Summary
여기에서 우리는 수유 행동 도중 이 근육의 역할을 이해하기 위하여 해양 연체 동물 Aplysia californica의 공급 장치에 내재된 근육의 최소침습 외과 병변을 위한 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
Aplysia californica는 학습과 행동의 신경 제어를 연구하기위한 모델 시스템입니다. 이 동물은 반 개방 순환 시스템을 가지고 있어 큰 손상을 입지 않고 많은 내부 구조물에 접근할 수 있습니다. 많은 조작은 생체 외와 시험관 내에서 쉽게 수행 될 수 있으므로 행동 및 신경 회로 분석을위한 고도로 견인 가능한 모델입니다. 수유 그리퍼 내의 근육의 기능을 더 잘 이해하기 위해, 우리는 동물의 본체 구멍을 열거나 수유 기관의 외부 층 (즉, 볼 질량)을 손상시키지 않고 병변을하는 기술을 개발했습니다. 이 기술에서는, grasper는 부분적으로 에버로 되어 있어 근육에 직접 접근할 수 있습니다. 이 절차를 통해 동물은 빠르고 안정적으로 회복할 수 있습니다. 이것은 I7 근육과 아방산이 있는 섬유를 병변으로 만들었기 때문에 두 근육이 생체 내 개구부에 크게 기여한다는 것을 보여줄 수 있습니다.
Introduction
Aplysia californica의 공급 시스템은 학습 및 기억 1, 동기 부여행동2,3,및 행동, 생체 역학 및 사이의 상호 작용을 이해하는 모델 시스템으로 사용의 오랜 역사를 가지고 먹이 동안 신경 제어4. 그것은 매우 접근 신경 회로, 큰의 상대적으로 적은 수와, 식별 가능한 뉴런. 동물은 반 개방 순환 시스템을 가지고 있어 상당한 손상을 일으키지 않고 많은 내부 구조물에 접근할 수 있습니다. 그것은 또한 생체 외와 생체 외에서 많은 조작에 강력한, 행동 및 신경 회로의 분석을 위한 높은 견인 모델 만들기.
먹이 행동을 초래하는 신경 패턴을 이해하려면 수유 기관인 볼질량 4를 구성하는 연약한 구조의 근본적인 역학을설명하는 것이 중요합니다. 5,6,배구체의 표면을 제어하는 볼 질량 내의 기본 구조의 내부 근육을 구성하는 외부 근육을 특성화하는 작업이 수행되었지만, 오돈토포레는 생체 내 실험에 크게 접근할 수 없습니다. 이러한근육의일부에 대 한 생체 외에서 연구 되었습니다 7,8,이러한 근육에 직접 액세스의 부족 어렵게 그들의 역할을 공부 하기 어렵게 만든, 행동 동물.
Aplysia 또는 유사한 연체 판 종에서 전극 이식 또는 병변에 대한 대부분의 기술은 신체 벽을열것을 요구 9,10,11,12. 신체 벽을 열면 상피 손상이 발생하며 절개는 hemolymph 탈출을 방지하기 위해 단단히 밀봉되어야합니다. 더 심각한 어려움은 Aplysia의 grasper의 grasper의 내부 근육에 도달 하려고 할 때 제기 (방사 표면 또는 odontophore 내에서 근육): 본체 구멍을 통해 입력 하는 데, 하나는 다음 몇 가지 를 통해 이동 해야 합니다. 내부 구조에 대한 액세스를 얻기 위해 볼 질량의 근육벽의 부분 (그림 1A). 이러한 누적된 부상 및 접근의 어려움은 동물이 이러한 수술에서 잘 회복되지 않기 때문에 기존의 수단을 통해 접근하게 되었다 (전체 회귀와 동물의, 단지 17%는 어떤 공급 능력을 회복, N = 12. 약 85%의 비적원 동물이 사료능력을 되찾았고, N =84).
방사체 오프너 8로 특징 지어진 I7근육은 오돈토포어 내부 깊숙이 있어 접근성이 더욱 복잡해졌습니다. 그것은 방사줄기의 기저부(도1C)와 방사체 표면의 밑면 사이에 뻗어, 오돈토포레의 내강을 통해(그림1C). I7 근육의 세 면에는 근육벽이 있고 네 번째 벽은 방사형 줄기로 구성됩니다. 생체 역학 연구의 목적을 위해, 이러한 구조중 어느 것에도 큰 손상을 주면 공급 장치의 정상적인 기능이 손상될 수 있습니다. 우리는 턱을 통해 오돈토포레를 밖으로 작동하고 얇은 연골 반경 표면에 절개를 통해 수술을 실시하는 새로운 접근법을 개발하여 I7 근육을 병변할 수 있게 했으며, 새로 기술된 미세 근육 섬유를 개발했습니다. 우리가 하위 방공 섬유로 참조 하는 방현면 아래 실행 (그림1C).
그림 1: 해부학 개요. (A) 아클리시아 내의 볼 질량의 위치. (B) 안부포어의 외부 해부학. 라둘라와 방공낭의 표면은 노란색입니다. 오돈토포어를 구성하는 근육은 실제 색상에 따라 빨간색으로 표시됩니다. (C) 오돈토포어의 시상 섹션으로, 경반섬유(곡선형 분홍색 선)와 I7 근육(직선 분홍색 선)의 위치를 보여준다. I6 근육의 단면은 진한 빨간색으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Protocol
Aplysia는 무척추 동물이며 따라서 IAUC 승인을 받지 않습니다. 동물에 대한 불편함을 최소화하려면 아래에 설명된 수술 기법을 적용하기 전에 동물이 완전히 마취되었는지 확인하십시오.
1. 동물 선택 및 마취
- 해초를 제공하고 물린 간격이 3에서 5 초 사이보다 크지 않다는 것을 확인하여 활성 동물을 선택하십시오.
-
0.333 어금니모 마그네슘 염화액으로 동물을 마취(표 1 참조)하여 60 mL 주사기에 18G 바늘로 머리 근처에 주입하여 가장 높은 농도의 마취물질이 볼질량 주위가 되도록 한다.
- 바늘로 외부 상피와 내부 조직 층을 모두 관통하도록주의하십시오. 주사가 코뿔소와 발 사이의 중간 쯤에 대략 코뿔소 아래에 있는지 확인하고 바늘이 턱방향을 가리키며 비스듬히 입력해야합니다.
- 10 분 후, 부드럽게 충분한 마취를 보장하기 위해, 이들이 철회하지 않는 것을 확인, 아가미와 코뿔소에 핀을 삽입하려고합니다.
- 슬러그의 입술과 턱이 완화되어 오돈토포레가 노출되도록 하십시오.
참고: 그림 2A의 입술에 주름은 동물의 입술과 턱이 손상없이 수행 할 수있는 수술 절차에 충분히 이완되지 않았음을 나타냅니다. 그림 2B의 부드럽고 편안한 입술은 턱이 완전히 편안하다는 것을 나타냅니다.
그림 2: 마취 된 Aplysia 입에서 긴장과 휴식. (A) 입술 주위의 근육 긴장이 높은아포시아. 이것은 턱 긴장과 상관관계가 있고 수술을 진행하는 금기. (B) 편안한 입술로 턱 안쪽을 보여주는 아시시아 (밝은 회색). 색상은 다시 동물에서 관찰된 색상과 일치합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 동물의 입술이 이완되지 않으면 염화마그네슘 30mL를 추가로 주입하고 5분 더 기다립니다. 이것이 입술 이완을 초래하지 않는 경우에, 그(것)들을 복구하는 것을 허용하기 위하여 좋은 물 교류를 가진 고립된 콘테이로 돌려보내 (단계 4 참조) 다른 동물로 진행합니다.
2. 방진 표면 노출
- 머리가 아래쪽으로 걸려 볼질량이 턱에 정착할 수 있도록 슬러그를 배치합니다.
- 엄지와 집게 손가락으로 압력을 가하여 볼 질량을 턱쪽으로 밀어 넣은 다음 볼 질량을 제자리에 잡습니다.
- 턱이 보이도록 턱을 회전시다. 동시에, 턱을 통해 볼 수 있도록 볼 질량에 압력을 유지합니다. (그림3).
그림 3: 턱 안쪽에 대한 부칼 질량 지원. 손가락은 배의 끝이 보일 때까지 턱의 안쪽 가장자리에 밀려 된 볼 질량을 지지합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 무딘 포셉의 끝을 오돈토포어의 갈라진 부분에 부드럽게 넣고 턱을 통해 방사표면을 활용하는 데 사용합니다. 턱이 충분히 완화되지 않은 경우, 이 과정을 지원하기 위해 갈라진 부분의 가장자리를 부드럽게 잡기 위해 집게를 사용합니다.
주의 사항: 이 압력은 동물에게 더 큰 손상을 입힐 위험이 있습니다. - 표면이 노출되면, 둘레 의 모든 방법을 방향 표면의 앞쪽 부분의 턱을 취소 작동합니다. 이것은 odontophore가 철회할 가능성이적습니다 (그림 4). 오돈토포레 벽의 절반 이상이 노출되지 않도록 하십시오.
그림 4: 오돈토포어의 부분 적감. 방진 표면은 완전히 노출되지만, 오돈토포레의 측면은 발견되지 않아 부분적인 회귀만 이뤄진다. 추가 로이빙은 동물에게 손상을 줄 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
참고: odontophore의 완전한 감전은 동물이 복구하는 것을 아주 느리게 하는 중요한 근육 손상을 일으키는 원인이 될 것입니다.
3. 외과 절개
-
방사표면이 완전히 노출되면, 수술을 위한 해부 범위 아래에 슬러그를 배열한다.
- 또는, 넓은 고무 밴드와 세 번째 손을 사용하여 수술을 위해 턱과 방공면을 안정시고, 특히 배우는 동안. 그러나 이것은 절차에 시간과 증가 된 조직 손상을 추가하여 장기적으로 덜 이상적입니다.
- 갈라진 면이 조사자와 마주치게 되도록 반경 표면을 배치합니다.
- 수평 접이 해부학 주름에 수직으로 형성되도록, 방향 기저 근처의 방향 표면을 부드럽게 잡아. 미세 가위를 사용하여 이 접기를 잘라 내어 해부학적 주름을 따라 절개를합니다(그림 5).
그림 5: 라디큘러 표면에 절개위치. (A) 절개가 있는 반경 표면. (B) 양측 I7 근육의 가닥이 부착되는 곳을 나타내는 원과 함께 방진 표면; 점선은 진도 아래 의 내림차순 근육의 위치를 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 이 초기 절개를 3-5cm로 확장하여 볼 질량의 내부에 접근할 수 있도록 합니다.
- 이 절개를 통해 직접 다시 가리키도록 빛을 조정합니다.
- 절개의 가장자리를 일부 하여 안구포의 내강과 I7 근육의 얇은 수직 가닥의 뒷면이 보이도록 합니다. (그림6)
그림 6: Radular 표면 절개를 통한 I7의 위치입니다. 절개를 통해 보면 I7의 두 가닥은 I4의 내부 표면 사이에서 볼 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 절개를 통해 도달, I7의 두 가닥을 잡고, 절개를 통해 그들을 당겨, 어디 만큼 근육은 실용적인멀리 절단 할 수 있습니다 (그림 7).
그림 7: 절개를 통해 I7 근육 가닥을 당깁니다. I7 근육은 매우 탄력적이며 제거를 위해 절개를 통해 위로 당길 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
참고: 연습으로, 그것은 일반적으로 시력보다 느낌으로 I7을 찾는 것이 더 효과적이다.
4. 수술 후 관리
- 병변이 수행 된 후, 전방 촉수를 잡고, 원래의 구성에 슬러그를 반환하는 방공 표면에 아래로 밀어.
- 수술 후 동물을 물 흐름이 좋은 보호 된 환경에 놓습니다. 증가 된 산소는 회복 속도를 높입니다. 동물은 수술 후 하루에 경고하고 반응있는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 복구되지 않는다고 가정할 수 있습니다.
참고: 동물은 일반적으로 수술 후 첫 번째 또는 두 번째 날에 먹이를 시작합니다. 물린 데 어려움을 겪고있는 동물조차도 해초를 제공해야하며, 먹는 시도로 동물의 회복이 개선된다는 일화적인 관찰입니다.
5. 경반 섬유 병변용
- 1.1에서 3.5 단계 따르십시오.
- 날카로운 가장자리가 위쪽으로 기울어진 절개를 통해 작은 직선 메스 블레이드 (#11 또는 이와 유사한)의 끝을 삽입합니다. 경사형 표면의 밑면에서 미세한 근육 섬유를 부드럽게 긁어냅니다. (그림8).
그림 8: 수식 섬유를 병변화. 메스 블레이드의 가장자리는 경색 표면의 아래쪽으로 절개를 통해 위쪽으로 기울어져 있어 경반 섬유를 부드럽게 긁어냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 4.1단계로 돌아갑니다.
Representative Results
이전 작품은 I7 근육이 grasper8의개구부에 기여했다고 제안했습니다. 우리 자신의 해부학 연구는 아방산이 섬유도 GRASPER 개방에 기여할 수 있음을 제안했다. 이러한 가설을 테스트하기 위해, 동물은 외과 적 시술을 받기 전과 후에 모두 물린을 생성하도록 유도되었다. Sham 동물은 방사체 표면의 절개를 포함한 모든 수술 단계를 거쳤지만 내부 근육은 제거되지 않았습니다. I7 병변을 받은 동물은 모두 I7 근육을 제거하였다. 아방막 섬유 병변을 행한 동물은 절개 바로 아래에서 제거된 아방도 섬유의 ~25%를 가졌다. Sham 병변은 물린 의 피크에서 개구부의 폭에 유의한 영향을 미치지 않았지만, I7 및 아방아 섬유 병변 모두 물린 폭을 현저히 감소시켰습니다(그림9).
그림 9: 피크 물기 동안 개방 폭에 대한 병변의 결과. 도시된 데이터는 각각의 3군(sham, I7 병변, 또는 SRF 병변)에서 5마리의 동물에 대한 수술 시술 전후의 평균 정규화 개방 폭사이의 차이이며, 각 동물은 자체 대조군으로 작용한다. 평균 은 이전에 5 물린, 그리고 5 물린 수술 후 평균 정규화 된 차이를 확인 했다. 개방 폭은 라둘라의 중심에서 피크 protraction에서 의 radular 에지까지의 거리였으며, radular base의 내부 표면으로부터 의 거리로부터 의한 거리로부터 의한 진도 표면의 갈라진 면 에지에 의해 정규화되었다. 차이는 표준 편차를 더하거나 뺀 평균으로 표시됩니다. 차이 데이터가 일반적으로 분포되었다는 것을 확립한 후, 병변에 효과가 없었던 확률이 결정되었다(즉, 무효 가설은 쌍을 이룬 을 적용하여 수술 절차의 효과가 평균적으로 0이 될 것이라는 것을 시험하였다) 각 독립 그룹에 t-테스트. 데이터는 sham 병변이 유의한 효력이 없었다는 것을 보여줍니다, 반면 I7 근육의 병변 또는 아방산섬유의 병변은 방진 통에 중요한 효력이 있었다 (p < 0.031 I7 병변 단을 위한, 단 하나 별표로 지시된 , 또는 p< 0.002 SRF 병변 군에 대해, 이중 별표로 표시). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 체중 | 염화 마그네슘 투여량 |
| <200g | 1/2 체중 |
| 200~350 g | 1/3 체중 |
| 350~450 g | 1/4 체중 |
표 1: 체중에 의해 염화 마그네슘 복용량.
Discussion
프로토콜 내에서 가장 중요한 단계는 동물이 완전히 마취되어 있는지 확인하고, 볼 질량의 감전이 기본 근육에 액세스하기에 충분하다는 것입니다. 이러한 단계를 완료하기 위해 몇 가지 연습이 필요할 수 있지만 일단 마스터되면 수술의 수율이 수행 된 모든 실험의 85 % 이상이 될 수 있습니다. 프로토콜을 올바르게 수정하고 문제를 해결하는 가장 중요한 방법은 내부 근육의 위치가 조사자에게 완전히 명확하도록 볼 질량의 해부를 수행하는 데 시간을 할애하는 것입니다. 방사체 표면을 통한 제안된 절개는 필연적으로 근본적인 아방광 섬유에 약간의 손상을 야기하기 때문에, 이러한 섬유의 특정 영역을 피하기 위해 절개의 정확한 위치를 수정하는 것이 적절할 수 있다.
외과 기술의 한 가지 제한은 양성강도와 같은 공급 반응에 비특이적 인 영향을 미칠 수 있다는 것입니다. 이러한 한계를 극복하는 한 가지 방법은 동물이 자신의 통제 역할을 하도록 하는 것입니다. 또한, 특정 근육(즉, I7 또는 SRF)의 제거를 제외하고 전체 수술 프로토콜을 실시하는 가짜 병변 기를 가지는 것이 중요하다. 이러한 제안에 따라, 조사원은 동물 사이의 가변성의 효과를 감소시키고 수술의 비 특정 효과의 본질적인 측정을해야합니다.
이전 작업은 병변에 신체 벽을 통해 접근 방식을 사용하거나 신경에서 중 하나를 기록13,14,또는 근육15,16,17. 우리의 실험실에서, 우리는 일화적으로 신체 벽 절개는 종종 hemolymph의 상당한 손실과 따라서 신체 볼륨의 동반 것을 관찰했다. 동물은 종종이에서 복구하는 데 며칠이 필요하며, 신체 벽 병변이 조심스럽게 봉합되지 않으면 동물이 회복되지 않을 수 있습니다. 또한, 동물의 사후 검사는 절개 및 강한 면역 반응 (일화 관찰)의 주위에 상당한 흉터를 보여줍니다. 대조적으로, 동물은 여기에 기술된 프로토콜로부터 회복 된 후 혈림프 또는 체적 의 변화의 손실을 보여주지 않는다 (96 동물의 관찰에 기초).
기술의 미래 응용은 Aplysia의 공급 장치 내의 다른 근육으로 확장 할 수 있습니다, 및 다른 동물. 우리는 I7 근육과 아방산이 섬유의 제거에 초점을 맞추고있다. 이 같은 일반적인 외과 기술은 또한 odontophore의 그밖 근육의 대부분에 접근을 허용합니다. 이들 중 일부는, I5 근육의 내부 부분 등, 가장 방공 표면을 통해 액세스. 다른 사람, I4의 내부 전단지 처럼, 더 나은 odontophore의 외부 상피를 통해 도달 될 수 있습니다. 우리는 부분적으로 에버로된 오돈토포어의 방진 갈라진 부분 아래 절개가 삽입될 수 있는 날카로운 후크에 대한 접근을 허용한 예비 시험을 치렀으며, 이는 오돈토포어 내의 다른 근육을 병변으로 사용할 수 있는, 근육 I88. 여기에 설명된 수술 프로토콜은 본체 구멍을 열지 않기 때문에 봉합이 필요하지 않습니다.
우리가 기술한 프로토콜은 그렇지 않으면 조작하기 어려운 연약한 조직 구조물에 일하는 그밖 조사자에게 일반적인 관심사일지도 모릅니다, 예를 들면, 그밖 연체 동물의 공급 장치. 더 일반적으로, 이 프로토콜은 혀, 트렁크 또는 촉수18과같은 연약한 구조물의 분석에 그밖 새로운 외과 접근을 건의할 수 있었습니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
셰리 니겔, 시루, 조이 우가 이러한 프로토콜을 개선하고 검증하기 위해 노력한 것을 인정하고 싶습니다. 이 작업은 NSF 그랜트 IOS 1754869에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blunt forceps | Fine Science Tools | 11210-10 | 2 pair |
| Scalpel blade (#11) | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Webcam | Logitech | c920 | for recording data |
References
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