Summary
I denne rapporten beskriver vi en enkel protokoll for å studere neurite utvekst i embryonale rotte kortikale neurons av co-transfecting med EGFP og protein av interesse.
Abstract
Neurite utvekst er en fundamental hendelse i dannelsen av nevrale kretser under nervesystemet utvikling. Alvorlig neurite Kader og Synaptic dysfunksjon forekommer i ulike nevrodegenerative sykdommer og alder-relaterte degenerasjon. Gransking av mekanismene som regulerer neurite utvekst ville ikke bare kaste verdifullt lys på hjernens utviklingsmessige prosesser, men også på slike nevrologiske lidelser. På grunn av den lave transfeksjoner effektivitet, er det for tiden utfordrende å studere effekten av et bestemt protein på neurite utvekst i primære pattedyr neurons. Her beskriver vi en enkel metode for undersøkelse av neurite utvekst av transfeksjoner av primære rotte kortikale neurons med EGFP og et protein av interesse (POI). Denne metoden tillater identifisering av POI transfekterte neurons gjennom EGFP signalet, og dermed effekten av POI på neurite utvekst kan bestemmes presist. Dette EGFP-baserte analysen gir en praktisk tilnærming for etterforskning av trasé regulere neurite utvekst.
Introduction
Neurites, inkludert både axons og dendrites, er anslagene fra neurons involvert i etableringen av nevrale nettverk. Den dynamiske utvekst av neurites er avgjørende for neurodevelopment. Imidlertid er de underliggende regulatoriske mekanismene under fortsatt uklare. Spesielt neurite Kader er ofte observert i ulike nevrodegenerative sykdommer og etter hjerne skader1. Derfor vil gransking av rollene til antatte molekyler i ulike neurite utvekst regulatoriske trasé forbedre vår forståelse av prosessen. Videre kan det avsløre romanen terapeutiske mål for ulike nevrologiske lidelser. Neuronal cellelinjer er verdifulle modeller for å studere neuronal prosesser inkludert neurite utvekst som de er enkle å manipulere og transfect2,3. Imidlertid har genetisk drift blitt rapportert å forekomme i noen brukte cellelinjer, noe som kan føre til variasjoner i deres fysiologiske svar4. Videre har differensial protein uttrykk blitt vist mellom neuronal cellelinjer og primære neurons. For eksempel, PC12, en neuronal cellelinje avledet fra rotte binyrene som er mye brukt for å studere neurite utvekst2,3, ikke uttrykke NMDA reseptorer5. Videre har det vært foreslått at den reduserte responsen på musen neuroblastom linje Nevro-2a til nervegifter i forhold til primære neurons skyldes mangel på uttrykk for visse membran reseptorer og Ion-kanaler6. Derfor primære neurons er en mer ønskelig og representativ modell for etterforskningen av neurite utvekst. Imidlertid er bruken av primære neurons hindret av deres lave transfeksjoner effektivitet7.
Her beskriver vi en metode som involverer co-transfeksjoner av protein av interesse (POI) og EGFP til primære rotte kortikale neurons. Den EGFP fungerer som en morfologiske markør for identifisering av vellykket transfekterte neurons og tillater måling av neurites. Vi validerte denne metoden ved hjelp av forbindelser/molekyler som er rapportert til modulere neurite utvekst. Dess, FE65, en neuronal adapter protein som har vist seg å stimulere neurite utvekst, ble brukt for å illustrere denne tilnærmingen8,9. Denne protokollen innebærer (1) isolering av primære kortikale neurons fra embryonale dag 18 (E18) rotte embryo, (2) transfeksjoner av neurons med EGFP og POI (FE65 i denne studien) og (3) Imaging og analyse av neurons ved hjelp av bildebehandling programvare ImageJ med NeuronJ plugin10,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer fulgte var i samsvar med etiske standarder for dyret eksperimentering etikk komiteen av det kinesiske Universitetet i Hong Kong.
1. utarbeidelse av Coverslips
- Plasser en steril 18 mm sirkulær dekkglass i hver brønn på en 12-brønn vev kultur plate.
- Coat dekkglass med 5 μg/mL Poly-D-lysin løsning i en fuktet 37 ° c inkubator i minst 1 time.
- Aspirer den Poly-D-lysin løsning fra vevet kulturen plate og skyll belagt coverslips gang med sterilt vann.
2. Rat embryonale Nevron disseksjon
- Ofre en tidsbestemt-gravid Sprague-Dawley rotte ved en svangerskapsdiabetes alder 18 dager (E18) ved enten cervical forvridning eller CO2 kvelning.
Merk: Vennligst sjekk lokale forskrifter for ofring av gravide rotter. - Åpne bukhulen til gravide rotte med dissekere saks og overføre livmoren til en 10 cm Petri parabolen.
- Åpne livmoren og fostervann SAC nøye med små dissekere saks og fjerne morkaken fra rotte embryo ved hjelp av små dissekere saks. Overfør hele embryo til en 10 cm Petri parabolen med pre-kjølt fosfat bufret saltvann supplert med glukose (PBS-glukose, 10 mM natrium fosfater, 2,68 mM kalium klorid, 140 mM natriumklorid og 3 g/L glukose) ved hjelp av et par små tang.
- Skjær langs sagittal Sutur av skallen og åpne den forsiktig med et par små dissekere saks. Overfør den embryonale hjernen med en liten flat spatel til en 10 cm Petri parabolen med iskald PBS-glukose.
- Skill de to cerebral halvkuler fra lillehjernen og hjernestammen ved hjelp av to #5 pinsett under et disseksjon mikroskop.
Merk: Vennligst se referanse12 for strukturen av rotte hjernen. - Fjern hjernehinnene ved hjelp av #5 pinsett.
- Isoler cortex fra cerebral halvkuler med to rett #5 pinsett.
- Overfør den isolerte cortex til iskaldt PBS-glukose i et 15 mL sentrifugerør.
3. primær kortikale Nevron kultur
Merk: Alle prosedyrene i trinn 3 og 4 utføres i et klasse II biosafety kabinett.
- Bosette den isolerte cortex ved tyngdekraften ved 4 ° c i 5 min og aspirer PBS-glukose.
- Tilsett 1 mL 0,05% Trypsin-EDTA til den isolerte cortex og bland forsiktig ved å trykke og ruge vevet i en 37 ° c vannbad i 10 min for å tillate enzymatisk fordøyelse. Trykk forsiktig på røret for å blande hver 2 min.
- Tilsett 4 mL vedlikeholds medium (f. eks Neurobasal medium) til vevet/Trypsin blanding.
Merk: Alt vedlikeholds medium som brukes i denne protokollen, suppleres med penicillin-Streptomycin og B-27 supplement13. - Distansere vevet forsiktig ved å trituration med en 1 mL pipette.
- Pellet dissosiert celler ved sentrifugering ved 200 x g i 5 min. aspirer supernatanten.
- Gjenta trinn 3,5 til 3,7 to ganger.
- Resuspend celle pellet i 1 mL vedlikeholds medium.
- Tilsett 10 μL av 0,4% Trypan blå oppløsning til 10 μL av celle fjæring for telling av levedyktige celler med en hemocytometer.
- Plate neurons i en tetthet på 65000/cm2 (levedyktige celler) i 1 ml vedlikehold medium per brønn i en 12-brønn plate.
4. Cell Transfeksjoner og fiksering
- Ved 2 dager in vitro (DIV2), transfect 0,5 μg av EGFP-konstruksjon (pEGFP-C1) til nevroner sammen med eller uten 0,5 μg av POI ved bruk av 1 μL av transfeksjoner reagens (f.eks. Lipofectamine 2000). Bruk produsentens instruksjoner.
Merk: Pattedyr uttrykk konstruksjoner ble utarbeidet ved hjelp av en endotoksin gratis plasmider forberedelse Kit. Behandling med kjemikalier/molekyler (i dette manuskriptet cytochalasin D (cyto D) og nerve vekstfaktor (NGF) ble brukt) kan gjøres ved 6 h etter transfeksjoner. - Aspirer kulturen medium 24 h post-transfeksjoner og vask transfekterte cellene en gang med 37 ° c PBS (10 mM natrium fosfater, 2,68 mM kalium klorid, 140 mM natriumklorid).
- Fix cellene med 4% paraformaldehyde i PBS for 10 min i mørket ved romtemperatur.
- Vask de faste cellene tre ganger med PBS.
- Legg til en minimal mengde fluorescens monterings medium på et mikroskop glass lysbilde. Overfør dekkglass forsiktig fra 12-brønn platen til monterings mediet med prøven vendt mot glass lysbildet.
Merk: Forsegle kanten av dekkglass med neglelakk hvis et vandig festemiddel brukes.
5. måling av Neurite utvekst
- Bruk en 40x målsetting for å fange opp bilder ved hjelp av en Epi-fluorescerende mikroskop.
- Ta bilder fra minst 40 intakte neurons med EGFP signal per transfeksjoner.
- Åpne fanget bildet i ImageJ programvare med NeuronJ plugin11 for å måle lengden av de lengste neurite, fra cellen kroppen til spissen av veksten kjegle, av hver avbildet Nevron.
- Analysere data innhentet med programvaren for å fastslå effekten av målrettede proteiner i neurite utvekst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å teste denne metodikken, brukte vi cyto D og nerve vekstfaktor NGF, som har vist å hemme og stimulere neurite utvekst henholdsvis14,15,16. Den neurite lengden av neurons transfekterte med EGFP ble målt etter behandling med cyto D eller NGF. Den transfeksjoner effektiviteten av EGFP til neurons var 2,7% (1 068 neurons telles). Som vist i figur 1A, cyto D undertrykt neurite forlengelse i en dose avhengig måte. Omvendt ble neurite utvekst forsterket i neurons behandlet med NGF (figur 1B).
Deretter undersøkte vi nytten av dette systemet ved transfecting den neuronal adapter FE65, som har vist å fremme neurite utvekst. Primær rotte kortikale neurons var co-transfekterte med FE65 og EGFP. Til tross for lav transfeksjoner effektivitet, Immuno-fluorescens analyse avslørte at over 80% av neurons ble vellykket co-transfekterte med EGFP og FE65 (figur 2A). I likhet med tidligere rapporter8,9, FE65 betydelig stimulert av neurite utvekst av 2x (figur 2B). Vi har også analysert uttrykk for EGFP og FE65 på ulike tidspunkt poeng av Western Blot analyse. Som vist i figur 2C, EGFP og FE65 ble detektert 6 h og 12 h post-transfeksjoner, henholdsvis. Lignende uttrykks nivåer av proteinene ble observert i 1 d til 7 d post-transfeksjoner neurons. Dette indikerer at analysen av neurite utvekst kan gjøres så tidlig som 6 h post-transfeksjoner eller i mer modne neurons. Sammen, disse dataene tyder på at den nevnte protokollen er egnet for å bestemme hvilken rolle antatte neurite utvekst regulatoriske proteiner av klassisk transfeksjoner.
Vi har også overvåket effekten av gen dosering på neurite utvekst ved transfecting primære rotte kortikale neurons med ulike mengder FE65 plasmider DNA. Som vist i figur 2D, ble det observert en dose avhengig økning i neurite utvidelse fra 0-0,5 ΜG av FE65 plasmider DNA. Det var imidlertid ingen signifikant forskjell mellom neurons transfekterte med enten 0,5 μg eller 1 mikrogram plasmider DNA (figur 2D).
Figur 1: Neurite utvekst er modulert av cyto D og NGF. E18 rotte kortikale neurons ble transfekterte på DIV2 med en EGFP uttrykk vektor. 6 h post-transfeksjoner, cellene ble behandlet med (A) 0-0,5 μg/ml cyto D eller (B) 0-100 ng/ml NGF for 24 h. Da neurons ble fikset og avbildet tilsvarende. Bilder ble tatt med 40x objektiv ved hjelp av en Epi-fluorescens mikroskop og lengden på den lengste neurite fra cellen kroppen til spissen av veksten kjegle ble målt ved hjelp av ImageJ med NeuronJ plugin. Tre uavhengige eksperimenter ble utført og minst 40 neurons ble målt i hver gruppe. Linjediagrammet viste fold endringen i gjennomsnittlig neurite lengde. Ikke-sammenkoblet t-test ble vedtatt for statistisk analyse. * p < 0,001, * * p < 0,05. Feilfelt = S.E.M. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: FE65 stimulerer neurite utvekst. E18 rotte kortikale neurons ble transfekterte på DIV2 med enten tom vektor kontroll (EV) eller FE65 sammen med en EGFP uttrykk vektor. Celler ble fikset og avbildet 24 h etter transfeksjoner. (A) transfekterte neurons ble counterstained med anti-FE65 antistoff og antall celler med EGFP eller FE65 enkeltvis TRANSFEKTERTE og EGFP + FE65 co-transfekterte ble talt. Tre uavhengige eksperimenter ble utført og minst 100 celler ble telt i hvert eksperiment. Data ble uttrykt som prosentandelen av celler med EGFP og EGFP + FE65 signaler. * p < 0,001. Feilfelt = S.D. (B) lengden på den lengste neurite fra celle legemet til spissen av veksten kjegle ble målt ved hjelp av ImageJ med NeuronJ plugin. Representative Nevron bilder ble vist i høyre panel. FE65 var farget av en geit anti-FE65 antistoff som beskrevet8,17. Tre uavhengige eksperimenter ble utført og minst 40 neurons ble målt per transfeksjoner. Linjediagrammet viste fold endringen i gjennomsnittlig neurite lengde. Dataene ble analysert av ikke-sammenkoblet t-test. * p < 0,001. Feilfelt = S.E.M. skala bar = 10 μm. (C) Western Blot analyse av uttrykk for nivåer av EGFP og FE65 på post-transfeksjoner tid punkter som indikert. EGFP og FE65 ble oppdaget av musen anti-GFP og anti-myC (til FE65 C-terminal myC tag), henholdsvis. (D) gjennomsnittlig neurite lengde neurons transfekterte med ulike mengder FE65 plasmider DNA som indikert. Statistiske analyser ble utført ved hjelp av enveis ANOVA-tester med Bonferroni post-hoc-test. * p < 0,001, * * p < 0,05. Feilfelt = S.E.M. skala bar = 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som nevnt tidligere, PC12 og dens subclones er mye brukt for å studere neurite forlengelse fordi de har utmerket transfeksjoner effektivitet2,3. I kontrast primære neurons har en lav transfeksjoner rate, som er et stort hinder for å studere neurite utvekst regulatorer ved transfeksjoner7. Her beskriver vi en praktisk protokoll for kvantifisere neurite utvekst i primære neurons. Til tross for den lave generelle transfeksjoner effektivitet, mer enn 80% av transfekterte neurons ble vellykket co-transfekterte med de to proteinene: FE65 og EGFP (figur 2A). Derfor, ved å analysere EGFP-merkede neurons, kan effekten av FE65 på neurite utvekst bestemmes presist (figur 2B).
En annen fordel med den EGFP-baserte tilnærmingen er beskrevet er at immunofluorescence farging kan utelates. Immunofluorescence farging av tuj 1, en Nevron-spesifikk klasse III β-tubulin, er mye ansatt som morfologiske markør når man studerer neurite forlengelse18,19,20,21. I tillegg til tuj 1, er farging av severdigheten nødvendig for identifisering av transfekterte neurons19,22,23. Det er kjent at konsistensen av immunofluorescence farging, som er avgjørende for neurite utvekst måling, påvirkes av mange faktorer, inkludert prøve forberedelser og antistoffer24. Derfor, den generelle enkelhet av EGFP-baserte metoden kan forbedre nøyaktigheten av analysen.
I vår protokoll, neurons er løst for neurite måling 24 h post-transfeksjoner. Dermed er neurons eksponert for transfeksjoner reagens for 24 h. Det er lenge kjent at transfeksjoner reagenser er giftige for cellene25. Hvis effekten av SEVERDIGHETEN på neurite forlengelse må fastsettes utover DIV3, kan fersk-medium etterfylling bidra til å minimere toksisitet. Videre kan alternative gen leveringsmetoder betraktes som ca2 + fosfat co-nedbør og nucleofection, som begge er vist å ha en mindre giftig effekt til cellene26. I tillegg viser vi her at den høyeste effekten av FE65 på neurite utvekst er observert i neurons transfekterte med at 0,5 μg av FE65 og 0,5 μg av EGFP plasmider ved hjelp av 1 μL av transfeksjoner reagens. For andre POI-er bør de optimale mengdene med plasmider DNA og transfeksjoner reagenser fastslås som proteiner har mye forskjellig omløpshastighet.
I tillegg til gen leveringsmetode, er celle tetthet en annen kritisk parameter som skal vurderes. Hvis Nevron tettheten er for høy, blir det vanskelig å identifisere opprinnelsen til neurites som de ville overlappe med hverandre. Selv om plating celler med lav tetthet kan løse problemet, overlevelse av primære neurons ville bli betydelig redusert med en lav celle tetthet27. Primær rotte hippocampus neurons har vist å vokse sunt på tettheten mellom 40 000 til 100000/cm2 28. I denne protokollen, en tetthet på 65000/cm2 av rotte kortikale neurons brukes. Likevel er det viktig å bestemme den aktuelle celle tettheten for ulike typer neurons under ulike eksperimentelle forhold.
Det neurite måler av utvikler rotten primære neurons (i.e. DIV3 neurons) er beskrevet her over. Men mer modent neuronal fenotyper kan observeres i neurons utover DIV329. Som effekter av interessepunkter eller narkotika på neurite forlengelse i modne neurons kan være forskjellig fra å utvikle neurons, etterforskning ved hjelp av neurons fra ulike stadier ville gi et mer helhetlig perspektiv. Det er verdt å merke seg at vi fortsatt var i stand til å observere EGFP uttrykk i neurons 7 d post-transfeksjoner. Dette kan lette studiet av interessepunkter eller rusmidler på neurite utvekst i modne neurons.
Humant indusert pluripotent stilk cellen (hiPSC)-avledet neurons er verdifulle verktøy i identifisering av romanen terapeutiske tilnærminger. For eksempel kan gransking av neurite utvekst i disse cellene avdekke romanen mål i neuroregeneration som bruk av hiPSC-avledet neurons unngår arten forskjeller. I likhet med primær gnager neurons, hiPSC-avledet neurons er vanskelig å transfect30, som kan redusere co-transfeksjoner effektiviteten av EGFP og POI. Derfor kan bruken av polycistronic pattedyr uttrykk vektorer sikre at alle transfekterte celler uttrykker hele settet av transfekterte gener inkludert EGFP og POI. I tillegg kan alternative gen leveringsmetoder, for eksempel electroporation, forbedre transfeksjoner effektivitet. Igjen, er celle levedyktighet et problem som må vurderes ved bruk av slike gen levering tilnærminger.
Det er kjent at rotte embryonale hjernebarken inneholder ulike typer neurons inkludert spiny Stel neurons, bipolar neurons og lang-prosjektering neurons31. Selv om denne protokollen som er angitt her, kan avdekke den generelle effekten av interessepunkter på neurite utvekst, er det mulig at samme POI kan vise ulike reaksjoner i ulike typer neurons. Myostatin øker for eksempel antallet sensoriske axons, men ikke av motor axons32. I et slikt scenario er modifisering av protokollen nødvendig, for eksempel tidligere isolering av bestemte typer neurons av Flow flowcytometri. Alternativt kan spesifikke neuronal markør antistoffer brukes for identifisering av de nødvendige typer neurons under Imaging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikter med innholdet i denne artikkelen.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av midler fra Research Grants Council Hong Kong, Health and Medical Research Fund (Hong Kong), CUHK direkte stipend ordningen, United College legat fondet og TUYF veldedige Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 tweezers | Regine | 5-COB | |
| 18 mm Circle Cover Slips | Thermo Scientific | CB00180RA | Sterilize before use |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| Cytochalasin D | Invitrogen | PHZ1063 | Dissolved in DMSO |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dissecting Scissors, 10 cm | World Precision Instruments | 14393 | |
| Dissecting Scissors, 12.5 cm | World Precision Instruments | 15922 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| Fluorescence Mounting Medium | Dako | S302380 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| NGF 2.5S Native Mouse Protein | Gibco | 13257019 | |
| Nugent Utility Forceps, 10 mm, Straight Tip | World Precision Instruments | 504489 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| pEGFP-C1 | Clontech | #6084-1 | |
| pCI FE65 | Please see references 8 and 15 | ||
| PBS Tablets | Gibco | 18912014 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Spatula | Sigma-Aldrich | S4147 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 |
References
- Kaplan, A., Bueno, M., Hua, L., Fournier, A. E. Maximizing functional axon repair in the injured central nervous system: Lessons from neuronal development. Developmental Dynamics. 247 (1), 18-23 (2018).
- Harrill, J. A., Mundy, W. R. Quantitative assessment of neurite outgrowth in PC12 cells. Methods in Molecular Biology. 758, 331-348 (2011).
- Yeyeodu, S. T., Witherspoon, S. M., Gilyazova, N., Ibeanu, G. C. A rapid, inexpensive high throughput screen method for neurite outgrowth. Current Chemical Genomics. 4, 74-83 (2010).
- Ben-David, U., et al. Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response. Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).
- Edwards, M. A., Loxley, R. A., Williams, A. J., Connor, M., Phillips, J. K. Lack of functional expression of NMDA receptors in PC12 cells. Neurotoxicology. 28 (4), 876-885 (2007).
- LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies. Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. Journal of Neuroscience. 30 (18), 6171-6177 (2010).
- Cheung, H. N., et al. FE65 interacts with ADP-ribosylation factor 6 to promote neurite outgrowth. The FASEB Journal. 28 (1), 337-349 (2014).
- Li, W., et al. Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1. Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry. Part A: the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).
- Swanson, L. W. Brain maps 4.0-Structure of the rat brain: An open access atlas with global nervous system nomenclature ontology and flatmaps. The Journal of Comparative Neurology. 526 (6), 935-943 (2018).
- Brewer, G. J. Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus. Journal of Neuroscience Research. 42 (5), 674-683 (1995).
- Yamada, K. M., Spooner, B. S., Wessells, N. K. Axon growth: roles of microfilaments and microtubules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 66 (4), 1206-1212 (1970).
- Casella, J. F., Flanagan, M. D., Lin, S. Cytochalasin D inhibits actin polymerization and induces depolymerization of actin filaments formed during platelet shape change. Nature. 293 (5830), 302-305 (1981).
- Calabrese, E. J. Enhancing and regulating neurite outgrowth. Critical Reviews in Toxicology. 38 (4), 391-418 (2008).
- Lau, K. F., et al. Dexras1 Interacts with FE65 to Regulate FE65-Amyloid Precursor Protein-dependent Transcription. Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34728-34737 (2008).
- Cui, X., et al. Niacin treatment of stroke increases synaptic plasticity and axon growth in rats. Stroke. 41 (9), 2044-2049 (2010).
- Khodosevich, K., Monyer, H. Signaling involved in neurite outgrowth of postnatally born subventricular zone neurons in vitro. BMC Neuroscience. 11, 18 (2010).
- Tang, F., et al. Resveratrol Enhances Neurite Outgrowth and Synaptogenesis Via Sonic Hedgehog Signaling Following Oxygen-Glucose Deprivation/Reoxygenation Injury. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 43 (2), 852-869 (2017).
- He, W., Liu, Y., Tian, X. Rosuvastatin Improves Neurite Outgrowth of Cortical Neurons against Oxygen-Glucose Deprivation via Notch1-mediated Mitochondrial Biogenesis and Functional Improvement. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 6 (2018).
- Tesarova, P., et al. Receptor for advanced glycation end products (RAGE)--soluble form (sRAGE) and gene polymorphisms in patients with breast cancer. Cancer Investigation. 25 (8), 720-725 (2007).
- Park, S. Y., et al. Hippocalcin Promotes Neuronal Differentiation and Inhibits Astrocytic Differentiation in Neural Stem Cells. Stem Cell Reports. 8 (1), 95-111 (2017).
- Radbruch, A. Immunofluorescence: Basic Considerations. Flow Cytometry and Cell Sorting. , Springer Lab Manual Book Series. 38-52 (2000).
- Wang, T., Larcher, L. M., Ma, L., Veedu, R. N. Systematic Screening of Commonly Used Commercial Transfection Reagents towards Efficient Transfection of Single-Stranded Oligonucleotides. Molecules. 23 (10), (2018).
- Sariyer, I. K. Transfection of neuronal cultures. Methods in Molecular Biology. 1078, 133-139 (2013).
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Research. 126 (3), 397-425 (1977).
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Further observations on hippocampal neurons in dispersed cell culture. The Journal of Comparative Neurology. 187 (3), 469-493 (1979).
- Biffi, E., Regalia, G., Menegon, A., Ferrigno, G., Pedrocchi, A. The influence of neuronal density and maturation on network activity of hippocampal cell cultures: a methodological study. PLoS One. 8 (12), e83899 (2013).
- Hiragi, T., et al. Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cell (hiPSC)-Derived Neurons in Mouse Hippocampal Slice Cultures. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 143 (2017).
- Zeng, H., Sanes, J. R. Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward. Nature Reviews. Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).
- Jones, M. R., Villalon, E., Northcutt, A. J., Calcutt, N. A., Garcia, M. L. Differential effects of myostatin deficiency on motor and sensory axons. Muscle & Nerve. 56 (6), E100-E107 (2017).
