Summary
本報告では、EGFPと目的のタンパク質との共トランスフェクトにより、胚ラット皮質ニューロンにおける神経伝達の増殖を研究するための簡単なプロトコルについて述べる。
Abstract
神経伝達の成長は、神経系の発達中の神経回路の形成における基本的な出来事である。重度の神経剤損傷およびシナプス機能障害は、様々な神経変性疾患および加齢に伴う変性に起こる。神経伝達物質の成長を調節するメカニズムの研究は、脳の発達過程だけでなく、そのような神経疾患にも貴重な光を当てるだろう。トランスフェクション効率が低いため、一次哺乳類ニューロンの神経伝達体外増殖に対する特定のタンパク質の影響を研究することは現在困難です。ここでは、EGFPと目的タンパク質(POI)を用いて一次ラット皮質ニューロンの共トランスフェクションによる神経質の成長を調べる簡単な方法について述べる。この方法は、EGFP信号を介してPOIトランスフェクトニューロンの同定を可能にし、したがって、神経突起成長に対するPOIの効果を正確に決定することができる。このEGFPベースのアッセイは、ニューライトの成長を調節する経路の調査に便利なアプローチを提供します。
Introduction
軸とデンドライトの両方を含むニューライトは、ニューラルネットワークの確立に関与するニューロンからの投影である。神経伝達物の動的な成長は神経発達に不可欠である。しかし、その下にある規制メカニズムは不明のままである。特に、神経質損傷は、様々な神経変性疾患および脳損傷後1でしばしば観察される。したがって、様々なニューライト成長調節経路における置き起分子の役割の調査は、プロセスの理解を向上させるだろう。さらに、様々な神経障害に対する新しい治療標的を明らかにしてもよい。神経細胞株は、神経伝達を含む神経細胞プロセスを研究するための貴重なモデルであり、操作とトランスフェクトが容易である2、3.しかし、遺伝的ドリフトは、いくつかの一般的に使用される細胞株で起こることが報告されており、これは彼らの生理的応答のばらつきにつながる可能性があります4.さらに、分タンパク質発現は、ニューロン細胞株と一次ニューロンとの間で示されている。例えば、PC12は、神経伝達体の成長2、3の研究に広く用いられているラット副腎に由来する神経細胞株であり、NMDA受容体5を発現しない。さらに、一次ニューロンと比較して神経芽細胞腫ライン神経-2aの反応性の低下は、特定の膜受容体およびイオンチャネル6の発現の欠如によるものであることが提案されている。したがって、一次ニューロンは、神経伝達体の成長の調査のためのより望ましい代表的なモデルである。しかし、一次ニューロンの使用は、その低いトランスフェクション効率7によって妨げられる。
ここでは、目的タンパク質(POI)とEGFPを一次ラット皮質ニューロンに対する共トランスフェクションを伴う方法について説明する。EGFPは正常にトランスフェクトされたニューロンの同定のための形態学的マーカーとして作用し、神経突起の測定を可能にする。この方法は、ニューライトの成長を調節すると報告されている化合物/分子を用いて検証した。また、FE65は、ニューライトの成長を刺激することが示されているニューロンアダプタータンパク質であり、このアプローチ8,9を例示するために用いられた。このプロトコルは、(1)胚18日目(E18)ラット胚からの一次皮質ニューロンの単離、(2)EGFPとPOI(本研究におけるFE65)とのニューロンの共トランスフェクション、(3)画像処理を用いてニューロンのイメージングと解析を含む。ニューロンJプラグイン10、11を持つソフトウェアImageJ。
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Protocol
すべての手順は、香港中華大学の動物実験倫理委員会の倫理基準に従っていました.
1. カバースリップの準備
- 無菌の18mm円形カバーを12ウェル組織培養板の各ウェルに入れます。
- カバースリップを加湿した37°Cインキュベーターで5 μg/mLポリD-リジン溶液で少なくとも1時間コートします。
- 組織培養プレートからポリD-リジン溶液を吸引し、被覆されたカバーリップを滅菌水で一度すすいでください。
2. ラット胚性ニューロン解剖
- 子宮頸部脱臼またはCO2窒息のいずれかによって18日(E18)の妊娠年齢で時限妊娠スプラーグ・ドーリーラットを犠牲にする。
注:妊娠中のネズミの犠牲については、現地の規制をご確認ください。 - ハサミを解剖して妊娠中のラットの腹腔を開き、子宮を10cmペトリ皿に移します。
- 小さな解剖はさみで子宮と天理嚢を慎重に開き、小さな解剖はさみを使用してラット胚から胎盤を取り除きます。胚全体を10cmペトリ皿に移し、小さな鉗子のペアを使用して、グルコース(PBS-グルコース、10mMリン酸ナトリウム、塩化カリウム、140mM塩化ナトリウムおよび3g/L)を補い、あらかじめ冷やされたリン酸塩バッファー生理食塩水を使用します。
- 頭蓋骨の矢状縫合糸に沿ってカットし、小さな解剖はさみで慎重にそれを開きます。小さな平らなへらで胚性脳を氷冷PBSブドウ糖で10cmペトリ皿に移します。
- 解剖顕微鏡下で2つの#5ピンセットを使用して、小脳と脳幹から2つの大脳半球を分離します。
注:ラット脳の構造については、参考文献12を参照してください。 - #5ピンセットを使用して髄膜を取り除く。
- 2つのまっすぐなピンセットで大脳半球から皮質を分離#5。
- 15 mL遠心管で単離された皮質を氷冷PBS-グルコースに移します。
3. 原発性皮質ニューロン培養
注:ステップ3および4のすべての手順は、クラスIIバイオセーフティキャビネット内で実行されます。
- 4°Cで4°Cで単離された皮質を5分間沈着させ、PBS-グルコースを吸引する。
- 0.05%トリプシン-EDTAの1 mLを単離された皮質に加え、37°Cの水浴で組織をタップして10分間インキュベートして穏やかに混ぜて、酵素消化を可能にします。チューブを軽くタップし、2分ごとに混合します。
- 組織/トリプシン混合物に4mLの維持培地(例えば、神経基底培地)を添加する。
注:このプロトコルで使用されるすべての維持培地は、ペニシリン連鎖マイシンおよびB-27サプリメント13を補う。 - 1 mLピペットを用いてトリチュレーションにより組織を穏やかに解離する。
- 断離細胞を200xgで5分間離離膜に分離したペレットを吸引する。
- 手順 3.5 ~ 3.7 を 2 回繰り返します。
- 細胞ペレットを1mLのメンテナンス培地で再ステースする。
- 0.4%トリパンブルー溶液の10 μLを10μLの細胞懸濁液に加え、生殖細胞計で生細胞を数え出す。
- ニューロンを65,000/cm2(生存細胞)の密度で12ウェルプレートにウェル当たり1mLの維持培地でプレートする。
4. 細胞トランスフェクションと固定
- インビトロ(DIV2)で2日間、1μLのトランスフェクション試薬(例えば、リポフェクタミン2000)を用いてPOIの0.5μgの有無にかかわらず一緒にEGFP構築物(pEGFP-C1)をニューロンにトランスフェクトする。製造元の指示に従って使用します。
注:哺乳動物発現物組子は、エンドトキシンフリープラスミド調製キットを用いて調製した。化学物質/分子による処理(この原稿ではサイトチャラシンD(Cyto D)および神経成長因子(NGF)を用いた)は、トランスフェクション後6時間で行うことができる。 - 培養培地を24時間トランスフェクション後に吸引し、37°C PBS(10mMリン酸ナトリウム、塩化カリウム2.68mM、塩化ナトリウム140mM)でトランスフェクト細胞を1回洗浄する。
- 室温で暗闇の中で10分間PBSに4%パラホルムアルデヒドで細胞を固定します。
- 固定細胞をPBSで3回洗います。
- 顕微鏡ガラススライドに最小限の蛍光取り付け媒体を追加します。カバースリップを12ウェルプレートから取り付け媒体に慎重に移し、サンプルをガラススライドに向けます。
注:水性取り付け媒体を使用する場合は、カバースリップの端をマニキュアでシールします。
5. ニューライトの生殖量の測定
- エピ蛍光顕微鏡を使用して画像をキャプチャする目的を 40 倍にします。
- トランスフェクションあたりのEGFP信号を持つ少なくとも40の無傷ニューロンからの画像をキャプチャします。
- NeuronJプラグイン11を用いてImageJソフトウェアで撮影した画像を開き、細胞体から成長コーンの先端までの最長の神経突起の長さを測定し、各画像化されたニューロンの長さを測定する。
- ソフトウェアで得られたデータを分析し、ニューライトの成長における標的タンパク質の効果を決定します。
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Representative Results
この方法論をテストするために、我々は、それぞれ14、15、16の神経伝達体の成長を阻害し、刺激することが示されているCyto Dおよび神経成長因子NGFを使用した。EGFPでトランスフェクトされたニューロンの神経突起長は、Cyto DまたはNGFによる治療後に測定した。EGFPのニューロンへのトランスフェクション効率は2.7%であった(1,068ニューロンを数えた)。図1Aに示すように、Cyto Dは用量依存的な方法でニューライト拡張を抑制した。逆に、NGFで処理したニューロンにおいて神経伝達体の成長が増強された(図1B)。
次に、神経伝達体の成長を促進することが示されているニューロンアダプターFE65をトランスフェクトすることにより、このシステムの有用性を調べた。原発性ラット皮質ニューロンをFE65およびEGFPと共生させた。トランスフェクション効率が低いにもかかわらず、免疫蛍光分析は、ニューロンの80%以上がEGFPおよびFE65との共生に成功したことを明らかにした(図2A)。以前の報告8、9、FE65と同様に、神経突起の成長を2倍に有意に刺激した(図2B)。また、ウェスタンブロット解析により、異なる時点におけるEGFPとFE65の発現を解析した。図2Cに示すように、EGFPおよびFE65はそれぞれ6時間及び12時間後トランスフェクションを検出した。タンパク質の同様の発現レベルは、トランスフェクション後ニューロンの1d〜7dで観察された。これは、ニューライトの成長の分析は、トランスフェクション後6時間またはより成熟したニューロンで早くも行うことができることを示している。このデータは、このプロトコルが古典的なトランスフェクションによる予測ニューライト生育調節タンパク質の役割を決定するのに適していることを示唆している。
また、FE65プラスミドDNAの異なる量の一次ラット皮質ニューロンをトランスフェクトすることにより、神経質の成長に対する遺伝子投与量の影響をモニタリングした。図2Dに示すように、FE65プラスミドDNAの0〜0.5μgからニューライト拡張の用量依存的増加が観察された。しかし、プラスミドDNAの0.5 μgまたは1 μgのいずれかでトランスフェクトされたニューロン間に有意な差はなかった(図2D)。
図1:神経突起成長は、Cyto DおよびNGFによって変調される。E18ラット皮質ニューロンをEGFP発現ベクターでDIV2上にトランスフェクトした。6h転写後、細胞を(A)0-0.5 μg/mL Cyto Dまたは(B)0-100 ng/mL NGFで24時間処理した。その後、ニューロンを固定し、それに応じて画像化した。画像はエピ蛍光顕微鏡を用いて40倍の目的で撮影し、細胞体から成長コーンの先端までの最長のニューライトの長さをNeuronJプラグインでImageJを用いて測定した。3つの独立した実験を行い、各群で少なくとも40個のニューロンを測定した。棒グラフは、平均ニューライト長さの折り目の変化を示した。統計分析には対和でないt検定が採用された。*p < 0.001, **p < 0.05.誤差余数 = S.E.M.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:FE65は神経突起の成長を刺激する。E18ラット皮質ニューロンは、空ベクターコントロール(EV)またはFE65のいずれかをEGFP発現ベクターと共にDIV2上でトランスフェクトした。細胞を固定し、トランスフェクション後24時間画像化した。(A)トランスフェクトされたニューロンを抗FE65抗体で逆染色し、EGFPまたはFE65を有する細胞数を一体的にトランスフェクトし、EGFP+FE65共生をカウントした。3つの独立した実験を行い、各実験で少なくとも100個の細胞を数えた。データは、EGFPおよびEGFP+FE65信号を持つ細胞のパーセンテージとして表した。*p < 0.001.誤差バー = S.D.(B)細胞本体から成長円根の先端までの最長の神経突起の長さは、NeuronJプラグインを用いてImageJを用いて測定した。代表的なニューロン画像を右パネルに示した。FE65は、記載のヤギ抗FE65抗体によって染色された8,17.3つの独立した実験が行われ、トランスフェクションごとに少なくとも40個のニューロンを測定した。棒グラフは、平均ニューライト長さの折り目の変化を示した。データは、ペアリングされていないt検定によって分析された。*p < 0.001.誤差バー = S.E.M. スケールバー = 10 μm.(C)指定されたトランスフェクション後の時間ポイントにおけるEGFPおよびFE65のレベルの発現のウェスタンブロット分析。EGFPおよびFE65は、それぞれマウス抗GFPおよび抗myc(FE65 C末端mycタグ)によって検出された。(D)示されているように様々な量のFE65プラスミドDNAを透過したニューロンの平均ニューライト長さ。統計分析は、ボンフェローニポストホック試験を用いて一方通行の分散分析を用いて行った。*p < 0.001, **p < 0.05.誤差バー = S.E.M. スケールバー = 10 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
前述したように、PC12およびそのサブクローンは、優れたトランスフェクション効率2、3を持っているので、神経伝達拡張を研究するために広く使用されています。対照的に、一次ニューロンはトランスフェクション速度が低く、トランスフェクション7による神経伝達成長調節因子の研究の大きな障害となっている。ここでは、一次ニューロンにおける神経伝達体の成長を定量するための便利なプロトコルについて述べる。全体的なトランスフェクション効率が低いにもかかわらず、トランスフェクトされたニューロンの80%以上が、FE65およびEGFP(図2A)の2つのタンパク質と共生することに成功した。従って、EGFP標識ニューロンを解析することにより、NEUriteの成長に対するFE65の効果を正確に決定することができた(図2B)。
記載されたEGFPベースのアプローチのもう一つの利点は、免疫蛍光染色を省略できることである。Tuj1の免疫蛍光染色は、ニューロン特異的クラスIIIβチューブリンであり、神経挙伸18、19、20、21を研究する際の形態マーカーとして広く用いられる。Tuj 1に加えて、トランスフェクトニューロン19、22、23の同定にはPOIの染色が必要である。神経挙体の増殖測定に重要な免疫蛍光染色の一貫性は、サンプル製剤および抗体24を含む多くの因子の影響を受けることが知られている。したがって、EGFPベースの方法の全体的な単純さは、アッセイの精度を向上させることができる。
我々のプロトコルでは、ニューロンはトランスフェクション後24時間の神経伝達測定のために固定される。したがって、ニューロンは24時間トランスフェクション試薬に曝露される。トランスフェクション試薬が細胞25に有毒であることは長い間知られている。NEURITE拡張に対するPOIの効果をDIV3を超えて決定する必要がある場合、新鮮な培地補充は毒性を最小限に抑えるのに役立つ可能性がある。また、代替遺伝子送達方法は、Ca2+リン酸塩共沈殿および核発沈などと考えられ、いずれも細胞26に対する毒性が低いことが示されている。さらに、ここでは、1 μLのトランスフェクション試薬を用いて、FE65の0.5μgとEGFPプラスミドの0.5μgを透過したニューロンにおいて、NEUriteの成長に対するFE65の最も高い効果が観察されたことを示す。他のPOIでは、タンパク質の回転率が大きく異なるように、プラスミドDNAおよびトランスフェクション試薬の最適な量を決定する必要があります。
遺伝子送達法に加えて、細胞密度は考慮されるべきもう一つの重要なパラメータである。ニューロン密度が高すぎると、神経突起の起源を特定することが困難になります。低密度でのめっき細胞は問題を解決するかもしれないが、一次ニューロンの生存率は低い細胞密度27で有意に減少するだろう。一次ラット海馬ニューロンは、40,000〜100,000/cm2 28の間の密度で健康的に成長することが示されている。このプロトコルでは、ラット皮質ニューロンの65,000/cm2の密度が使用される。それにもかかわらず、異なる実験条件下で異なるタイプのニューロンに対して適切な細胞密度を決定することが重要です。
ラット一次ニューロン(すなわちDIV3ニューロン)の発症の神経伝達体測定について、ここでは説明する。しかし、より成熟したニューロン型はDIV329を超えるニューロンで観察することができる。成熟したニューロンの神経伝達拡張に対するPOIや薬物の影響は、発達ニューロンとは異なる場合があるため、異なる段階からのニューロンを用いての調査は、より包括的な視点を提供するだろう。ニューロン7dポストトランスフェクションでEGFP発現を観察できたことは注目に値する。これは、成熟したニューロンの神経伝達の成長にPOIや薬物の研究を容易にする可能性があります。.
ヒト誘導多能性幹細胞(hiPSC)由来ニューロンは、新しい治療アプローチを同定する上で貴重なツールです。例えば、これらの細胞における神経伝達体の増殖の研究は、hiPSC由来ニューロンの使用が種の違いを避けるため、神経再生における新しい標的を明らかにすることができる。原発性げっ歯類ニューロンと同様に、hiPSC由来ニューロンは30をトランスフェクトすることが困難であり、EGFPとPOIの共トランスフェクション効率を低下させる可能性がある。したがって、ポリシストロニック哺乳類発現ベクターを使用すると、すべてのトランスフェクトされた細胞がEGFPおよびPOIを含むトランスフェクトされた遺伝子のセット全体を発現することを確実にすることができる。さらに、エレクトロポレーションなどの代替遺伝子送達方法は、トランスフェクション効率を向上させる可能性がある。繰り返しますが、細胞の生存率は、このような遺伝子送達アプローチを用いるときに考慮する必要がある問題である。
ラット胚性脳皮質には、スピニーステラニューロン、双極性ニューロンおよび長い突出ニューロン31を含む異なる種類のニューロンが含まれていることが知られている。ここで述べたこのプロトコルは、神経突起の成長に対するPOIの一般的な影響を明らかにすることができますが、同じPOIが異なるタイプのニューロンで異なる応答を示す可能性があります。例えば、ミオスタチンは感覚軸母の数を増やすが、モーター軸母32の数は増加しない。このようなシナリオでは、フローサイトメトリーによる特定のタイプのニューロンの事前分離など、プロトコルの変更が必要です。あるいは、特異的なニューロンマーカー抗体は、イメージング中に必要なタイプのニューロンの同定に使用され得る。
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Disclosures
著者は、彼らがこの記事の内容と利益相反を持っていないと宣言します。
Acknowledgments
この研究は、研究助成金協議会香港、保健医療研究基金(香港)、CUHK直接助成金スキーム、ユナイテッドカレッジ基金、TUYF慈善信託からの資金によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 tweezers | Regine | 5-COB | |
| 18 mm Circle Cover Slips | Thermo Scientific | CB00180RA | Sterilize before use |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| Cytochalasin D | Invitrogen | PHZ1063 | Dissolved in DMSO |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dissecting Scissors, 10 cm | World Precision Instruments | 14393 | |
| Dissecting Scissors, 12.5 cm | World Precision Instruments | 15922 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| Fluorescence Mounting Medium | Dako | S302380 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| NGF 2.5S Native Mouse Protein | Gibco | 13257019 | |
| Nugent Utility Forceps, 10 mm, Straight Tip | World Precision Instruments | 504489 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| pEGFP-C1 | Clontech | #6084-1 | |
| pCI FE65 | Please see references 8 and 15 | ||
| PBS Tablets | Gibco | 18912014 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Spatula | Sigma-Aldrich | S4147 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 |
References
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