Summary
여기에서, 우리는 간격 접합 connexin 43를 중단하고 견인및 세포간 응력의 관측을 통해 내피 생체 역학에 있는 후속 충격을 측정하기 위하여 역학 기지를 둔 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
내피 세포는 세포 간 응력과 견인력을 생성하기 위해 설립되었지만, 내피 간 스트레스와 견인 생성에서 역할 갭 접합이 작용한다는 것은 현재 알려져 없습니다. 따라서, 우리는 여기에 갭 접합 코넥신 (Cx43)의 영향을 조사하는 역학 기반 프로토콜을 제시 (Cx43) 알려진 Cx43 억제제 2,5 디하이드록시 찰콘 (chalcone)에 동천 내피 단층을 노출시킴으로써 내피 생체 역학에 있다 이 억제제가 견인력과 세포간 응력에 미치는 영향을 측정합니다. 우리는 대조군과 비교할 때 높은 chalcone 복용량 (2 μg/mL)에서 견인력과 세포 간 응력 모두의 감소를 보여주는 대표적인 결과를 제시합니다. 이 프로토콜은 적절한 억제제가 사용된다는 가정하에 Cx43뿐만 아니라 다른 갭 접합에도 적용될 수 있습니다. 우리는 이 프로토콜이 심혈관 및 메카생물학 연구 분야에서 유용할 것이라고 믿습니다.
Introduction
물리적 인 힘의 효과및 세포 및 조직 생리학 및 병리학에 대한 기계적 특성의 연구를 참조하는 분야는 기계생물학1로알려져 있다. 메카노생물학에서 활용된 몇 가지 유용한 기술은 단층 스트레스 현미경 검사법 및 견인력 현미경입니다. 견인력 현미경법은 세포 기판 인터페이스에서 생성된 견인력을 계산할 수 있게 해주며, 단층 응력 현미경은 단일층 내의 인접 세포 간에 생성된 세포간 응력의 계산을 허용합니다2 ,3,4,5,6. 이전 방법에서 산출된 결과는 세포 유래 기계적 응력이 세포 프로세스의 호스트의 운명을 결정하는 중요한 역할을 한다는 것을건의했습니다 3,4,5. 예를 들어, 외부 기계적 힘에 노출되면 집단으로 이동하는 셀 그룹이 형태를 변경하고 모양을 편광하여 적용된 힘의 방향을 따라 정렬하고 이동하여 부분적으로견인7을 생성할 수 있습니다. 8. 견인은 세포 수축성을 평가하는 데 사용할 수 있는 메트릭을 제공하며 견인력 현미경 검사법(TFM)을 사용하여 계산됩니다. 견인력 현미경 검사법(TFM)은 세포 유도 기질 변형의 결정으로 시작하여 수학적으로 엄격한 역학 기반 계산 접근법을 사용하여 견인장을 계산합니다. 견인력을 계산하는 능력이 꽤 오랜 시간 동안 주변에 있기 때문에, 연구원은 TFM을 활용하여 암9,상처 치유10 및 엔지니어링 심장 평가를 포함한 다양한 프로세스에 대한 견인력이 미치는 영향을 밝혔습니다. 조직11.
TFM 및 MSM의 구현은 다음과 같은 순서로 실행되어야하는 세 가지 필수 단계로 나눌 수 있습니다 : 첫째, 세포에 의해 생성 된 하이드로 겔 변형이 결정됩니다; 둘째, 견인은 하이드로 겔 변형에서 회수됩니다. 셋째, 유한 요소 접근법은 전체 단층 내에서 정상 및 전단 세포 간 응력을 계산하는 데 사용됩니다. 겔 변위를 계산하기 위해, 세포와 형광 비드 이미지를 맞춤형 입자 이미지 속도계(PIV) 루틴을 사용하여 참조 비드 이미지(셀 제외)와 비교하였다. PIV 분석을 위한 상호 상관 윈도우 크기와 겹치는 것은 각각 32 x 32 픽셀 및 0.5로 선택되었다. 이때, 픽셀 시프트는 평면 변위를 얻기 위해 픽셀 대 미크론 변환 인자(우리의 현미경의 경우, 이 변환 인자는 0.65)와 곱하여 미크론으로 변환되었다. 평면 외 변위를 무시하는 것과 관련된 오류는 무시할 수있는 12,13입니다. 겔 변위를 계산한 후, 활용될 수 있는 두 가지 유형의 견인 측정, 제한된 견인력 및 구속되지 않은 견인력8,14가있다. 구속되지 않은 트랙션은 전체 시야(셀이 있는 영역 및 셀이 없는 영역 포함)에 대한 트랙션 필드를 제공하며, 제한된 트랙션은 셀14를포함하는 영역에 대해서만 트랙션 필드를 제공합니다. 그런 다음, 세포간 응력은 견인력 현미경 검사법의 연장인 단층 응력 현미경 검사법(MSM)을 사용하여 계산됩니다. MSM의 구현은 셀 기판 인터페이스에서 세포의 단층이 가하는 국부적 견인력이 뉴턴의 법칙 7에서 요구하는 대로 셀-셀 인터페이스에서 세포 간에 전달되는 기계적 힘에 의해 균형을 이루어야 한다는 가정을 기반으로 합니다7. ,12,13. 여기서 중요한 가정은 단층내의 견인 분포가 알려져 있고 힘 균형이 셀 재료 특성에 의존하지 않기 때문에 셀 단층이 얇은 탄성 시트로 처리 될 수 있다는 것입니다. 또 다른 주요 가정은 견인력이 광학 시야 내의 국소 세포 간 응력(단층 내)에 의해 균형을 이루고 이러한 힘 균형의 영향은 원위 영역(단층 외부)에서 최소화된다는것입니다 13. 따라서 단층 경계에서 세포간 응력, 변위 또는 둘 다의 조합으로 정의된 경계 조건은 MSM13을수행하는 데 매우 중요합니다. 위의 정보를 고려하여 MSM을 사용하여 유한 요소 분석(FEM)을 수행하여 최대 주 응력(σmax)및 최소 주 응력(σmin)을복구하여 단층. 이러한 주 응력은 이후에 전체 단층 내에서 2D 평균 정상 세포간 응력 [(σmax + σmin)/2] 및 2D 최대 전단 간 응력 [(σmax - σmin)/2]를 계산하는 데 사용됩니다. 12,13. 이 절차는 Tambe 등12,13에 의해 더 자세히 설명되어 있습니다.
단층 응력 현미경 검사법 (MSM)은 단층6,7,8,12,13내에서 생성된 세포 간 응력의 계산을 허용합니다. 이러한 세포간 스트레스는 조직 성장 및 수리, 상처 치유 및 암 전이12,15,16,17에중요한 것으로 제안되었다. 또한, 세포간 스트레스는 내피 세포 이동 및 내피 장벽 기능17,18에서도중요할 것으로 제안되었다. 단단한 접합부 및 접착접선 접합부와 같은 세포 세포 접합부는 둘 다 내피 세포 간 응력 생성 및 전송에 있는 중요한 역할을 하기 위하여 건의되는 동안, 간격 접합의 역할은 애매하게 남아 있습니다. 갭 접합부는 인접 한 세포를 물리적으로 연결하고 인접 세포19,20,21사이를 통과하는 전류 및 분자 (&1 KDa)에 대한 경로를 제공합니다. 내피 세포는 Cx37, Cx40 및 Cx43 갭 접합부19,22,Cx43을 발현하지만, Cx43은 틀림없이 질병 진행성23의측면에서 가장 중요하다. Cx43의 중요성의 증거는 마우스에서 Cx43의 유전 적 결실이 저혈압24의 결과이며 혈관 신생25에부작용이 있다는 사실에서 발견 될 수 있습니다. 또한, Cx43은 세포 이동 및 증식및 죽상동맥경화증의 진행에 중요한 것으로 문서화되어있다 18,22,23,24,25 .
이 프로토콜에서, 우리는 TFM 및 MSM을 사용하여 내피, 내피 단층 내의 견인 및 세포 간 스트레스 생성이 내피 갭 접합 Cx43의 붕괴에 의해 영향을 받을 지 여부를 조사했습니다. 우리는 Cx43 발현26을억제하기 위해 문서화된 분자인 2,5-디하이드록시찰콘(chalcone)으로 Cx43을 중단시켰습니다. Chalcone은 Cx43 발현26을중단시키기 위해 이전에 리 외에 의해 보고된 바와 같이 siRNA 대신 Cx43을 중단시키는 데 사용되었다. 또한, 우리는 또한 잠재적으로 다양한 혈관의 예방 및 치료에 사용될 수있는 항 염증 및 항 혈소판 화합물로보고되었기 때문에 내피에 대한 chalcone의 영향에 특히 관심이 있었다 병리학26. Chalcone 처리는 실험 개시 후에 1 시간, chalcone 처리한 단층은 총 6 시간 동안 심상하고, 심상 처리는 견인을 결정하기 위하여 주문을 쓰여진 MATLAB 부호로 수행되고 그 후에 세포 간 스트레스. 우리의 결과는 Cx43이 내피 생체 역학에 있는 중요한 역할을 한다는 것을 건의하는 견인및 세포간 응력에 있는 전반적인 감소를 보여주었습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 폴리아크릴아미드 (PA) 젤 만들기
-
페트리 접시의 준비
- 200 mL의 초순수와 80 μL 아세트산 및 50 μL의 3-(트리메톡시실릴) 프로필 메타크릴레이트를 혼합하여 바인드 실란 용액을 준비합니다. 바인드 시레인은 하이드로겔 부착을 위해 유리 바닥 페트리 접시 표면을 기능화하는 데 사용되는 용액이다.
- 바인드 시란 용액을 교반판에 적어도 1시간 동안 저어줍니다.
- 페트리 접시의 중심을 바인드 실란 용액으로 45분 동안 처리합니다.
- 바인드 스틸란 용액을 제거하고 페트리 접시를 초순수 2x-3x로 헹구세요.
- 페트리 접시 표면을 말려 실온에서 보관하여 나중에 사용할 수 있습니다.
-
하이드로겔 용액의 준비
- 표 1에따라 초순수, 40% 아크릴아미드 및 2% 비스-아크릴아미드를 15 mL 원심분리기 튜브에 섞는다.
- 하이드로겔 용액에 80 μL의 형광 비드를 추가합니다.
- 튜브를 부드럽게 흔들어 구슬을 젤 용액과 섞습니다.
- 원심분리기 튜브의 튜브 캡을 가볍게 조이고 진공 챔버에 놓습니다.
- 진공 챔버에서 적어도 45 분 동안 젤 용액을 탈기하십시오.
-
하이드로겔 중합
- 먼저, 10% 황황산 암모늄(초순수에 용해)의 75 μL을 넣고 8 μL의 TEMED(N,N,N', N'-Tetramelelethane-1,2-diamine)를 하이드로겔 용액에 추가합니다.
- 페트리 접시의 중앙에 하이드로겔 용액 24 μL을 놓습니다(표 2참조).
- 하이드로겔을 평평하게 하려면 18mm 커버슬립을 사용합니다. 이것은 ~ 100 μm의 높이를 줄 것이다.
- 겔 중합을 위해 적어도 30-40 분 기다립니다.
- 겔 탈수를 방지하기 위해 고분자 하이드로겔을 초순수에 담급합하십시오.
- 형광 비드의 광표백을 방지하기 위해 알루미늄 호일로 페트리 접시를 덮고 4 °C에서 보관하십시오.
참고 : 하이드로 겔은 최대 3 개월의 기간을 저장할 수 있지만, 이 젤은 최상의 결과를 얻기 위해 제조 후 1 주 이상 사용하지 않는 것이 좋습니다.
2. 세포 배양
- 배양 인간 배꼽 정맥 내피 세포(HUVECs)는 세포 배양 배지 200(재료 표참조)에서 37°C 및 5%CO2에서0.1% 젤라틴 코팅 플라스크상에 1% 페니실린-스트렙토마이신을 보충하였다.
3. 마이크로 패턴 스텐실 준비
- 실리콘 염기를 실리콘 경화제와 20:1 의 비율로 혼합하여 100 mm 페트리 접시에 폴리디메틸실록산(PDMS)의 얇은 층을 경화(base: 경화제).
참고: 경화제 비율(예: 10:1 또는 30:1)에 다른 베이스를 사용할 수 있습니다. 그러나, 경화제 비율이 낮은 염기는 더 단단한 패턴을 산출하고, 경화제 비율이 높을수록 더 부드러운 패턴을 생성할 것이다. - 20:1(기본:경화제) PDMS 용액을 준비하고 50 mL 원심분리기 튜브에 조심스럽게 섞습니다. 불균일한 혼합으로 불완전한 중합을 초래할 것이므로 튜브를 거꾸로 뒤집고 여러 번 격렬하게 흔들어 PDMS 용액의 적절한 혼합을 보장합니다.
- 190 x g에서1 분 동안 PDMS 솔루션을 원심 분리하여 위의 단계에서 도입 된 기포를 제거하십시오.
- 100mm 페트리 접시의 중앙에 5-6 mL의 PDMS 용액을 붓고 PDMS 용액이 전체 페트리 접시 표면을 덮을 때까지 접시를 교반합니다.
- PDMS 용액을 50-60°C에서 밤새 경화하였다. PDMS는 또한 실온에서 경화될 수 있다.
- 구멍 펀처가 있는 원형 직경 16mm PDMS 스텐실을 제거합니다.
- 생검 펀치를 사용하여 PDMS 스텐실에 작은 구멍을 만듭니다. 이 프로토콜은 1.25 mm 직경 생검 펀치를 사용합니다.
- PDMS 스텐실을 먼저 70% 에탄올에 2-3분 동안 담근 다음, 과도한 에탄올을 흡입한 다음 UV 광 아래에 5분 동안 두어 멸균합니다.
4. 콜라겐-I 하이드로겔 코팅
- 하이드로겔에서 커버슬립을 제거하고 여분의 액체를 흡인합니다.
- PDMS 스텐실을 하이드로겔 표면에 놓습니다.
참고: 핀셋은 PDMS 스텐실에 광압을 가하여 PDMS 스텐실과 하이드로겔 표면 사이의 방수 밀봉을 보장하는 데 사용할 수 있습니다. 당사의 PDMS 스텐실은 수밀성이므로 젤 상부 표면과 PDMS 스텐실 바닥 면 사이의 물 접근을 방지합니다. 또한, 하이드로겔 강성은 PDMS 강성에 대하여 조정될 필요가 없다. - 0.1M HEPES(4-(2-하이드록세틸)-1-피프라진에탄설포산)에 용해된 헥사노에이트(설포-산파아미노)를 설포수니미딜-6-(4-아지도-2-니트로페닐아미노)로 하이드로겔 표면을 100대 농도로 커버한다. 램프(전력 36W)를 8분 동안 사용할 수 있습니다.
- 여분의 설포-SANPAH 및 HEPES 용액을 흡인하고 0.1 M HEPES로 하이드로겔을 두 번 헹구고 초순수로 2 개의 린스를 추가로 헹구습니다.
- 0.1 mg/mL 콜라겐-I를 4°C에서 하룻밤 동안 과량의 초순수 및 코팅 하이드로겔을 흡인합니다.
- 접시를 덮고 형광 비드를 광표백으로부터 보호하십시오.
참고: PDMS 스텐실은 마이크로 패턴 단층을 만드는 데 사용됩니다. 마이크로 패턴 단층은 각 실험 중에 동일한 형상과 치수의 여러 단층이 동시에 관찰될 수 있도록 하기 때문에 활용됩니다. 그러나, 마이크로패턴이 바람직하지 않은 경우 4.2단계를 제외하고 위의 단계를 따를 수 있다.
5. 하이드로겔에 HUVEC 단층 만들기
- 인큐베이터에서 3-5 분 동안 조직 배양 플라스크에서 세포를 분리하기 위해 1x 트립신을 사용하십시오.
- 트립시니화 후, 트립신 용액에 세포 배양 배지를 첨가하고 15 mL 원심분리튜브에 첨가한다.
- 1710 x g에서3 분 동안 세포 용액을 원심 분리기. 세포의 작은, 백색 펠릿은 원심 분리기 관의 바닥에 표시되어야 합니다.
- 50 x 104 세포 / mL의 농도로 매체에서 상류 세포를 흡인하고 재중단.
- 하이드로겔에서 콜라겐-I를 제거하고 PBS로 1x 헹구어 주세요.
- PDMS 스텐실의 상부에 75 x 103 세포를 추가하고 세포가 37°C 및 5%CO2에서인큐베이터에서 적어도 1시간 동안 하이드로겔 표면에 부착되도록 한다.
- PDMS 스텐실을 제거하고 페트리 접시에 적어도 2 mL의 미디어를 추가합니다. PDMS 스텐실을 10x 트립신에 담그고 부착된 세포를 제거하고 70% 에탄올로 분무한 다음 UV 광 아래에 5분 동안 소독합니다.
- 인큐베이터에 페트리 접시를 놓고 적어도 36 시간 또는 동시 단층이 관찰 될 때까지 기다립니다.
6. Cx43 중단을 위한 2,5디하이드록시찰콘 처리
- 디메틸설폭사이드(DMSO)에 2,5디하이드록시찰콘(chalcone)을 용해하여 0.1875 mg/mL 스톡 용액을 만듭니다.
- 낮은 chalcone 농도 (0.2 μg/mL) aliquot 및 높은 chalcone 농도 (2 μg/mL) aliquot를 만들기 위해 세포 배양 매체로 주식 용액을 희석.
7. 데이터 수집
- 현미경으로 세포 섬을 찾습니다.
- 위상 대비 및 비드 이미지를 각각 이미지 셀 형태및 하이드로겔 변위를 획득합니다.
참고: 이 프로토콜은 데이터 수집을 위해 10배 의 목표를 사용했습니다. - 실험의 끝에서, 10x 트립신으로 세포를 분리하고 세포없이 겔 표면의 이미지를 획득 (참조 이미지).
8. 면역 염색
- 4% 포름알데히드로 단층을 고정하고 37°C에서 15분 동안 배양합니다.
- 4% 포름알데히드를 제거하고 0.2% 트리톤 X-100을 37°C에서 5분 동안 추가하여 세포를 투과시합니다.
- 0.2% 트리톤 X-100을 제거하고 PBS 2x-3x로 단층을 헹구고 있습니다.
- 37°C에서 45분 동안 2% 소 혈청 알부민(BSA) 용액으로 단층을 덮습니다.
- 2% BSA 용액을 제거하고 PBS 2x-3x로 단층을 헹구고 있습니다.
- 1차 Cx43 항체를 1:400의 농도로 시료에 넣고 4°C에서 밤새 배양한다.
- 원발성 항체를 제거하고 PBS 2x-3x로 시료를 헹구다.
- 3:200의 농도로 이차 항체를 첨가하고 37°C에서 2시간 동안 배양한다.
참고: 광표백을 방지하기 위해 샘플을 덮어야 합니다. - 이차 항체를 제거하고 PBS 2x-3x로 헹구어 보시고 자합니다.
- 장착 매체(Fluromount-G DAPI)로 시료를 덮고 18mm 커버 슬립으로 밀봉합니다.
9. 견인력 현미경 검사법 (TFM) 및 단층 응력 현미경 검사법 (MSM)의 구현
-
하이드로겔 변형 계산
참고: MATLAB을 사용하는 단계별 변위 계산 절차는 다음과 같습니다.- MATLAB에서 기본 traction.m 파일을 엽니다(모든 MATLAB 루틴에 대한 보충 자료 참조).
참고: 코드에 제공된 지침을 따라 MATLAB 디렉터리를 설정합니다. - 이미지 형식, 픽셀 대 미크론 변환, 영의 계수, 푸아송 비율 및 현미경 목표의 다음 변수를 정의합니다.
- OpenFiles 서브루틴을 사용하여 비드, 트립신 이미지 및 위상 이미지를 찾습니다.
참고: 대용량 데이터 세트의 경우 파일의 이름을 순차적으로 지정하는 것이 가장 좋습니다. 예를 들어 파일 이름은 "filename1.tif", "filename2.tif" 등이어야 합니다. - 셀 단층 주위에 사각형 ROI(관심 영역)를 정의하고 cell_cropper 서브루틴을 실행하여 원본 이미지를 자르는 것입니다.
- 변위_finder 서브루틴을 실행하여 변위를 계산합니다.
- Dedrift 서브루틴을 실행하여 현미경 단계 드리프트로 인해 발생할 수 있는 추가적인 비세포 변위를 제거합니다.
- MATLAB에서 기본 traction.m 파일을 엽니다(모든 MATLAB 루틴에 대한 보충 자료 참조).
-
견인력 계산
참고: 여기서 는 맞춤형 MATLAB 루틴을 사용하여 제한되지 않은 견인력이 계산됩니다. 앞서 언급한 MATLAB 루틴을 이용한 단계별 견인 계산은 아래에 제시되어 있다.- traction.m 루틴 내에서 경계 조건, 겔 두께, 젤 높이 및 드리프트 내에서 다음 변수를 정의합니다.
- traction_finder 서브루틴을 실행하여 견인을 계산하고 plot_traction 서브루틴을 실행하여 견인을 플롯합니다. 해당 픽셀 위치와 함께 x 방향(Tx) 및 y 방향(Ty)의 모든 트랙션은 코드에 의해 생성되는 traction.dat 파일에서 찾을 수 있습니다.
-
세포간 응력 계산
참고: 앞에서 언급한 MATLAB 루틴을 사용하여 세포간 응력 계산에 대한 단계별 지침은 다음과 같습니다.- mark_circular_domain 서브루틴을 실행하여 단일레이어 경계를 지정합니다. 이 루틴은 사용자가 수동으로 단일 레이어 주위에 경계를 그릴 수 있도록 모든 자른 위상 이미지를 순차적으로 묻는 메시지를 표시합니다. 명령 창에서 생성된 nXPt를 기록하고 나중에 FEM 해석을 위해 X축과 Y축의 그리드 매개변수로 사용합니다(9.3.2 단계 참조).
- Run_StressCode를 실행하여 셀룰러 응력을 계산합니다. 이 서브루틴은 "model.in" 파일에서 매개 변수를 직접 읽고 FEM 분석을 수행하기 위해 "island.exe"를 실행합니다. 이 루틴을 실행하기 전에 model.in 파일의 모든 매개변수(예: X 및 Y의 그리드 매개변수, 픽셀에서 미크론 변환, 젤의 영의 계수, 푸아송 비율, 단층 높이 및 단층 패턴(스트립 또는 구멍)가 편집되었는지 확인합니다. 올바르게.
- plot_FEM_결과 서브루틴을 사용하여 모든 FEM 결과를 플로팅합니다.
참고: 생성된 모든 결과는 MATLAB 디렉터리에 있는 결과 폴더에 자동으로 저장됩니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
대조군 이미지, 0.2 μg/mL, 및 2 μg/mL 단층 처리된 단층은 찰콘 처리 30분 전에 촬영하였다(그림1A-C)및 2시간 후 의 찰콘 처리(도1D-F). 세포-유도 비드 변위(μm)는 HUVEC 단층 대조층 대조층 대조군과 비교했을 때 저용량 chalcone 및 고용량chalcone 조건 모두에서 감소하는 것으로 관찰되었다(그림2E,F). chalcone 처리 이전에, rms 견인은 모든 조건에 대해 약 51±8Pa(도 3A-C)였다. 갈콘 처리 후, 저용량 의 질콘 처리 단층에서 59 ±11 Pa로 rms 견인력이 소폭 증가하였고(그림3E)고용량 의 질콘 처리 단층에서 18±2로 rms 견인력이 거의 2배 감소하였다. 도 3F)를대조군과 비교하였다(도3D). 칼콘 치료 전에, 평균 정상 세포간 응력은 약 220±66Pa(도 4A-C)였다. 칼콘 치료 후, 저용량 칼콘 치료를 받은 평균 정상 세포간 스트레스 크기가 285±75Pa로 증가하였으나(도4E)평균 정상 간 스트레스 크기는 106으로 현저하게 감소하였다. ± 4 Pa 고용량 의 chalcone 처리(도 4F)대조군 평균 정상 세포 간 응력과 비교했을 때 (235±18 Pa, 도 4D). 최대 전단 간 응력은 약 241±30Pa(그림 5A-C)였지만,칼콘 처리 전, 낮은 칼콘 농도에서 227±20 Pa로 감소하였다(도5E) 고차콘 농도 치료에서 최대 전단 간 응력 의 크기가 91±6Pa로 추가로감소(도5F)최대 전단 간 응력(270±30 Pa, 도 5D)을 대조군으로 비교하면 ). 견인 및 세포간 응력 분석은 그림 6A-C에표시됩니다. 모든 플롯된 결과는 통계적 유의성(t-test 및 단일 인자 ANOVA 검정)을 위해 시험되었고, 두 테스트 결과 모두 0.2 μg/mL chalcone 농도와 2를 독립적으로 비교할 때 통계적으로 유의한 것으로 나타났습니다(p< 0.05). μg/mL chalcone을 사용하여 조건을 제어합니다(chalcone 제외).
그림 1: HUVEC 단층의 대표적인 위상 대비 이미지. 예상 대조 이미지 30분(A)및 2시간(D), 0.2 μg/mL 의 chalcone으로 처리된 HUVECs의 위상 대비이미지(30분(B)및2시간(E)및 2 μg/mL chalcone으로 처리된 HUVECs의 위상 대비 이미지 실험 개시의 30 분(C)및 2 시간(F)에서. 배율 막대는 1.25mm의 단층 지름을 나타냅니다.
그림 2: HUVEC 단층에서 생성된 변위 필드 그림입니다. 대조군 HUVECs의 대표적인 변위(μm)는30분(A)및 2시간(D) 및 HUVECs를 30분(B) 및2h(E)에서 0.2μg/mL로 처리한 후벡, HUVECs를 30분(C) 및 2시간(F)에서 2 μg/mL로 처리하였다. 실험 개시. 축척 막대는 1.25mm의 단층 지름을 나타냅니다. 색상 막대는 μm의 변위를 나타냅니다.
그림 3: HUVEC 단층의 RMS 견인 분포. rms 견인의 예는 각각 0.2 μg/mL chalcone, 및 2 μg/mL chalcone HUVECs 전에 chalcone 처리(A-C)및 chalcone 처리의 시간 후에(D-F),각각. 눈금 막대는 1.25 mm의 단층 직경을 나타냅니다. 색상 막대는 Pa. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: HUVEC 단층의 평균 정상 세포간 응력 분포. 평균 정상 세포 간 스트레스(Pa) 대조군 HUVECs분포는 30분(A) 및 2시간(D), HUVECs는 30분(B) 및 2시간(E)에서 0.2 μg/mL 칼콘으로 처리되었으며, HUVECs는 30분(C)에서 2 μg/mL 칼콘으로 처리되었습니다. 및 2 시간(F). 배율 막대는 1.25mm의 단층 지름을 나타냅니다. 색상 막대는 Pa. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: HUVEC 단층의 최대 전단 간 응력 분포. 최대 전단 간 응력(Pa) 대조군 HUVECs분포는 30분(A) 및 2시간(D) 및 HUVECs로 처리된 HUVECs를 30분(B) 및 2시간(E)에서 처리한 HUVECs및 30분(C) 및 2 μg/mL 칼콘으로 처리한 HUVECs 2 시간(F). 배율 막대는 1.25mm의 단층 지름을 나타냅니다. 색상 막대는 Pa. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: HUVEC 단층에서 RMS 견인력과 세포간 응력의 비교및 HUVEC 갭 접합 Cx43 구조에 대한 칼콘 치료의 영향. 평균 정상 세포 간스트레스(A),최대 전단 간 응력(B) 및 RMS 견인(C)의 플롯은 HUVEC 단층에서 제어에 비해 chalcone 투여량(0.2 μg/mL 및 2 μg/mL)의 영향을 보여줍니다. 오류 막대에 표준 오류가 표시됩니다. 결과는 통계적으로 유의한 것으로 나타났습니다(표본 크기 = 6개의 섬, 신뢰도 95%) 제어(p < 0.05) 및 단일 인자 ANOVA(p < 0.05)에 비해 두 t 테스트를 모두 사용합니다. 별도의 접시에서, 면역염색은 연약한 1.2 kPa 하이드로겔에 상주하는 세포의 섬에 대한 약물의 5시간 후 첨가를 수행하였다. 녹색은 Cx43을 나타내고 파란색은 DAPI(핵)를 나타냅니다. 패널 D는 다음을 나타내며, 대조군(E,H), 0.2 μg/mL 질콘 처리 세포(F,I) 및 2μg/mL 질콘 처리세포(G,J)를 나타날 수 있다. 배율 막대 = 200 μm, 목표 = 20x. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
추가 그림 1: HUVEC 단층의 고분해능 Cx43 염색. HUVEC 단층은 Cx43(녹색) 및 핵(DAPI, 파랑)에 대해 염색하여 찰콘의 투여량 의존적 효과를 관찰하였다. 더 높은 배율 이미지(63x 목표)는 주로 핵 주위의 Cx43 국소화를 드러냅니다(녹색 형광 강도에서 분명). 대조군(A-C),0.2 μg/mL 질콘 처리세포(D-F)및 2 μg/mL 질콘 처리 세포(G-I)를 도시한다. 스케일 바 = 100 μm, 목표 = 63배 오일 침지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 1200 Pa | 870 Pa | 1 kPa | 4 kPa | 6.3 kPa | 11 kPa | 90 kPa | 150 kPa | |
| 솔루션 구성 | 0.05% BIS | 0.1% BIS | 0.03% BIS | 0.1% BIS | 0.03% BIS | 0.07% BIS | 0.3% BIS | 0.6% BIS |
| 5.5% 아크릴 | 2% 아크릴 | 5% 아크릴 | 5% 아크릴 | 10% 아크릴 | 10% 아크릴 | 12% 아크릴 | 12% 아크릴 | |
| 초순수 | 12.49 mL | 13.38 mL | 12.78 mL | 12.255 mL | 10.905 mL | 10.63 mL | 8.30 mL | 5.9 mL |
| 40% 아크릴아미드 | 2.062 mL | 750 μL | 1.875 mL | 1.875 mL | 3.75 ml | 3.75 mL | 4.5 mL | 4.5 mL |
| 2% BIS 아크릴아미드 | 375 μL | 750 μL | 225 μL | 750 μL | 225 μL | 525 μL | 2.12 mL | 4.5 mL |
| 불장 비드(0.2 μm 또는 0.5 μm) | 80 μL | 80 μL | 80 μL | 80 μL | 80 μL | 80 μL | 80 μL | 견인력은 측정할 수 없습니다. |
표 1: 폴리아크릴아미드 젤은 다른 영의 모둘리용 제형을 제조한다.
| 볼륨 | 두께 | 커버 슬립 | ||
| 20mm sl 웰 | 두꺼운 | 500 μL | ~1 mm | 25 mm |
| 얇은 | 24 μL | ~ 100 μm | 18 mm | |
| 잘 14mm sl | 두꺼운 | 175 μL | ~ 700 μm | 18 mm |
| 얇은 | 10.3 μL | ~ 100 μm | 12 mm | |
| 14mm 6웰 | 두꺼운 | 280 μL | ~1.5 mm | 18 mm |
표 2: 겔 부피 및 두께.
추가 파일: MATLAB 루틴. 이 파일을 보려면 여기를 클릭하십시오 (다운로드 오른쪽 버튼을 클릭하십시오).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
우리 그룹뿐만 아니라 다른 사람뿐만 아니라,성공적으로시험관 7,15,18,27에서 다양한 병리학 및 생리 적 세포 과정에서 세포 접합의 영향을 조사하기 위해 TFM과MSM을사용하고있다 . 예를 들어, Hardin 등은 세포간 스트레스 전달가이드 내피 세포에서의 파라셀룰러 갭 형성을 시사하는 매우 통찰력 있는 연구를제시15. 우리가 여기 보고하는 Cx43 관련 변경사항을 Hardin 등에서 보고한 변경사항과 관련시킬 수 있지만, 이 프로토콜에서 파라셀룰러 갭 형성을 구체적으로 다루지는 않습니다. 여기에서, 우리는 특히 간격 접합 Cx43를 표적으로 하고 내피 생체 역학에 그것의 영향을 조사하기 위하여 역학 기지를 둔 프로토콜을 제출했습니다.
이 프로토콜을 성공시키기 위해, 우리가 극복해야 했던 몇몇 도전이 있었습니다, 그 중 일부는 그밖 연구원이 유사한 연구 결과를 위한 우리의 프로토콜을 채택하기로 결정할 때 발생할 수 있었습니다. 주요 도전은 Cx43 발현이 억제될 수 있는 최적 chalcone 복용량 범위를 찾아내는 것이었습니다, 동시에 우리의 내피 단층을 온전하게 유지하면서. HUVECs에 대한 chalcone의 IC50은 이전에 10.01 μg / mL28로보고되었습니다. 그러나 HUVEC 단층층을 0.2 μg/mL에서 20 μg/mL에 이르는 다중 chalcone 농도에 노출했을 때, 우리는 2 μg/mL의 chalcone 농도가 여전히 동존하면서도 견딜 수 있는 가장 높은 농도라는 것을 발견했습니다. MSM을 사용하여 세포간 응력을 측정하기 위해 단층이 필요하기 때문에 이 프로토콜에 대한 동시 단층이 필수적이었습니다. 다음으로, 우리는 chalcone의 선택된 복용량이 Cx43 구조 또는 명백한 발현을 성공적으로 중단시키는지 결정하기 위하여 면역형광 분석기를 수행했습니다. 우리의 결과는 0.2 μg/mL chalcone를 가진 Cx43 구조물의 중단이 통제에서 구별하기 시각적으로 어려웠던 동안, chalcone의 2 μg/mL로 처리된 세포가 Cx43 구조 및 잠재적으로 표현에 있는 명백한 다름을 보여주기 위하여 나타났다는 것을 밝혔습니다 ( 도 6D 및 보조 그림 1). 또한, 우리의 결과는 Cx43 중단이 실제로 가장 높은 농도에서 견인력과 세포 간 응력을 감소시킴으로써 내피 생체 역학에 영향을 미친다는 것을 보여주었습니다. 이 사실 인정은 또한 견인력 및 세포 간 응력을 감소시키기 위하여 siRNA를 가진 Cx43의 침묵을 보여주었던 Bazellieres 외와 일치합니다, 그러나 상피 세포의 시트에27. 우리의 결과는 다른 사람들과 일치하지만 우리가 Cx43 발현을 방해하는 데 사용되는 분자, chalcone, 또한 Cx43 중단26이외에 MAPK 및 NFkB의 활성화에 영향을 미치기 위하여 제안되었다는 것을 주의해야 한다. 따라서, 우리는 위에서 언급한 분자 또는 그들의 관련되는 통로를 구체적으로 보고 있지 않았기 때문에, 우리는 잠재적인 MAPK 및 NFkB 섭동이 내피 생체 역학에 미칠 수 있는 영향을 배제할 수 없습니다.
언급 할 가치가또 다른 핵심 포인트는 복구 된 견인력과 세포 간 응력은 자연에서 2D이며 평면 (z 방향) 견인 및 세포 간 응력12,13을무시한다는 것입니다. 평면 외 응력을 무시하는 것과 관련된 작은 오류가 있지만 이 오류는 무시할 수있는 13입니다. 또한, 단층의 측면 치수는 z 방향으로 유의한 변위를 기대하지 않도록 단층 높이(~5 μm)에 비해 충분히 크다(1.25 mm)이다. 또한 MSM 계산은 단층 경계12,13에서오류를 제공합니다. 그러나, Tambe 등. 실험적으로 오차가 광학 가장자리(즉, 단층 경계)에서 가장 높고 경계가장자리(13)로부터빠르게 붕괴되는 것으로 나타났다. 우리는 마이크로 패터닝을 수행한 다음 전체 단층의 세포간 응력을 계산하여 세포간 응력 계산 중에 발생할 수 있는 경계 오류를 방지합니다.
단층 스트레스 현미경 검사는 내피 생체 역학에 있는 역할 간격 접합 중단의 더 완전한 이해를 갖기 위하여 이 방법에서 산출된 세포간 긴장 정보가 필수적이기 때문에 이 프로토콜에서 이용됩니다. 또한, 세포간 응력은 하딘 외15 및 크리슈난 외17,예를 들어 내피 장벽 기능에 중요한 것으로 제안되었다. 또한, 세포간 응력은 여기에 제시된 대표적인 데이터의 견인과 상관관계가 있었지만, 자극에 따라 항상 그렇지는 않습니다. Steward et al.의 연구에서, 예를 들어, 내피 세포 간 응력은 유체 전단 하에서 감소하는 것으로 나타났으며, 견인력은 상대적으로 변하지 않은7. 또한, 우리가 여기에 제시하는 프로토콜은 세포 유래 기계적 힘의 동시 측정과 접합부 및 초점 유착의 염색을 허용하지 않지만, 이러한 추가는이 프로토콜에 무료일 것입니다. 끝으로, 우리가 여기에서 제시하는 프로토콜은 Cx43가 내피 생체 역학, 특히 내피 세포 유래 힘에 전적으로 가지고 있는 영향을 조사하는 역학 기지를 둔 방법을 기술합니다. 당사는 당사의 역학 기반 프로토콜이 현재 존재하는 생물학적 기반 프로토콜과 함께 이 분야에서 진정으로 획기적인 작업을 제공하는 데 사용될 수 있다고 믿습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 중앙 플로리다 대학 창업 기금과 국립 심장, 폐, 그리고 수상 K25HL132098에서 건강의 국립 연구소의 혈액 연구소에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 mm coverslip | ThermoFisher | 18CIR-1 | Essential to flatten polyacrylamide gels |
| 2% bis-acrylamide | BIO-RAD | 1610143 | Component of polyacrylamide gel |
| 2′,5′-Dihydroxychalcone | SIGMA | IDF00046 | To disrupt Cx43 structure |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | SIGMA | 2530-85-0 | Stock solution to make bind silane mixture with acetic acid and ultra-pure water |
| 40% Acrylamide | BIO-RAD | 1610140 | Component of polyacrylamide gel |
| Acetic acid | Fisher-Sceintific | 64-19-7 | Essential to make bind saline solution |
| Alexa Fluro 488 goat anti-mouse IgG; | ThermoFisher | Catalog # A-11001 | Secondary antibody |
| Ammonium persulfate | BIO-RAD | 1610700 | Polyacrylamide gel polymerizing agent |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | SIGMA | 9048-46-8 | To make blocking solution |
| Bovine Type I Atelo-Collagen Solution, 3 mg/mL, 100 mL | Advance Biomatrix | 5005-100ML | Use as a extracellular matrix |
| Corning Cell Culture Phosphate Buffered Saline (1x) | Fisher-Sceintific | 21040CV | Buffer Saline needed for cell culture |
| Dimethyl Sulfoxide, Fisher BioReagents | Fisher-Sceintific | 67-68-5 | To dissolve chalcone and make stock solution |
| Fluoromount-G with DAPI | ThermoFisher | 00-4959-52 | Mounting medium for immunostaing used to stain for DAPI |
| Fluroscent microsphere Carboxylate-modified beads | ThermoFisher | F8812 | 0.5 micron carboxylate-modified beads (red), 2% solids |
| HEPES buffer solution 1 M | SIGMA | 7365-45-9 | Essential to |
| LVES | ThermoFisher | A1460801 | Essential HUEVC media 200 supplement |
| Medium 200 | ThermoFisher | M200500 | Essential media for HUVEC cell culture |
| Mouse monoclonal Cx43 antibody (CX - 1B1) | ThermoFisher | Catalog #13-8300 | Primary antibody for Cx43 |
| Petri dish (35 mm dia) | CellVis | D35-20-1.5H | 35 mm petri dish with a 20 mm center well |
| Sulfo-SANPAH Crosslinker 100 mg | Proteochem | 102568-43-4 | Essential to functionalize polyacrylamide gel surface |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | DOW corning | 2646340 | Silicon elastomer with curing agent to make PDMS |
| TEMED | BIO-RAD | 1610801 | Polyacrylamide gel polymerizing agent |
| Triton-X 100 | SIGMA | 9002-93-1 | To permeabilize cells |
| Trypsin -EDTA | ThermoFisher | 25300054 | Used to detach cells |
References
- Mammoto, T., Mammoto, A., Ingber, D. E. Mechanobiology and developmental control. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 27-61 (2013).
- Schwarz, U. S., Soine, J. R. Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances. Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (11 Pt B), 3095-3104 (2015).
- Style, R. W., et al. Traction force microscopy in physics and biology. Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).
- Colin-York, H., et al. Super-Resolved Traction Force Microscopy (STFM). Nano Letters. 16 (4), 2633-2638 (2016).
- Zimmermann, J., et al. Intercellular stress reconstitution from traction force data. Biophysical Journal. 107 (3), 548-554 (2014).
- Islam, M. M. Recent Advances in Experimental Methods of Cellular Force Sensing. Biomedical Journal of Science & Technical Research. 17 (3), (2019).
- Steward Jr, R., Tambe, D., Hardin, C. C., Krishnan, R., Fredberg, J. J. Fluid shear, intercellular stress, and endothelial cell alignment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 308 (8), C657-C664 (2015).
- Trepat, X., et al. Physical forces during collective cell migration. Nature Physics. 5, 426-430 (2009).
- Li, Z., et al. Cellular traction forces: a useful parameter in cancer research. Nanoscale. 9 (48), 19039-19044 (2017).
- Brugues, A., et al. Forces driving epithelial wound healing. Nature Physics. 10 (9), 683-690 (2014).
- Pasqualini, F. S., et al. Traction force microscopy of engineered cardiac tissues. PLoS One. 13 (3), e0194706 (2018).
- Tambe, D. T., et al. Collective cell guidance by cooperative intercellular forces. Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).
- Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PLoS One. 8 (2), e55172 (2013).
- Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), C595-C605 (2002).
- Hardin, C. C., et al. Long-range stress transmission guides endothelial gap formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 749-754 (2018).
- Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer. Molecular Biology of the Cell. 29 (19), 2292-2302 (2018).
- Krishnan, R., et al. Substrate stiffening promotes endothelial monolayer disruption through enhanced physical forces. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), C146-C154 (2011).
- Islam, M. M., Steward, R. L. Probing Endothelial Cell Mechanics through Connexin 43 Disruption. Experimental Mechanics. 59, 327 (2019).
- Figueroa, X. F., Duling, B. R. Gap junctions in the control of vascular function. Antioxidants & Redox Signaling. 11 (2), 251-266 (2009).
- Nielsen, M. S., et al. Gap junctions. Comprehensive Physiology. 2 (3), 1981-2035 (2012).
- Sohl, G., Willecke, K. Gap junctions and the connexin protein family. Cardiovascular Research. 62 (2), 228-232 (2004).
- Haefliger, J. A., Nicod, P., Meda, P. Contribution of connexins to the function of the vascular wall. Cardiovascular Research. 62 (2), 345-356 (2004).
- Marquez-Rosado, L., Solan, J. L., Dunn, C. A., Norris, R. P., Lampe, P. D. Connexin43 phosphorylation in brain, cardiac, endothelial and epithelial tissues. Biochimica et Biophysica Acta. 1818 (8), 1985-1992 (2012).
- Liao, Y., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. Endothelial cell-specific knockout of connexin 43 causes hypotension and bradycardia in mice. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9989-9994 (2001).
- Walker, D. L., Vacha, S. J., Kirby, M. L., Lo, C. W. Connexin43 deficiency causes dysregulation of coronary vasculogenesis. Developmental Biology. 284 (2), 479-498 (2005).
- Lee, Y. N., et al. 2',5'-Dihydroxychalcone down-regulates endothelial connexin43 gap junctions and affects MAP kinase activation. Toxicology. 179 (1-2), 51-60 (2002).
- Bazellieres, E., et al. Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome. Nature Cell Biology. 17 (4), 409-420 (2015).
- Nam, N. H., et al. Synthesis and cytotoxicity of 2,5-dihydroxychalcones and related compounds. Archives of Pharmacal Research. 27 (6), 581-588 (2004).
