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Biochemistry

कोनेक्सिन 43 स्ट्रक्चरल व्यवधान के माध्यम से परेशान एंडोथेलियल बायोमैकेनिक्स

Published: October 4, 2019 doi: 10.3791/60034
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Mechanical and Aerospace Engineering, University of Central Florida, 2Burnett School of Biomedical Sciences, College of Medicine, University of Central Florida

Summary

यहाँ, हम अंतराल जंक्शन connexin 43 को बाधित करने के लिए एक यांत्रिकी आधारित प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं और बाद में प्रभाव को मापने के लिए यह कर्षण और intercellular तनाव के अवलोकन के माध्यम से endothelial biomechanics पर है.

Abstract

अंत:कोशिकीय कोशिकाओं को अंतरकोशिकीय तनाव और कर्षण उत्पन्न करने के लिए स्थापित किया गया है, लेकिन भूमिका अंतराल जंक्शनों endothelial intercellular तनाव और कर्षण पीढ़ी में खेलने वर्तमान में अज्ञात है. इसलिए, हम यहाँ एक यांत्रिकी आधारित प्रोटोकॉल प्रस्तुत करने के लिए अंतराल जंक्शन connexin 43 (Cx43) के प्रभाव की जांच करने के लिए endothelial biomechanics पर एक ज्ञात Cx43 अवरोध करनेवाला 2,5-dihydroxychalcone (chalcone) और confluent endothelial monolayers उजागर द्वारा है प्रभाव को मापने इस अवरोधकरनेवाला कर्षण और intercellular तनाव पर है. हम प्रतिनिधि परिणाम प्रस्तुत करते हैं, जो नियंत्रण की तुलना में एक उच्च चालकोन खुराक (2 ग्राम/एमएल) के तहत दोनों कर्षण और अंतरकोशिकीय तनावों में कमी दिखाते हैं। इस प्रोटोकॉल न सिर्फ Cx43 के लिए लागू किया जा सकता है, लेकिन यह भी अन्य अंतराल जंक्शनों के रूप में अच्छी तरह से, यह मानते हुए उपयुक्त अवरोध करनेवाला प्रयोग किया जाता है. हमारा मानना है कि यह प्रोटोकॉल हृदय और मेकोबायोलॉजी अनुसंधान के क्षेत्र में उपयोगी होगा।

Introduction

वह क्षेत्र जो कोशिकीय बलों और यांत्रिक गुणों के अध्ययन को को संदर्भित करता है , सेलुलर और ऊतक शरीर क्रिया विज्ञान और विकृति पर इसे यांत्रिक जीव विज्ञान1के रूप में जाना जाता है . मेकोबायोलॉजी में उपयोग की गई कुछ उपयोगी तकनीकें मोनोलेयर तनाव माइक्रोस्कोपी और कर्षण बल माइक्रोस्कोपी हैं। ट्रैक्शन बल माइक्रोस्कोपी सेल-सब्सट्रेट इंटरफ़ेस में उत्पन्न कर्षणों की गणना के लिए अनुमति देता है, जबकि मोनोलेयर तनाव माइक्रोस्कोपी एक मोनोलेयर 2 के भीतर आसन्न कोशिकाओं के बीच उत्पन्न अंतरकोशिकीय तनावों की गणना के लिए अनुमति देता है ,3,4,5,6. पिछली विधियों से प्राप्त परिणामों से पता चलता है कि सेल व्युत्पन्न यांत्रिक तनाव अनेक सेल्यूलर प्रक्रियाओं3,4,5के भाग्य का निर्धारण करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । उदाहरण के लिए, किसी बाह्य यांत्रिक बल के संपर्क में आने पर, सामूहिक रूप से प्रवास करने वाली कोशिकाओं का समूह अपनी आकृति विज्ञान को बदल सकता है और उनके आकार का ध्रुवीकरण कर सकता है ताकि वे अनुप्रयुक्त बल की दिशा के साथ संरेखित हो सकें और उसे आंशिक रूप से, कर्षण7उत्पन्न करसकें। 8. ट्रैक्शन ्स वे मीट्रिक प्रदान करते हैं जिनका उपयोग सेल अनुबंधता का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है और उनकी गणना कर्षण बल माइक्रोस्कोपी (टीएफएम) का उपयोग करके की जाती है. ट्रैक्शन बल माइक्रोस्कोपी (टीएफएम) एक गणितीय कठोर, यांत्रिकी आधारित अभिगणनायिक दृष्टिकोण का उपयोग करकर्षण क्षेत्र की गणना के बाद सेल प्रेरित सब्सट्रेट विकृतियों के निर्धारण के साथ शुरू होता है। कर्षण की गणना करने की क्षमता के बाद से काफी कुछ समय के लिए चारों ओर किया गया है, शोधकर्ताओं ने TFM का उपयोग किया है प्रभाव कर्षण पता चलता है प्रक्रियाओं के एक मेजबान पर है, कैंसरसहित 9, घाव भरने10 और इंजीनियर हृदय का आकलन ऊतक11|

TFM और MSM के कार्यान्वयन के साथ तीन आवश्यक कदम है कि निम्नलिखित क्रम में क्रियान्वित किया जाना चाहिए में विभाजित किया जा सकता है: पहले, कोशिकाओं द्वारा उत्पादित hydrogel विरूपण निर्धारित कर रहे हैं; दूसरा, कर्षण hydrogel विरूपण से बरामद कर रहे हैं; और तीसरे, एक परिमित तत्व दृष्टिकोण पूरे मोनोलेयर के भीतर सामान्य और कतरनी intercellular तनाव की गणना करने के लिए प्रयोग किया जाता है। जेल विस्थापन की गणना करने के लिए, कोशिकाओं के साथ फ्लोरोसेंट मनका छवियों एक कस्टम लिखा कण छवि velocimetry (PIV) दिनचर्या का उपयोग करके संदर्भ मनका छवि (कोशिकाओं के बिना) के साथ तुलना की गई। पार सहसंबंध विंडो आकार और PIV विश्लेषण के लिए ओवरलैप क्रमशः 32 x 32 पिक्सल और 0.5 होना चुना गया. इस समय, पिक्सेल बदलाव एक पिक्सेल-से-माइक्रोन रूपांतरण कारक (हमारे माइक्रोस्कोप के लिए, इस रूपांतरण कारक है 0.65) के साथ गुणा करके microns में परिवर्तित कर रहे थे में विमान विस्थापन प्राप्त करने के लिए. विमान के बाहर विस्थापन की अनदेखी के साथ जुड़े त्रुटियाँ नगण्य हैं12,13. जेल विस्थापन की गणना के बाद, वहाँ कर्षण माप के दो प्रकार है कि उपयोग किया जा सकता है, सीमित कर्षण और unconstrained कर्षण8,14. अप्रतिबंधित कर्षण दृश्य के संपूर्ण फ़ील्ड के लिए कर्षण फ़ील्ड प्रदान करते हैं (जिसमें कक्षों के साथ और उसके बिना क्षेत्र शामिल हैं), जबकि विवश कर्षण केवल उन क्षेत्रों के लिए कर्षण फ़ील्ड प्रदान करते हैं जिनमें कक्ष14शामिल हैं. फिर, intercellular तनाव मोनोलेयर तनाव माइक्रोस्कोपी (एमएसएम) का उपयोग कर गणना कर रहे हैं, जो कर्षण बल माइक्रोस्कोपी का एक विस्तार है। एमएसएम का कार्यान्वयन इस धारणा पर आधारित है कि सेल-सबस्ट्रेट इंटरफ़ेस पर कोशिकाओं के मोनोलेयर द्वारा लगाए गए स्थानीय कर्षणों को सेल-सेल इंटरफ़ेस पर कोशिकाओं के बीच संचारित यांत्रिक बलों द्वारा संतुलित किया जाना चाहिए जैसा कि न्यूटन के नियमों 7 द्वारा मांग की गई है ,12,13. यहाँ एक महत्वपूर्ण धारणा यह है कि सेल मोनोलेयर को एक पतली लोचदार शीट के रूप में माना जा सकता है क्योंकि मोनोलेयर में कर्षण वितरण ज्ञात है और बल संतुलन सेल सामग्री गुणों पर निर्भर नहीं करता है। एक अन्य प्रमुख धारणा यह है कि कर्षण बल ऑप्टिकल क्षेत्र के भीतर स्थानीय अंतरकोशिकीय दबावों द्वारा संतुलित होते हैं (एकपरत के भीतर) और इस बल संतुलन का प्रभाव दूरस्थ क्षेत्र (एकपरत के बाहर)13में न्यूनतम है। अतः अंतरकोशिकीय तनावों, विस्थापनों, या मोनोलेयर सीमा पर दोनों के संयोजन द्वारा परिभाषित सीमा शर्तें एमएसएम13करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। उपरोक्त जानकारी को ध्यान में रखते हुए, हम एमएसएम का उपयोग एक परिमित तत्व विश्लेषण (फेम) को अधिकतम मुख्य तनाव(अधिकतम) और न्यूनतम मुख्य तनाव ($न्यूनतम) को ठीक करने के लिए प्रत्येक बिंदु पर तनाव तल को घुमाकर करते हैं मोनोलेयर। इन प्रमुख तनावों का उपयोग बाद में पूरे मोनोलेयर के भीतर 2D औसत सामान्य अंतरकोशिकीय प्रतिबल की गणना करने के लिए किया जाता है [([अधिकतम +मिनट) /2] और 2D अधिकतम कतरनी अंतरकोशिकीय प्रतिबल [([अधिकतम -$ न्यूनतम) /2 ] पूरे मोनोलेयर के भीतर 12,13. इस प्रक्रिया को और अधिक विस्तार से Tambe एट अल द्वारा वर्णित है12,13

मोनोलेयर स्ट्रेस माइक्रोस्कोपी (एमएसएम) एक मोनोलेयर6,7,8,12,13के भीतर उत्पन्न सेल-सेल इंटरसेल्यूलर तनावों की गणना के लिए अनुमति देता है। इन अंतरकोशिकीय दबावों को ऊतक के विकास और मरम्मत , घाव भरने और कैंसर मेटास्टेसिस12,15 ,16,17के लिए महत्वपूर्ण होने का सुझाव दिया गया है . इसके अतिरिक्त, अंत:कोशिकीय कोशिका प्रवास तथा अंत:मंडलीय अवरोध फलन17,18में अंतरकोशिकीय तनावों को भी महत्वपूर्ण बनाने का सुझाव दिया गया है । जबकि तंग जंक्शनों और अनुयायियों जंक्शनों जैसे सेल-सेल जंक्शनों को एंडोथेलियल अंतरकोशिकीय तनाव उत्पादन और संचरण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने का सुझाव दिया गया है, अंतराल जंक्शनों की भूमिका मायावी बनी हुई है। गैप जंक्शनों को शारीरिक रूप से आसन्न कोशिकाओं को जोड़ता है और विद्युत धारा और अणुओं (lt;1 KDa ) को पड़ोसी कोशिकाओं19,20,21के बीच से गुजरने के लिए एक मार्ग प्रदान करता है . यद्यपि अंत:प्रज्ञा कोशिकाएं Cx37, Cx40 और Cx43 अंतराल जंक्शनों19,22,Cx43 को व्यक्त करती हैं , रोग की प्रगति के मामले में निश्चित रूप से सबसे महत्वपूर्ण है23. Cx43 के महत्व के साक्ष्य तथ्य यह है कि चूहों में Cx43 के आनुवंशिक विलोपन हाइपोटेंशन24 में परिणाम और एंजियोजेनेसिस पर प्रतिकूल प्रभाव पड़ता है में पाया जा सकता है25. इसके अलावा, Cx43 सेल प्रवास और प्रसार के लिए महत्वपूर्ण होने के लिए प्रलेखित किया गया है और atherosclerosis की प्रगति में18,22,23,24,25 .

इस प्रोटोकॉल में, हम TFM और MSM का इस्तेमाल किया जांच करने के लिए कि क्या कर्षण और intercellular तनाव पीढ़ी confluent के भीतर, endothelial मोनोलेयर endothelial अंतराल जंक्शन Cx43 के विघटन से प्रभावित होगा. हम 2,5-dihydroxychalcone (चैलकोन) के साथ Cx43 बाधित, एक अणु Cx43 अभिव्यक्ति26को बाधित करने के लिए प्रलेखित . Chalcone SiRNA के बजाय Cx43 को बाधित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था के रूप में chalcone पहले ली एट अल द्वारा सूचित किया गया है Cx43 अभिव्यक्ति26को बाधित करने के लिए . इसके अलावा, हम विशेष रूप से endothelium पर chalcone के प्रभाव में रुचि रखते थे के रूप में यह भी एक विरोधी भड़काऊ और विरोधी प्लेटलेट यौगिक है कि संभवतः रोकथाम और विभिन्न संवहनी के उपचार के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है होने की सूचना दी गई है रोग26| Chalcone उपचार प्रयोग शुरुआत के बाद एक घंटे प्रदर्शन किया गया, chalcone इलाज monolayers छह घंटे की कुल के लिए छवि थे, और छवि प्रसंस्करण एक कस्टम लिखा MATLAB कोड के साथ किया गया था कर्षण निर्धारित करने के लिए और बाद में intercellular तनाव. हमारे परिणाम कर्षण और intercellular तनाव में एक समग्र कमी से पता चला, सुझाव Cx43 endothelial biomechanics में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है.

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Protocol

1. पॉलीऐक्रिलमाइड (पीए) जैल बनाना

  1. पेट्री डिश की तैयारी
    1. 200 एमएल अल्ट्राप्यूर पानी को 80 डिग्री सेल्सियस एसिटिक एसिड और 3-(ट्राइमेथॉक्सीसिलिल) के 50 डिग्री एल के साथ मिलाकर बांध सिलन घोल तैयार करें। बाइंड silane hydrogel लगाव के लिए कांच के नीचे पेट्री डिश सतह functionalize करने के लिए इस्तेमाल किया एक समाधान है।
    2. कम से कम 1 ज के लिए एक हलचल प्लेट पर बाइंड silane समाधान हिलाओ.
    3. 45 मिनट के लिए बाइंड silane समाधान के साथ पेट्री पकवान के केंद्र अच्छी तरह से इलाज.
    4. बाँध silane समाधान निकालें और अल्ट्रा शुद्ध पानी 2x-3x के साथ पेट्री पकवान कुल्ला.
    5. पेट्री डिश सतह सूखी और भविष्य में उपयोग के लिए कमरे के तापमान पर दुकान।
  2. हाइड्रोजेल समाधान की तैयारी
    1. तालिका 1के अनुसार 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में अल्ट्रा-शुद्ध जल, 40% ऐक्रिलमाइड और 2% बिस्-ऐक्रिलमाइड मिलाएं।
    2. hydrogel समाधान करने के लिए फ्लोरोसेंट मोती के 80 डिग्री एल जोड़ें.
    3. धीरे जेल समाधान के साथ मोती मिश्रण करने के लिए ट्यूब हिला.
    4. हल्के से अपकेंद्रण ट्यूब पर ट्यूब टोपी कस और एक वैक्यूम कक्ष में जगह है.
    5. वैक्यूम कक्ष में कम से कम 45 मिनट के लिए जेल समाधान Degas.
  3. हाइड्रोजेल बहुलकन
    1. सबसे पहले, 10% अमोनियम पर्सुलफेट का 75 डिग्री सेल्सियस जोड़ें (अल्ट्रा-शुद्ध पानी में घुलगया) और फिर हाइड्रोजेल समाधान में TEMED (N,N,N',N',N'-tetrametethane-1,2-diamine) के 8 $L जोड़ें।
    2. पेट्री डिश के केंद्र में हाइड्रोजेल विलयन का 24 डिग्री सेल्सियस रखें (सारणी 2देखें)।
    3. hydrogel समतल करने के लिए एक 18 मिमी कवरस्लिप का प्रयोग करें। यह 100 डिग्री मीटर की ऊंचाई दे देंगे।
    4. जेल बहुलकीकरण के लिए कम से कम 30-40 मिनट प्रतीक्षा करें।
    5. जेल निर्जलीकरण को रोकने के लिए अल्ट्रा-शुद्ध पानी में बहुलक hydrogel जलमग्न।
    6. फ्लोरोसेंट मोती की photobleaching को रोकने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ पेट्री पकवान कवर और 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान.
      नोट: hydrogels अप करने के लिए की अवधि संग्रहीत किया जा सकता 3 महीने, लेकिन यह सुझाव दिया है कि इन जैल अब से अधिक इस्तेमाल किया जा 1 सप्ताह के निर्माण के बाद सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त करने के लिए.

2. सेल संस्कृति

  1. कोशिका संस्कृति माध्यम में संस्कृति मानव नाभि शिरा endothelial कोशिकाओं (HUVECs) 200 (सामग्री की तालिकादेखें) 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर 0.1% जिलेटिन लेपित फ्लास्क पर 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक .

3. माइक्रोपैटर्न स्टेंसिल तैयारी

  1. 20:1 (आधार: इलाज एजेंट) के अनुपात में सिलिकॉन इलाज एजेंट के साथ सिलिकॉन आधार मिश्रण द्वारा एक 100 मिमी पेट्री डिश में polydimethylsiloxane (PDMS) की एक पतली परत का इलाज।
    नोट: यह एजेंट अनुपात (उदा. 10:1 या 30:1) के इलाज के लिए अन्य आधार का उपयोग करने के लिए संभव है। हालांकि, एजेंट अनुपात के इलाज के लिए एक कम आधार एक कठोर पैटर्न उपज, जबकि एजेंट अनुपात के इलाज के लिए एक उच्च आधार एक नरम पैटर्न का उत्पादन होगा।
  2. एक 20:1 (आधार: curing एजेंट) PDMS समाधान तैयार है और एक 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में ध्यान से मिश्रण. ट्यूब उल्टा उलटा और PDMS समाधान की उचित मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए जोरदार कई बार हिला, के रूप में nonuniform मिश्रण अधूरा बहुलकीकरण में परिणाम होगा.
  3. 190 x ग्रामपर 1 मिनट के लिए PDMS समाधान centrifuging द्वारा ऊपर कदम से शुरू किया गया है कि बुलबुले निकालें.
  4. एक 100 मिमी पेट्री डिश के केंद्र में PDMS समाधान के 5-6 एमएल डालो और पकवान आंदोलन जब तक PDMS समाधान पूरे पेट्री डिश सतह को शामिल किया गया.
  5. 50-60 डिग्री सेल्सियस पर रात भर PDMS समाधान का इलाज। PDMS भी कमरे के तापमान पर ठीक किया जा सकता है.
  6. एक छेद पंचर के साथ एक परिपत्र, 16 मिमी व्यास PDMS स्टेंसिल निकालें.
  7. PDMS स्टेंसिल में छोटे छेद बनाने के लिए एक बायोप्सी पंच का प्रयोग करें। इस प्रोटोकॉल एक 1.25 मिमी व्यास बायोप्सी पंच का उपयोग करता है.
  8. पहले 2-3 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में उन्हें submerging द्वारा PDMS stencils बाँझ, अतिरिक्त इथेनॉल बंद aspirating और फिर 5 मिनट के लिए एक यूवी प्रकाश के तहत रखने.

4. कोलेजन-I हाइड्रोजेल कोटिंग

  1. hydrogel से कवरस्लिप निकालें और किसी भी अतिरिक्त तरल aspirate.
  2. हाइड्रोजेल सतह पर पीडीएमएस स्टेंसिल रखें।
    नोट: चिमटी का उपयोग PDMS स्टेंसिल और हाइड्रोजेल सतह के बीच एक पानी तंग सील सुनिश्चित करने के लिए पीडीएमएस स्टेंसिल पर हल्का दबाव लागू करने के लिए किया जा सकता है। हमारे PDMS स्टेंसिल पानी तंग कर रहे हैं और इस प्रकार जेल शीर्ष सतह और PDMS स्टेंसिल नीचे सतह के बीच पानी का उपयोग रोकने के. इसके अलावा, हाइड्रोजेल कठोरता को पीडीएमएस कठोरता के संबंध में समायोजित करने की आवश्यकता नहीं है।
  3. सल्फोसिसिनीमिडिल-6-(4-अजीडो-2-निट्रोफीनिलेमिनो) हेक्सानोएट (सल्फो-सैनपाह) के साथ हाइड्रोजेल सतह को कवर करें जो 0.1 एम हेप्स (4-(2-हाइड्रोक्सीएथिल)-1-पिपराज़ीनइथेनसल्फोनिक एसिड की एकाग्रता में बफर समाधान 1: 1000 और एक जगह के तहत एक एकाग्रता में एक बफर समाधान है। दीपक (शक्ति 36 डब्ल्यू) 8 मिनट के लिए.
  4. अतिरिक्त सल्फो-सैनपाह और HEPES समाधान को प्रेरित करें और हाइड्रोजेल को 0.1 एम हेप्स के साथ दो बार कुल्ला करें और अल्ट्रा-शुद्ध पानी के साथ एक अतिरिक्त दो कुल्ला करें।
  5. 0.1 मिलीग्राम/एमएल कोलेजन-I के साथ अतिरिक्त अल्ट्रा-शुद्ध पानी और कोट हाइड्रोजेल्स को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दें।
  6. व्यंजन कवर और photobleaching से फ्लोरोसेंट मोती की रक्षा.
    नोट: PDMS stencils micropatterned monolayers बनाने के लिए उपयोग किया जाता है. Micropaterned monolayers उपयोग किया जाता है के रूप में वे एक ही ज्यामिति और आयामों के कई monolayers के लिए अनुमति के लिए प्रत्येक प्रयोग के दौरान एक साथ मनाया जा. हालांकि, micropatterns वांछित नहीं होना चाहिए ऊपर कदम 4.2 के अपवाद के साथ पीछा किया जा सकता है.

5. hydrogels पर HUVEC मोनोलेयर्स बनाना

  1. इनक्यूबेटर में 3-5 मिनट के लिए ऊतक संस्कृति फ्लास्क से कोशिकाओं को अलग करने के लिए 1x ट्रिप्सिन का उपयोग करें।
  2. trypsinization के बाद, trypsin समाधान करने के लिए सेल संस्कृति मीडिया जोड़ें और 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में जोड़ें.
  3. 1710 x ग्रामपर 3 मिनट के लिए कोशिका समाधान को सेंट्रीफ्यूज करें। कोशिकाओं का एक छोटा, सफेद गोली अपकेंद्रित्र ट्यूब के तल पर दिखाई देना चाहिए।
  4. सुपरनेंट को प्रेरित करें और मीडिया में कोशिकाओं को 50 x 104 कोशिकाओं/
  5. hydrogel से कोलेजन-I निकालें और पीबीएस के साथ 1x कुल्ला।
  6. पीडीएमएस स्टेंसिल के शीर्ष पर 75 x 103 कोशिकाओं को जोड़ें और कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2पर इनक्यूबेटर में कम से कम 1 एच के लिए हाइड्रोजेल सतह से संलग्न होने की अनुमति दें।
  7. PDMS स्टेंसिल निकालें और पेट्री डिश में मीडिया के कम से कम 2 एमएल जोड़ें. किसी भी संलग्न कोशिकाओं को हटाने और 70% इथेनॉल के साथ छिड़काव और फिर 5 मिनट के लिए यूवी प्रकाश के तहत रखने से बाँझ करने के लिए 10x trypsin में PDMS स्टेंसिल डूब।
  8. इनक्यूबेटर में पेट्री डिश रखें और कम से कम 36 एच या एक confluent मोनोलेयर मनाया जाता है जब तक प्रतीक्षा करें।

6. Cx43 व्यवधान के लिए 2,5 dihydroxychalcone उपचार

  1. डाइमेथिलसल्फोक्साइड (DMSO) में 2,5 डाइहाइड्रॉक्सीचलकोन (चैलकोन) को भंग करके 0.1875 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक समाधान करें।
  2. सेल संस्कृति मीडिया के साथ शेयर समाधान को कम chalcone एकाग्रता बनाने के लिए (0.2 g/mL) alicot और एक उच्च chalcone एकाग्रता (2 g/mL) alicot.

7. डेटा अधिग्रहण

  1. सूक्ष्मदर्शी के साथ कोशिका द्वीपों का पता लगाएँ।
  2. क्रमशः, छवि सेल आकारिकी और hydrogel विस्थापन के लिए चरण इसके विपरीत और मनका छवियों का अधिग्रहण।
    नोट: इस प्रोटोकॉल डेटा प्राप्ति के लिए एक 10x उद्देश्य का उपयोग किया।
  3. प्रयोग के अंत में, 10x trypsin के साथ कोशिकाओं को अलग और कोशिकाओं के बिना जेल सतह की एक छवि प्राप्त (संदर्भ छवि).

8. इम्यूनोस्टेनिंग

  1. 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 4% फार्मेल्डिहाइड और इनक्यूबेट के साथ मोनोलेयर्स को ठीक करें।
  2. 4% फॉर्मेल्डिहाइड निकालें और कोशिकाओं को permebilize करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 0.2% ट्राइटन एक्स-100 जोड़ें।
  3. 0.2% Triton X-100 निकालें और PBS 2x-3x के साथ monolayers कुल्ला.
  4. 37 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए 2% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (BSA) समाधान के साथ कवर मोनोलेयर।
  5. 2% बीएसए समाधान निकालें और पीबीएस 2x-3x के साथ मोनोलेयर्स कुल्ला।
  6. नमूना करने के लिए 1:400 की एकाग्रता पर प्राथमिक Cx43 एंटीबॉडी जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
  7. प्राथमिक एंटीबॉडी निकालें और पीबीएस 2x-3x के साथ नमूना कुल्ला.
  8. 3:200 की सांद्रता में द्वितीयक एंटीबॉडी जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 ज के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: नमूने photobleaching को रोकने के लिए कवर किया जाना चाहिए.
  9. माध्यमिक एंटीबॉडी निकालें और PBS 2x-3x के साथ कुल्ला.
  10. बढ़ते मध्यम (Fluromount-G DAPI) के साथ कवर नमूना और एक 18 मिमी कवर पर्ची के साथ सील.

9. कर्षण बल माइक्रोस्कोपी (टीएफएम) और मोनोलेयर तनाव माइक्रोस्कोपी (एमएसएम) का कार्यान्वयन

  1. हाइड्रोजेल विरूपण गणना
    नोट: MATLAB का उपयोग कर एक चरण दर चरण विस्थापन गणना प्रक्रिया नीचे दी गई है।
    1. MATLAB में मुख्य कर्षण.m फ़ाइल खोलें (सभी MATLAB दिनचर्या के लिए अनुपूरक सामग्री देखें).
      नोट: MATLAB निर्देशिका सेट करने के लिए कोड में दिए गए निर्देशों का पालन करें।
    2. निम्न चरों को परिभाषित करें: छवि प्रारूप, पिक्सेल-से-माइक्रोन रूपांतरण, यंग का मापांक, पॉइसन का अनुपात, और माइक्रोस्कोप उद्देश्य.
    3. OpenFiles सबनेश का उपयोग कर मनका, trypsin छवि, और चरण छवि का पता लगाएँ।
      नोट: बड़े डेटा सेट के लिए, यह अनुक्रमिक क्रम में फ़ाइलों को नाम करने के लिए सबसे अच्छा है। उदाहरण के लिए, फ़ाइलों का नाम होना चाहिए "filename1.tif", "filename2.tif", आदि.
    4. सेल मोनोलेयर के चारों ओर एक वर्ग ROI (ब्याज का क्षेत्र) को परिभाषित करें और मूल छवि को क्रॉप करने के लिए सेल-cropper सबनेटोने को निष्पादित करें।
    5. विस्थापनकी गणना करने के लिए विस्थापन-खोजक उपनेमका निष्पादित करें.
    6. माइक्रोस्कोप चरण बहाव के कारण हो सकता है कि किसी भी अतिरिक्त गैर-कोल्यूलर विस्थापन को दूर करने के लिए Dedrift सबरूटीन निष्पादित करें।
  2. कर्षणों की अभिकलन
    नोट: यहाँ, unconstrained कर्षण हमारे कस्टम लिखा MATLAB दिनचर्या का उपयोग कर गणना कर रहे हैं. पहले उल्लेख किया MATLAB दिनचर्या का उपयोग कर कदम कर्षण गणना द्वारा कदम नीचे दिया गया है.
    1. कर्षण.m दिनचर्या के भीतर निम्नलिखित चर को परिभाषित करें: सीमा हालत, जेल मोटाई, जेल ऊंचाई, और बहाव.
    2. कर्षणकीमकीण्डर उपनेमका को ट्रैक्शनकी की गणना करने के लिए और ट्रैक्शन को प्लॉट करने के लिए प्लॉट-ट्रैक्शन सबरूटीन निष्पादित करें। एक्स दिशा (Tx) और वाई-दिशा (Ty) में सभी कर्षण उनके संबंधित पिक्सेल स्थानों के साथ एक कर्षण.dat फ़ाइल है कि कोड द्वारा उत्पन्न किया जाएगा में पाया जा सकता है.
  3. अंतरकोशिकीय तनावों की अभिकलन
    नोट: पहले उल्लेख किया MATLAB दिनचर्या का उपयोग intercellular तनाव गणना के लिए कदम दर कदम निर्देश नीचे दिए गए हैं.
    1. मोनोलेयर सीमा निर्दिष्ट करने के लिए मार्क-सर्कुलर-डोमेन सबनेटोने को निष्पादित करें। यह रूटिन सभी फसली चरण छवियों को क्रमिक रूप से उपयोगकर्ता के लिए मोनोलेयर के चारों ओर एक सीमा आकर्षित करने के लिए संकेत देगा। आदेश विंडो में उत्पन्न nXPts का एक नोट रखें और उन्हें बाद में दोनों एक्स अक्ष और फेम विश्लेषण के लिए वाई अक्ष में ग्रिड पैरामीटर के रूप में उपयोग करें (चरण 9.3.2 देखें).
    2. intercellular तनाव की गणना करने के लिए Run$StressCode निष्पादित करें। इस subनेश सीधे "model.in" फ़ाइल से पैरामीटर पढ़ता है और फेम विश्लेषण करने के लिए "island.exe" निष्पादित करता है। इस दिनचर्या को चलाने से पहले, सुनिश्चित करें कि model.in फ़ाइल में सभी पैरामीटर, एक्स और वाई में ग्रिड पैरामीटर, माइक्रोन रूपांतरण के लिए पिक्सेल, जेल के यंग के मापांक, पॉइसन का अनुपात, मोनोलेयर ऊंचाई, और मोनोलेयर पैटर्न (पट्टी या छेद), संपादित किए जाते हैं सही.
    3. प्लॉट का उपयोग कर सभी FEM परिणाम प्लॉट [FEM]results subroutine.
      नोट: उत्पन्न सभी परिणाम स्वचालित रूप से MATLAB निर्देशिका में परिणाम फ़ोल्डर में संग्रहीत किया जाएगा।

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Representative Results

नियंत्रण के चरण विपरीत छवियों, 0.2 g/mL, और 2 g/mL chalcone इलाज मोनोलेयर्स chalcone उपचार से पहले 30 मिनट लिया गया (चित्र 1ए -सी) और chalcone उपचार के बाद 2 घंटे (चित्र 1D-F) कोशिका-प्रेरित मनका विस्थापन (जेडएम) को कम मात्रा में चालकोन और उच्च खुराक चालोन स्थितियों में कमी देखी गई (चित्र 2ई, एफ) जब नियंत्रण की तुलना में एचयूईसी मोनोलेयर्स ( चित्र2डी)। चालकोन उपचार से पहले, rms कर्षण सभी स्थितियों के लिए 51 के आसपास थे - 8 पा (चित्र 3ए -सी) . चालकोन उपचार के बाद, एक कम खुराक चैलकोन उपचारित मोनोलेयर्स में आरएमएस कर्षणों में एक छोटी सी वृद्धि हुई थी (चित्र 3ई) और लगभग 2 गुना कमी तम्स कर्षणों में 18 - 2 उच्च खुराक में चैकोन उपचारित मोनोलेयर्स ( चित्र 3च) नियंत्रण की तुलना में (चित्र 3ं). चालकोन उपचार से पहले, औसत सामान्य अंतरकोशिकीय तनाव लगभग 220 - 66 पा (चित्र 4ए-सी) थे। चालकोन उपचार के बाद, औसत सामान्य अंतरकोशिकीय तनाव परिमाण में 285 डिग्री 75 पै कम खुराक चैलकोन उपचार के साथ वृद्धि हुई (चित्र 4ई) लेकिन औसत सामान्य अंतरकोशिकीय तनाव परिमाण में एक महत्वपूर्ण कमी 106 उच्च खुराक चालकोन उपचार के साथ 4 पा (चित्र 4च) जब औसत सामान्य अंतरकोशिकीय तनावों को नियंत्रित करते हैं (235 ] 18 पा , चित्र 4छ) । अधिकतम कतरनी अंतरकोशिकीय तनाव 241 के आसपास थे - 30 पा (चित्र 5ए- सी) chalcone उपचार से पहले , लेकिन chalcone उपचार के बाद, वहाँ 227 तक कमी थी - 20 पा कम chalcone एकाग्रता पर (चित्र 5ई) और अधिकतम कतरनी अंतरकोशिकीय प्रतिबल परिमाण में और कमी 91 डिग्री 6 पा उच्च चालकोन सांद्रता उपचार (चित्र 5च) की तुलना में अधिकतम कतरनी अंतरकोशिकीय तनावों (270 ] 30 पा, चित्र 5D ) ). कर्षणों तथा अंतरकोशिकीय तनावों का विश्लेषण चित्र 6ए-सीमें प्रस्तुत किया गया है। सभी प्लॉट किए गए परिणामों का सांख्यिकीय महत्व (टी-परीक्षण और एकल कारक ANOVA परीक्षण) के लिए परीक्षण किया गया, और दोनों परीक्षणों में परिणाम सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण पाए गए(च और 0.05) जब स्वतंत्र रूप से तुलना 0.2 g/mL chalcone एकाग्रता और 2 शर्तों को नियंत्रित करने के लिए (बिना चालकोन के)।

Figure 1
चित्र 1: HUVEC monolayers के प्रतिनिधि चरण विपरीत छवियों. 30 मिनट (ए) और 2 ज (डी) पर नियंत्रण HUVECs के उदाहरण चरण विपरीत छवियों , 30 मिनट (बी) और 2 एच (ई) पर इलाज किया HUVECs के चरण विपरीत छवियों और 2 g/ प्रयोग की शुरुआत में 30 मिनट (सी) और 2 ज (एफ) पर। स्केल बार 1.25 मिमी के मोनोलेयर व्यास का प्रतिनिधित्व करता है. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: एचयूईसी मोनोलेयर्स द्वारा उत्पादित विस्थापन क्षेत्र का चित्रण। 30मिनट (ए) और 2 ज ( डी ) पर नियंत्रण के प्रतिनिधि विस्थापन (जेडएम ) और 2 ज (डी) HUVECs का इलाज 30 मिनट (बी) और 2 ज (ई) पर 2 डिग्री / प्रयोग शुरुआत. स्केल बार 1.25 मिमी के मोनोलेयर व्यास का प्रतिनिधित्व करता है. रंग पट्टी $m में विस्थापनों का प्रतिनिधित्व करती है. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: HUVEC मोनोलेयर्स में RMS कर्षण वितरण। नियंत्रण के rms कर्षण (पा) का उदाहरण, 0.2 g/mL chalcone, और 2 g/mL chalcone HUVECs chalcone उपचार से पहले (ए -सी) और chalcone उपचार के एक घंटे के बाद (डी-एफ), क्रमशः. स्केल बार 1.25 मिमी के मोनोलेयर व्यास का प्रतिनिधित्व करता है. रंग पट्टी Pa. में RMS कर्षण का प्रतिनिधित्व करता है कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: एचयूईसी मोनोलेयर्स में औसत सामान्य अंतरकोशिकीय तनाव वितरण। औसत सामान्य अंतरकोशिकीय तनाव (पा ) नियंत्रण HUVECs का वितरण 30 मिनट (ए) और 2 ज (डी) पर किया जाता है , एचयूवीसी को 30 मिनट (बी) और 2 ज (ई) पर 2 डिग्री / और 2 ज (एफ) स्केल बार 1.25 मिमी के मोनोलेयर व्यास का प्रतिनिधित्व करता है रंग पट्टी पा में तनाव का प्रतिनिधित्व करता है कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: अधिकतम शीर अंतरकोशिकीय तनाव वितरण HUVEC monolayers में. अधिकतम कतरनी अंतरकोशिकीय तनाव (पा) नियंत्रण HUVECs का वितरण 30 मिनट (ए) और 2 ज (डी) पर किया जाता है , एचयूवीसी को 30 मिनट (बी)और 2 ज (ई) पर 2 डिग्री / 2 ज (एफ) स्केल बार 1.25 मिमी के मोनोलेयर व्यास का प्रतिनिधित्व करता है रंग पट्टी पा में तनाव का प्रतिनिधित्व करता है कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6: HUVEC मोनोलेयर्स में आरएमएस कर्षण और इंटरसेल्यूलर तनाव की तुलना और HUVEC अंतराल जंक्शन Cx43 संरचनाओं पर chalcone उपचार के प्रभाव। नियंत्रण की तुलना में एचयूईसी मोनोलेयर्स पर एवरेंन नॉर्मल इंटरसेलरल स्ट्रेस (ए), अधिकतम कतरनी अंतरकोशिकीय तनाव (बी) और आरएमएस ट्रैक्शन (सी) के प्रभाव को दिखाते हैं ( 0.2 डिग्री ग्राम/ त्रुटि पट्टियाँ मानक त्रुटि दिखाएँ। परिणाम सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण होना करने के लिए पाया गया (नमूना आकार - 6 द्वीपों, 95% का विश्वास स्तर के साथ) नियंत्रण की तुलना में दोनों टी-परीक्षणों का उपयोग करना(च और 0.05) और एकल कारक ANOVA(च और 0.05)। अलग-अलग व्यंजनमें, इम्यूनोस्टेनिंग का प्रदर्शन नरम 1.2 केपीए हाइड्रोगेल्स पर रहने वाले कोशिकाओं के द्वीपों के लिए दवा के 5 एच के बाद किया गया था। हरे रंग Cx43 का प्रतिनिधित्व करता है और नीले DAPI (न्यूक्लियस) का प्रतिनिधित्व करता है। पैनल डी निम्नलिखित दर्शाया गया है: नियंत्रण (ई, एच), 0.2 [g/mL chalcone इलाज कोशिकाओं (एफ, मैं) और 2 डिग्री ग्राम / स्केल बार - 200 डिग्री मी, उद्देश्य - 20x. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Supplementary Figure 1
अनुपूरक चित्र 1: उच्च संकल्प Cx43 HUVEC monolayers में धुंधला. Chalcone की खुराक पर निर्भर प्रभाव का निरीक्षण करने के लिए Cx43 (हरा) और नाभिक (DAPI, नीले) के लिए फिक्स्ड HUVEC मोनोलेयर्स दाग े थे। उच्च आवर्धन छवियों (63x उद्देश्य) ज्यादातर नाभिक के आसपास Cx43 स्थानीयकरण प्रकट (हरी फ्लोरोसेंट तीव्रता से स्पष्ट). दिखाया गया है नियंत्रण (ए-सी), 0.2 g/mL chalcone इलाज कोशिकाओं (डी-एफ) और 2 g/mL chalcone इलाज कोशिकाओं (जी -I) कर रहे हैं. स्केल बार - 100 डिग्री मी, उद्देश्य - 63x तेल विसर्जन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

1200 पा 870 पा 1 के.पा. 4 के.पीए 6.3 के.पीए 11 के.पीए 90 के.पीए 150 kPa
समाधान संघटन 0.05% बीआईएस 0.1% बीआईएस 0.03% बीआईएस 0.1% बीआईएस 0.03% बीआईएस 0.07% बीआईएस 0.3% बीआईएस 0.6% बीआईएस
5.5% ऐक्रिल 2% ऐक्रिल 5% एक्रिल 5% एक्रिल 10% एक्रिल 10% एक्रिल 12% एक्रिल 12% एक्रिल
अल्ट्रा शुद्ध पानी 12.49 एमएल 13.38 एमएल 12.78 एमएल 12.255 एमएल 10.905 एमएल 10.63 एमएल 8.30 एमएल 5.9 एमएल
40% ऐक्रिलमाइड 2.062 एमएल 750 जेडएल 1.875 एमएल 1.875 एमएल 3.75 मिलीलीटर 3.75 एमएल 4.5 एमएल 4.5 एमएल
2% बीआईएस एक्रिलमाइड 375 जेडएल 750 जेडएल 225 जेडएल 750 जेडएल 225 जेडएल 525 जेडएल 2.12 एमएल 4.5 एमएल
फ्लूरोसेंट मोती (0.2 डिग्री मीटर या 0.5 डिग्री मी) 80 डिग्री सेल्सियस 80 डिग्री सेल्सियस 80 डिग्री सेल्सियस 80 डिग्री सेल्सियस 80 डिग्री सेल्सियस 80 डिग्री सेल्सियस 80 डिग्री सेल्सियस ट्रैक्शन औसत दर्जे के नहीं हैं

तालिका 1: Polyacrylamide जेल विभिन्न युवा moduli के लिए योगों बनाने.

आयतन मोटाई कवरस्लिप
20 मिमी sl अच्छी तरह से मोटी 500 $L $ 1 मिमी 25 मिमी
पतली 24 जेडएल $100 $m 18 मिमी
14 मिमी sl अच्छी तरह से मोटी 175 जेडएल $700 $m 18 मिमी
पतली 10.3 जेडएल $100 $m 12 मिमी
14 मिमी 6-वेल मोटी 280 जेडएल $1.5 मिमी 18 मिमी

तालिका 2: जेल मात्रा और मोटाई.

पूरक फ़ाइल: MATLAB दिनचर्या. कृपया इस फ़ाइल को देखने के लिए यहाँ क्लिक करें (डाउनलोड करने के लिए सही क्लिक करें).

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Discussion

हमारे समूह, साथ ही अन्य लोगों, सफलतापूर्वक TFM और एमएसएम का उपयोग कर रहा है विभिन्न रोग और शारीरिक सेलुलर प्रक्रियाओं में सेल सेल जंक्शनों के प्रभाव की जांच करने के लिएइनविट्रो 7,15,18,27 . उदाहरण के लिए, हार्डिन एट अल ने एक बहुत ही व्यावहारिक अध्ययन प्रस्तुत किया जो यह सुझाव देता है कि अंत:कोशिकीय कोशिकाओं में अंतरकोशिकीय द्रव संचरण का मार्गदर्शन करताहै। हालांकि यह संभव Cx43 से संबंधित परिवर्तन हम यहाँ हार्डिन एट अल द्वारा रिपोर्ट परिवर्तन करने के लिए रिपोर्ट से संबंधित है, हम विशेष रूप से इस प्रोटोकॉल में paracellular अंतर गठन पता नहीं है. यहाँ, हम विशेष रूप से अंतराल जंक्शन Cx43 लक्ष्य और endothelial biomechanics पर इसके प्रभाव की जांच करने के लिए एक यांत्रिकी आधारित प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया.

इस प्रोटोकॉल को सफल बनाने के लिए, वहाँ कुछ चुनौतियों है कि हम पर काबू पाने के लिए किया था, जिनमें से कुछ हो सकता है अन्य शोधकर्ताओं को इसी तरह के अध्ययन के लिए हमारे प्रोटोकॉल अपनाने का फैसला करना चाहिए. एक बड़ी चुनौती एक इष्टतम chalcone खुराक रेंज जहां Cx43 अभिव्यक्ति बाधित किया जा सकता है खोजने के लिए किया गया था, जबकि एक साथ हमारे endothelial monolayers बरकरार रखते हुए. एचयूवीसी के लिए चैकोन का IC50 पहले 10.01 ग्राम/ हालांकि, जब हमने अपने HUVEC मोनोलेयर्स को 0.2 डिग्री/एमएल से लेकर 20 डिग्री ग्राम/एमएल तक कई चैलकोन सांद्रता को उजागर किया, तो हमने पाया कि 2 डिग्री जी/एमएल की एक चालकोन सांद्रता हमारे मोनोलेयर्स का सामना करते हुए अभी भी शेष है। एक confluent monolayer इस प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक था, के रूप में एक monolayer MSM का उपयोग intercellular तनाव को मापने के लिए आवश्यक है. अगले, हम chalcone की चयनित खुराक सफलतापूर्वक Cx43 संरचना या स्पष्ट अभिव्यक्ति बाधित अगर यह निर्धारित करने के लिए एक इम्यूनोफ्लोरेसींस परख प्रदर्शन किया. हमारे परिणाम से पता चला है कि जबकि Cx43 संरचना के साथ व्यवधान 0.2 g/mL chalcone नेत्रहीन नियंत्रण से भेद करने के लिए मुश्किल था, chalcone के 2 g/mL के साथ इलाज कोशिकाओं Cx43 संरचना और संभावित अभिव्यक्ति में एक स्पष्ट अंतर दिखाने के लिए दिखाई दिया ( चित्र 6D और अनुपूरक चित्र 1) । इसके अलावा, हमारे परिणामों से पता चला है कि Cx43 व्यवधान वास्तव में अपने उच्चतम एकाग्रता पर कर्षण और intercellular तनाव को कम करने से endothelial biomechanics प्रभावित करता है. इन निष्कर्षों Bazellieres एट अल के साथ समझौते में हैं, जो siRNA के साथ Cx43 के मौन भी कर्षण और intercellular तनाव को कम करने के लिए दिखाया है, लेकिन उपकला कोशिकाओं की एक चादर में27. हालांकि हमारे परिणाम दूसरों के साथ समझौते में हैं यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि अणु हम Cx43 अभिव्यक्ति, chalcone को बाधित करने के लिए इस्तेमाल किया, भी MapK और NFkB के सक्रियण को प्रभावित करने के लिए सुझाव दिया गया है Cx43 व्यवधान26के अलावा . इसलिए, चूंकि हमने उपर्युक्त अणुओं या उनके संबद्ध मार्गों को विशेष रूप से नहीं देखा था, इसलिए हम एक संभावित एमएपीके और एनएफकेबी क्षोभ के प्रभाव से इंकार नहीं कर सकते हैं जो एंडोथेलियल बायोमैकेनिक्स पर भी हो सकता है।

उल्लेखनीय बात यह है कि बरामद कर्षण और अंतरकोशिकीय तनाव प्रकृति में 2D होते हैं और विमान (z-दिशा) कर्षणों और अंतरकोशिकीयतनावों 12,13से बाहर की उपेक्षा करते हैं। जबकि वहाँ एक छोटी सी त्रुटि बाहर के विमान तनाव की अनदेखी के साथ जुड़ा हुआ है, यह त्रुटि नगण्य है13. इसके अतिरिक्त, मोनोलेयर का पार्श्व आयाम मोनोलेयर ऊँचाई (ज 5 उ) के सापेक्ष पर्याप्त रूप से बड़ा (1ण्25 मिमी) होता है ताकि हम z-दिशा में महत्वपूर्ण विस्थापनों की अपेक्षा न कर े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े इसके अलावा, MSM गणना monolayer सीमा12,13पर त्रुटि प्रदान करता है. हालांकि, Tambe एट अल प्रयोगात्मक पता चला है कि त्रुटियों ऑप्टिकल किनारों पर सबसे अधिक कर रहे हैं (यानी, monolayer सीमा) और decays जल्दी से सीमा किनारों से दूर13. हम micropatterning प्रदर्शन करते हैं और फिर intercellular तनाव की गणना करने के लिए सीमा त्रुटियों है कि intercellular तनाव गणना के दौरान हो सकता है से बचने के लिए पूरे monolayer.

मोनोलेयर तनाव माइक्रोस्कोपी का उपयोग इस प्रोटोकॉल में किया जाता है क्योंकि इस विधि से प्राप्त अंतरकोशिकीय तनाव सूचना आवश्यक है ताकि एंडोथेलियल बायोमैकेनिक्स पर भूमिका अंतराल जंक्शन व्यवधान की अधिक पूर्ण समझ हो सके। इसके अतिरिक्त, अंतरकोशिकीय तनावों को एंडोथेलियल बाधा कार्य में महत्वपूर्ण होने का सुझाव दिया गया है, जैसा कि हार्डिन एट अल15 और कृष्णन एट अल17द्वारा सुझाव दिया गया है। इसके अलावा, जबकि intercellular तनाव प्रतिनिधि यहाँ प्रस्तुत डेटा में कर्षण के लिए सहसंबद्ध थे, यह हमेशा उत्तेजना के आधार पर मामला नहीं है. स्टीवर्ड एट अल के अध्ययन में, उदाहरण के लिए, एंडोथेलियल अंतरकोशिकीय तनाव ों में तरल कतरनी के नीचे कम करने के लिए दिखाया गया था, जबकि कर्षण अपेक्षाकृत अपरिवर्तित बने रहे7. इसके अलावा, प्रोटोकॉल हम यहाँ मौजूद सेल व्युत्पन्न यांत्रिक बलों के एक साथ माप और जंक्शनों और फोकल आसंजन के धुंधला के लिए अनुमति नहीं है, लेकिन इस तरह के एक अतिरिक्त इस प्रोटोकॉल के लिए मानार्थ होगा. समापन में, प्रोटोकॉल हम यहाँ मौजूद एक यांत्रिकी आधारित विधि का वर्णन करने के लिए प्रभाव Cx43 की जांच करने के लिए केवल endothelial biomechanics पर है, विशेष रूप से endothelial सेल व्युत्पन्न बलों. हमारा मानना है कि हमारे यांत्रिकी आधारित प्रोटोकॉल वर्तमान में मौजूदा जैविक आधारित प्रोटोकॉल के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता क्षेत्र में सही मायने में groundbreaking काम प्रदान करते हैं.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस काम के केंद्रीय फ्लोरिडा स्टार्ट-अप फंड और राष्ट्रीय हृदय, फेफड़े, और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के रक्त संस्थान द्वारा पुरस्कार K25HL132098 के तहत समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 mm coverslip ThermoFisher 18CIR-1 Essential to flatten polyacrylamide gels
2% bis-acrylamide BIO-RAD 1610143 Component of polyacrylamide gel
2′,5′-Dihydroxychalcone SIGMA IDF00046 To disrupt Cx43 structure
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate SIGMA 2530-85-0 Stock solution to make bind silane mixture with acetic acid and ultra-pure water
40% Acrylamide BIO-RAD 1610140 Component of polyacrylamide gel
Acetic acid Fisher-Sceintific 64-19-7 Essential to make bind saline solution
Alexa Fluro 488 goat anti-mouse IgG; ThermoFisher Catalog # A-11001 Secondary antibody
Ammonium persulfate BIO-RAD 1610700 Polyacrylamide gel polymerizing agent
Bovine Serum Albumin (BSA) SIGMA 9048-46-8 To make blocking solution
Bovine Type I Atelo-Collagen Solution, 3 mg/mL, 100 mL Advance Biomatrix 5005-100ML Use as a extracellular matrix
Corning Cell Culture Phosphate Buffered Saline (1x) Fisher-Sceintific 21040CV Buffer Saline needed for cell culture
Dimethyl Sulfoxide, Fisher BioReagents Fisher-Sceintific 67-68-5 To dissolve chalcone and make stock solution
Fluoromount-G with DAPI ThermoFisher 00-4959-52 Mounting medium for immunostaing used to stain for DAPI
Fluroscent microsphere Carboxylate-modified beads ThermoFisher F8812 0.5 micron carboxylate-modified beads (red), 2% solids
HEPES buffer solution 1 M SIGMA 7365-45-9 Essential to
LVES ThermoFisher A1460801 Essential HUEVC media 200 supplement
Medium 200 ThermoFisher M200500 Essential media for HUVEC cell culture
Mouse monoclonal Cx43 antibody (CX - 1B1) ThermoFisher Catalog #13-8300 Primary antibody for Cx43
Petri dish (35 mm dia) CellVis D35-20-1.5H 35 mm petri dish with a 20 mm center well
Sulfo-SANPAH Crosslinker 100 mg Proteochem 102568-43-4 Essential to functionalize polyacrylamide gel surface
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit DOW corning 2646340 Silicon elastomer with curing agent to make PDMS
TEMED BIO-RAD 1610801 Polyacrylamide gel polymerizing agent
Triton-X 100 SIGMA 9002-93-1 To permeabilize cells
Trypsin -EDTA ThermoFisher 25300054 Used to detach cells

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References

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जैव रसायन अंक 152 ट्रैक्शन बल माइक्रोस्कोपी मोनोलेयर तनाव माइक्रोस्कोपी मेकोनोबायोलॉजी अंतराल जंक्शन Cx43 अंतरकोशिकीय तनाव
कोनेक्सिन 43 स्ट्रक्चरल व्यवधान के माध्यम से परेशान एंडोथेलियल बायोमैकेनिक्स
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Islam, M. M., Steward, Jr., R. L. Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption. J. Vis. Exp. (152), e60034, doi:10.3791/60034 (2019).

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