Summary
I denne rapport beskriver vi en simpel protokol til undersøgelse af neurit-vækst i embryonale rotte kortikale neuroner ved co-transftering med EGFP og det protein af interesse.
Abstract
Neurite udvækst er en fundamental begivenhed i dannelsen af neurale kredsløb under nervesystemet udvikling. Svær neurit skade og synaptisk dysfunktion forekommer i forskellige neurodegenerative sygdomme og aldersrelaterede degeneration. Undersøgelse af de mekanismer, der regulerer neurite udvækst ville ikke kun kaste værdifuldt lys på hjernens udviklingsmæssige processer, men også på sådanne neurologiske lidelser. På grund af den lave transfektering effektivitet, er det i øjeblikket udfordrende at studere virkningen af et specifikt protein på neurite udvækst i primære pattedyr neuroner. Her beskriver vi en simpel metode til undersøgelse af neurite udvækst ved co-transfection af primære rotte kortikale neuroner med EGFP og et protein af interesse (POI). Denne metode gør det muligt at identificere POI transficeret neuroner gennem egfp signal, og dermed virkningen af POI på neurite udvækst kan bestemmes præcist. Denne EGFP-baserede analyse giver en bekvem tilgang til undersøgelse af veje, der regulerer neurite outgrowth.
Introduction
Neurites, herunder både axoner og dendritter, er fremskrivninger fra neuroner, der er involveret i etableringen af neurale netværk. Den dynamiske udvækst af neuritter er afgørende for Neuro udvikling. De underliggende reguleringsmekanismer er dog stadig uklare. Især neurite skader er ofte observeret i forskellige neurodegenerative sygdomme og efter hjerneskader1. Derfor, undersøgelse af rollerne af formodede molekyler i forskellige neurite udvækst regulerings veje ville forbedre vores forståelse af processen. Desuden, det kan afsløre nye terapeutiske mål for forskellige neurologiske lidelser. Neuronal cellelinjer er værdifulde modeller for at studere neuronal processer, herunder neurite udvækst, da de er nemme at manipulere og transficere2,3. Imidlertid er genetisk afdrift blevet rapporteret at forekomme i nogle almindeligt anvendte cellelinjer, hvilket kan føre til variationer i deres fysiologiske respons4. Desuden er differential protein ekspression blevet vist mellem neuronal cellelinjer og primære neuroner. For eksempel, PC12, en neuronal cellelinje afledt af rotte binyrerne, der er almindeligt anvendt til at studere neurite udvækst2,3, ikke udtrykker NMDA-receptorer5. Desuden er det blevet foreslået, at den reducerede reaktionsevne af muse neuroblastom linje Neuro-2A til neurotoksiner i forhold til primære neuroner skyldes den manglende ekspression af visse membranreceptorer og Ionkanaler6. Derfor, primære neuroner er en mere ønskelig og repræsentativ model for undersøgelse af neurite outgrowth. Men, brugen af primære neuroner hæmmes af deres lave transfektering effektivitet7.
Her beskriver vi en metode, der involverer Co-transfection af det protein af interesse (POI) og EGFP til primære rotte kortikale neuroner. Den egfp fungerer som en morfologiske markør for identifikation af vellykkede transficeret neuroner og tillader måling af neurites. Vi validerede denne metode ved hjælp af forbindelser/molekyler, der er blevet rapporteret at moduere neurite outgrowth. Desuden, FE65, et neuronal adapter protein, der har vist sig at stimulere neurite udvækst, blev brugt til at illustrere denne fremgangsmåde8,9. Denne protokol indebærer (1) isolering af primære kortikale neuroner fra embryonale dag 18 (E18) rotte embryoner, (2) Co-transfection af neuroner med EGFP og POI (FE65 i dette studie) og (3) billeddannelse og analyse af neuroner ved hjælp af billedbehandling software ImageJ med NeuronJ plugin10,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle de fulgte procedurer var i overensstemmelse med de etiske standarder i dyreforsøg etiske komité for det kinesiske universitet i Hong Kong.
1. klargøring af Dæksedler
- Placer en steril 18 mm cirkulær dækseddel i hver brønd af en 12-brønd vævskultur plade.
- Coveret med 5 μg/mL poly-D-lysin opløsning i en befugret 37 °C inkubator i mindst 1 time.
- Aspirer poly-D-lysin opløsning fra vævskultur pladen og skyl de coatede dæksedler én gang med sterilt vand.
2. rotte embryonale neuron Dissection
- Ofrer en tidsindstillet gravid Sprague-Dawley rat ved en gestationsalder på 18 dage (E18) ved enten livmoderhals dislokation eller CO2 -kvælning.
Bemærk: Tjek venligst lokale regler for ofring af drægtige rotter. - Åbn bughulen af den gravide rotte med dissekere saks og overføre livmoderen til en 10 cm Petri skål.
- Åbn livmoderen og Foster sækken forsigtigt med små dissekere saks og fjern placenta fra rotte embryonet ved hjælp af små dissekere saks. Hele embryonet overføres til en 10 cm Petri skål med forkølet phosphatbufferet saltvand suppleret med glucose (PBS-glucose, 10 mM natrium phosphater, 2,68 mM kaliumchlorid, 140 mM natriumchlorid og 3 g/L glucose) ved hjælp af et par små pincet.
- Skær langs den sagittale sutur af kraniet og Åbn det forsigtigt med et par små dissekere saks. Overfør den embryonale hjerne med en lille flad spatel til en 10 cm Petri skål med iskold PBS-glucose.
- Adskil de to hjernehalvdele fra cerebellum og hjernestammen ved hjælp af to #5 pincet under et dissektion-mikroskop.
Bemærk: Se venligst reference12 for strukturen af rotte hjernen. - Fjern meninges ved hjælp af #5 tweezers.
- Isoler cortex fra de cerebrale halvkugler med to lige #5 tweezers.
- Den isolerede cortex overføres til iskold PBS-glucose i et 15 mL centrifugeglas.
3. primær kortikal neuron kultur
Bemærk: Alle procedurer i trin 3 og 4 udføres i et klasse II-biosikkerheds kabinet.
- Aflæg den isolerede cortex med tyngdekraften ved 4 °C i 5 minutter og Aspirer PBS-glucose.
- Der tilsættes 1 mL 0,05% trypsin-EDTA til den isolerede cortex og blandes forsigtigt ved at tappe og inkubere vævet i et 37 °C vandbad i 10 minutter for at tillade enzymatisk fordøjelse. Tryk forsigtigt på røret for at blande hver 2 min.
- Tilsæt 4 mL vedligeholdelses medium (f. eks. Neurobasal medium) til vævet/trypsin-blandingen.
Bemærk: Alle de vedligeholdelses medier, der anvendes i denne protokol, suppleres med penicillin-streptomycin og B-27 supplement13. - Afdissociér vævet forsigtigt ved formalings med en 1 ml pipette.
- Pellet de dissocierede celler ved centrifugering ved 200 x g i 5 min. aspirere supernatanten.
- Gentag trin 3,5 til 3,7 to gange.
- Resuspension af celle pellet i 1 mL vedligeholdelses medium.
- Tilsæt 10 μL 0,4% Trypan blå opløsning til 10 μL cellesuspension til optælling af levedygtige celler med et hemocytometer.
- Sæt neuronerne i en densitet på 65000/cm2 (levedygtige celler) i 1 ml vedligeholdelses medium pr. brønd i en 12-brønd plade.
4. celle Transfection og fiksering
- 2 dage in vitro (DIV2), transficere 0,5 μg egfp-konstruktion (pegfp-C1) til neuroner sammen med eller uden 0,5 μg POI ved brug af 1 μl transfektering reagens (f. eks. lipofectamin 2000). Brug producentens anvisninger.
Bemærk: Pattedyrs udtryks konstruktioner blev fremstillet ved hjælp af en endotoksin gratis plasmid forberedelse kit. Behandling med kemikalier/molekyler (i dette manuskript cytochalasin D (cyto D) og nerve vækstfaktor (NGF) blev anvendt) kan gøres på 6 h efter transfection. - Indsug kulturmediet 24 h efter transfusioner, og vask de transficeret celler én gang med 37 °c PBS (10 mm natrium fosfater, 2,68 mm kaliumchlorid, 140 mm natriumchlorid).
- Fastgør cellerne med 4% PARAFORMALDEHYD i PBS i 10 minutter i mørke ved stuetemperatur.
- Vask de faste celler tre gange med PBS.
- Tilsæt en minimal mængde fluorescens monterings medium på et mikroskop glas rutsjebane. Overfør forsigtigt dæksedlen fra 12-brøndens plade til monterings mediet med prøven vendt mod glas sliden.
Bemærk: Forsegl kanten af dæksedlen med neglelak, hvis der anvendes et vandigt monterings medium.
5. måling af Neurite-udvækst
- Brug en 40x-målsætning til optagelse af billeder ved hjælp af et EPI-fluorescerende mikroskop.
- Optag billeder fra mindst 40 intakte neuroner med EGFP-signal pr. transfection.
- Åbn det optagne billede i ImageJ software med neuronj plugin11 at måle længden af den længste neurite, fra cellen kroppen til spidsen af vækst keglen, af hver afbildet neuron.
- Analysere de data, opnået med softwaren til at bestemme effekten af de målrettede proteiner i neurite outgrowth.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at teste denne metode, vi brugte cyto D og nerve vækstfaktor ngf, som har vist sig at hæmme og stimulere neurite udvækst henholdsvis14,15,16. Neurite-længden af neuroner, der blev transficeret med EGFP, blev målt efter behandling med cyto D eller NGF. Den transfektering effektivitet af egfp til neuroner var 2,7% (1.068 neuroner tælles). Som vist i figur 1A, undertrykte cyto D neurite forlængelse på en dosisafhængig måde. Omvendt blev neurite udvækst potenseret i neuroner behandlet med NGF (figur 1B).
Dernæst undersøgte vi nytten af dette system ved at transfficerer neuronal adapter FE65, som har vist sig at fremme neurite outgrowth. Primære rotte kortikale neuroner blev co-transficeret med FE65 og EGFP. På trods af den lave transfektering effektivitet, immuno-fluorescens analyse afslørede, at over 80% af neuroner blev med held Co-transfected med egfp og FE65 (figur 2A). Svarende til tidligererapporter FE65,stimuleret signifikant neurite udvækst med 2x (figur 2B). Vi analyserede også ekspression af EGFP og FE65 på forskellige tidspunkter ved Western blot Analysis. Som vist i figur 2Cblev egfp og FE65 detekteret henholdsvis 6 timer og 12 timer efter transfection. Lignende ekspressionsniveauer af proteinerne blev observeret i 1 d til 7 d post-transfection neuroner. Dette indikerer, at analysen af neurite udvækst kunne ske så tidligt som 6 h post-transfection eller i mere modne neuroner. Sammen, disse data tyder på, at den nævnte protokol er egnet til at bestemme rollen som formodede neurite udvækst regulerende proteiner ved klassisk transfection.
Vi overvågede også effekten af gen dosering på neurite udvækst ved transfficerende primære rotte kortikale neuroner med forskellige mængder af FE65 plasmid DNA. Som vist i figur 2Dblev der observeret en dosisafhængig øgning i neurite-forlængelsen fra 0-0,5 μg FE65 plasmid-DNA. Der var dog ingen signifikant forskel mellem neuroner transficeret med enten 0,5 μg eller 1 μg plasmid DNA (figur 2D).
Figur 1: neurite udvækst er moduleret af cyto D og ngf. E18 rotte kortikale neuroner blev transficeret på DIV2 med en egfp ekspressions vektor. 6 h efter transfection blev cellerne behandlet med (A) 0-0,5 μg/ml cyto D eller (B) 0-100 ng/ml ngf i 24 timer. Så neuronerne blev fastsat og afbildet i overensstemmelse hermed. Billeder blev taget med 40x mål ved hjælp af et EPI-fluorescens mikroskop, og længden af den længste neurit fra celle legemet til spidsen af vækst keglen blev målt ved hjælp af ImageJ med NeuronJ-plugin'et. Der blev udført tre uafhængige eksperimenter, og mindst 40 neuroner blev målt i hver gruppe. Søjlediagrammet viste fold ændringen i den gennemsnitlige neurite længde. Ikke-parret t-test blev vedtaget til statistisk analyse. * p < 0,001, * * p < 0,05. Fejllinjer = S.E.M. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: FE65 stimulerer neurite-outgrowth. E18 rotte kortikale neuroner blev transficeret på DIV2 med enten Tom vektorkontrol (EV) eller FE65 sammen med en egfp-ekspressions vektor. Celler blev fastsat og afbildet 24 h efter transfection. (A) de transficeret neuroner blev modfarvet med anti-FE65-antistoffer, og antallet af celler med egfp eller FE65 enkeltvis transficeret og egfp + FE65 Co-transficeret blev talt. Der blev udført tre uafhængige eksperimenter, og mindst 100 celler blev talt i hvert eksperiment. Data blev udtrykt som procentdelen af celler med EGFP-og EGFP + FE65-signaler. * p < 0,001. Fejllinjer = S.D. (B) længden af den længste neurit fra celle legemet til spidsen af vækst keglen blev målt ved hjælp af ImageJ med neuronj-plugin'et. Repræsentative neuron billeder blev vist i højre panel. FE65 blev plettet af en ged anti-FE65 antistof som beskrevet8,17. Der blev udført tre uafhængige eksperimenter, og mindst 40 neuroner blev målt pr. transfection. Søjlediagrammet viste fold ændringen i den gennemsnitlige neurite længde. Dataene blev analyseret af uparret t-test. * p < 0,001. Fejllinjer = S.E.M. Scale bar = 10 μm.C) Western blot analyse af ekspression af egfp-og FE65-niveauer ved post-transfection-tidspunkterne som angivet. EGFP og FE65 blev detekteret af henholdsvis Mouse anti-GFP og anti-MYC (til FE65 C-Terminal MYC-tag). D) den gennemsnitlige neurite-længde af neuroner, som er transficeret med forskellige mængder FE65 plasmid-DNA som indikeret. Der blev udført statistiske analyser ved hjælp af envejs-ANOVA-tests med Bonferroni post-hoc-test. * p < 0,001, * * p < 0,05. Fejllinjer = S.E.M. Scale bar = 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som nævnt før, PC12 og dens subkloner er almindeligt ansat til at studere neurite udvidelse, fordi de har fremragende transfektering effektivitet2,3. I modsætning hertil, primære neuroner har en lav transfektering sats, som er en stor hindring for at studere neurite udvækst regulatorer ved transfektering7. Her beskriver vi en bekvem protokol til kvantificering af neurite-udvækst i primære neuroner. På trods af den lave samlede transfektering effektivitet, blev mere end 80% af de transficeret neuroner med held Co-transficeret med de to proteiner: FE65 og egfp (figur 2A). Ved at analysere EGFP-mærkede neuroner kan effekten af FE65 på neurite-udvækst derfor bestemmes præcist (figur 2B).
En anden fordel ved den EGFP-baserede fremgangsmåde er, at immunofluorescens farvning kan udelades. Immunofluorescens farvning af tuj 1, en neuron-specifik klasse III β-Tubulin, er almindeligt anvendt som en morfologisk markør, når man studerer neurite forlængelse18,19,20,21. Ud over tuj 1 er farvning af POI påkrævet til identifikation af transficeret neuroner19,22,23. Det er velkendt, at konsistensen af immunofluorescens farvning, som er afgørende for neurite-udvækstmålingen, påvirkes af mange faktorer, herunder prøveforberedelse og antistoffer24. Derfor kan den generelle enkelhed af den EGFP-baserede metode forbedre nøjagtigheden af analysen.
I vores protokol, neuroner er fastsat for neurite måling 24 h post-transfection. Således er neuroner udsat for transfektering reagens for 24 h. Det er længe kendt, at transfektering reagenser er giftige for cellerne25. Hvis virkningen af POI på neurite udvidelse skal bestemmes ud over DIV3, kan frisk medium genopfyldning bidrage til at minimere toksiciteten. Desuden kan alternative genleveringsmetoder betragtes som ca2 + phosphatco-udfældning og nukleofection, som begge er påvist at have en mindre toksisk virkning på cellerne26. Derudover viser vi her, at den højeste effekt af FE65 på neurite udvækst observeres i neuroner transficeret med at 0,5 μg FE65 og 0,5 μg egfp plasmider ved hjælp af 1 μl transfektering reagens. For andre Poier bør de optimale mængder plasmid DNA og transfektering reagenser bestemmes som proteiner har vidt forskellige omsætnings rater.
Ud over genleveringsmetode er celletæthed en anden kritisk parameter, der skal overvejes. Hvis neuron tætheden er for høj, bliver det vanskeligt at identificere oprindelsen af neurites, som de ville overlappe hinanden. Selvom plating celler ved en lav densitet kan løse problemet, overlevelse af primære neuroner ville blive betydeligt reduceret ved en lav celletæthed27. Primære rotte hippocampus neuroner har vist sig at vokse sundt ved tætheden mellem 40.000 til 100000/cm2 28. I denne protokol anvendes en densitet på 65000/cm2 af rotte kortikale neuroner. Ikke desto mindre er det vigtigt at bestemme den passende celletæthed for forskellige typer af neuroner under forskellige eksperimentelle betingelser.
Neurite-målingen af udvikling af rotte primære neuroner (dvs. DIV3 neuroner) er beskrevet her. Men, mere modne neuronal fænotyper kan observeres i neuroner ud over DIV329. Som virkningerne af Poier eller lægemidler på neurite udvidelse i modne neuroner kan være forskellige fra de udviklende neuroner, undersøgelse ved hjælp af neuroner fra forskellige stadier ville give et mere omfattende perspektiv. Det er værd at bemærke, at vi stadig var i stand til at observere EGFP udtryk i neuroner 7 d post-transfection. Dette kan lette studiet af Poier eller lægemidler på neurite udvækst i modne neuroner.
Menneskeskabte pluripotente stamceller (hiPSC)-afledte neuroner er værdifulde værktøjer til identifikation af nye terapeutiske tilgange. For eksempel, undersøgelse af neurite udvækst i disse celler kunne afsløre nye mål i Neuro som brugen af hipsc-afledte neuroner undgår artsforskelle. På samme vis som primære gnaver neuroner er hipsc-afledte neuroner svære at transficere30, hvilket kan reducere Co-transfection effektivitet af egfp og POI. Derfor kan brugen af polycistronic-udtryks vektorer sikre, at alle transficeret celler udtrykker hele sættet af transficeret gener, herunder egfp og Poier. Desuden kan alternative genleverings metoder, såsom elektro portering, forbedre transfektering effektivitet. Igen, cellelevedygtighed er et spørgsmål, der skal overvejes, når du bruger sådanne gen levering tilgange.
Det er kendt, at rotte embryonale hjernebarken indeholder forskellige typer af neuroner, herunder spiny stellate neuroner, bipolar neuroner og lang projicering neuroner31. Mens denne protokol, der er angivet her, kan afsløre den generelle virkning af POI'er på neurite outgrowth, er det muligt, at det samme POI kan udvise forskellige reaktioner i forskellige typer af neuroner. For eksempel øger myostatin antallet af sensoriske axoner, men ikke af motor axoner32. I et sådant scenario er ændring af protokollen nødvendig, såsom forudgående isolering af specifikke typer af neuroner ved strømnings cytometri. Alternativt kan specifikke neuronal markør antistoffer anvendes til identifikation af de nødvendige typer af neuroner under billeddannelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter med indholdet af denne artikel.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af midler fra forsknings stipendierne i Hongkong, sundheds-og medicinal forskningsfonden (Hongkong), CUHK Direct Grant-ordningen, United College-fonden og TUYF-velgørenheds Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 tweezers | Regine | 5-COB | |
| 18 mm Circle Cover Slips | Thermo Scientific | CB00180RA | Sterilize before use |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| Cytochalasin D | Invitrogen | PHZ1063 | Dissolved in DMSO |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dissecting Scissors, 10 cm | World Precision Instruments | 14393 | |
| Dissecting Scissors, 12.5 cm | World Precision Instruments | 15922 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| Fluorescence Mounting Medium | Dako | S302380 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| NGF 2.5S Native Mouse Protein | Gibco | 13257019 | |
| Nugent Utility Forceps, 10 mm, Straight Tip | World Precision Instruments | 504489 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| pEGFP-C1 | Clontech | #6084-1 | |
| pCI FE65 | Please see references 8 and 15 | ||
| PBS Tablets | Gibco | 18912014 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Spatula | Sigma-Aldrich | S4147 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 |
References
- Kaplan, A., Bueno, M., Hua, L., Fournier, A. E. Maximizing functional axon repair in the injured central nervous system: Lessons from neuronal development. Developmental Dynamics. 247 (1), 18-23 (2018).
- Harrill, J. A., Mundy, W. R. Quantitative assessment of neurite outgrowth in PC12 cells. Methods in Molecular Biology. 758, 331-348 (2011).
- Yeyeodu, S. T., Witherspoon, S. M., Gilyazova, N., Ibeanu, G. C. A rapid, inexpensive high throughput screen method for neurite outgrowth. Current Chemical Genomics. 4, 74-83 (2010).
- Ben-David, U., et al. Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response. Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).
- Edwards, M. A., Loxley, R. A., Williams, A. J., Connor, M., Phillips, J. K. Lack of functional expression of NMDA receptors in PC12 cells. Neurotoxicology. 28 (4), 876-885 (2007).
- LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies. Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. Journal of Neuroscience. 30 (18), 6171-6177 (2010).
- Cheung, H. N., et al. FE65 interacts with ADP-ribosylation factor 6 to promote neurite outgrowth. The FASEB Journal. 28 (1), 337-349 (2014).
- Li, W., et al. Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1. Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry. Part A: the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).
- Swanson, L. W. Brain maps 4.0-Structure of the rat brain: An open access atlas with global nervous system nomenclature ontology and flatmaps. The Journal of Comparative Neurology. 526 (6), 935-943 (2018).
- Brewer, G. J. Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus. Journal of Neuroscience Research. 42 (5), 674-683 (1995).
- Yamada, K. M., Spooner, B. S., Wessells, N. K. Axon growth: roles of microfilaments and microtubules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 66 (4), 1206-1212 (1970).
- Casella, J. F., Flanagan, M. D., Lin, S. Cytochalasin D inhibits actin polymerization and induces depolymerization of actin filaments formed during platelet shape change. Nature. 293 (5830), 302-305 (1981).
- Calabrese, E. J. Enhancing and regulating neurite outgrowth. Critical Reviews in Toxicology. 38 (4), 391-418 (2008).
- Lau, K. F., et al. Dexras1 Interacts with FE65 to Regulate FE65-Amyloid Precursor Protein-dependent Transcription. Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34728-34737 (2008).
- Cui, X., et al. Niacin treatment of stroke increases synaptic plasticity and axon growth in rats. Stroke. 41 (9), 2044-2049 (2010).
- Khodosevich, K., Monyer, H. Signaling involved in neurite outgrowth of postnatally born subventricular zone neurons in vitro. BMC Neuroscience. 11, 18 (2010).
- Tang, F., et al. Resveratrol Enhances Neurite Outgrowth and Synaptogenesis Via Sonic Hedgehog Signaling Following Oxygen-Glucose Deprivation/Reoxygenation Injury. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 43 (2), 852-869 (2017).
- He, W., Liu, Y., Tian, X. Rosuvastatin Improves Neurite Outgrowth of Cortical Neurons against Oxygen-Glucose Deprivation via Notch1-mediated Mitochondrial Biogenesis and Functional Improvement. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 6 (2018).
- Tesarova, P., et al. Receptor for advanced glycation end products (RAGE)--soluble form (sRAGE) and gene polymorphisms in patients with breast cancer. Cancer Investigation. 25 (8), 720-725 (2007).
- Park, S. Y., et al. Hippocalcin Promotes Neuronal Differentiation and Inhibits Astrocytic Differentiation in Neural Stem Cells. Stem Cell Reports. 8 (1), 95-111 (2017).
- Radbruch, A. Immunofluorescence: Basic Considerations. Flow Cytometry and Cell Sorting. , Springer Lab Manual Book Series. 38-52 (2000).
- Wang, T., Larcher, L. M., Ma, L., Veedu, R. N. Systematic Screening of Commonly Used Commercial Transfection Reagents towards Efficient Transfection of Single-Stranded Oligonucleotides. Molecules. 23 (10), (2018).
- Sariyer, I. K. Transfection of neuronal cultures. Methods in Molecular Biology. 1078, 133-139 (2013).
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Research. 126 (3), 397-425 (1977).
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Further observations on hippocampal neurons in dispersed cell culture. The Journal of Comparative Neurology. 187 (3), 469-493 (1979).
- Biffi, E., Regalia, G., Menegon, A., Ferrigno, G., Pedrocchi, A. The influence of neuronal density and maturation on network activity of hippocampal cell cultures: a methodological study. PLoS One. 8 (12), e83899 (2013).
- Hiragi, T., et al. Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cell (hiPSC)-Derived Neurons in Mouse Hippocampal Slice Cultures. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 143 (2017).
- Zeng, H., Sanes, J. R. Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward. Nature Reviews. Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).
- Jones, M. R., Villalon, E., Northcutt, A. J., Calcutt, N. A., Garcia, M. L. Differential effects of myostatin deficiency on motor and sensory axons. Muscle & Nerve. 56 (6), E100-E107 (2017).
