Summary
Здесь мы представляем протокол для минимально инвазивного хирургического поражения мышц, присущих аппарату кормления морского моллюска Aplysia californica, чтобы понять роль этих мышц во время кормления поведения.
Abstract
Aplysia californica является модельной системой для изучения нейронного контроля обучения и поведения. Это животное имеет полуоткрытую систему кровообращения, что позволяет получить доступ ко многим из его внутренних структур, не причиняя каких-либо значительных повреждений. Многие манипуляции можно легко выполнять как in vivo, так и in vitro, что делает его высокоуступчивой моделью для анализа поведения и нейронных схем. Чтобы лучше понять функции мышц в кормущей хватке, мы разработали методику поражения их без открытия основной полости тела животного или повреждения внешних слоев кормящего органа (т.е. буккальной массы). В этом методе, захват частично everted, позволяющ сразу доступ к мускулатуре. Эта процедура позволяет животным быстро и надежно восстанавливаться. Это позволило к поражению мышц I7 и субрадулярных волокон, что позволяет нам показать, что обе мышцы вносят значительный вклад в открытие in vivo.
Introduction
Система кормления Aplysia californica имеет долгую историю использования в качестве модели системы для понимания обучения и памяти1, мотивированное поведение 2,3, и взаимодействие между поведением, биомеханики и нейронного контроля во время кормления4. Он имеет высокодоступную нейронную схему, с относительно небольшим числом крупных, идентифицируемых нейронов. У животного полуоткрытая кровеносная система, что позволяет получить доступ ко многим его внутренним структурам, не причиняя значительного ущерба. Он также является надежным для многих манипуляций как in vivo, так и in vitro, что делает его высокоуступчивой моделью для анализа поведения и нейронных схем.
Чтобы понять нейронные модели, которые приводят к кормления поведения, важно описать основные механики мягкой структуры, которая составляет орган питания, buccal массы4. Хотя была проделана работа, чтобы охарактеризовать внешние мышцы, которые составляют buccal массы5,6, внутренние мышцы основной структуры в buccal массы, которая контролирует поверхность захвата, одонтофор, были в значительной степени недоступны для экспериментов in vivo. Хотя были в пробирке исследования о функциях некоторых из этих мышц7,8, отсутствие прямого доступа к этим мышцам затрудняет изучение их роли в нетронутых, ведя себя животных.
Большинство методов для имплантации электродов или поражений в Aplysia или аналогичных моллюсков видов требуют, чтобы стенка тела быть открыт9,10,11,12. Открытие стенки тела вызывает эпителиальную травму, и разрез должен быть надежно запечатан, чтобы предотвратить побег гемолимфы. Еще более серьезные трудности возникают при попытке достичь внутренних мышц захвата Aplysia (мышцы, лежащие в основе радулярной поверхности или в одонтофоре): введя через основную полость тела, нужно затем пройти через некоторые часть мышечной стенки буккальной массы, чтобы получить доступ к внутренним структурам(рисунок 1A). Эта накопленная травма и трудность доступа сделали подход с помощью обычных средств проблематичным, потому что животные не оправиться хорошо от этих операций (животных с полными отвращениями, только 17% восстановили любую способность кормления, N No 12. Около 85% невсегдаевки животных восстановили способность к корму, N No 84).
Мышца I7, которая была охарактеризованакак радулярный нож 8, находится глубоко внутри самого одонтофора, что еще больше усложняет доступ. Он простирается между основанием радулярного стебля(рисунок 1С)и нижней частью радулярной поверхности, через просвет в одонтофоре (рисунок1С). С трех сторон мышц I7 находятся стенки мышц, а четвертая стена состоит из радулярного стебля. Для целей биомеханического исследования, серьезные нарушения любой из этих структур будет поставить под угрозу нормальную функцию кормления аппарата. Мы разработали новый подход к работе одонтофора через челюсти, и проведение операции через разрез на тонкой, хрящевой радулярной поверхности, что позволило к поражению мышцы I7, а также недавно описанные тонкие мышечные волокна, которые работать прямо под радулярной поверхности, которую мы называем субрадулярных волокон(рисунок 1C).
Рисунок 1: Анатомический обзор. (A) Расположение buccal массы в Aplysia. (B) Внешняя анатомия одонтофора. Поверхность радула и радулярного мешка желтая; мышцы, составляющие одонтофор, показаны красным цветом, в зависимости от их фактических цветов. (C) Сагиттальный раздел одонтофора, показывающий расположение субрадулярных волокон (изогнутая розовая линия) и I7 мышцы (прямая розовая линия). Поперечное сечение мышцы I6 показано темно-красным цветом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Protocol
Аплисия беспозвоночных и, таким образом, не подвергается утверждению IAUC. Чтобы свести к минимуму дискомфорт для животных, убедитесь, что они полностью под анестетом перед применением хирургических методов, описанных ниже.
1. Отбор животных и анестезия
- Выберите активное животное, предлагая ему водоросли и подтверждая, что интервалы укуса не больше, чем между 3 и 5 с.
-
Анестезируйте животное с 0,333 молярного хлорида магния (см. таблицу 1) путем введения вблизи головы с 18 G иглы на 60 мл шприца, так что самая высокая концентрация анестезии будет вокруг buccal массы.
- Позаботьтесь, чтобы проникнуть как внешний эпителий и внутренний слой ткани с иглой. Убедитесь, что инъекция находится примерно под ринофором, на полпути между ринофором и ногой, и игла должна войти косо, указывая в направлении челюстей.
- После 10 минут, осторожно попытаться вставить булавку в жабры и ринофора, проверяя, что они не втягивается, чтобы обеспечить достаточную анестезию.
- Убедитесь, что губы и челюсть пули расслаблены, так что одонтофор может быть выставлен.
ПРИМЕЧАНИЕ: Морщины на губах Рисунок 2A указывает на то, что губы и челюсть животного не достаточно расслаблены для хирургической процедуры, которая будет выполнена без повреждений. Гладкие, расслабленные губы Рисунок 2B указывают на то, что челюсти полностью расслаблены.
Рисунок 2: Напряжение и расслабление в анестезируемых аплизии рот. ()А) Ацилисия показывает высокую степень мышечного напряжения вокруг губ. Это коррелирует с напряжением челюсти и противопоказаний, применяющих операцию. (B) Ацилисия с расслабленными губами, показывая внутри челюстей (светло-серый). Цвета снова соответствуют тем, которые наблюдаются в животном. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
- Если губы животного не расслаблены, введите дополнительно 30 мл хлорида магния и подождите еще 5 минут. Если это не приводит к релаксации губ, вернуть их в изолированный контейнер с хорошим потоком воды, чтобы позволить им восстановить (см. шаг 4) и приступить к другому животному.
2. Разоблачение радулярной поверхности
- Расположите пулю так, чтобы голова висела вниз, позволяя букальной массе осесть против челюстей.
- Применить давление с большим и указательным пальцами, чтобы подтолкнуть buccal массы к челюстям, удерживая buccal массы на месте.
- Поверните челюсти так, чтобы они были видны. В то же время, поддерживать давление на buccal массы так, что нос buccal массы видно через челюсти. (Рисунок 3).
Рисунок 3: Поддержка Buccal масса против внутри челюстей. Пальцы поддерживают buccal массы, которая была толкнул против внутреннего края челюстей, пока кончик носможно увидеть. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
- Аккуратно работать кончики тупых щипцы в расщелину одонтофора и использовать их для рычага радулярной поверхности через челюсти. Если челюсти не достаточно расслаблены, используйте щипцы, чтобы аккуратно понять край расщелины, чтобы помочь этому процессу.
ПРЕДЕКТО: Это давление рискует больше вреда для животного. - Как только поверхность подвергается, работа челюсти очистить от передней части радулярной поверхности всю дорогу по периметру. Это делает одонтофор менее вероятно, чтобы отказаться(Рисунок 4). Убедитесь, что не более половины стен одонтофора подвергается воздействию.
Рисунок 4: Частичная отвращение одонтофора. Поверхность радуляра полностью обнажается, но стороны одонтофора не раскрыто, что делает это лишь частичной эверсией. Дальнейшая эверсия, скорее всего, приведет к повреждению животного. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Полная эверсия одонтофора вызовет серьезные повреждения мышц, от которых животные очень медленно восстанавливаются.
3. Хирургические разрезы
-
После того, как радулярная поверхность полностью подвергается, организовать пули под вскрытие области для операции.
- Кроме того, используйте широкую резинку и третью руку, чтобы стабилизировать челюсти и радулярную поверхность для операции, особенно во время обучения. Это, однако, добавляет время и увеличение повреждения тканей процедуры, что делает его менее идеальным в долгосрочной перспективе.
- Поместите радулярную поверхность так, чтобы сторона расщелина влица лащец на следователя.
- Аккуратно схватить радулярную поверхность, возле радулярного основания, так что горизонтальная складка образуется перпендикулярно анатомической складке. Используйте тонкие ножницы, чтобы прорезать этот складок, делая разрез вдоль анатомической складки(рисунок5).
Рисунок 5: Расположение разреза на радулярную поверхность. (A) Радулярная поверхность, с разрезом. (B) Радулярная поверхность с кругами, показывающими, где прикрепляются нити двусторонней мышцы I7; пунктирные линии показывают расположение нисходящих мышц под радулярной поверхностью. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
- Расширьте этот первоначальный разрез до 3-5 см, чтобы обеспечить доступ к внутренней части буккальной массы.
- Отрегулируйте свет так, чтобы он успотыкал прямо через этот разрез.
- Часть края разреза так, что задняя часть просвета одонтофора и тонкие вертикальные нити мышцi I7 видны. (Рисунок 6)
Рисунок 6: Расположение I7 через радулярную разрез поверхности. Глядя через разрез, обе нити I7 можно увидеть между внутренними поверхностями I4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
- Достичь через разрез, захватить обе нити I7, и вытащить их через разрез, где столько, сколько мышцы могут быть отрезаны, как это практично (Рисунок 7).
Рисунок 7: Тяговая I7 мышечной strand через разрез. Мышца I7 очень эластичная и может быть вытянута через разрез для удаления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
ПРИМЕЧАНИЕ: С практикой, как правило, более эффективным, чтобы найти I7 по ощущениям, чем в поле зрения.
4. Послеоперационный уход
- После поражения были выполнены, захватить передние щупальца, и нажмите вниз на радулярной поверхности, чтобы вернуть пули к своей первоначальной конфигурации.
- Поместите послеоперационных животных в защищенную среду с хорошим потоком воды. Повышенная оксигенация ускоряет восстановление. Убедитесь, что животные бдительны и отзывчивы на следующий день после операции. Если это не так, можно предположить, что они не будут восстанавливаться.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, животные начинают питаться на первый или второй день после операции. Даже животные, которые испытывают проблемы с кусаться должны быть предложены водоросли, так как это наше анекдотические наблюдения, что восстановление животного улучшается его попытки съесть.
5. Для субрадулярного волокна Lesion
- Следуйте шагам от 1.1 до 3.5
- Вставьте кончик небольшого прямого лезвия скальпеля (#11 или аналогичный) через разрез с острым краем под углом вверх. Аккуратно соскребите тонкие мышечные волокна из нижней части радулярной поверхности. (Рисунок 8).
Рисунок 8: Корыстит субрадные волокна. Край лезвия скальпеля наклонен вверх через разрез к нижней части радулярной поверхности, так что он может мягко соскребать субрадулярных волокон. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
- Возвращение к шагу 4.1.
Representative Results
Предыдущая работа показала, что мышца I7 способствовала открытию захвата8. Наши собственные анатомические исследования показали, что субрадулярные волокна могут также способствовать открытию захвата. Чтобы проверить эти гипотезы, животные были индуцированы для генерации укусов как до, так и после получения хирургической процедуры. Шам животных подвергались всем хирургическим шагам, включая разрез на радулярной поверхности, но внутренние мышцы не были удалены. У животных, подвергавшихся поражению I7, были удалены мышцы I7. У животных, подвергаемых к поражению субрадулярного волокна, было удалено 25% субрадулярных волокон непосредственно под разрезом. Поражения шамней не оказали существенного влияния на ширину отверстия на пике кусания, в то время как оба I7 и субрадулярных волокон поражения значительно уменьшить ширину укуса (Рисунок 9).
Рисунок 9: Результаты поражений на ширине открытия во время пиковой кусаться. Показаны данные различия между усредненные нормализованные ширины открытия радула до и после хирургической процедуры для 5 животных в каждой из 3 групп (обман, I7 поражения, или SRF поражения), с каждым животным, выступающей в качестве своего собственного контроля. Средние были приняты 5 укусов до, и 5 укусов после хирургической процедуры, чтобы определить среднюю нормализованную разницу. Ширина открытия была расстоянием от центра радула до радулярного края на пиковом затягивании, нормализованном расстоянием от внутренней поверхности радулярного основания до кромки-сторонних краев радулярной поверхности. Различия отображаются как средство плюс-минус стандартное отклонение. После установления того, что данные о разнице обычно распределяются, была определена вероятность того, что это не имело никакого эффекта (т.е. нулевая гипотеза была проверена на то, что последствия хирургических процедур будут равны миноносными) путем применения парного t-тест для каждой независимой группы. Данные показывают, что обмановое повреждение не оказало существенного влияния, в то время как повреждение мышц I7 или повреждение субрадулярных волокон оказали значительное влияние на радулярное открытие (р.л.; 0.031 для группы поражения I7, указанное с одной звездочкой , или р Злт; 0,002 для группы поражения SRF, указанной двойной звездочкой). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Вес тела | Доза хлорида магния |
| Злт;200 г | 1/2 массы тела |
| 200-350 г | 1/3 массы тела |
| 350-450 г | 1/4 массы тела |
Таблица 1: Доза хлорида магния по массе тела.
Discussion
Наиболее важными шагами в протоколе являются необходимость обеспечения того, чтобы животное полностью обезглавлена, и что эверсия buccal массы достаточно, чтобы получить доступ к основным мышцам. Это может потребовать некоторой практики для совершенствования этих шагов, но как только они освоены, выход от операций, вероятно, будет больше, чем 85% всех экспериментов. Самый важный способ правильно изменить и устранить неполадки протокола, чтобы тратить время делать вскрытия buccal массы так, что расположение внутренних мышц полностью ясно следователю. Поскольку предлагаемый разрез через радулярную поверхность неизбежно наносит некоторый ущерб основным подрадным волокнам, может быть целесообразным изменить точное расположение разреза, чтобы избежать определенных областей этих волокон.
Одним из ограничений хирургической техники является то, что она может иметь неспецифические последствия для кормления ответов, таких как сила затягивания. Один из способов преодолеть это ограничение заключается в том, чтобы животные служат в качестве своего собственного контроля. Кроме того, крайне важно иметь группу фиктивного поражения, которая подвергается всему хирургическому протоколу, за исключением удаления конкретной мышцы (т.е. I7 или SRF). Следуя этим предложениям, исследователь уменьшит последствия изменчивости между животными и имеет внутреннюю меру неспецифических эффектов хирургии.
Предыдущая работа использовала подходы через стенку тела к поражению или записи либо от нервов13,14, или мышцы15,16,17. В нашей лаборатории, мы анекдотически наблюдается, что разрезы стенки тела часто сопровождается значительной потерей гемолимфы и, следовательно, объем тела. На восстановление животных часто требуется несколько дней, а если на стенке тела не пришиваются тщательно, животные могут не оправиться. Кроме того, вскрытие животных выявило значительные рубцы вокруг разреза и сильный иммунный ответ (анекдотические наблюдения). В отличие от этого, животные не показывают потери гемолимфы или изменения объема тела после восстановления из протокола, описанного здесь (на основе наблюдений в 96 животных).
Дальнейшее применение метода может распространить его на другие мышцы в кормовом аппарате Аполисии, а также на других животных. Мы сосредоточились на удалении мышц I7 и субрадулярных волокон. Эти же общие хирургические методы также позволяют доступ к большинству других мышц одонтофора. Некоторые из них, такие как внутренняя часть мышцi I5, лучше всего доступны через радулярную поверхность. Другие, как внутренние листовки I4, могут быть лучше достигнуты через внешний эпителий одонтофора. Мы сделали предварительные испытания, где разрез под радулярной расщелины частично everted одонтофора позволило доступ к заточенный крюк, который будет вставлен, которые затем могут быть использованы для поражения другой мышцы в одонтофоре, мышцы I88. Поскольку описанный здесь хирургический протокол не открывает основную полость тела, не требуется зашивания.
Протокол, который мы описали, может представлять общий интерес для других исследователей, работающих над структурами мягких тканей, которыми в противном случае было бы трудно манипулировать, например, аппаратом кормления других моллюсков. В более общем плане, этот протокол может предложить другие новые хирургические подходы к анализу мягких структур, таких как языки, стволы или щупальца18.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы хотели бы отметить тяжелую работу, которую Шерри Ниггель, Лу и Джоуи Ву вложили в совершенствование и проверку этих протоколов. Эта работа была поддержана NSF Грант IOS 1754869.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blunt forceps | Fine Science Tools | 11210-10 | 2 pair |
| Scalpel blade (#11) | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Webcam | Logitech | c920 | for recording data |
References
- Pinsker, H., Kupfermann, I., Castellucci, V., Kandel, E. Habituation and Dishabituation of the GM-Withdrawal Reflex in Aplysia. Science. 167, 1740-1742 (1970).
- Kupfermann, I. Feeding Behavior in Aplysia: A Simple System for the Study of Motivation. Behavioral Biology. 10, 1-26 (1974).
- Susswein, A. J., Chiel, H. J. Nitric oxide as a regulator of behavior: New ideas from Aplysia feeding. Progress in Neurobiology. 97, 304-317 (2012).
- Chiel, H. J. Aplysia feeding biomechanics. Scholarpedia. 2, 4165 (2007).
- Neustadter, D. M., Drushel, R. F., Chiel, H. J. Kinematics of the buccal mass during swallowing based on magnetic resonance imaging in intact, behaving Aplysia californica. Journal of Experimental Biology. 205, 939-958 (2002).
- Neustadter, D. M., Herman, R. L., Drushel, R. F., Chestek, D. W., Chiel, H. J. The kinematics of multifunctionality: comparisons of biting and swallowing in Aplysia californica. Journal of Experimental Biology. 210, 238-260 (2007).
- Brezina, V., Evans, C. G., Weiss, K. R. Characterization of the membrane ion currents of a model molluscan muscle, the accessory radula closer muscle of Aplysia california. I. Hyperpolarization-activated currents. Journal of Neurophysiology. 71, 2093-2112 (1994).
- Evans, C. G., Rosen, S., Kupfermann, I., Weiss, K. R., Cropper, E. C. Characterization of a Radula Opener Neuromuscular System in Aplysia. Journal of Neurophysiology. 76 (2), 1267-1281 (1996).
- Cullins, M. J., Chiel, H. J. Electrode Fabrication and Implantation in Aplysia californica for Multi-channel Neural and Muscular Recordings in Intact, Freely Behaving Animals. Journal of Visualized Experiment. (40), 1791 (2010).
- Dudek, F. E., Cobbs, J. S., Pinsker, H. M. Bag cell electrical activity underlying spontaneous egg laying in freely behaving Aplysia brasiliana. Journal of Neurophysiology. 42, 804-817 (1979).
- Hermann, P., Maat, A., Jansen, R. The Neural Control of Egg-Laying Behaviour in the Pond Snail Lymnaea Stagnalis: Motor Control of Shell Turning. Journal of Experimental Biology. 197, 79-99 (1994).
- Jansen, R. F., Pieneman, A. W., Ater Maat, Pattern Generation in the Buccal System of Freely Behaving Lymnaea stagnalis. Journal of Neurophysiology. 82, 3378-3391 (1999).
- Kupfermann, I. Dissociation of the appetitive and consummatory phases of feeding behavior in Aplysia: a lesion study. Behavioral Biology. 10, 89-97 (1974).
- Scott, M. L., Kirk, M. D. Recovery of consummatory feeding behavior after bilateral lesions of the cerebral-buccal connectives in Aplysia california. Brain Research. 585, 272-274 (1992).
- de Boer, P. A., Jansen, R. F., ter Maat, A., van Straalen, N. M., Koene, J. M. The distinction between retractor and protractor muscles of the freshwater snail’s male organ has no physiological basis. Journal of Experimental Biology. 213, 40-44 (2010).
- Chiel, H. J., Weiss, K. R., Kupfermann, I. An identified histaminergic neuron modulates feeding motor circuitry in Aplysia. Journal of Neuroscience. 6, 2427-2450 (1986).
- Hurwitz, I., Neustadter, D., Morton, D. W., Chiel, H. J., Susswein, A. J. Activity patterns of the B31/B32 pattern initiators innervating the I2 muscle of the buccal mass during normal feeding movements in Aplysia californica. Journal of Neurophysiology. 75, 1309-1326 (1996).
- Kier, W. M. The diversity of hydrostatic skeletons. Journal of Experimental Biology. 215, 1247-1257 (2012).
