Summary
在本报告中，我们描述了一个简单的方案，通过与EGFP和感兴趣的蛋白质共同转染，研究胚胎大鼠皮质神经元中的神经质外生。
Abstract
神经细胞生长是神经系统发育过程中神经回路形成的基本事件。严重的神经质损伤和突触功能障碍发生在各种神经退行性疾病和与年龄相关的退化。研究调节神经酸盐生长的机制，不仅会为大脑发育过程提供有价值的光，而且还可以揭示这些神经紊乱。由于转染效率低，目前研究特定蛋白质对原生哺乳动物神经元中神经质生长的影响具有挑战性。在这里，我们描述了一种通过与EGFP和感兴趣的蛋白质（POI）共同转染原发性大鼠皮质神经元来研究神经质外生的简单方法。该方法允许通过EGFP信号识别POI转染神经元，从而可以精确确定POI对神经质生长的影响。这种基于EGFP的测定为研究调节神经细胞生长的途径提供了一种方便的方法。
Introduction
神经酸盐，包括斧子和树突，是参与建立神经网络的神经元的投影。神经酸盐的动态生长对神经发育至关重要。然而，下面的基本监管机制仍不清楚。特别是，神经质损伤经常在各种神经退行性疾病和脑损伤后观察到1。因此，研究假定分子在各种神经酸盐生长调节途径中的作用，将增进我们对该过程的理解。此外，它可能揭示各种神经疾病的新治疗目标。神经元细胞系是研究神经元过程的宝贵模型，包括神经质生长，因为它们易于操作和转染2，3。然而，据报道，遗传漂移发生在一些常用的细胞系中，这可能导致其生理反应的变化4。此外，在神经元细胞系和主神经元之间也显示了差异蛋白表达。例如，PC12，一种来自大鼠肾上腺的神经元细胞系，广泛用于研究神经质外生长2，3，不表达NMDA受体5。此外，据提出，与原发神经元相比，小鼠神经母细胞瘤线神经-2a对神经毒素的响应能力降低是由于某些膜受体和电通道6缺乏表达。因此，原神经元是神经质生长研究更可取和更具代表性的模型。然而，主神经元的使用受到其低转染效率7的阻碍。
在这里，我们描述了一种涉及感兴趣蛋白（POI）和EGFP与原发性大鼠皮质神经元共转染的方法。EGFP作为形态标记，用于识别成功转染的神经元，并允许测量神经酸盐。我们使用已报告的化合物/分子来调节神经酸盐生长，验证了这种方法。此外，FE65，一种神经元适配器蛋白，已被证明能刺激神经质生长，用于说明这种方法8，9。该协议涉及 （1） 从胚胎第18天（E18）大鼠胚胎分离原发性皮质神经元，（2）与EGFP和POI（本研究中的FE65）共同转染神经元，以及（3）使用图像处理对神经元的成像和分析软件图像J与NeuronJ插件10，11。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
所遵循的所有程序均符合香港中文大学动物实验伦理委员会的道德标准。
1. 准备盖玻片
- 将无菌的 18 mm 圆形盖玻片放入 12 孔组织培养板的每个孔中。
- 在加湿的 37°C 培养箱中用 5 μg/mL 多 D-莱金溶液涂抹盖玻片，至少 1 小时。
- 从组织培养板中吸出多D-莱辛溶液，用无菌水冲洗一次涂层盖玻片。
2. 大鼠胚胎神经元解剖
- 在妊娠年龄为18天（E18）时，通过宫颈脱位或CO2窒息牺牲一只怀孕的斯普拉格-道利大鼠。
注：请查看当地法规，了解怀孕大鼠的牺牲情况。 - 用解剖剪刀打开怀孕大鼠的腹腔，将子宫转移到10厘米的培养皿中。
- 用小解剖剪刀仔细打开子宫和羊水囊，用小解剖剪刀从大鼠胚胎中取出胎盘。使用一对小钳子将整个胚胎转移到10厘米培养皿中，并加用预先冷冻的磷酸盐缓冲盐水补充葡萄糖（PBS-葡萄糖，10mM磷酸钠，2.68m氯化钾，140 mM氯化钠和3克/升葡萄糖）。
- 沿着头骨的下垂缝合线切开，用一把小解剖剪刀小心地打开它。用一个小平的铲子将胚胎大脑转移到一个10厘米的培养皿，带有冰冷的PBS-葡萄糖。
- 在解剖显微镜下使用两个#5钳将两个大脑半球从小脑和脑干中分离出来。
注：有关大鼠大脑的结构，请参阅参考12。 - 使用#5钳子去除脑膜炎。
- 用两个直#5钳子将皮层与大脑半球分离。
- 在15 mL离心管中将分离的皮层转移到冰冷的PBS-葡萄糖中。
3. 初级皮质神经元培养
注：步骤 3 和步骤 4 中的所有程序都在 II 类生物安全柜内执行。
- 通过重力在4°C下稳定出分离的皮层5分钟，并吸出PBS-葡萄糖。
- 将1 mL的0.05%胰蛋白酶-EDTA加入分离的皮层，通过在37°C水浴中轻敲并孵育组织10分钟，从而进行酶消化，轻轻混合。轻轻敲击管子，每 2 分钟混合一次。
- 在组织/胰蛋白酶混合物中加入4 mL的维持介质（例如，神经巴生介质）。
注：该协议中使用的所有维护介质均辅以青霉素-链霉素和B-27补充剂13。 - 使用 1 mL 移液器通过三聚体轻轻地分离组织。
- 在200 x g下离心5分钟，将分离的细胞压灭5分钟。
- 重复步骤 3.5 到 3.7 两次。
- 将细胞颗粒重新悬浮在1 mL的维护培养基中。
- 将10μL的0.4%试青溶液加入10μL的细胞悬浮液中，通过血细胞计计算活细胞。
- 在12孔板中，以65，000/cm2（活细胞）的密度，每孔维持介质1mL的密度将神经元板。
4. 细胞转染和固定
- 在2天体外（DIV2），通过1μL转染试剂（例如利泊胺2000），将EGFP结构（pEGFP-C1）转染为神经元，无论是否超过0.5μg的POI。使用制造商的说明。
注：哺乳动物表达结构是使用无内毒素质粒制备试剂盒制备的。使用化学物/分子（本手稿中细胞沙沙沙辛 D （细胞D） 和神经生长因子 （NGF） 的治疗可在转染后 6 小时进行。 - 转染后24小时吸出培养基，用37°C PBS（10mM磷酸钠、2.68mM氯化钾、140 mM氯化钠）洗涤转染细胞一次。
- 在室温下，在PBS中用4%的甲醛将细胞固定10分钟。
- 用PBS清洗固定细胞三次。
- 在显微镜玻璃玻片上添加少量荧光安装介质。将盖玻片从 12 孔板小心地转移到安装介质上，样品面向玻璃滑块。
注：如果使用水性安装介质，则用指甲油密封盖玻片的边缘。
5. 神经细胞生长的测量
- 使用 40x 物镜使用外显荧光显微镜拍摄图像。
- 每次转染时，使用 EGFP 信号从至少 40 个完整神经元捕获图像。
- 使用 NeuronJ 插件11在 ImageJ 软件中打开捕获的图像，以测量每个图像神经元从细胞体到生长锥尖的最长神经质的长度。
- 分析使用软件获得的数据，以确定靶向蛋白在神经细胞生长中的影响。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
为了测试这种方法，我们使用细胞D和神经生长因子NGF，这已被证明分别抑制和刺激神经质生长14，15，16。使用EGFP转染的神经元的中性粒体长度在使用Cyto D或NGF治疗后被测量。EGFP对神经元的转染效率为2.7%（计算1，068个神经元）。如图1A所示，细胞D以剂量依赖性的方式抑制神经质扩张。相反，在用NGF治疗的神经元中，神经质外生长被强于强体（图1B）。
接下来，我们研究了这个系统的效用，通过转染神经元适配器FE65，这已被证明促进神经质生长。原发性大鼠皮质神经元与FE65和EGFP共同转染。尽管转染效率低，免疫荧光分析表明，超过80%的神经元成功地与EGFP和FE65（图2A）共同转染。与前几份报告8、9类似，FE65显著刺激了神经素生长2倍（图2B）。通过西方污点分析，分析了EGFP和FE65在不同时间点的表达。如图2C所示，EGFP和FE65在转染后分别检测到6小时和12小时。在转染后神经元中观察到蛋白质的类似表达水平。这表明，神经质生长的分析可以早在转染后6小时或在更成熟的神经元中进行。这些数据共同表明，上述协议适用于通过经典转染确定假定神经酸盐生长调节蛋白的作用。
我们还通过转染不同量的FE65质粒DNA的原发性大鼠皮质神经元，监测基因剂量对神经质生长的影响。如图2D所示，从0-0.5微克的FE65质粒DNA中观察到神经酸盐延伸的剂量依赖性增加。然而，使用0.5μg或1μg质粒DNA转染的神经元之间没有显著差异（图2D）。
图1：神经素生长由细胞D和NGF调节。E18大鼠皮质神经元在DIV2上转染，使用EGFP表达载体。6 h 转染后，细胞用（A）0-0.5微克/mL细胞D或（B）0-100纳克/mL NGF处理24小时。然后神经元被固定并相应地成像。使用表观荧光显微镜用40倍物镜捕获图像，并使用ImageJ与NeuronJ插件测量从细胞体到生长锥尖的最长神经酸盐的长度。进行了三个独立的实验，每组至少测量了40个神经元。条形图显示了平均神经酸盐长度的折叠变化。采用未配对的t检验进行统计分析。*p < 0.001， #p < 0.05。错误栏 = S.E.M.请点击此处查看此图的较大版本。
图2：FE65刺激神经酸盐生长。E18 大鼠皮质神经元在 DIV2 上转染，使用空载体控制 （EV） 或 FE65 与 EGFP 表达载体一起转染。细胞在转染后24小时被固定并成像。（A） 转染神经元与抗FE65抗体进行反染色，并计算了EGFP或FE65单独转染和EGFP+FE65共同转染的细胞数量。进行了三个独立的实验，每个实验中至少计算了100个细胞。数据以EGFP和EGFP+FE65信号的细胞百分比表示。*p < 0.001。误差条 = S.D. （B） 使用 ImageJ 插件测量从细胞体到生长锥尖的最长神经酸盐的长度。在右侧面板中显示了代表性神经元图像。FE65被山羊抗FE65抗体染色，如描述8，17。进行了三个独立的实验，每个转染至少测量了40个神经元。条形图显示了平均神经酸盐长度的折叠变化。数据通过未配对的 t 检验进行分析。*p < 0.001。误差条 = S.E.M. 刻度柱 = 10 μm （C） 西方斑点分析 EGFP 和 FE65 水平在转染后时间点表达，如所示。EGFP和FE65分别被鼠标抗GFP和反霉素（到FE65 C-端子霉牌）检测到。（D） 以不同量的FE65质粒DNA转染的神经元的平均神经酸盐长度，如所示。使用 Bonferroni 后测试使用单向方差分析测试进行统计分析。*p < 0.001， #p < 0.05。误差栏 = S.E.M. 缩放栏 = 10 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
如前所述，PC12及其子克隆被广泛用于研究神经酸盐延伸，因为它们具有优异的转染效率2，3。相比之下，原发神经元的转染率较低，这是通过转染7研究神经质生长调节器的主要障碍。在这里，我们描述了一个方便的协议，用于量化原始神经元中的神经质外生。尽管整体转染效率较低，但超过80%的转染神经元成功地与两种蛋白质共同转染：FE65和EGFP（图2A）。因此，通过分析EGFP标记的神经元，可以精确确定FE65对神经质生长的影响（图2B）。
所述基于EGFP的方法的另一个优点是可以省略免疫荧光染色。图杰1号（一种神经元特异性III型β-图布林）的免疫荧光染色在研究中性光酸伸长18、19、20、21时被广泛用作形态标记。除了Tuj 1，需要染色的POI是识别转染神经元19，22，23。众所周知，免疫荧光染色的一致性是神经酸盐生长测量的关键，受包括样品制备和抗体24在内的多种因素的影响。因此，基于EGFP的方法的整体简单性可以提高测定的准确性。
在我们的协议中，神经元固定在中性粒体测量24h转染后。因此，神经元暴露于转染试剂24小时。众所周知，转染试剂对细胞25有毒。如果需要确定POI对神经酸盐延伸的影响超过DIV3，新鲜的中补量可能有助于将毒性降至最低。此外，可以考虑替代基因传递方法，如Ca2+磷酸盐共沉淀和核素，两者都证明对细胞的毒性较小26。此外，我们在这里表明，使用1μL转染试剂，在转染的神经元中观察到FE65对神经质生长的最高影响，即0.5μg的FE65和0.5μg的EGFP质粒。对于其他POIs，应确定质粒DNA和转染试剂的最佳量，因为蛋白质的周转率差别很大。
除了基因传递方法外，细胞密度是另一个需要考虑的关键参数。如果神经元密度过高，就很难识别神经酸盐的起源，因为它们会相互重叠。虽然低密度的电镀细胞可以解决这个问题，但原神经元在低细胞密度27下会显著降低原神经元的存活率。原发性大鼠海马神经元已被证明在40，000至100，000/cm之间的密度下健康成长2 28。在此协议中，使用65，000/cm2的大鼠皮质神经元密度。然而，重要的是要确定不同类型神经元在不同实验条件下的合适细胞密度。
此处描述了发育大鼠原神经元（即 DIV3 神经元）的中性粒石测量。然而，更成熟的神经元表型可以在DIV329之后的神经元中观察到。由于POIs或药物对成熟神经元中神经质延伸的影响可能与发育中的神经元不同，因此使用不同阶段神经元进行调查将提供一个更全面的视角。值得注意的是，我们仍然能够观察到EGFP表达在神经元7d转染后。这可能促进对成熟神经元中神经质生长的POIs或药物的研究。
人类诱导多能干细胞（hiPSC）衍生的神经元是鉴定新治疗方法的宝贵工具。例如，对这些细胞中神经质生长的调查可以揭示神经再生的新靶点，因为使用hiPSC衍生神经元可以避免物种差异。与原啮齿动物神经元类似，hiPSC衍生的神经元很难转染30，这可能会降低EGFP和POI的共同转染效率。因此，使用多cistronic哺乳动物表达载体可以确保所有转染细胞表达包括EGFP和POI在内的整套转染基因。此外，替代基因传递方法，如电穿孔，可以提高转染效率。同样，细胞活力是一个在使用这种基因传递方法时需要考虑的问题。
众所周知，大鼠胚胎大脑皮层包含不同类型的神经元，包括尖酸硬质神经元、双相神经元和长期投影神经元31。虽然此处所述的此协议可以揭示 POI 对神经质生长的一般影响，但同一 POI 可能在不同类型的神经元中表现出不同的响应。例如，肌他汀增加了感觉斧子的数量，但不是电机斧子32的数量。在这种情况下，修改协议是必要的，例如事先通过流细胞测定分离特定类型的神经元。或者，在成像过程中，可以使用特定的神经元标记抗体来识别所需类型的神经元。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者声明他们与本文的内容没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作由香港研究资助局、健康及医学研究基金（香港）、中大直接资助计划、联合学院捐赠基金及TUYF慈善信托基金资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 tweezers | Regine | 5-COB | |
| 18 mm Circle Cover Slips | Thermo Scientific | CB00180RA | Sterilize before use |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| Cytochalasin D | Invitrogen | PHZ1063 | Dissolved in DMSO |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dissecting Scissors, 10 cm | World Precision Instruments | 14393 | |
| Dissecting Scissors, 12.5 cm | World Precision Instruments | 15922 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| Fluorescence Mounting Medium | Dako | S302380 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| NGF 2.5S Native Mouse Protein | Gibco | 13257019 | |
| Nugent Utility Forceps, 10 mm, Straight Tip | World Precision Instruments | 504489 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| pEGFP-C1 | Clontech | #6084-1 | |
| pCI FE65 | Please see references 8 and 15 | ||
| PBS Tablets | Gibco | 18912014 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Spatula | Sigma-Aldrich | S4147 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 |
References
- Kaplan, A., Bueno, M., Hua, L., Fournier, A. E. Maximizing functional axon repair in the injured central nervous system: Lessons from neuronal development. Developmental Dynamics. 247 (1), 18-23 (2018).
- Harrill, J. A., Mundy, W. R. Quantitative assessment of neurite outgrowth in PC12 cells. Methods in Molecular Biology. 758, 331-348 (2011).
- Yeyeodu, S. T., Witherspoon, S. M., Gilyazova, N., Ibeanu, G. C. A rapid, inexpensive high throughput screen method for neurite outgrowth. Current Chemical Genomics. 4, 74-83 (2010).
- Ben-David, U., et al. Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response. Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).
- Edwards, M. A., Loxley, R. A., Williams, A. J., Connor, M., Phillips, J. K. Lack of functional expression of NMDA receptors in PC12 cells. Neurotoxicology. 28 (4), 876-885 (2007).
- LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies. Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. Journal of Neuroscience. 30 (18), 6171-6177 (2010).
- Cheung, H. N., et al. FE65 interacts with ADP-ribosylation factor 6 to promote neurite outgrowth. The FASEB Journal. 28 (1), 337-349 (2014).
- Li, W., et al. Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1. Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry. Part A: the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).
- Swanson, L. W. Brain maps 4.0-Structure of the rat brain: An open access atlas with global nervous system nomenclature ontology and flatmaps. The Journal of Comparative Neurology. 526 (6), 935-943 (2018).
- Brewer, G. J. Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus. Journal of Neuroscience Research. 42 (5), 674-683 (1995).
- Yamada, K. M., Spooner, B. S., Wessells, N. K. Axon growth: roles of microfilaments and microtubules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 66 (4), 1206-1212 (1970).
- Casella, J. F., Flanagan, M. D., Lin, S. Cytochalasin D inhibits actin polymerization and induces depolymerization of actin filaments formed during platelet shape change. Nature. 293 (5830), 302-305 (1981).
- Calabrese, E. J. Enhancing and regulating neurite outgrowth. Critical Reviews in Toxicology. 38 (4), 391-418 (2008).
- Lau, K. F., et al. Dexras1 Interacts with FE65 to Regulate FE65-Amyloid Precursor Protein-dependent Transcription. Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34728-34737 (2008).
- Cui, X., et al. Niacin treatment of stroke increases synaptic plasticity and axon growth in rats. Stroke. 41 (9), 2044-2049 (2010).
- Khodosevich, K., Monyer, H. Signaling involved in neurite outgrowth of postnatally born subventricular zone neurons in vitro. BMC Neuroscience. 11, 18 (2010).
- Tang, F., et al. Resveratrol Enhances Neurite Outgrowth and Synaptogenesis Via Sonic Hedgehog Signaling Following Oxygen-Glucose Deprivation/Reoxygenation Injury. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 43 (2), 852-869 (2017).
- He, W., Liu, Y., Tian, X. Rosuvastatin Improves Neurite Outgrowth of Cortical Neurons against Oxygen-Glucose Deprivation via Notch1-mediated Mitochondrial Biogenesis and Functional Improvement. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 6 (2018).
- Tesarova, P., et al. Receptor for advanced glycation end products (RAGE)--soluble form (sRAGE) and gene polymorphisms in patients with breast cancer. Cancer Investigation. 25 (8), 720-725 (2007).
- Park, S. Y., et al. Hippocalcin Promotes Neuronal Differentiation and Inhibits Astrocytic Differentiation in Neural Stem Cells. Stem Cell Reports. 8 (1), 95-111 (2017).
- Radbruch, A. Immunofluorescence: Basic Considerations. Flow Cytometry and Cell Sorting. , Springer Lab Manual Book Series. 38-52 (2000).
- Wang, T., Larcher, L. M., Ma, L., Veedu, R. N. Systematic Screening of Commonly Used Commercial Transfection Reagents towards Efficient Transfection of Single-Stranded Oligonucleotides. Molecules. 23 (10), (2018).
- Sariyer, I. K. Transfection of neuronal cultures. Methods in Molecular Biology. 1078, 133-139 (2013).
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Research. 126 (3), 397-425 (1977).
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Further observations on hippocampal neurons in dispersed cell culture. The Journal of Comparative Neurology. 187 (3), 469-493 (1979).
- Biffi, E., Regalia, G., Menegon, A., Ferrigno, G., Pedrocchi, A. The influence of neuronal density and maturation on network activity of hippocampal cell cultures: a methodological study. PLoS One. 8 (12), e83899 (2013).
- Hiragi, T., et al. Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cell (hiPSC)-Derived Neurons in Mouse Hippocampal Slice Cultures. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 143 (2017).
- Zeng, H., Sanes, J. R. Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward. Nature Reviews. Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).
- Jones, M. R., Villalon, E., Northcutt, A. J., Calcutt, N. A., Garcia, M. L. Differential effects of myostatin deficiency on motor and sensory axons. Muscle & Nerve. 56 (6), E100-E107 (2017).
