Summary
En este informe, describimos un protocolo simple para estudiar el crecimiento de neurita en neuronas corticales de rata embrionaria mediante la co-transfección con EGFP y la proteína de interés.
Abstract
El crecimiento de neurita es un evento fundamental en la formación de los circuitos neuronales durante el desarrollo del sistema nervioso. El daño grave a la neurita y la disfunción sináptica ocurren en diversas enfermedades neurodegenerativas y en la degeneración relacionada con la edad. La investigación de los mecanismos que regulan el crecimiento de las neuritas no sólo arrojaría una valiosa luz sobre los procesos de desarrollo cerebral, sino también sobre estos trastornos neurológicos. Debido a la baja eficiencia de transfección, actualmente es difícil estudiar el efecto de una proteína específica en el crecimiento de neurita en las neuronas primarias de mamíferos. Aquí, describimos un método simple para la investigación del crecimiento de neurita por la co-transfección de neuronas corticales de rata primaria con EGFP y una proteína de interés (POI). Este método permite la identificación de las neuronas transfectó el PDI a través de la señal EGFP, y por lo tanto el efecto del PDI en el crecimiento de neurita se puede determinar con precisión. Este ensayo basado en el EGFP proporciona un enfoque conveniente para la investigación de vías que regulan el crecimiento de las neuritas.
Introduction
Los neuritas, incluyendo axones y dendritas, son las proyecciones de las neuronas implicadas en el establecimiento de las redes neuronales. El crecimiento dinámico de los neurótesis es esencial para el neurodesarrollo. Sin embargo, los mecanismos reglamentarios subyacentes que hay debajo siguen sin estar claros. En particular, el daño de neurita se observa a menudo en varias enfermedades neurodegenerativas y después de lesiones cerebrales1. Por lo tanto, la investigación de los roles de las moléculas putativas en varias vías reguladoras de crecimiento de neurita mejoraría nuestra comprensión del proceso. Por otra parte, puede revelar nuevas dianas terapéuticas para diversos trastornos neurológicos. Las líneas celulares neuronales son modelos valiosos para estudiar los procesos neuronales, incluido el crecimiento de neurita, ya que son fáciles de manipular y transfectar2,3. Sin embargo, se ha informado que la deriva genética ocurre en algunas líneas celulares de uso común, lo que podría conducir a variaciones en sus respuestas fisiológicas4. Además, se ha demostrado la expresión diferencial de proteínas entre las líneas celulares neuronales y las neuronas primarias. Por ejemplo, PC12, una línea celular neuronal derivada de la glándula suprarrenal de rata que se utiliza ampliamente para el estudio de crecimiento de neurita2,3, no expresa los receptores NMDA5. Además, se ha propuesto que la menor capacidad de respuesta de la línea de neuroblastoma de ratón neuro-2a a las neurotoxinas en comparación con las neuronas primarias se debe a la falta de expresión de ciertos receptores de membrana y canales iónicos6. Por lo tanto, las neuronas primarias son un modelo más deseable y representativo para la investigación del crecimiento de neurita. Sin embargo, el uso de neuronas primarias se ve obstaculizado por su baja eficiencia de transfección7.
Aquí, describimos un método que implica la co-transfección de la proteína de interés (POI) y EGFP a las neuronas corticales de rata primarias. El EGFP actúa como un marcador morfológico para la identificación de las neuronas transpiradas con éxito y permite la medición de neurítos. Validamos este método mediante el uso de compuestos/moléculas que se han informado para modular el crecimiento de neurita. Además, FE65, una proteína adaptadora neuronal que se ha demostrado para estimular el crecimiento de neurita, se utilizó para ilustrar este enfoque8,9. Este protocolo implica (1) el aislamiento de las neuronas corticales primarias de embriones embrionarios embrionarios embrionarios embrionarios del día 18 (E18), (2) la co-transfección de neuronas con EGFP y el PDI (FE65 en este estudio) y (3) la toma de imágenes y el análisis de las neuronas mediante el procesamiento de imágenes software ImageJ con el plugin NeuronJ10,11.
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Protocol
Todos los procedimientos seguidos se ajustaron a las normas éticas del comité de ética de experimentación animal de la Universidad China de Hong Kong.
1. Preparación de Coverslips
- Coloque un cubreobjetos circular escorazado de 18 mm en cada pocal de una placa de cultivo de tejido de 12 pocillos.
- Cubra el cubreobjetos con una solución de poli-D-lisina de 5 g/ml en una incubadora humidificada de 37 oC durante al menos 1 h.
- Aspirar la solución de poli-D-lisina de la placa de cultivo de tejido y enjuagar los cubrecubiertas recubiertos una vez con agua estéril.
2. Disección de neuronas embrionarias de rata
- Sacrificar una rata Sprague-Dawley embarazada embarazada a una edad gestacional de 18 días (E18) por luxación cervical o asfixia porCO2.
NOTA: Consulte la normativa local para el sacrificio de ratas embarazadas. - Abra la cavidad abdominal de la rata embarazada con tijeras disalizantes y transfiera el útero a un plato Petri de 10 cm.
- Abra el útero y el saco amniótico cuidadosamente con pequeñas tijeras disembrantes y retire la placenta del embrión de rata usando tijeras disecantes pequeñas. Transfiera todo el embrión a una placa Petri de 10 cm con solución salina tamponada de fosfato preenfriado suplementada con glucosa (PBS-glucosa, fosfatos sódicos de 10 mM, cloruro de potasio de 2,68 mM, cloruro sódico de 140 mM y glucosa de 3 g/L) utilizando un par de pequeños fórceps.
- Corta a lo largo de la sutura sagital del cráneo y ábrela cuidadosamente con un par de tijeras disecuentes pequeñas. Transfiera el cerebro embrionario con una pequeña espátula plana a una placa Petri de 10 cm con PBS-glucosa helada.
- Separe los dos hemisferios cerebrales del cerebelo y el tallo cerebral usando dos pinzas #5 bajo un microscopio de disección.
NOTA: Consulte la referencia12 para la estructura del cerebro de la rata. - Retire las meninges con las pinzas #5.
- Aísle la corteza de los hemisferios cerebrales con dos pinzas rectas #5.
- Transfiera la corteza aislada a PBS-glucosa helada en un tubo centrífugo de 15 ml.
3. Cultivo primario de neuronas corticales
NOTA: Todos los procedimientos de los pasos 3 y 4 se realizan dentro de un gabinete de Bioseguridad Clase II.
- Asentar la corteza aislada por gravedad a 4 oC durante 5 min y aspirar la PBS-glucosa.
- Añadir 1 mL de 0,05% de trippsina-EDTA a la corteza aislada y mezclar suavemente tocando e incubar el tejido en un baño de agua de 37 oC durante 10 minutos para permitir la digestión enzimática. Toque suavemente el tubo para mezclar cada 2 minutos.
- Añadir 4 ml de medio de mantenimiento (p. ej., medio neurobasal) a la mezcla de tejido/trippsina.
NOTA: Todo el medio de mantenimiento utilizado en este protocolo se complementa con Penicilina-Streptomicina y suplemento B-2713. - Disociar el tejido suavemente mediante la trituración utilizando una pipeta de 1 ml.
- Pellet las células disociadas por centrifugación a 200 x g durante 5 min. Aspirar el sobrenadante.
- Repita los pasos 3.5 a 3.7 dos veces.
- Resuspender el pellet celular en 1 ml de medio de mantenimiento.
- Añadir 10 l de solución de Trypan Blue al 00 l de suspensión celular para el recuento de células viables por un hemocitómetro.
- Placa las neuronas a una densidad de 65,000/cm2 (células viables) en 1 ml de medio de mantenimiento por pozo en una placa de 12 pocillos.
4. Transfección y fijación celular
- A los 2 días in vitro (DIV2), transfecto 0,5 g de construcción de EGFP (pEGFP-C1) a neuronas junto con o sin 0,5 g de PDI mediante el uso de 1 l de reactivo de transfección (p. ej., Lipofectamine 2000). Siga las instrucciones del fabricante.
NOTA: Las construcciones de expresión de mamíferos se prepararon utilizando un kit de preparación de plásmido libre de endotoxinas. El tratamiento con productos químicos/moléculas (en este manuscrito se utilizaron citoclasina D (Cito D) y factor de crecimiento nervioso (NGF)) a las 6 h después de la transfección. - Aspirar el medio de cultivo 24 h después de la transfección y lavar las células transfectótas una vez con PBS de 37 oC (10 mM de fosfatos sódicos, 2,68 mM de cloruro de potasio, 140 mM de cloruro sódico).
- Fijar las células con 4% de paraformaldehído en PBS durante 10 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente.
- Lave las células fijas tres veces con PBS.
- Agregue una cantidad mínima de medio de montaje de fluorescencia en una diapositiva de vidrio del microscopio. Transfiera cuidadosamente el cubreobjetos de la placa de 12 pocillos al medio de montaje con la muestra mirando hacia el portaobjetos de vidrio.
NOTA: Selle el borde de la cubierta con esmalte de uñas si se utiliza un medio de montaje acuoso.
5. Medición del crecimiento de Neurita
- Utilice un objetivo de 40x para capturar imágenes utilizando un microscopio epifluorescente.
- Captura imágenes de al menos 40 neuronas intactas con señal EGFP por transfección.
- Abra la imagen capturada en el software ImageJ con el plugin NeuronJ11 para medir la longitud de la neurita más larga, desde el cuerpo celular hasta la punta del cono de crecimiento, de cada neurona con imagen.
- Analizar los datos obtenidos con el software para determinar el efecto de las proteínas objetivo en el crecimiento de neurita.
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Representative Results
Para probar esta metodología, utilizamos Cyto D y factor de crecimiento nervioso NGF, que se ha demostrado para inhibir y estimular el crecimiento de neurita respectivamente14,15,16. La longitud de neurita de las neuronas transtrófilos o infectadas por la EFP se midió después del tratamiento con Cito D o NGF. La eficiencia de transfección de EGFP a las neuronas fue del 2,7% (1.068 neuronas contadas). Como se muestra en la Figura 1A, Cyto D suprimió la extensión de la neurita de una manera dependiente de la dosis. Por el contrario, el crecimiento de neurita se potenciaba en las neuronas tratadas con NGF(Figura 1B).
A continuación, investigamos la utilidad de este sistema mediante la transfección del adaptador neuronal FE65, que se ha demostrado para promover el crecimiento de neurita. Las neuronas corticales de ratas primarias fueron co-infectadas con FE65 y EGFP. A pesar de la baja eficiencia de transfección, el análisis de inmunofluorescencia reveló que más del 80% de las neuronas fueron co-transclostrasadas con éxito con EGFP y FE65(Figura 2A). Al igual que los informes anteriores8,9, FE65 estimuló significativamente el crecimiento de neurita por 2x(Figura 2B). También analizamos la expresión de EGFP y FE65 en diferentes puntos de tiempo mediante el análisis de manchas occidentales. Como se muestra en la Figura 2C,EGFP y FE65 se detectaron 6 h y 12 h después de la transfección, respectivamente. Se observaron niveles de expresión similares de las proteínas en 1 d a 7 d neuronas post-transfección. Esto indica que el análisis del crecimiento de neurita podría hacerse tan pronto como 6 h después de la transfección o en neuronas más maduras. Juntos, estos datos sugieren que el protocolo mencionado es adecuado para determinar el papel de las proteínas reguladoras de crecimiento de neurita putativa por transfección clásica.
También monitoreamos el efecto de la dosificación génica en el crecimiento de neurita mediante la transfección de neuronas corticales de rata primaria con diferentes cantidades de ADN plásmido FE65. Como se muestra en la Figura 2D, se observó un aumento dependiente de la dosis en la extensión de la neurita de 0 a 0,5 g de ADN de plásmido FE65. Sin embargo, no hubo diferencia significativa entre las neuronas transfectó con 0,5 g o 1 g de ADN de plásmido(Figura 2D).
Figura 1: El crecimiento de neurita es modulado por Cyto D y NGF. Las neuronas corticales de ratas E18 fueron transfectó en DIV2 con un vector de expresión EGFP. 6 h después de la transfección, las células fueron tratadas con (A) 0-0,5 g/mL Cyto D o (B) 0-100 ng/mL NGF durante 24 h. Entonces las neuronas fueron fijas e imágenes en consecuencia. Las imágenes fueron capturadas con un objetivo de 40x utilizando un microscopio de epifluorescencia y la longitud de la neurita más larga desde el cuerpo celular hasta la punta del cono de crecimiento se midió mediante el uso de ImageJ con el plugin NeuronJ. Se realizaron tres experimentos independientes y se midieron al menos 40 neuronas en cada grupo. El gráfico de barras mostraba el cambio de pliegue en la longitud media de la neurita. Se adoptó una prueba t no emparejada para el análisis estadístico. *p < 0.001, **p < 0.05. Barras de error : S.E.M. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: FE65 estimula el crecimiento de la neurita. Las neuronas corticales de ratas E18 fueron transfectó en DIV2 con control vectorial vacío (EV) o FE65 junto con un vector de expresión EGFP. Las células se fijaron e imágenes 24 h después de la transfección. (A) Las neuronas transfectó con anticuerpos anti-FE65 y se contó el número de células con EGFP o FE65 transpiradas por separado por separado y CO-transinfectas EGFP + FE65. Se realizaron tres experimentos independientes y se contaron al menos 100 células en cada experimento. Los datos se expresaron como el porcentaje de células con señales EGFP y EGFP + FE65. *p < 0.001. Barras de error - S.D. (B) La longitud de la neurita más larga desde el cuerpo de la célula hasta la punta del cono de crecimiento se midió mediante el uso de ImageJ con el complemento NeuronJ. Las imágenes representativas de las neuronas se mostraron en el panel derecho. FE65 fue manchado por un anticuerpo anti-FE65 de cabra como se describe8,17. Se realizaron tres experimentos independientes y se midieron al menos 40 neuronas por transfección. El gráfico de barras mostraba el cambio de pliegue en la longitud media de la neurita. Los datos fueron analizados mediante pruebas t no emparejadas. *p < 0.001. Barras de error: Barra de escala S.E.M.(C)Análisis de la mancha occidental de la expresión de los niveles de EGFP y FE65 en los puntos de tiempo posteriores a la transfección, como se indica. EGFP y FE65 fueron detectados por mouse anti-GFP y anti-myc (a fe65 C-terminal myc tag), respectivamente. (D) La longitud media de neurita de las neuronas transmedianas con varias cantidades de ADN plásmido FE65 como se indica. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando pruebas de ANOVA unidireccionales con la prueba post-hoc de Bonferroni. *p < 0.001, **p < 0.05. Barras de error: Barra de escala S.E.M. a 10 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Como se ha dicho antes, PC12 y sus subclones son ampliamente empleados para el estudio de la extensión de neurita porque tienen una excelente eficiencia de transfección2,3. Por el contrario, las neuronas primarias tienen una baja tasa de transfección, que es un obstáculo importante para el estudio de los reguladores de crecimiento de neurita por transfección7. Aquí, describimos un protocolo conveniente para cuantificar el crecimiento de neurita en las neuronas primarias. A pesar de la baja eficiencia general de transfección, más del 80% de las neuronas transtrinfectadas fueron co-infectadas con éxito con las dos proteínas: FE65 y EGFP(Figura 2A). Por lo tanto, mediante el análisis de las neuronas etiquetadas EGFP, el efecto de FE65 en el crecimiento de neurita podría determinarse con precisión(Figura 2B).
Otra ventaja del enfoque basado en EGFP descrito es que se puede omitir la tinción de inmunofluorescencia. La tinción de inmunofluorescencia de Tuj 1, una neurona específica de la clase III de la tubulina, se emplea ampliamente como marcador morfológico cuando se estudia el alargamiento de neurita18,19,20,21. Además del Tuj 1, se requiere la tinción del PDI para la identificación de las neuronas transfectóte19,22,23. Se sabe que la consistencia de la tinción de inmunofluorescencia, que es crucial para la medición del crecimiento de neurita, se ve afectada por muchos factores, incluyendo la preparación de muestras y anticuerpos24. Por lo tanto, la simplicidad general del método basado en EGFP podría mejorar la precisión del ensayo.
En nuestro protocolo, las neuronas se fijan para la medición de neurita 24 h después de la transfección. Por lo tanto, las neuronas se exponen al reactivo de transfección durante 24 horas. Se sabe desde hace mucho tiempo que los reactivos de transfección son tóxicos para las células25. Si es necesario determinar el efecto del PDI en la extensión de la neurita más allá del DIV3, la reposición media fresca puede ayudar a minimizar la toxicidad. Además, se pueden considerar métodos alternativos de administración de genes como la coprecipitación de fosfato Ca2+ y la nucleofección, que han demostrado tener un efecto menos tóxico en las células26. Además, aquí mostramos que el efecto más alto de FE65 en el crecimiento de neurita se observa en las neuronas infectadas con ese 0,5 g de FE65 y 0,5 g de plásmidos de EGFP mediante el uso de 1 l de reactivo de transfección. Para otros PDI, las cantidades óptimas de ADN plásmido y reactivos de transfección deben determinarse, ya que las proteínas tienen tasas de rotación muy diferentes.
Además del método de administración de genes, la densidad celular es otro parámetro crítico a tener en cuenta. Si la densidad de las neuronas es demasiado alta, se hace difícil identificar los orígenes de los neurótesis, ya que se superponen entre sí. Aunque las células de chapado a baja densidad pueden resolver el problema, la supervivencia de las neuronas primarias se reduciría significativamente a una densidad celular baja27. Se ha demostrado que las neuronas del hipocampo de ratas primarias crecen saludablemente a la densidad entre 40.000 y 100.000/cm2 28. En este protocolo, se utiliza una densidad de 65.000/cm2 de neuronas corticales de rata. Sin embargo, es importante determinar la densidad celular adecuada para diferentes tipos de neuronas bajo diferentes condiciones experimentales.
La medición de neurita del desarrollo de neuronas primarias de rata (es decir, neuronas DIV3) se describe aquí. Sin embargo, fenotipos neuronales más maduros se pueden observar en neuronas más allá de DIV329. Como los efectos de los PDI o fármacos en la extensión de la neurita en las neuronas maduras pueden ser diferentes de las neuronas en desarrollo, la investigación mediante el uso de neuronas de diferentes etapas proporcionaría una perspectiva más completa. Vale la pena señalar que todavía fuimos capaces de observar la expresión de EGFP en las neuronas 7 d post-transfección. Esto puede facilitar el estudio de PDI o fármacos en el crecimiento de neurita en neuronas maduras.
Las neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas por el hombre (hiPSC) son herramientas valiosas para identificar nuevos enfoques terapéuticos. Por ejemplo, la investigación del crecimiento de neurita en estas células podría revelar nuevos objetivos en neuroregeneración, ya que el uso de neuronas derivadas de hiPSC evita las diferencias de especies. Al igual que las neuronas de roedores primarios, las neuronas derivadas de hiPSC son difíciles de transfectar30, lo que puede reducir la eficiencia de co-transfección de EGFP y el PDI. Por lo tanto, el uso de vectores de expresión de mamíferos policistricos podría garantizar que todas las células transcretivas expresen todo el conjunto de genes transinfectados, incluidos EGFP y PDI. Además, los métodos alternativos de administración de genes, como la electroporación, pueden mejorar la eficiencia de la transfección. Una vez más, la viabilidad celular es un problema que debe tenerse en cuenta al utilizar estos enfoques de administración de genes.
Se sabe que la corteza cerebral embrionaria de rata contiene diferentes tipos de neuronas incluyendo neuronas estelares espinosas, neuronas bipolares y neuronas de largo proyección31. Si bien este protocolo aquí establecido puede revelar el efecto general de los PDI en el crecimiento de la neutralidad, es posible que el mismo PDI pueda exhibir diferentes respuestas en diferentes tipos de neuronas. Por ejemplo, la miostatina aumenta el número de axónicos sensoriales, pero no el de los axónicos motores32. En tal escenario, la modificación del protocolo es necesaria, como el aislamiento previo de tipos específicos de neuronas por citometría de flujo. Alternativamente, se pueden utilizar anticuerpos de marcadores neuronales específicos para la identificación de los tipos requeridos de neuronas durante la toma de imágenes.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses con el contenido de este artículo.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por fondos del Consejo de Becas de Investigación Hong Kong, Health and Medical Research Fund (Hong Kong), el esquema de subvenciones directas CUHK, el fondo de dotación de United College y el TUYF Charitable Trust.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 tweezers | Regine | 5-COB | |
| 18 mm Circle Cover Slips | Thermo Scientific | CB00180RA | Sterilize before use |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| Cytochalasin D | Invitrogen | PHZ1063 | Dissolved in DMSO |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dissecting Scissors, 10 cm | World Precision Instruments | 14393 | |
| Dissecting Scissors, 12.5 cm | World Precision Instruments | 15922 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| Fluorescence Mounting Medium | Dako | S302380 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| NGF 2.5S Native Mouse Protein | Gibco | 13257019 | |
| Nugent Utility Forceps, 10 mm, Straight Tip | World Precision Instruments | 504489 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| pEGFP-C1 | Clontech | #6084-1 | |
| pCI FE65 | Please see references 8 and 15 | ||
| PBS Tablets | Gibco | 18912014 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Spatula | Sigma-Aldrich | S4147 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 |
References
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