4. Udvid denne indledende indsnit til 3-5 cm for at give adgang til det indvendige af den bukkale masse.
5. Juster lys, så det peger direkte tilbage gennem denne incision.
6. Del kanterne af snittet, så bagsiden af lumen af odontophore og de tynde lodrette tråde af i7 musklen er synlige. (Figur 6)

Figur 6: placering af i7 gennem Radular overflade incision. Ser man gennemsnittet, kan begge tråde af i7 ses mellem de indvendige overflader af i4. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

7. Nå ind gennemsnittet, forstå begge tråde af i7, og trække dem op gennemsnittet, hvor så meget som musklen kan skæres væk som er praktisk (figur 7).

Figur 7: trække den i7 muskel streng gennemsnittet. Den i7 muskel er meget elastisk og kan trækkes op gennem indsnit for fjernelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Bemærk: Med praksis er det normalt mere effektivt at finde i7 ved at føle end ved synet.

4. post operativ pleje

1. Når der er udført læsioner, skal du tage fat i de forreste tentakler og trykke ned på radular-overfladen for at returnere Slug til dens oprindelige konfiguration.
2. Placer post-kirurgiske dyr i et beskyttet miljø med god vandgennemstrømning. Øget iltning hastigheder opsving. Sørg for, at dyrene er opmærksomme og reagerer på dagen efter operationen. Hvis dette ikke er tilfældet, kan det antages, at de ikke vil komme sig.
   Bemærk: Dyrene vil normalt begynde at fodre på den første eller anden dag efter operationen. Selv dyr, der har problemer med at bide, bør tilbydes tang, da det er vores anekdotiske observation, at et dyrs helbredelse forbedres af dets forsøg på at spise.

5. for sub-radular fiber læsion

1. Følg trinene fra 1,1 til 3,5
2. Indsæt spidsen af en lille lige skalpel klinge (#11 eller lignende) gennemsnittet med den skarpe kant vinklet opad. Forsigtigt skrabe de fine muskuløse fibre fra undersiden af radular overfladen. (Figur 8).

Figur 8: Lesioning af Subradular fibre. Kanten af skalpel bladet er vinklet opad gennemsnittet på undersiden af radulært overflade, så det forsigtigt kan skrabe de sub-radulære fibre væk. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

3. Vend tilbage til trin 4,1.

Representative Results

Tidligere arbejde havde antydet, at i7-musklen bidrog til åbningen af fanger udløsende⁸. Vores egne anatomiske undersøgelser tyder på, at sub-radular fibre kan også bidrage til at fanger udløsende åbning. For at teste disse hypoteser, dyr blev induceret til at generere bid både før og efter at have modtaget en kirurgisk procedure. Sham dyr blev udsat for alle de kirurgiske trin, herunder indsnit i radular overfladen, men ingen interne muskler blev fjernet. Dyr udsat for en i7 læsion havde begge i7 muskler fjernet. Dyr, der udsættes for en sub-radular fiber læsion havde ~ 25% af sub-radular fibre fjernet umiddelbart under incisionen. Fingeret læsioner havde ingen signifikant effekt på bredden af åbningen på toppen af bide, mens både i7 og sub-radular fibre læsioner væsentligt reducere bid bredde (figur 9).

Figur 9: resultater af læsioner på Åbningsbredden under spids bidende. De viste data er forskellene mellem den gennemsnitlige normaliserede åbningsbredde for Radula før og efter den kirurgiske procedure for 5 dyr i hver af de 3 grupper (Sham, i7 læsion, eller SRF læsion), med hvert dyr tjener som sin egen kontrol. Gennemsnit blev taget af 5 bites før, og 5 bid efter den kirurgiske procedure for at bestemme den gennemsnitlige normaliserede forskel. Åbningen bredde var afstanden fra centrum af Radula til radular Edge på Peak protraktion, normaliseret af afstanden fra den indvendige overflade af radular base til de Cleft-sidekanter af radular overflade. Forskellene vises som middel plus eller minus standardafvigelsen. Efter at det var fastslået, at data om forskellen normalt blev distribueret, blev sandsynligheden for, at læsionen ikke havde nogen virkning, fastsat (dvs. nulhypotesen blev afprøvet, at virkningerne af de kirurgiske indgreb i gennemsnit ville være nul) ved at anvende en parret t-test til hver uafhængig gruppe. Dataene viser, at fingeret læsion ikke havde nogen signifikant effekt, hvorimod en læsion af de i7 muskler eller en læsion af sub-radular fibre havde en signifikant effekt på radular åbning (p < 0,031 for i7 læsion gruppen, indikeret med en enkelt Asterisk , eller p < 0,002 for srf læsion-gruppen, angivet med en dobbelt Asterisk). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Kropsvægt	Magnesium klorid dosis
< 200 g	1/2 legemsvægt
200-350 g	1/3 legemsvægt
350-450 g	1/4 legemsvægt

Tabel 1: Magnesium klorid dosis efter legemsvægt.

Discussion

De mest kritiske trin i protokollen er behovet for at sikre, at dyret er fuldt bedøvet, og at eversion af den buccale masse er lige nok til at få adgang til de underliggende muskler. Det kan kræve nogle praksis at perfektionere disse trin, men når de er mestrer, udbyttet fra operationer sandsynligvis vil være større end 85% af alle eksperimenter udført. Den vigtigste måde at korrekt modificere og fejlfinding protokollen er at bruge tid på at gøre dissektioner af den buccale masse, således at placeringen af de interne muskler er helt klar til investigator. Fordi den foreslåede indsnit gennem radular overfladen uundgåeligt forårsager nogle skader på de underliggende sub-radular fibre, det kan være hensigtsmæssigt at ændre den nøjagtige placering af snittet for at undgå specifikke regioner af disse fibre.

En begrænsning af den kirurgiske teknik er, at det kan have ikke-specifikke virkninger på fodring svar, såsom styrken af protraktion. En måde at overvinde denne begrænsning er at have dyr til at fungere som deres egen kontrol. Derudover er det afgørende at have en Sham-læsions gruppe, som er underkastet hele den kirurgiske protokol med undtagelse af fjernelse af den specifikke muskel (dvs. i7 eller SRFs). Ved at følge disse forslag vil en investigator reducere virkningerne af variabilitet mellem dyr og have et iboende mål for de ikke-specifikke virkninger af kirurgi.

Tidligere arbejde har brugt tilgange gennem kroppen væggen til læsion eller optage enten fra nerver^13,14, eller muskler^15,16,17. I vores laboratorium, har vi anekdomæssigt observeret, at kropsvæg indsnit er ofte ledsaget af et betydeligt tab af hemolymph og dermed af kroppens volumen. Dyr ofte kræver flere dage til at inddrive fra dette, og hvis kroppen væg læsion ikke er omhyggeligt sutureret, dyr kan ikke komme sig. Desuden afslører post mortem undersøgelse af dyrene en betydelig ardannelse omkring snittet og et stærkt immunrespons (anekdotiske observationer). I modsætning hertil viser dyr ingen tab af hemolymph eller ændring i krops volumen efter nyttiggørelse fra den protokol, der er beskrevet her (baseret på observationer i 96 dyr).

Fremtidige anvendelser af teknikken kan udvide det til andre muskler i fodrings apparatet af Aplysia, og til andre dyr. Vi har fokuseret på fjernelsen af de i7 muskler og sub-radular fibre. Disse samme generelle kirurgiske teknikker giver også adgang til de fleste af de andre muskler i odontophore. Nogle af disse, såsom den interne del af i5 muskel, er bedst tilgængelige gennem radular overflade. Andre, ligesom de indre foldere af i4, kan bedre nås gennem den udvendige epitel af odontophore. Vi har gjort indledende forsøg, hvor et snit under radular kløft af den delvist krænget odontophore tillod adgang til en skærpet krog, der skal indsættes, som derefter kunne bruges til at læsion en anden muskel i odontophore, muskel i8⁸. Da den kirurgiske protokol, der er beskrevet her, ikke åbner hovedrummets hulrum, er det ikke nødvendigt at suturere.

Den protokol, som vi har beskrevet, kan være af almen interesse for andre efterforskere, der arbejder på bløddels strukturer, som ellers ville være svære at manipulere, f. eks. Mere generelt kan denne protokol foreslå andre nye kirurgiske tilgange til analyse af bløde strukturer som tunger, kufferter eller tentakler¹⁸.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blunt forceps	Fine Science Tools	11210-10	2 pair
Scalpel blade (#11)	Fine Science Tools	10011-00
Spring scissors	Fine Science Tools	15024-10
Webcam	Logitech	c920	for recording data