Summary
Driedimensionaal co-Culture spheroid-systeem voor angiogenese is ontworpen om de fysiologische angiogenese na te bootsen. Co-Culture sferoïden worden gevormd door twee humane vasculaire celprecursoren, ecfcs en MSCS, en ingebed in collageen gel. Het nieuwe systeem is effectief voor het evalueren van angiogene modulatoren en verschaft relevantere informatie aan de in vivo studie.
Abstract
Studies op het gebied van angiogenese zijn in de laatste decennia agressief gegroeid met de erkenning dat angiogenese een kenmerk is van meer dan 50 verschillende pathologische aandoeningen, zoals reumatoïde artritis, oculopathie, cardiovasculaire aandoeningen , en tumor metastasen. Tijdens de ontwikkeling van angiogenese is het van cruciaal belang om in vitro assay systemen met geschikte celtypen en goede condities te gebruiken om het fysiologisch angiogenese proces weer te geven. Om de beperkingen van de huidige in vitro angiogenese assay systemen met behulp van voornamelijk endotheel cellen te overwinnen, ontwikkelden we een 3-dimensionaal (3D) Co-Culture spheroid kiemen assay systeem. Co-Culture sferoïden werden geproduceerd door twee humane vasculaire celprecursoren, endotheliale kolonie vormende cellen (ecfcs) en mesenchymale stamcellen (MSCS) met een ratio van 5 tot 1. Ecfcs + MSCS sferoïden werden ingebed in de type I collageenmatrix om de in vivo extracellulaire omgeving na te bootsen. Er werd een real-time celrecorder gebruikt om de progressie van angiogene kiemen van sferoïden gedurende 24 uur continu te observeren. er werd ook een live-cel fluorescerende etiketterings techniek toegepast om de lokalisatie van elk celtype tijdens kiemvorming te tracten. Het angiogene potentieel werd gekwantificeerd door het aantal kiemgroenten te tellen en de cumulatieve lengte van kiemgroenten die uit de individuele spheroïden voortvloeien te meten. Vijf willekeurig geselecteerde sferoïden werden per experimentele groep geanalyseerd. Vergelijkings experimenten toonden aan dat ecfcs + MSCS sferoïden een groter kiemgetal en een cumulatieve kiem lengte vertoonden in vergelijking met ecfcs-alleen sferioïden. Bevacizumab, een door de FDA goedgekeurde Angiogeneseremmer, werd getest met het nieuw ontwikkelde co-Culture spheroid assay-systeem om te controleren of het mogelijk is Anti-angiogene geneesmiddelen op te schermen. De IC50 -waarde voor ecfcs + MSCS-sferoïden in vergelijking met de ecfcs-alleen-sferoïden was dichter bij de effectieve plasmaconcentratie van Bevacizumab verkregen uit het xenotransplantaatmodellen is tumor muismodel. De huidige studie suggereert dat het 3D ECFCs + MSCs spheroid angiogenese systeem relevant is voor de fysiologische angiogenese en een effectieve plasmaconcentratie kan voorspellen vóór dier experimenten.
Introduction
Ongeveer 500.000.000 mensenwereld wijd wordt verwacht te profiteren van angiogenese-modulerende therapie voor vasculaire malformatie-geassocieerde ziekten zoals reumatoïde artritis, oculopathie, cardiovasculaire aandoeningen, en tumor metastasen1. De ontwikkeling van geneesmiddelen die angiogenese beheersen is dus uitgegroeid tot een belangrijk onderzoeksgebied in de farmaceutische industrie. Tijdens het proces van de ontwikkeling van de drug, in vivo dierlijke studie is nodig om te verkennen van de effecten van drugs kandidaten op fysiologische functies en systemische interacties tussen organen. Echter, ethische en kosten kwesties hebben de bezorgdheid over dierproeven verhoogd2. Daarom zijn verbeterde in vitro assay-systemen nodig om nauwkeurigere en voorspelbare gegevens te verkrijgen die leiden tot betere besluitvorming voor dierproeven. Huidige in vitro angiogenese assays meten meestal proliferatie, invasie, migratie of tubulaire structuur vorming van endotheliale cellen (ECs) in tweedimensionale (2D) cultuur platen3. Deze 2D angiogenese testen zijn snel, eenvoudig, kwantitatief en kosteneffectief, en hebben aanzienlijk bijgedragen aan de ontdekking van angiogenese-modulerende geneesmiddelen. Er moeten echter nog enkele kwesties worden verbeterd.
Dergelijke 2D in vitro assay-systemen kunnen geen complexe multi-step-gebeurtenissen van angiogenese weerspiegelen die in vivo fysiologische omstandigheden voorkomen, wat leidt tot onnauwkeurige resultaten die discrepanties veroorzaken tussen in vitro assay gegevens en resultaten van klinische proeven4. 2D cultuuromstandigheden induceren ook de verandering van cellulaire fenotypes. Bijvoorbeeld, na proliferatie in 2D cultuur platen, ECs hebben een zwakke cellulaire fenotype als gemanifesteerd door verminderde expressie van CD34 en verschillende signalen die mobiele reacties regelen5,6. Om de beperkingen van 2D-cultuurgebaseerde angiogenese systemen te overwinnen, zijn driedimensionale (3D) spheroid-testsystemen voor angiogenese ontwikkeld. Sprouting gevolgd door tubulaire structuur vorming van sferoïden gevormd door ECs reflecteren in vivo Neo-vascularisatie processen7,8. Zo is de 3D-spheroid-angiogenese test beschouwd als een effectief assay-systeem voor het screenen van potentiële Pro-of anti-angiogenese medicijnen.
De meeste 3D-spheroid-angiogenese-assays gebruiken alleen ECs, voornamelijk humane navelstreng-endotheelcellen (HUVECs) of humane dermale microvasculaire endotheliale cellen (HDMECs) om zich te concentreren op de cellulaire respons van ECs tijdens angiogenese. Echter, bloed capillairen zijn samengesteld uit twee celtypen: ECs en pericytes. Het uitwerken van bi-directionele interactie tussen ECs en pericytes is essentieel voor een goede vasculaire integriteit en functie. Verschillende ziekten, zoals erfelijke beroerte, diabetische retinopathie en veneuze malformatie, worden geassocieerd met veranderde pericyt dichtheid of verminderde pericyte gehechtheid aan het endotheel9. Pericytes zijn ook bekend als een belangrijk element van het angiogene proces. Pericytes worden gerekruteerd om nieuw gevormde scheeps structuren te stabiliseren door ECs. In dit opzicht bevat mono-Culture spheroid angiogenese test geen pericytes7,10. Daarom kan co-Culture sferoïden gevormd door ECs en pericytes een waardevolle benadering bieden voor het meer nabootsen van fysiologisch angiogene gebeurtenissen.
De huidige studie was gericht op het ontwikkelen van een 3D co-Culture spheroid-angiogenese test met een combinatie van humane endotheliale kolonie vormende cellen (ECFCs) en mesenchymale stamcellen (MSCs) om in vivo angiogenese nauwer te reflecteren. Co-Culture spheroid-systeem als een in vitro vertegenwoordiging van een normaal bloedvat werd voor het eerst vastgesteld door Korff et al. in 200111. Ze combineerden HUVECs en menselijke navel slagader gladde spiercellen (HUSMCs), en toonden aan dat de co-cultuur van twee volwassen vasculaire cellen het kiem potentieel verminderde. Volwassen ECs (huvecs) staan bekend om geleidelijk verliezen hun vermogen om te vermenigvuldigen en te differentiëren, die negatieve invloed hebben op hun angiogenese reacties12,13. Volwassen perivasculaire cellen (HUSMCs) kunnen leiden tot endotheliale celinactivatie door middel van de intrekking van de vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) responsiviteit11. Het belangrijkste verschil tussen Korff en ons co-Culture spheroid-systeem zijn de gebruikte celtypes. We hebben twee vasculaire precursoren, ECFCs en MSCs, toegepast om een juiste angiogenese testsysteem op te zetten om Pro-of-Anti-angiogene agentia te onderzoeken. ECFCs zijn de voorloper van ECs. ECFCs hebben een robuuste proliferatie capaciteit in vergelijking met volwassen ECs14, die het mogelijk maken om de beperking van ECs te overwinnen. Ecfcs dragen bij aan de vorming van nieuwe schepen in vele postnatale pathologische omstandigheden15,16,17. MSCS zijn pluripotente stamcellen die het vermogen hebben om te differentiëren in pericytes, wat bijdraagt aan angiogenese18,19.
In eerdere rapporten vertoonden ecfcs en MSCS synergetische effecten op in vitro buis vorming20, in vivo Neo-vascularisatie21,22, en verbeterde reperfusie van ischemische weefsels23,24. In de huidige studie werden ecfcs en MSCS gebruikt om co-Culture sferoïden te vormen en ingebed in type I collageen gel om een in vivo 3D-omgeving weer te geven. Collageen wordt beschouwd als een belangrijke bestanddelen van de extracellulaire matrix (ECM) rond ECs25. De ECM speelt een cruciale rol bij het reguleren van Celgedrag26. Het hier voorgestelde assay-protocol kan binnen twee dagen eenvoudig en snel worden uitgevoerd met behulp van gemeenschappelijke laboratoriumtechnieken. Voor effectieve celtracering tijdens het kiemen-proces kan elk celtype worden fluorescently gelabeld en bewaakt met behulp van een real-time celrecorder. Het nieuw opgerichte 3D co-Culture spheroid angiogenese systeem is ontworpen om de gevoeligheid voor het evalueren van potentiële angiogene modulatoren te verhogen en om voorspelbare informatie te verschaffen vóór in vivo onderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Menselijke ECFCs werden geïsoleerd van menselijk perifeer bloed zoals beschreven in een eerder verslag27. Kort, de mononucleaire cellaag werd gescheiden van het hele bloed met behulp van de Ficoll-PAQUE Plus, en gekweekt in het juiste medium totdat de endotheelachtige kolonies werden verschenen. Kolonies werden verzameld en ECFCs werden geïsoleerd met behulp van CD31 gecoate magnetische kralen. MSCs waren geïsoleerd van de aanhanger van de mononucleaire cel (MNC) van het humane volwassen beenmerg. Het studie protocol werd goedgekeurd door de institutioneel Review Board van de Duksung Women's University (IRB No. 2017-002-01).
1. celcultuur
-
Voorbereiding van ECFCs en MSCs medium en Coat Plates
- Bereid endotheliale celgroei medium MV2 (ECGM-MV2, behalve hydrocortison) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% glutamine-penicillaire-streptomycine (GPS).
- Bereid mesenchymale stamcel groeimedium-2 (MSCGM-2) met 10% FBS en 1% GPS.
- Voor de ECFC-cultuur, Coat de celkweek platen met 1% gelatine oplossing. Om 1% gelatine oplossing te bereiden, los 1 g gelatie poeder op in 500 mL PBS met de magnetische roerder, en steriliseren met autoclaaf. Platen kunnen worden gecoat met 3 mL/60 mm, 5 mL/100 mm, of 15 mL/150 mm 1% gelatine oplossing. Incuberen gecoate platen gedurende 15 minuten in een cel kweek incubator (37 °C en 5% CO2). Verwijder daarna de resterende 1% gelatine oplossing door aspiratie en was de gecoate platen één keer met PBS.
-
Groeiende ECFCs en MSCs
- Zaad 1 x 106 ecfcs op 1% Gelatin-Coated 150 mm platen, en groeien met behulp van ecgm-MV2 (10% FBS, 1% GPS) in een cel cultuur incubator (37 ° c en 5% Co2) tot 80-90% confluency. Gebruik ECFCs op passage nummers 7-10 om consistente resultaten te verkrijgen.
- Zaad 1 x 106 MSCS op niet-gecoate 150 mm platen, en groeien met behulp van mscgm-2 in een cel cultuur incubator (37 ° c en 5% Co2) tot 80-90% confluency. Gebruik MSCs op passage nummers 7-10 om consistente resultaten te verkrijgen.
2. bereiding van 1,2% m/v methylcellulose oplossing
- Meet 6 g methylcellulose in een glazen fles van 500 mL en Steriliseer in een autoclaaf.
- Verwarm ECGM-MV2 (zonder FBS en GPS) bij 60 °C gedurende 20 minuten en voeg 250 mL verwarmde ECGM-MV2 toe aan gesteriliseerd methylcellulose poeder. Om steriele omstandigheden te behouden, voert u het proces in de stroom afzuigkap uit.
- Voeg een gesteriliseerde magnetische roerstaaf toe en meng de oplossing gedurende 20 minuten op de magneetroerder tot de methylcellulose grondig wordt bevochten en gelijkmatig wordt gedispergeerd zonder klonten. Voeg 250 mL koude (4 °C) ECGM-MV2 (zonder FBS en GPS) toe onder de steriele toestand en meng voor 10 minuten extra op de magneetroerder. Daarna, Chill de oplossing in een koelkast (4 °C) 's nachts.
Opmerking: Methylcellulose is een koolhydraat polymeer dat goed oplost in koele temperaturen als gevolg van zwelling en daaropvolgende hydratatie. - De volgende dag, aliquot de oplossing in een buis van 50 mL en centrifugeer bij 5.000 x g gedurende 3 uur bij 4 °c. Neem de heldere viskeuze supernatant oplossing en bewaar deze bij 4 °C tot maximaal 3-6 maanden.
Opmerking: Het sediment kan residuele cellulosevezels bevatten, dus neem voorzichtig de supernatant oplossing die achter minstens 5 mL volume blijft. Dit volume kan worden aangepast volgens de experimentele omstandigheden.
3. genereren en insluiten van alleen ECFCs-, MSCs-only-en ECFCs-MSCs-Spheroids
Dag 1
- Voorbereiding van ECFCs en MSCs Cell Suspension
- Was de 80-90% confluente ECFCs en MSCs door toevoeging van fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) zonder calcium en magnesium, en aspirate.
- Om ECFCs en MSCs van de kweek plaat los te maken, inculeer ze met 0,05% trypsine-EDTA gedurende 3 minuten en 5 min in een cel kweek incubator (respectievelijk 37 °C en 5% CO2) in een cel kweek incubator.
- Inactiveren trypsine door toevoeging van DMEM medium met 10% FBS en 1% GPS. Pipetteer de cellen omhoog en omlaag om een eencellige suspensie te maken.
- Sediment de cellen door centrifugeren bij 282 x g gedurende 5 min bij RT.
- Verwijder de supernatant en onderbreek de cellen in het betreffende medium.
- ECFCs en MSCs labelen met fluorescerende kleurstof
Opmerking: Voer celmembraan etikettering van ECFCs uit met PKH67 (groen) en MSCs met PKH26 (rode) fluorescerende kleurstof volgens de instructies van de fabrikant met licht aangebrachte wijzigingen als volgt.- Was de cellen twee keer met serumvrij medium om FBS te verwijderen.
Opmerking: Eiwitten en lipiden in FBS verminderen de effectieve kleurstof concentratie voor het labelen van cellen door binding. - Tel ECFCs en MSCs met behulp van een hemocytometer onder de Microscoop en breng 3 x 106 ecfcs en 2 x 106 MSCS over in 2 ml micro-tubes.
Opmerking: Dit zijn de optimale celdichtheden voor het labelen van cellen met kleurstoffen. Het gebruik van een groot aantal cellen veroorzaakt slechte en heterogene kleuring, terwijl het gebruik van te weinig cellen het herstel van slechte cellen oplevert. - Centrifugeer de buisjes op 100 x g gedurende 5 minuten bij RT om een celpellet te verkrijgen. Zuig de supernatant voorzichtig op en laat niet meer dan 15-25 μL restvolume.
- Desuspendeer ECFCs en MSCs in 250 μL verdunningsmiddel C van de kleurstof Kit. Pipetteer de celsuspensie voorzichtig om volledige dispersie te garanderen.
Opmerking: Diluent C is een fysiologisch zout en kan de kleurings efficiëntie van kleurstof verminderen door micellen te vormen. Laat daarom de cellen niet lang in verdunningsmiddel C staan en draai de buisjes niet in Vortex. - Bereid de kleurings oplossing voor ECFCs door 5 μL PKH67 tot 250 μL verdunningsmiddel C (eindconcentratie van 20 μM) en voor MSCs toe te voegen door 3 μL van PKH26 tot 250 μL verdunningsmiddel C (eindconcentratie van 12 μM) toe te voegen.
Opmerking: De uiteindelijke kleurstof concentraties verschillen van de aanbevelingen van de fabrikant. Hoge concentratie zou leiden tot celklontering en celtoxiciteit. Lage concentratie zou niet voldoende zijn voor vlekken. - Voeg 250 μL ECFCs-celsuspensie toe aan 250 μL PKH67 kleurstofoplossing en 250 μL MSCs tot 250 μL PKH26 kleurstofoplossing. Meng de cellen onmiddellijk met kleurstoffen door het pipetteren op en neer en inbroed gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Voor betere resultaten, bedek de buis met aluminiumfolie en plaats op een shaker om voldoende mengen tijdens vlekken te garanderen.
- Stop het kleuringsproces door 0,5 mL FBS toe te voegen aan de bevlekt celsuspensie en inbroed vervolgens gedurende 1 minuut zodat FBS overtollige ongebonden kleurstof kan binden. Sediment de bevlekt cellen door centrifugeren bij 100 x g gedurende 5 min.
Opmerking: ECFCs-en MSCs-pellets zijn respectievelijk licht geel en roze na kleuring. - Verwijder voorzichtig de supernatant en was de cellen twee keer met een volledig medium om overtollige kleurstof te verwijderen. Centrifugeer de buisjes op 100 x g gedurende 5 minuten en onderbreek de pellet in 2 ml van elk compleet medium.
- Was de cellen twee keer met serumvrij medium om FBS te verwijderen.
- Genereren van ecfc, MSC of ecfc + MSC sferoïden
Opmerking: Pas de hangende druppel techniek toe om sferoïden te genereren zoals eerder beschreven28. De stappen voor de bereiding van sferoïden worden hieronder gegeven.- Tel de gebeitste ECFCs en MSCs.
- Opschorten gekleurd ECFCs, MSCs of ECFCs + MSCs in ECGM-MV2 met 20% methylcellulose oplossing en 5% FBS. Bereid bij een celdichtheid van 4 x 104 cellen/ml voor ECFCs of MSCS (25 μL celsuspensie bevat 1.000 cellen). Voor twee celsuspensie van ECFCs en MSCs, bereidt u zich voor op een celdichtheid van 2 x 104 cellen/ml ecfcs en 0,4 x 104 cel/ml MSCS (25 ΜL bevat 500 ecfcs en 100 MSCS).
Opmerking: De verhouding tussen ECFCs en MSCs mag niet hoger zijn dan 5:1. Een groter aantal MSCs kan leiden tot overmatige migratie en onregelmatige ontspruiten morfologie. Een kleiner aantal MSCs kan leiden tot een slechte interactie tussen cellen, waardoor arme kiemen. - Maak een hydratatie-eenheid door 15 mL PBS aan de onderkant van een 150 mm kweek plaat toe te voegen.
- Breng de celsuspensie over in het rechthoekige reservoir met gesteriliseerd polystyreen voor het gebruik van meerkanaalspipetten. Dispergeer de cellen suspensie gelijkmatig door pipetteren.
- Stort 25 μL celsuspensie op de cover van een 150 mm kweek plaat met behulp van een meerkanaals Pipet (ongeveer 100 druppels/afdekking van de 150 mm plaat). Keer de afdekking om met een met PBS gevulde hydratatie-eenheid en inculeer in een celkweek incubator voor 24 uur.
Opmerking: Methylcellulose oplossing zorgt voor een goede viscositeit van de suspensie oplossing. Wanneer de hangende druppel methode werd uitgevoerd zonder Hydroxypropyl methylcellulose oplossing, werden druppels gemakkelijk naar beneden gleed wanneer de afdekking werd omgekeerd (aanvullend figuur 1). Bovendien, na een nachtelijke incubatie, werden de sferoïden niet perfect gevormd zonder Hydroxypropyl methylcellulose oplossing. Dit resultaat geeft aan dat de juiste viscositeit door Hydroxypropyl methylcellulose oplossing nodig is om een ronde vorm van de spheroïden te vormen.
Dag 2
- Embeding sferioïden in geneutraliseerde collageen gel
- Warme FBS en ECGM-MV2 (zonder FBS en GPS) in een waterbad (37 °C). Plaats de koude Hydroxypropyl methylcellulose oplossing op een werkbank om op kamertemperatuur te komen.
- Plaats een 24-put plaat in een celkweek incubator (37 °C) voor opwarming.
- Snijd de puntige pipetpunten van 1 ml 3-5 mm om aspiraat-spheroïden en viskeuze suspensies, zoals Hydroxypropyl methylcellulose oplossing en type I collageen, comfortabel en nauwkeurig.
- Bereid 3 mg/mL geneutraliseerde type I collageen gel op ijs volgens de instructies van de fabrikant van het type I collageen gel.
Opmerking: Neutralisatie moet worden uitgevoerd op ijs om gelatie van collageen bij kamertemperatuur te voorkomen. Voor een goed van een 24-goed plaat is 500 μL geneutraliseerde collageen nodig. Bereid altijd 1 mL extra volume collageen voor. Collageen gel kan worden gebruikt tot 2-3 h na neutralisatie indien bewaard op ijs. - Oogst de sferoïden door de afdekking met sferoïden met 5 ml PBS te spoelen. Verzamel spheroid-suspendeerde oplossing in een conische buis van 50 mL. Spoel de afdekking opnieuw af met 5 mL PBS om de resterende spheroïden te verkrijgen.
Opmerking: Tijdens de oogst, nauwlettend observeren om het bestaan van spheroids te bevestigen. Voor meer visuele inspectie, overdracht van ongeveer 50-100 μL spheroid-Suspended oplossing op het glaasje, en controleer de ronde vorm van de sferoïden onder de Microscoop. - Sediment de sferoïden door centrifugeren bij 282 x g gedurende 5 min. Gooi het supernatant voorzichtig weg zonder de sferoïden te storen die niet meer dan 100-200 μL restvolume achterlaten.
- Tik zachtjes op de wand van de buis zodat spheroïden vrij worden opgehangen in de resterende 100-200 μL rest oplossing.
- Voeg ecgm-MV2 met 5% FBS en 40% Hydroxypropyl methylcellulose oplossing toe aan de spheroid-bevattende buis. Het toegevoegde volume wordt bepaald op basis van ongeveer 100 spheroids/mL. Meng de spheroid-suspensie voorzichtig door pipetteren met een Blunt 1 mL pipetpunt.
Opmerking: Methylcellulose oplossing wordt veel gebruikt als een suspeniteurmiddel dat sferoïden niet toestaat te bezinksel. De concentratie FBS moet 5% zijn. Hogere FBS-concentratie veroorzaakt abnormale kiemen als gevolg van overmatige groeifactoren. Lagere FBS-concentratie kan geen gezonde voorwaarden voor cellen handhaven. - Mix spheroid-suspensie oplossing en neutraliseerde-type I collageen gel (3 mg/mL) bij een 1:1 verhouding op ijs. Gebruik een Blunt pipetpunt van 1 mL om te voorkomen dat de spheroids worden afgebroken.
Opmerking: 1 ml van de spheroids-suspende collageen gel oplossing is vereist voor een goed van een 24-Well plaat. Maak indien mogelijk een extra gemengde suspensie oplossing. - Als de angiogene eigenschappen van een agent (s) of chemische (s) moeten worden getest, breng dan 1 mL van de spheroid-suspendergel-oplossing in een 1 mL micro-buis en voeg middel (en) of chemische (s) toe, gevolgd door zachte menging met een stompe 1mL pipetpunt.
Opmerking: Het volume van de agent en de chemische kan optellen tot 200 mL, die verdunt de type I collageen gel concentratie van 1,5 mg/mL tot 1,25 mg/mL, maar heeft geen invloed op type I collageen gel polymerisatie. Voeg hetzelfde volume voertuig toe aan de controle-spheroids. - Voeg de spheroid-suspenderen collageen gel-oplossing toe aan putjes van een voorverwarmde 24-Wells plaat (0,9 mL/well) door pipetteren en incuberen gedurende 30 minuten in een celkweek incubator voor polymerisatie.
Opmerking: Tijdens het insluitings proces van de spheroid mag u de gel niet storen door de plaat te agiteren. - Bedek de spheroid-opschorting collageen gel door toevoeging van 100 μL ECGM-MV2 met 2,5% FBS met/zonder VEGF. Voor ECFC-alleen spheroids, stimuleer de cellen met exogene toevoeging van VEGF (eindconcentratie van 50 ng/mL) om de juiste spruiten te vormen. Ecfc + MSC sferoïden vereisen geen exogene stimulatie door groeifactoren.
- Plaats de plaat in een real-time cel recorder geïnstalleerd in een celkweek incubator (37 °c en 5% Co2) en richt zich willekeurig op 5-10 sferoïden (10x objectief objectief). Bewaak de kiemvorming van elke fluorescentie-gelabelde sferoïden elke 1 h gedurende 24 uur zonder enige verstoring.
4. kwantaatspheroid-spruiten
- Importeer de afbeeldingsbestanden naar ImageJ-software om het aantal spruiten te kwantificen en de lengte van elke Sprout te meten. Voor co-Culture spheroids, label ECFCs met groene fluorescerende kleurstof voor het maken van spheroids. Meet vervolgens het aantal en de lengte van spruiten met groene fluorescentie (aanvullend figuur 2). Vijf willekeurig geselecteerde sferoïden werden per experimentele groep gekwantificeerd.
Opmerking: Spruiten zijn gezamenlijk langwerpige structuren gevormd door verschillende ECFCs die zich uitstrekken uit spheroids. De kiem lengte wordt gemeten als de lengte vanaf het punt van spruiten van het oppervlak van de spheroïden tot aan het uiteinde van spruiten. - Uitdrukken de waarden als middel ± SEM van ten minste drie onafhankelijke experimenten. Bepaal het statistisch significante verschil met one-way ANOVA voor meervoudige vergelijkingen of student t-toets voor gekoppelde vergelijkingen.
Opmerking: P ≤ 0,05 wordt als statistisch significant beschouwd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vergelijkings experimenten werden uitgevoerd met mono-Culture sferoïden (alleen ecfcs) en co-Culture sferoïden (ecfcs + MSCS) om te onderzoeken of MSCS een belangrijke rol spelen bij ecfcs-gemedieerde angiogenese. De kiemvorming van elke spheroid werd gedurende 24 uur bewaakt door een real-time celrecorder die de progressie van angiogene kiemen uit spheroïden kon opvangen. Het angiogene potentieel werd gekwantificeerd door het aantal kiemgroenten te tellen en de cumulatieve lengte van kiemgroenten die uit individuele spheroïden voortvloeien te meten. Vijf willekeurig geselecteerde sferoïden per experimentele groep werden geanalyseerd. Voor ecfcs + MSCS-sferoïden waren het aantal spruiten en de cumulatieve kiem lengte significant hoger in vergelijking met die van ecfcs-alleen sferioïden op alle tijdstippen (Figuur 1A-C). Kiemgetal en lengte van ecfcs + MSCS sferoïden stegen continu gedurende 12 uur, maar het aantal en de lengte van ecfcs-alleen-sferoïden stegen gedurende 6 uur en werden niet gewijzigd op latere tijdstippen (Figuur 1B, C). Bovendien waren spruiten gevormd door ecfcs + MSCS sferoïden dikker en duurzamer dan die gevormd door ecfcs-alleen sferoïden met/zonder VEGF-behandeling (Figuur 1A, en aanvullende video 1a, B, D). MSCS-alleen sferoïden vormen geen spruiten, maar toonden individuele migratie van MSCS buiten sferoïden (afbeelding 1A en aanvullende video 1c). Deze resultaten tonen de significante bijdrage van MSCs, pericyte precursoren, aan de cellulaire angiogenese van ECFCs. MSCs zijn bekend om te scheiden van verschillende groeifactoren29 die ECFCs kunnen stimuleren om spruiten en buisvormige structuren te vormen.
ECFCs werden geëtiketteerd met groen-fluorescerende kleurstof en MSCs werden gelabeld met rood-fluorescerende kleurstof alvorens te combineren om ECFCs + MSCs spheroids te genereren. Samen met real-time Recording kan deze Live Cell fluorescentie etiketteer techniek de cellulaire bewegingen van ECFCs en MSCs tijdens Sprout vorming volgen. Fluorescerende beeldvorming toonde aan dat ECFCs-gemedieerde Sprout structuren werden bedekt met MSCs (afbeelding 2 en aanvullende video 2). Dit suggereert dat gecombineerde MSCs fungeren als perivasculaire cellen tijdens Sprout vorming, die de ontkiemen stabiliteit en duurzaamheid verbeteren door de nauwe associatie tussen twee vasculaire cellen.
Het nieuw ontwikkelde co-Culture spheroid-testsysteem werd getest met Bevacizumab, een door de FDA goedgekeurde Angiogeneseremmer, om te controleren of het mogelijk is om Anti-angiogene geneesmiddelen op te schermen. Ecfcs + MSCS sferoïden, voorbehandeld met Bevacizumab vertoonden een verlaagd kiemgetal en een cumulatieve kiem lengte in een dosisafhankelijke manier vergeleken met controle-ecfcs + MSCS sferoïden (Figuur 3a, B). In parallelle experimenten vertoonden ecfcs-alleen sferoïden die voorbehandeld werden met Bevacizumab gevolgd door stimulatie met VEGF (50 ng/ml) ook een verlaagd VEGF-geïnduceerde kiemgetal en cumulatieve kiem lengte in een dosisafhankelijke manier (Figuur 3C, D) . De IC50 -waarden van Bevacizumab voor het remmen van de cumulatieve kiem lengte in ecfcs + MSCS sferoïden was 46 maal hoger dan die in ecfcs-alleen sferoïden (tabel 1). Dit resultaat impliceert sterk dat een hogere concentratie nodig is voor de remming van fysiologisch relevante vasculaire vorming door ECFCs en MSCs in vergelijking met de concentratie die nodig is om alleen door de EC gemedieerde vasculaire vorming te remmen.
Vervolgens werd een xenotransplantaatmodellen is tumor muismodel uitgevoerd met Bevacizumab behandeling om te onthullen welk spheroid-systeem voorspelbare gegevens verschaft die correleren met de effectieve plasmaconcentratie in vivo. Mens-afgeleide multiform glioblastoom U87MG-rode-Fluc cellijn werd subcutaan geïnjecteerd om immuun-deficiënte muizen. Na bevestiging van de tumorvorming op 1 week, muizen werden willekeurig verdeeld in 3 groepen die verschillende behandelingen kregen: controle (0 mg/kg), lage dosis (1 mg/kg), en hoge dosis (30 mg/kg). Tumor groei werd significant geremd in de 30 mg/kg-behandelde groep in vergelijking met controlegroep (aanvullend figuur 3A). De 1 mg/kg-behandelde groep toonde een neiging voor tumor afname, maar er was geen statistisch verschil in vergelijking met controlegroep. De plasmaconcentratie van de muis bij 3 weken van de behandeling met Bevacizumab was 568.0 ± 40.62 μg/mL bij 30 mg/kg en 38,1 ± 0,72 μg/mL bij 1 mg/kg (aanvullend Figuur 3b). In het bijzonder werd de plasmaconcentratie van Bevacizumab met een effectieve remming (568.0 ± 40.62 μg/ml bij 30 mg/kg gedurende een behandeling van 3 weken) nauwkeurig bereikt door ecfcs + MSCS sferoïden (1261.5 ± 214.49 μg/ml), maar niet alleen ecfcs-sferoïden (27,0 ± 9.97 μg/ml). Zo kan het ecfcs + MSCS spheroid-angiogenese-testsysteem worden beschouwd als een geschikt assay-systeem voor het voorspellen van effectieve plasmaconcentratie vóór dierproeven.
Figuur 1: Sprout vorming van alleen ECFCs, alleen MSCS en ecfcs + MSCS spheroids. A) representatieve beelden van kiemvorming uit ecfcs-only, alleen MSCS-en ecfcs + MSC-sferoïden ingebed in de collageen gel van type I op 0, 6, 12, 18 en 24 h (schaalbalk = 100 μm). B) kwantitatieve grafiek van kiemgetal gevormd uit ecfcs-only en ecfcs + MSCS sferoïden (gemiddelde ± SEM, n = 3). C) kwantitatieve grafiek van de cumulatieve kiem lengte, gevormd uit ecfcs-only en Ecfcs + MSCS sferoïden (gemiddelde ± SEM, n = 3). * duidt op een significant verschil tussen ecfcs-only en ecfcs + MSCS sferoïden op dezelfde tijdstippen (p ≤ 0,05). # duidt op significant verschil tussen groepen aangeduid met een beugel (p ≤ 0,05). Dit cijfer is gewijzigd van een vorige publicatie30. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: lokalisatie van ECFCs en MSCs in Sprout structuren. Representatieve afbeeldingen met locaties van twee celtypen in Sprout structuren na 24 h. ECFCs en MSCs werden fluorescently gelabeld met respectievelijk PKH67 (groen) en PKH26 (rood) en uitgevoerde 3D ECFCs + MSCs spheroid angiogenese test. Pijlen toont aan dat MSCs waren bedekt met ECFCs-gemedieerde Sprout structuren (schaal Bar = 100 μm). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: remmende werking van Bevacizumab op Sprout vorming van ecfcs + MSCs en ecfcs-alleen sferioïden. Ecfcs + MSCS en ecfcs-alleen sferoïden werden behandeld met Bevacizumab, en Sprout vorming werd gemonitord voor 24 h.B) kwantitatieve grafiek van de cumulatieve kiem lengte van ecfcs + MSCS sferoïden behandeld met Bevacizumab (gemiddelde ± SEM, n = 3). C) kwantitatieve grafiek van kiemgetal uit VEGF-gestimuleerde ECFCs-alleen sferoïden behandeld met Bevacizumab (gemiddelde ± SEM, n = 3). D) kwantitatieve grafiek van de cumulatieve kiem lengte van VEGF-gestimuleerde ECFCs-alleen-sferoïden behandeld met Bevacizumab (gemiddelde ± SEM, n = 3). * duidt op significant verschil met de controlegroep (witte staaf) (p ≤ 0,05). # duidt op significant verschil met VEGF-behandelde groep (zwarte balk) (p ≤ 0,05). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Tijd h |
IC50 (μg/ml) van Avastin | p-waarde | |
| Alleen ECFCs-spheroid | ECFCs + MSCs spheroid | ||
| 6 | 94,62 ± 38,53 | 3058,21 ± 373,31 | 0,003 |
| 12 | 58,61 ± 17,80 | 2006 ± 484,73 | 0,015 |
| 18 | 83,38 ± 54,54 | 1509,51 ± 483,88 | 0,042 |
| 24 | 27,04 ± 9,97 | 1261,51 ± 214,49 | 0,0045 |
Tabel 1: IC50 waarden van Bevacizumab voor remming van de cumulatieve kiem lengte in ofwel ecfcs-only ofwel Ecfcs + MSCS spheroids. Ecfcs-alleen sferoïden werden behandeld met Bevacizumab gevolgd door stimulatie met VEGF (50 ng/ml), wat nodig is voor Sprout vorming uit ecfcs-alleen sferioïden. Ecfcs + MSCS sferoïden werden behandeld met Bevacizumab zonder VEGF-stimulatie. Beide sferoïden ingebed in type I collageen gel en Sprout vorming uit elke spheroid werd waargenomen voor 24 h met behulp van een real-time cel recorder. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM (n = 3).
Aanvullend figuur 1: Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend figuur 2: Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend figuur 3: Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullende video 1a: Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Aanvullende video 1b: Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Aanvullende video 1c: Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Aanvullende video 1d: Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Aanvullende video 2: Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De huidige studie introduceert een verbeterd in vitro angiogenese assay systeem met behulp van co-cultuur sferoïden gevormd door twee menselijke vasculaire cel voor ouders, ecfcs en MSCS. co-Culture spheroid-systeem kan in vivo vasculaire kiemvorming nabootsen, wat bereikt door interactie en integratie tussen endotheliale cellen en pericytes. Vergeleken met andere in vitro angiogenese tests die alleen ECs-gemedieerde angiogenese reflecteren, is dit co-Culture assay-systeem meer representatief voor de meerstaps cascade van fysiologisch angiogenese, inclusief cellulaire interactie, kiemvorming, en rijping van het schip. Dit nieuw opgezette assay-systeem lijkt ook op de in vivo extracellulaire micro omgeving door het zaaien van sferoïden in type I collageen gel. We stellen voor dat het 3D co-Culture spheroid angiogenese assay systeem betrouwbaar, herhaalbaar, gemakkelijk kwantificeerbaar en vooral fysiologisch relevant is.
Tijdens het uitvoeren van de co-Culture spheroid-test is het essentieel om sferoïden in gel in te sluiten met de juiste concentratie van geneutraliseerd type I collageen en FBS. De beste eindconcentratie van neutraliseerd type I collageen is 1,5 mg/mL, en het percentage FBS is 2,5%. In de voorbereidende experimenten resulteerde een hogere concentratie van collageen in stijve gel en bemoeilijkt de kwaliteit en kwantiteit van kiemgroenten afkomstig van spheroïden. Kleine concentraties collageen leverden een zachte en fragiele gel op die de integriteit van spheroïden niet kon handhaven. Evenzo veroorzaakten hogere hoeveelheden FBS plethoric kiemen van spheroïden op het basale niveau, ongeacht de angiogene factor stimulatie. Lagere FBS-concentratie leidde tot slechte omstandigheden van cellen. Voor consistente en reproduceerbare resultaten moet een behoorlijk aantal spheroid worden ingesloten (ongeveer 50 spheroids/well). Meer dan 50 sferoïden/well zou kunnen leiden tot de nabijheid van sferoïden binnen de put, die de kwaliteit en hoeveelheid gegenereerde spruiten abnormaal kunnen beïnvloeden.
Het is van cruciaal belang om type I collageen in gekoelde omstandigheden te behouden tijdens neutralisatie en meng stappen met de spheroid-suspensie omdat collageen bij kamertemperatuur kan stollen, wat resulteert in een onregelmatige matrix. Bij het mengen van de spheroid-suspensie met collageen oplossing wordt aanbevolen om 1 mL pipetpunt te gebruiken met een 3-5 mm snede aan het uiteinde om een breed gat te maken. Dit zorgt voor een eenvoudige hantering van de viskeuze collageen oplossing en beschermt sferoïden tegen scheuren. Roeren van de plaat na het insluiten van spheroid-zwevende collageen oplossing kan de integriteit van de gel verstoren en resulteren in breuk die de normale kiem generatie kan belemmeren.
In co-Culture spheroid assay met behulp van ECFCs en MSCs moet de 5:1-ratio worden gehandhaafd. Gebruik van een groter aantal MSCs veroorzaakt verspreiding rond de spheroid als gevolg van de migrerende fenotype MSCs, die kan invloed hebben op ideale kiem generatie. Een kleiner aantal MSCs is onvoldoende om ECFCs-kiemen te stimuleren en de kiemgroenten goed te bedekken. Daarnaast is het essentieel om de celcondities tijdens de groei te controleren. Als een slechte kiem wordt waargenomen, is het raadzaam om een andere gezonde passages van de cellen te gebruiken. Voor een betere uitkomst wordt het gebruik van ECFCs en MSCs bij een passage van minder dan 10 sterk aanbevolen.
Hier presenteren we een verbeterd 3D angiogenese assay systeem met co-Culture sferoïden die in vivo angiogenese nauwkeurig opvangen. Vergeleken met 2D-eencelassay systemen reflecteren deze co-Culture spheroid-testsysteem meer getrouwe cellulaire responsen tussen twee vasculaire celtypen om buisvormige structuren te vormen in fysiologische omstandigheden. Dit systeem blijft echter oververeenvoudigd in vergelijking met het complexe proces van meervoudige stappen in vivo angiogenese. Vasculaire generatie in vivo gebeurt meestal door meerdere interacties van verschillende andere celtypen, met inbegrip van Epitheelcellen, fibroblasten, immuuncellen, en ook overvloedige ECM-eiwitten. Toekomstige toepassingen van dit nieuwe systeem omvatten de introductie van andere celtypen en de ECM om de fysiologische en/of pathologische angiogenese nauwkeuriger weer te geven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gesteund door een subsidie (17172MFDS215) van het ministerie van voedsel-en geneesmiddelen veiligheid, de National Research Foundation of Korea (NRF) subsidie gefinancierd door de Korea Government (MSIP) (2017R1A2B4005463), en het basis wetenschaps onderzoeksprogramma via de National Research Foundation of Korea (NRF), gefinancierd door het ministerie van onderwijs (2016R1A6A1A03007648).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin EDTA (1x) | Gibco | 25300-054 | |
| Bevacizumab | Roche | NA | Commercial name: Avastin |
| Dulbecco Modified Eagle Medium | Gibco | 11885-084 | DMEM |
| Dulbeco's Phosphate buffered saline (10x) | Gibco | 21600-010 | PBS (10x) |
| Dulbeco's Phosphate buffered saline (1x) | Corning | 21-031-CVR | PBS (1x) |
| Endothelial cell Growth medium MV2 kit | Promocell | C-22121 | ECGM-MV2 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlas | FP-0500A | FBS |
| Gelatin | BD Sciences | 214340 | |
| L-Glutamine–Penicillin–Streptomycin | Gibco | 10378-016 | GPS |
| Mesenchymal stem cell growth medium-2 | Promocell | C-28009 | MSCGM-2 |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| PKH26 Fluorescent Cell Linker Kits | Sigma-Aldrich | MINI26 | PKH26 |
| PKH67 Fluorescent Cell Linker Kits | Sigma-Aldrich | MINI67 | PKH67 |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Type I collagen gel | Corning | 354236 | |
| Vascular endothelial growth factor A | R&D | 293-VE-010 | VEGF |
References
- Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).
- Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvascular research. 74 (2-3), 172-183 (2007).
- Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. International journal of experimental pathology. 90 (3), 195-221 (2009).
- Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. Designing materials to direct stem-cell fate. Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).
- Fina, L., et al. Expression of the CD34 gene in vascular endothelial cells. Blood. 75 (12), 2417-2426 (1990).
- Delia, D., et al. CD34 expression is regulated reciprocally with adhesion molecules in vascular endothelial cells in vitro. Blood. 81 (4), 1001-1008 (1993).
- Korff, T., Augustin, H. G. Tensional forces in fibrillar extracellular matrices control directional capillary sprouting. Journal of Cell Science. 112 (19), 3249-3258 (1999).
- Korff, T., Augustin, H. G. Integration of endothelial cells in multicellular spheroids prevents apoptosis and induces differentiation. The Journal of cell biology. 143 (5), 1341-1352 (1998).
- Gaengel, K., Genové, G., Armulik, A., Betsholtz, C. Endothelial-mural cell signaling in vascular development and angiogenesis. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 29 (5), 630-638 (2009).
- Hutmacher, D. W. Biomaterials offer cancer research the third dimension. Nature Materials. 9 (2), 90-93 (2010).
- Korff, T., Kimmina, S., Martiny-Baron, G., Augustin, H. G. Blood vessel maturation in a 3-dimensional spheroidal coculture model: direct contact with smooth muscle cells regulates endothelial cell quiescence and abrogates VEGF responsiveness. FASEB Journal. 15 (2), 447-457 (2001).
- Gumkowski, F., Kaminska, G., Kaminski, M., Morrissey, L. W., Auerbach, R. Heterogeneity of mouse vascular endothelium. In vitro studies of lymphatic, large blood vessel and microvascular endothelial cells. Journal of Vascular Research. 24 (1-2), 11-23 (1987).
- Asif, A. R., Oellerich, M., Armstrong, V. W., Hecker, M., Cattaruzza, M. T-786C polymorphism of the NOS-3 gene and the endothelial cell response to fluid shear stress-a proteome analysis. Journal of Proteome Research. 8 (6), 3161-3168 (2009).
- Melero-Martin, J. M., et al. In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells. Blood. 109 (11), 4761-4768 (2007).
- Ingram, D. A., et al. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood. 104 (9), 2752-2760 (2004).
- Murasawa, S., Asahara, T. Endothelial progenitor cells for vasculogenesis. Physiology (Bethesda). 20, 36-42 (2005).
- Rafii, S., Lyden, D., Benezra, R., Hattori, K., Heissig, B. Vascular and haematopoietic stem cells: novel targets for anti-angiogenesis therapy. Nature Review Cancer. 2 (11), 826-835 (2002).
- Shi, S., Gronthos, S. Perivascular niche of postnatal mesenchymal stem cells in human bone marrow and dental pulp. Journal of Bone and Mineral Research. 18 (4), 696-704 (2003).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
- Lee, H., Kang, K. T. Advanced tube formation assay using human endothelial colony forming cells for in vitro evaluation of angiogenesis. Korean Journal of Physiology & Pharmacology. 22 (6), 705-712 (2018).
- Melero-Martin, J. M., et al. Engineering robust and functional vascular networks in vivo with human adult and cord blood-derived progenitor cells. Circulation Research. 103 (2), 194-202 (2008).
- Kang, K. T., Allen, P., Bischoff, J. Bioengineered human vascular networks transplanted into secondary mice reconnect with the host vasculature and re-establish perfusion. Blood. 118 (25), 6718-6721 (2011).
- Kang, K. T., Coggins, M., Xiao, C., Rosenzweig, A., Bischoff, J. Human vasculogenic cells form functional blood vessels and mitigate adverse remodeling after ischemia reperfusion injury in rats. Angiogenesis. 16 (4), 773-784 (2013).
- Kang, K. T., Lin, R. Z., Kuppermann, D., Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. Endothelial colony forming cells and mesenchymal progenitor cells form blood vessels and increase blood flow in ischemic muscle. Scientific Reports. 7 (1), 770 (2017).
- Paupert, J., Sounni, N. E., Noel, A. Lymphangiogenesis in post-natal tissue remodeling: lymphatic endothelial cell connection with its environment. Molecular Aspects of Medicine. 32 (2), 146-158 (2011).
- Lu, P., Weaver, V. M., Werb, Z. The extracellular matrix: a dynamic niche in cancer progression. Journal of Cell Biology. 196 (4), 395-406 (2012).
- Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. Chapter 13. An in vivo experimental model for postnatal vasculogenesis. Methods in Enzymology. 445, 303-329 (2008).
- Laib, A. M., et al. Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo. Nature Protocols. 4 (8), 1202-1215 (2009).
- Leuning, D. G., et al. The cytokine secretion profile of mesenchymal stromal cells is determined by surface structure of the microenvironment. Scientific Reports. 8 (1), 7716 (2018).
- Shah, S., Kang, K. T. Two-Cell Spheroid Angiogenesis Assay System Using Both Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells. Biomolecules & Therapeutics (Seoul). 26 (5), 474-480 (2018).
