Summary
Bu yazıda, EGFP ve ilgi proteini ile birlikte transfekting tarafından embriyonik sıçan kortikal nöronlarda neurite büyüme incelenmesi için basit bir protokol açıklanmıştır.
Abstract
Neurite büyüme sinir sistemi gelişimi sırasında nöral devrelerin oluşumunda temel bir olaydır. Şiddetli nötrit hasarı ve sinaptik disfonksiyon çeşitli nörodejeneratif hastalıklarda ve yaşa bağlı dejenerasyonda meydana gelir. Neurite büyümesini düzenleyen mekanizmaların araştırılması sadece beyin gelişim süreçlerine değil, aynı zamanda bu tür nörolojik bozukluklara da değerli Bir ışık tutamaz. Düşük transfeksiyon verimliliği nedeniyle, şu anda birincil memeli nöronlarda nörit büyüme üzerinde belirli bir proteinin etkisini incelemek zordur. Burada, egfp ve ilgi bir protein (POI) ile birincil sıçan kortikal nöronların co-transfeksiyon tarafından neurite outgrowth soruşturma için basit bir yöntem açıklar. Bu yöntem, EGFP sinyali ile POI transfected nöronların belirlenmesini sağlar, ve böylece neurite outgrowth poi etkisi tam olarak belirlenebilir. Bu EGFP tabanlı test, neurite büyümesini düzenleyen yolların araştırılması için uygun bir yaklaşım sağlar.
Introduction
Hem aksonlar hem de dendritler de dahil olmak üzere nöritler, nöral ağların kurulmasında rol oynayan nöronların projeksiyonlarıdır. Nöritlerin dinamik büyümesi nörogelişim için gereklidir. Ancak, altında yatan düzenleyici mekanizmalar belirsizliğini koruyor. Özellikle, neurite hasar genellikle çeşitli nörodejeneratif hastalıklarda gözlenen ve beyin yaralanmalarısonra 1. Bu nedenle, çeşitli neurite outgrowth düzenleyici yollarda putatif moleküllerin rollerinin araştırılması süreci anlayışımızı artıracaktır. Ayrıca, çeşitli nörolojik bozukluklar için yeni terapötik hedefler ortaya çıkarabilir. Nöronal hücre hatları onlar işlemek ve transfectkolayolduğu gibi neurite outgrowth dahil olmak üzere nöronal süreçleri incelemek için değerlimodellerdir 2 ,3. Ancak, genetik sürüklenme bazı yaygın olarak kullanılan hücre hatları meydana bildirilmiştir, onların fizyolojik yanıtları varyasyonları yol açabilir4. Ayrıca nöronal hücre hatları ile primer nöronlar arasında diferansiyel protein ekspresyonu gösterilmiştir. Örneğin, PC12, yaygın neuriteoutgrowth2 ,3, NMDA reseptörleri ifade etmez çalışma için kullanılan sıçan adrenal bezinden elde edilen bir nöronal hücre hattı5 . Ayrıca, birincil nöronlara göre nörotoksinlere fare nöroblastom hattı nöroblastom hattı nöro-2a azaltılmış yanıt bazı membran reseptörleri ve iyonkanallarınınifade eksikliği nedeniyle olduğu ileri sürülmuştur 6 . Bu nedenle, birincil nöronlar daha arzu edilen ve temsili bir model neurite outgrowth soruşturma için. Ancak, birincil nöronların kullanımı düşük transfeksiyon verimliliği7tarafından engellenir.
Burada, ilgi proteininin (POI) ve EGFP'nin birincil sıçan kortikal nöronlarına birlikte transfeksiyonunu içeren bir yöntemi tanımlıyoruz. EGFP başarılı transfeced nöronların belirlenmesi için bir morfolojik belirteç olarak davranır ve nöritlerin ölçümü sağlar. Bu yöntemi, netürit büyümesini modüle ettiği bildirilen bileşikler/moleküller kullanarak doğruladık. Ayrıca, FE65, neurite büyüme uyarmak için gösterilmiştir bir nöronal adaptör protein, Bu yaklaşım göstermek için kullanılmıştır8,9. Bu protokol (1) embriyonik gün 18 (E18) sıçan embriyolarından birincil kortikal nöronların izolasyonunu, (2) egfp ve POI (bu çalışmada FE65) ile nöronların birlikte transfeksiyonunu ve (3) görüntü işlemeyi kullanarak nöronların görüntülenme ve analizini içerir. NeuronJ eklentisi ile yazılım ImageJ10,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Takip edilen tüm prosedürler, Hong Kong Çin Üniversitesi hayvan deneyleri etik komitesinin etik standartlarına uygun du.
1. Kapak Kapaklarının Hazırlanması
- 12 kuyulu doku kültürü plakasının her kuyunun içine steril 18 mm'lik dairesel bir kapak yerleştirin.
- En az 1 saat nemlendirilmiş 37 °C inkübatörde 5 μg/mL poli-D-lizin çözeltisi ile örtüyü kaplayın.
- Poli-D-lizin çözeltisini doku kültür plakasından aspire edin ve kaplamalı kapakları steril suyla bir kez durulayın.
2. Sıçan Embriyonik Nöron Diseksiyonu
- 18 günlük gebelik yaşında (E18) zamanlanmış hamile bir Sprague-Dawley sıçanını servikal çıkığı veya CO2 boğulması ile kurban edin.
NOT: Lütfen hamile farelerin kurban için yerel düzenlemeleri kontrol edin. - Gebe sıçanın karın boşluğunu makasla açın ve rahmi 10 cm Petri kabına aktarın.
- Küçük diseksiyon makasla rahmi ve amniyotik keseyi dikkatlice açın ve küçük diseksiyon makasla sıçan embriyosundaki plasentayı çıkarın. Bir çift küçük forsep sinif kullanarak tüm embriyoyu 10 cm'lik petri kabına glukoz (PBS-glukoz, 10 mM sodyum fosfat, 2,68 mM potasyum klorür, 140 mM sodyum klorür ve 3 g/L glukoz) ile takviye edilmiş önceden soğutulmuş fosfat lı bir kabına aktarın.
- Kafatasının sagittal sütür boyunca kesin ve küçük diseksiyon makas bir çift ile dikkatlice açın. Küçük bir düz spatula ile embriyonik beyin transferi buz gibi PBS-glikoz ile 10 cm Petri çanak.
- Bir diseksiyon mikroskobu altında iki #5 cımbız kullanarak beyincik ve beyin sapından iki serebral hemisfer ayırın.
NOT: Fare beyninin yapısı için lütfen referans12'ye bakın. - #5 cımbız kullanarak menenjler çıkarın.
- Korteksi serebral hemisferlerden iki #5 cımbızla ayırın.
- İzole korteksi 15 mL'lik bir santrifüj tüple buz gibi PBS-glikoza aktarın.
3. Primer Kortikal Nöron Kültürü
NOT: 3 ve 4.
- İzole korteksi 4 °C'de 5 dk için yer çekimine göre yerleştirin ve PBS-glukoza aspire edin.
- İzole kortekse %0,05 Tripsin-EDTA 1 mL ekleyin ve enzimatik sindirime izin vermek için 37 °C'lik bir su banyosunda 10 dakika boyunca dokuya dokunarak ve kuluçkaya yatırarak hafifçe karıştırın. Her 2 dakikada bir karıştırmak için tüpü hafifçe dokunun.
- Doku/tripsin karışımına 4 mL bakım ortamı (örn. Nörobazal Orta) ekleyin.
NOT: Bu protokolde kullanılan tüm bakım ortamı Penisilin-Streptomisin ve B-27 ek13ile desteklenmektedir. - 1 mL pipet kullanarak triturasyon ile dokuyu hafifçe ayırın.
- Pelet 5 dk. Supernatant aspire için 200 x g santrifüj tarafından ayrıştırılmış hücreler.
- 3,5 ile 3,7 arası adımları iki kez tekrarlayın.
- 1 mL bakım ortamında hücre peletini yeniden askıya alın.
- Hemositometre ile canlı hücrelerin saylanması için hücre süspansiyonunun 10 μL'sine %0,4 Trypan Blue çözeltisi ekleyin.
- 12 kuyulu bir plakada her kuyuda 1 mL bakım ortamında 65.000/cm2 (canlı hücreler) yoğunluktaki nöronları plakalayın.
4. Hücre Transfeksiyonu ve Fiksasyonu
- 2 gün in vitro (DIV2), transfect 0.5 g EGFP yapı (pEGFP-C1) ile birlikte veya 0.5g POI olmadan transfeksiyon reaktifi 1 μL kullanarak nöronlara (örneğin, Lipofektamine 2000). Üreticinin yönergelerini kullanın.
NOT: Endotoksin içermeyen plazmid hazırlama kiti kullanılarak memeli ekspresyonu yapılar hazırlanmıştır. Transfeksiyon sonrası 6 saat te kimyasallar/moleküller (bu el yazması sitodizin D (Cyto D) ve sinir büyüme faktörü (NGF) kullanılmıştır) ile tedavi yapılabilir. - Transfeksiyon sonrası kültür ortamını 24 saat aspiratve 37 °C PBS (10 mM sodyum fosfat, 2,68 mM potasyum klorür, 140 mM sodyum klorür) ile yıkayın.
- Oda sıcaklığında karanlıkta 10 dakika pbs% 4 paraformaldehit ile hücreleri düzeltin.
- Sabit hücreleri PBS ile üç kez yıkayın.
- Mikroskop cam slayt üzerinde floresan montaj ortamı az miktarda ekleyin. Kapak kaymasını 12 kuyulu plakadan cam kaydırağa bakan numuneyle montaj ortamına dikkatlice aktarın.
NOT: Sulu bir montaj ortamı kullanılıyorsa, kapağın kenarını oje ile kapatın.
5. Neurite Büyümeölçümü
- Epi-floresan mikroskobu kullanarak görüntüleri yakalamak için 40 x'lik bir hedef kullanın.
- Transfeksiyon başına EGFP sinyali ne kadar az 40 bozulmamış nörondan görüntüler yakalayın.
- En uzun nöritin uzun luğunu ölçmek için NeuronJ eklentisi11 ile ImageJ yazılımında yakalanan görüntüyü açın, hücre gövdesinden büyüme konisinin ucuna, her görüntülenmiş nöronun ucuna kadar.
- Hedeflenen proteinlerin neurite büyümedeki etkisini belirlemek için yazılımla elde edilen verileri analiz edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu metodolojiyi test etmek için, sito D ve sinir büyüme faktörü NGF, sırasıyla inhibe ve nötrit büyümesini uyarmak için gösterilmiştir14,15,16kullanılır. EGFP ile transfektör lüznit uzunluğu Cyto D veya NGF ile tedavi edildikten sonra ölçüldü. EGFP'nin nöronlara transfeksiyon verimi %2.7 (1.068 nöron sayıldı) idi. Şekil 1A'dagösterildiği gibi, Cyto D doza bağımlı bir şekilde nötrit uzantısını bastırmıştır. Tersine, nstf ile tedavi nöronlarda nötrit büyüme potentiated oldu (Şekil 1B).
Daha sonra, nöronal adaptör FE65 transfecting tarafından bu sistemin yarar araştırılmış, hangi neurite büyüme teşvik gösterilmiştir. Primer sıçan kortikal nöronlar FE65 ve EGFP ile birlikte transfected edildi. Düşük transfeksiyon etkinliğine rağmen, immün-floresan analizi nöronların %80'inden fazlasının EGFP ve FE65 ile başarılı bir şekilde transfeced olduğunu ortaya koymuştur(Şekil 2A). Önceki raporlara benzer8,9, FE65 önemli ölçüde 2x(Şekil 2B)tarafından nötrit büyüme uyarılmış . EGFP ve FE65'in farklı zaman noktalarındaki ifadesini de Batı leke analizi ile analiz ettik. Şekil 2C'degösterildiği gibi, EGFP ve FE65 sırasıyla 6 h ve 12 h post-transfection saptadı. Proteinlerin benzer ekspresyon düzeyleri transfeksiyon sonrası nöronlarda 1 d-7 d'de gözlendi. Bu, neurite outgrowth analizi gibi erken yapılabilir gösterir 6 saat post-transfection veya daha olgun nöronlarda. Bu veriler birlikte, söz konusu protokolün klasik transfeksiyon ile putatif neurite outgrowth düzenleyici proteinlerin rolünü belirlemek için uygun olduğunu göstermektedir.
Ayrıca fe65 plazmid DNA farklı miktarlarda primer sıçan kortikal nöronlar transfecting tarafından neurite outgrowth üzerinde gen dozajı etkisini izledi. Şekil 2D'degösterildiği gibi, 0 - 0.5 μg FE65 plazmid DNA'sında nörit uzantısında doza bağlı bir artış gözlendi. Ancak 0.5 g veya 1 μg plazmid DNA ile transfekte olan nöronlar arasında anlamlı bir fark yoktu (Şekil 2D).
Şekil 1: Neurite büyüme Cyto D ve NGF tarafından modüle edilir. E18 sıçan kortikal nöronlar Div2 üzerinde EGFP ekspresyon vektörü ile transfekslendi. 6 saat transfeksiyon sonrası, hücreler (A) 0-0.5 μg/mL Cyto D veya (B) 0-100 ng/mL NGF ile 24 saat tedavi edildi. Sonra nöronlar sabit ve buna göre görüntülendi. Görüntüler epi-floresan mikroskobu kullanılarak 40x objektif olarak çekildi ve hücre gövdesinden büyüme konisinin ucuna kadar en uzun nörit uzunluğu NeuronJ eklentisi ile ImageJ kullanılarak ölçüldü. Her grupta üç bağımsız deney yapıldı ve en az 40 nöron ölçüldü. Çubuk grafik ortalama neurite uzunluğu kat değişikliği gösterdi. İstatistiksel analiz için eşleşmemiş t-testi kabul edilmiştir. *p < 0.001, **p < 0.05. Hata çubukları = S.E.M. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: FE65 neurite büyümesini uyarır. E18 sıçan kortikal nöronlar div2 üzerinde boş vektör kontrolü (EV) veya FE65 ile birlikte EGFP ekspresyon vektörü ile transfektasyon yapıldı. Hücreler transfeksiyondan sonra 24 saat sabitlendi ve görüntülendi. (A)Transfected nöronlar anti-FE65 antikor ile karşılanmış ve EGFP veya FE65 tekil transfected ve EGFP + FE65 eş transfected olan hücrelerin sayısı sayılmıştır. Üç bağımsız deney yapıldı ve her deneyde en az 100 hücre sayıldı. Veriler EGFP ve EGFP + FE65 sinyallerine sahip hücrelerin yüzdesi olarak ifade edildi. *p < 0.001. Hata çubukları = S.D. (B) Hücre gövdesinden büyüme koninin ucuna kadar olan en uzun neuritin uzunluğu NeuronJ eklentisi ile ImageJ kullanılarak ölçüldü. Temsili nöron görüntüleri sağ panelde gösterilmiştir. FE65 bir keçi anti-FE65 antikor olarak açıklandığı gibi lekelioldu 8,17. Transfeksiyon başına üç bağımsız deney yapıldı ve en az 40 nöron ölçüldü. Çubuk grafik ortalama neurite uzunluğu kat değişikliği gösterdi. Veriler eşleşmemiş t-testi ile analiz edildi. *p < 0.001. Hata çubukları = S.E.M. Ölçek çubuğu = 10 μm. (C) Batı leke analizinde EGFP ve FE65 seviyelerinin transfeksiyon sonrası zaman noktalarında ifade edilebisi belirtilir. EGFP ve FE65 sırasıyla fare anti-GFP ve anti-myc (FE65 C-terminal myc etiketi) tarafından tespit edildi. (D) Nöronların ortalama neurit uzunluğu, belirtildiği gibi çeşitli miktarlarda FE65 plazmid DNA ile transfected. Bonferroni post-hoc testi ile tek yönlü ANOVA testleri kullanılarak istatistiksel analizler yapıldı. *p < 0.001, **p < 0.05. Hata çubukları = S.E.M. Ölçek çubuğu = 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Daha önce de belirtildiği gibi, PC12 ve subklonları yaygın olarak neurite uzantısı çalışmak için istihdam çünkü mükemmel transfeksiyon verimliliği2,3. Buna karşılık, birincil nöronlar düşük transfeksiyon hızıvar, transfeksiyon7ile neurite outgrowth regülatörleri incelenmesi için önemli bir engeldir. Burada, birincil nöronlarda nötrit büyümesini ölçmek için uygun bir protokol uyguluyoruz. Düşük genel transfeksiyon etkinliğine rağmen transfected nöronların %80'inden fazlası iki proteinle başarılı bir şekilde birlikte transfeced idi: FE65 ve EGFP(Şekil 2A). Bu nedenle, EGFP etiketli nöronları analiz ederek, FE65'in neurite büyüme üzerindeki etkisi kesin olarak belirlenebilir (Şekil 2B).
Açıklanan EGFP tabanlı yaklaşımın bir diğer avantajı da immünororesans boyamanın atlanabildiğidir. Nomünofloresan boyama Tuj 1, bir nöron özgü sınıf III β-tubulin, yaygın olarak neurite uzama18,19,20,21incelerken morfolojik belirteç olarak istihdam edilmektedir. Tuj 1 ek olarak, POI boyama transfected nöronların belirlenmesi için gereklidir19,22,23. Bu immünüfüoresans boyama tutarlılığı, hangi neurite outgrowth ölçümü için çok önemlidir, örnek hazırlanması ve antikorlar dahil olmak üzere birçok faktörden etkilenir bilinmektedir24. Bu nedenle, EGFP tabanlı yöntemin genel basitliği testin doğruluğunu artırabilir.
Protokolümüzde nöronlar transfeksiyon sonrası 24 saat nörit ölçümü için sabitlenir. Böylece, nöronlar transfeksiyon reaktifi maruz 24 saat. Transfeksiyon reaktiflerinin hücreler için toksik olduğu uzun zamandır bilinmektedir25. İçN'nin nisute uzantısı üzerindeki etkisinin DIV3'ün ötesinde belirlenmesi gerekiyorsa, taze ortam ikmali toksisiteyi en aza indirmeye yardımcı olabilir. Ayrıca, alternatif gen iletim yöntemleri Ca2+ fosfat ko-çökeltme ve nükleofeksiyon gibi düşünülebilir, her ikisi de hücreler için daha az toksik etkisi olduğu gösterilmiştir26. Ayrıca burada, FE65'in nörit büyümesi üzerindeki en yüksek etkisinin, 1 μL transfeksiyon reaktifi kullanılarak 0,5 g FE65 ve 0,5 g EGFP plazmidi ile transfece edilen nöronlarda gözlendiğini gösteriyoruz. Diğer İçN'ler için, proteinlerin çok farklı ciro oranlarına sahip olduğu için optimal miktarda plazmid DNA ve transfeksiyon reaktifleri belirlenmelidir.
Gen iletim yöntemine ek olarak, hücre yoğunluğu dikkate alınması gereken bir diğer kritik parametredir. Nöron yoğunluğu çok yüksekse, birbirleriyle çakışacak gibi nöritlerin kökenini belirlemek zor olur. Düşük yoğunlukta kaplama hücreleri sorunu çözebilir rağmen, primer nöronların sağkalım önemli ölçüde düşük hücre yoğunluğu azalacaktır27. Primer sıçan hipokampal nöronlar arasında yoğunlukta sağlıklı büyümek gösterilmiştir 40,000 için 100,000/cm2 28 . Bu protokolde sıçan kortikal nöronlarının yoğunluğu 65.000/cm 2'dir. Bununla birlikte, farklı deneysel koşullar altında nöronların farklı türleri için uygun hücre yoğunluğunu belirlemek önemlidir.
Gelişmekte olan sıçan primer nöronların (yani DIV3 nöronların) nötriit ölçümü burada açıklanmıştır. Ancak, daha olgun nöronal fenotipler DIV329ötesinde nöronların görülebilir. Olgun nöronlarda nisi veya ilaçların nötron uzantısı üzerindeki etkileri gelişmekte olan nöronlardan farklı olabileceğinden, farklı aşamalardan gelen nöronları kullanarak araştırma daha kapsamlı bir bakış açısı sağlayacaktır. Biz hala nöronlar EGFP ekspresyonu gözlemlemek mümkün olduğunu kayda değer 7 d post-transfeksiyon. Bu olgun nöronlarda nöral outgrowth üzerinde İçN'ler veya ilaçların çalışmasını kolaylaştırabilir.
İnsan indüklenen pluripotent kök hücre (hiPSC) türetilmiş nöronlar yeni terapötik yaklaşımların belirlenmesinde değerli araçlardır. Örneğin, hiPSC kaynaklı nöronların kullanımı tür farklılıklarını önlüyor gibi bu hücrelerde neurite outgrowth incelenmesi nörojenerasyon yeni hedefler ortaya çıkarabilir. Birincil kemirgen nöronların benzer, hiPSC türetilmiş nöronlar transfect zordur30, Hangi EGFP ve POI co-transfection verimliliğini azaltabilir. Bu nedenle, polikistronik memeli ekspresyon vektörlerinin kullanımı tüm transfected hücrelerin EGFP ve İçN'ler de dahil olmak üzere transfected genlerin tüm kümesini ifade sağlamak sağlayabilir. Ayrıca, elektroporasyon gibi alternatif gen dağıtım yöntemleri transfeksiyon verimliliğini artırabilir. Yine, hücre canlılığı bu tür gen iletim yaklaşımları kullanırken göz önünde bulundurulması gereken bir konudur.
Bu sıçan embriyonik beyin korteks dikenli stellat nöronlar, bipolar nöronlar ve uzun projektörler31dahil olmak üzere nöronların farklı türleri içerdiği bilinmektedir . Burada belirtilen bu protokol İçN'lerin nörit büyümesi üzerindeki genel etkisini ortaya çıkarsa da, aynı İçN'in farklı nöron türlerinde farklı tepkiler göstermesi mümkündür. Örneğin, miyostatin duyusal akson sayısını artırır ama motor akson ların sayısını artırır32. Böyle bir senaryoda, protokol modifikasyonu gereklidir, örneğin akış sitometrisi tarafından belirli nöronların önceden izole edilmesi gibi. Alternatif olarak, görüntüleme sırasında gerekli nöron türlerinin belirlenmesinde spesifik nöronal marker antikorlar kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, bu makalenin içeriği ile çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma Araştırma Hibekonseyi Hong Kong, Sağlık ve Tıbbi Araştırma Fonu (Hong Kong), CUHK doğrudan hibe programı, United College bağış fonu ve TUYF Charitable Trust fonları tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #5 tweezers | Regine | 5-COB | |
| 18 mm Circle Cover Slips | Thermo Scientific | CB00180RA | Sterilize before use |
| B27 Supplement | Gibco | 17504044 | |
| Cytochalasin D | Invitrogen | PHZ1063 | Dissolved in DMSO |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Dissecting Scissors, 10 cm | World Precision Instruments | 14393 | |
| Dissecting Scissors, 12.5 cm | World Precision Instruments | 15922 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| Fluorescence Mounting Medium | Dako | S302380 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| NGF 2.5S Native Mouse Protein | Gibco | 13257019 | |
| Nugent Utility Forceps, 10 mm, Straight Tip | World Precision Instruments | 504489 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| pEGFP-C1 | Clontech | #6084-1 | |
| pCI FE65 | Please see references 8 and 15 | ||
| PBS Tablets | Gibco | 18912014 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Spatula | Sigma-Aldrich | S4147 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 |
References
- Kaplan, A., Bueno, M., Hua, L., Fournier, A. E. Maximizing functional axon repair in the injured central nervous system: Lessons from neuronal development. Developmental Dynamics. 247 (1), 18-23 (2018).
- Harrill, J. A., Mundy, W. R. Quantitative assessment of neurite outgrowth in PC12 cells. Methods in Molecular Biology. 758, 331-348 (2011).
- Yeyeodu, S. T., Witherspoon, S. M., Gilyazova, N., Ibeanu, G. C. A rapid, inexpensive high throughput screen method for neurite outgrowth. Current Chemical Genomics. 4, 74-83 (2010).
- Ben-David, U., et al. Genetic and transcriptional evolution alters cancer cell line drug response. Nature. 560 (7718), 325-330 (2018).
- Edwards, M. A., Loxley, R. A., Williams, A. J., Connor, M., Phillips, J. K. Lack of functional expression of NMDA receptors in PC12 cells. Neurotoxicology. 28 (4), 876-885 (2007).
- LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies. Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. Journal of Neuroscience. 30 (18), 6171-6177 (2010).
- Cheung, H. N., et al. FE65 interacts with ADP-ribosylation factor 6 to promote neurite outgrowth. The FASEB Journal. 28 (1), 337-349 (2014).
- Li, W., et al. Neuronal adaptor FE65 stimulates Rac1-mediated neurite outgrowth by recruiting and activating ELMO1. Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7674-7688 (2018).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry. Part A: the Journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).
- Swanson, L. W. Brain maps 4.0-Structure of the rat brain: An open access atlas with global nervous system nomenclature ontology and flatmaps. The Journal of Comparative Neurology. 526 (6), 935-943 (2018).
- Brewer, G. J. Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus. Journal of Neuroscience Research. 42 (5), 674-683 (1995).
- Yamada, K. M., Spooner, B. S., Wessells, N. K. Axon growth: roles of microfilaments and microtubules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 66 (4), 1206-1212 (1970).
- Casella, J. F., Flanagan, M. D., Lin, S. Cytochalasin D inhibits actin polymerization and induces depolymerization of actin filaments formed during platelet shape change. Nature. 293 (5830), 302-305 (1981).
- Calabrese, E. J. Enhancing and regulating neurite outgrowth. Critical Reviews in Toxicology. 38 (4), 391-418 (2008).
- Lau, K. F., et al. Dexras1 Interacts with FE65 to Regulate FE65-Amyloid Precursor Protein-dependent Transcription. Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34728-34737 (2008).
- Cui, X., et al. Niacin treatment of stroke increases synaptic plasticity and axon growth in rats. Stroke. 41 (9), 2044-2049 (2010).
- Khodosevich, K., Monyer, H. Signaling involved in neurite outgrowth of postnatally born subventricular zone neurons in vitro. BMC Neuroscience. 11, 18 (2010).
- Tang, F., et al. Resveratrol Enhances Neurite Outgrowth and Synaptogenesis Via Sonic Hedgehog Signaling Following Oxygen-Glucose Deprivation/Reoxygenation Injury. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 43 (2), 852-869 (2017).
- He, W., Liu, Y., Tian, X. Rosuvastatin Improves Neurite Outgrowth of Cortical Neurons against Oxygen-Glucose Deprivation via Notch1-mediated Mitochondrial Biogenesis and Functional Improvement. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 6 (2018).
- Tesarova, P., et al. Receptor for advanced glycation end products (RAGE)--soluble form (sRAGE) and gene polymorphisms in patients with breast cancer. Cancer Investigation. 25 (8), 720-725 (2007).
- Park, S. Y., et al. Hippocalcin Promotes Neuronal Differentiation and Inhibits Astrocytic Differentiation in Neural Stem Cells. Stem Cell Reports. 8 (1), 95-111 (2017).
- Radbruch, A. Immunofluorescence: Basic Considerations. Flow Cytometry and Cell Sorting. , Springer Lab Manual Book Series. 38-52 (2000).
- Wang, T., Larcher, L. M., Ma, L., Veedu, R. N. Systematic Screening of Commonly Used Commercial Transfection Reagents towards Efficient Transfection of Single-Stranded Oligonucleotides. Molecules. 23 (10), (2018).
- Sariyer, I. K. Transfection of neuronal cultures. Methods in Molecular Biology. 1078, 133-139 (2013).
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Research. 126 (3), 397-425 (1977).
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Further observations on hippocampal neurons in dispersed cell culture. The Journal of Comparative Neurology. 187 (3), 469-493 (1979).
- Biffi, E., Regalia, G., Menegon, A., Ferrigno, G., Pedrocchi, A. The influence of neuronal density and maturation on network activity of hippocampal cell cultures: a methodological study. PLoS One. 8 (12), e83899 (2013).
- Hiragi, T., et al. Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cell (hiPSC)-Derived Neurons in Mouse Hippocampal Slice Cultures. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 143 (2017).
- Zeng, H., Sanes, J. R. Neuronal cell-type classification: challenges, opportunities and the path forward. Nature Reviews. Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).
- Jones, M. R., Villalon, E., Northcutt, A. J., Calcutt, N. A., Garcia, M. L. Differential effects of myostatin deficiency on motor and sensory axons. Muscle & Nerve. 56 (6), E100-E107 (2017).
