Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Возмущение эндотелиальной биомеханики через Connexin 43 Структурные нарушения

Published: October 4, 2019 doi: 10.3791/60034
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Mechanical and Aerospace Engineering, University of Central Florida, 2Burnett School of Biomedical Sciences, College of Medicine, University of Central Florida

Summary

Здесь мы представляем протокол на основе механики, чтобы нарушить разрыв соединения connexin 43 и измерить последующее воздействие это оказывает на эндотелиальной биомеханики через наблюдение тяги и межклеточных напряжений.

Abstract

Эндотелиальные клетки были созданы для генерации межклеточных напряжений и тяг, но роль разрыв увязов играть в эндотелиального межклеточного стресса и тяги поколения в настоящее время неизвестно. Таким образом, мы представляем здесь механики на основе протокола для зондирования влияния разрыв соединения connexin 43 (Cx43) имеет на эндотелиальной биомеханики, подвергая слияния эндотелиальных монослоев известного ингибитора Cx43 2,5-dihydroxychalcone (халкон) и измерение влияния этого ингибитора на тяги и межклеточные стрессы. Мы представляем репрезентативные результаты, которые показывают снижение как тяги, так и межклеточных напряжений при высокой дозировке халкона (2 мкг/мл) по сравнению с контролем. Этот протокол может быть применен не только к Cx43, но и к другим развязкам, при условии использования соответствующего ингибитора. Мы считаем, что этот протокол будет полезен в области сердечно-сосудистых и механобиологических исследований.

Introduction

Поле, которое относится к изучению влияния физических сил и механических свойств на клеточной и тканевой физиологии и патологии известен как механобиология1. Несколько полезных методов, которые были использованы в механобиологии являются монослой нойелии стресс микроскопии и тяговой силы микроскопии. Микроскопия силы тяги позволяет вычислять tractions произведенных на интерфейсе клетк-субстрата, пока микроскопия усилия монослой позволяет вычислить межклеточных напряжений произведенных между смежными клетками внутри monolayer2 ,3,4,5,6. Результаты, полученные из предыдущих методов, показали, что механические напряжения, полученные из клеток, играют решающую роль в определении судьбы множества клеточных процессов3,4,5. Например, при воздействии внешней механической силы, группа клеток, мигрирующих как коллектив, может изменить свою морфологию и поляризовать свою форму, чтобы выровнять и мигрировать по направлению прикладной силы, частично генерируя тяги7, 8. Tractions обеспечивают метрику, которая может быть использована для оценки сотрудничности клеток и рассчитывается с помощью микроскопии силы тяги (TFM). Микроскопия силы тяги (TFM) начинает с определением клеточных индуцированных деформаций субстрата последовано за вычислением поля тяги используя математически строгий, механик-основанный вычислительный подход. Так как способность вычислить тяги была вокруг в течение довольно продолжительного времени, исследователи использовали TFM, чтобы выявить влияние tractions на множество процессов, в том числе рак9, заживление ран10 и оценка инженерии сердечной ткань11.

Внедрение ТФМ и МСМ вместе можно разделить на три основных шага, которые должны быть выполнены в следующем порядке: во-первых, определяются гидрогелевые деформации, производимые клетками; во-вторых, тяги восстанавливаются после деформаций гидрогеля; и в-третьих, для вычисления нормальных и сдвига межклеточных напряжений в рамках всего монослойа используется подход конечного элемента. Для вычисления смещений геля изображения флуоресценции с клетками сравнивались с эталонным изображением биса (без клеток) с помощью специально написанной целуются велоциметрии изображения частиц (PIV). Размер кросс-корреляционного окна и перекрытие для анализа PIV были выбраны в 32 х 32 пикселя и 0,5, соответственно. В это время пиксельные сдвиги были преобразованы в микроны путем умножения с коэффициентом преобразования пикселя к микрон (для нашего микроскопа этот коэффициент преобразования составляет 0,65) для получения перемещений в плоскости. Ошибки, связанные с игнорированием внеплановых перемещений, незначительны12,13. После вычисления смещений геля, Есть два типа измерения тяги, которые могут быть использованы, ограниченные тяги и неограниченные тяги8,14. Неограниченные тяги обеспечивают поле тяги для всего поля зрения (включая области с ячейками и без), в то время как ограниченные тяги обеспечивают поле тяги только для областей, которые включают ячейки14. Затем межклеточные напряжения рассчитываются с помощью монослойной стрессовой микроскопии (МСМ), которая является продолжением микроскопии силы тяги. Внедрение МСМ основано на предположении, что локальные тяги, прилагаемые монослой ячеек на интерфейсе клеток-субстрата, должны быть сбалансированы механическими силами, передаваемыми между клетками на интерфейсе ячейки, как того требуют законы Ньютона7 ,12,13. Ключевым предположением здесь является то, что монослой клетки можно рассматривать как тонкий эластичный лист, потому что распределение тяги в монослой еронет и баланс силы не зависит от свойств клеточного материала. Еще одно ключевое предположение состоит в том, что силы тяги уравновешиваются локальными межклеточными нагрузками в оптическом поле зрения (в пределах монослой) и влияние этого силового баланса минимально в дистальной области (вне монослой)13. Таким образом, пограничные условия, определяемые межклеточными нагрузками, смещениями или комбинацией обоих на монослойной границе, имеют решающее значение для выполнения МСМ13. Принимая во внимание приведенную выше информацию, мы используем МСМ для выполнения конечного анализа элементов (FEM) для восстановления максимального основного стресса(максимума)и минимального основного стресса(min)путем вращения плоскости напряжения в каждой точке в монослой. Эти основные стрессы впоследствии используются для расчета 2D среднего нормального межклеточного стресса(макс ймин) /2» и 2D максимального сдвига межклеточного стресса(макс -мин) /2 » в пределах всего монослойного 12,13. Эта процедура описана более подробно Tambe et al.12,13

Монослойная микроскопия стресса (МСМ) позволяет рассчитать межклеточные напряжения клеток, образовавшиеся в пределах монослойной6,7,8,12,13. Эти межклеточные стрессы были предложены, чтобы иметь важное значение для роста тканей и ремонта, заживление ран, и метастазировать рак12,15,16,17. Кроме того, межклеточные стрессы были предложены также иметь важное значение в эндотелиальной миграции клеток и эндотелиальной функциибарьера 17,18. В то время как соединения клеток, такие как узкие соединения и адепты, как было предложено, чтобы играть важную роль в эндотелиальной межклеточной генерации стресса и передачи, роль разрыв соединений остается неуловимым. Разрыв ные соединения физически соединяют соседние клетки и обеспечивают путь для электрического тока и молекул (Злт;1 KDa), чтобы пройти между соседними клетками19,20,21. Хотя эндотелиальные клетки выражают Cx37, Cx40, и Cx43 разрыв узлов19,22, Cx43, возможно, наиболее важным с точки зрения прогрессирования заболевания23. Доказательства важности Cx43 можно найти в том, что генетическое удаление Cx43 у мышей приводит к гипотонии24 и оказывает неблагоприятное воздействие на ангиогенез25. Кроме того, Cx43 был задокументирован, чтобы быть важным для миграции клеток и распространения и в прогрессировании атеросклероза18,22,23,24,25 .

В этом протоколе мы использовали TFM и MSM для исследования того, будет ли тяга и межклеточное напряжение в рамках слияния, эндотелиальный монослой будет влиять на нарушение эндотелиального разрыва соединения Cx43. Мы нарушили Cx43 с 2,5-dihydroxychalcone (халкон), молекула документально ингибировать Cx43 выражение26. Chalcone был использован для того чтобы нарушить Cx43 вместо siRNA по мере того как chalcone было сообщено ранее Ли et al. для того чтобы нарушить выражение Cx4326. Кроме того, мы были особенно заинтересованы в влиянии халкона на эндотелий, как было также сообщается, противовоспалительное и противо-тромбоцитов соединения, которые потенциально могут быть использованы для профилактики и лечения различных сосудистых патологии26. Обработка chalcone была выполнена час после начала эксперимента, chalcone-обработанные monolayers были изображены на итог 6 часов, и обработка изображения была выполнена с custom-written кодом MATLAB для того чтобы обусловить tractions и затем межклеточные Напряжения. Наши результаты показали общее снижение тяги и межклеточных стрессов, предполагая, что Cx43 играет ключевую роль в эндотелиальной биомеханике.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Изготовление гелей полиакриламид (PA)

  1. Приготовление блюда Петри
    1. Приготовьте связываемый силановой раствор, смешивая 200 мл ультрачистой воды с 80 йл уксусной кислотой и 50 зл 3-(триметоксисил)пропил метакрилат. Bind silane - это решение, используемое для функционализации стеклянной нижней поверхности чашки Петри для крепления гидрогеля.
    2. Перемешать раствор связывания силан на перемешать пластины, по крайней мере 1 ч.
    3. Побалуйте центр хорошо чашку Петри с связывая силан раствор в течение 45 минут.
    4. Удалить связывательный силановый раствор и промыть чашку Петри ультра-чистой водой 2x-3x.
    5. Сухие поверхности чашки Петри и хранить при комнатной температуре для будущего использования.
  2. Приготовление раствора гидрогеля
    1. Смешайте ультра-чистую воду, 40% акриламида и 2% бис-акриламида в 15 мл центрифуги трубки в соответствии с таблицей 1.
    2. Добавьте в раствор гидрогеля 80 л/с флуоресцентных бусинок.
    3. Аккуратно встряхните трубку, чтобы смешать бисер с раствором геля.
    4. Слегка затяните крышку трубки на центрифуге трубки и поместите в вакуумную камеру.
    5. Дега гель раствор, по крайней мере 45 мин в вакуумной камере.
  3. Гидрогель полимеризация
    1. Во-первых, добавьте 75 зЛ 10% аммония persulfate (растворенный в ультра-чистой воде), а затем добавьте 8 зл TEMED (N, N,N',N'-tetramethylethane-1,2-diamine) к раствору гидрогеля.
    2. Поместите 24 л раствора гидрогеля в центре чашки Петри (см. Таблицу 2).
    3. Используйте 18-мм крышку, чтобы сгладить гидрогель. Это даст высоту 100 мкм.
    4. Подождите, по крайней мере 30-40 минут для геля полимеризации.
    5. Погрузите полимеризованный гидрогель в ультра-чистую воду, чтобы предотвратить обезвоживание геля.
    6. Обложка чашку Петри с алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить фотоотбеление флуоресцентных бусин и хранить при 4 градусах Цельсия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гидрогель может храниться в течение до 3 месяцев, но предлагается, чтобы эти гели использовать не более чем через 1 неделю после изготовления для получения наилучших результатов.

2. Клеточная культура

  1. Культура человеческой пупочной вены эндотелиальных клеток (HUVECs) в клеточной культуре среды 200 (см. Таблица материалов) дополнены 1% пенициллина-стрептомицина на 0,1% желатина покрытием колбы при 37 КК и 5% CO2.

3. Подготовка трафарета микрошаблона

  1. Лечить тонкий слой полидиметилсилоксана (PDMS) в 100 мм Петри блюдо путем смешивания силиконовой базы с силиконовым лечащевым агентом в соотношении 20:1 (база: лечащий агент).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать другую базу для лечения коэффициентов агента (напротив 10:1 или 30:1). Тем не менее, более низкая база для лечения агента отношение даст более жесткую картину, в то время как более высокая база для лечения агента отношение будет производить более мягкую картину.
  2. Подготовьте 20:1 (базовый: лечебный агент) PDMS раствор и тщательно перемешайте в 50 мл центрифуги трубки. Перевернуть трубку вверх дном и энергично встряхнуть несколько раз, чтобы обеспечить надлежащее смешивание раствора PDMS, так как неравномерное смешивание приведет к неполной полимеризации.
  3. Удалите пузырьки, которые были введены из вышеуказанного шага центрифугировании раствора PDMS в течение 1 мин при 190 х г.
  4. Налейте 5-6 мл раствора PDMS в центре 100 мм чашки Петри и агитировать блюдо до решения PDMS охватывает всю поверхность блюда Петри.
  5. Лечить раствор PDMS на ночь при 50-60 градусах Цельсия. PDMS также можно вылечить при комнатной температуре.
  6. Удалите круговой трафарет PDMS диаметром 16 мм с помощью перфоратора отверстия.
  7. Используйте удар биопсии для создания небольших отверстий в трафарете PDMS. В этом протоколе используется биопсия диаметром 1,25 мм.
  8. Стерилизовать трафареты PDMS, сначала погрузив их в 70% этанола в течение 2-3 мин, успокоив избыток этанола, а затем поместив под ультрафиолетовый свет в течение 5 мин.

4. Гидрогелевое покрытие коллагена-I

  1. Снимите крышку с гидрогеля и усилите лишнюю жидкость.
  2. Поместите трафарет PDMS на поверхность гидрогеля.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пинцеты могут быть использованы для применения легкого давления на трафарет PDMS для обеспечения водонепроницаемого уплотнения между трафаретом PDMS и поверхностью гидрогеля. Наши трафареты PDMS являются водонепроницаемыми и тем самым препятствуют доступу к воде между верхней поверхностью геля и поверхностью дна PDMS. Кроме того, жесткость гидрогеля не нужно корректировать в отношении жесткости PDMS.
  3. Обложка поверхности гидрогеля с sulfosuccinimidyl-6-(4-азидо-2-нитрофениламино) гексаноат (сульфо-SANPAH) растворяется в 0,1 M HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинетанесульфоновой кислоты) буферный раствор в концентрации 1: 1000 место под УФ-место под 100 лампа (мощность 36 Вт) в течение 8 мин.
  4. Прикрепляйте избыток раствора сульфо-САНПАХ и HEPES и промойте гидрогель дважды с 0,1 M HEPES следуют дополнительные два полоскания с ультра-чистой водой.
  5. Аспирируем избыток ультра-чистой воды и шерсти гидрогелей с 0,1 мг/мл коллагена-I ночь на 4 градуса Цельсия.
  6. Обложка блюда и защитить флуоресцентные бусы от фотоотбелевания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: трафареты PDMS используются для создания монослойных микрошаблонов. Микроузорные монослои используются, поскольку они позволяют одновременно наблюдать несколько монослойов одной и той же геометрии и размеров в ходе каждого эксперимента. Однако, если микрошаблоны не желать вышеуказанных шагов могут следовать, за исключением шага 4.2.

5. Создание монослойных huVEC на гидрогелях

  1. Используйте 1x трипсин, чтобы отсоединить клетки от тканевых культовых колб в течение 3-5 мин в инкубаторе.
  2. После трипсинизации добавьте средства массовой информации клеточной культуры в раствор трипсина и добавьте в 15 мл центрифуги трубки.
  3. Центрифуги яточного раствора в течение 3 мин при 1710 х г. Небольшой белый гранулы клеток должны быть видны в нижней части центрифуги трубки.
  4. Аспирировать супернатант и resuspend клетки в средствах массовой информации до концентрации 50 х 104 клетки / мл.
  5. Удалить коллаген-I из гидрогеля и промыть 1x с PBS.
  6. Добавьте 75 х 103 ячеек в верхней части трафарета PDMS и позвольте клеткам прикрепляться к поверхности гидрогеля не менее 1 ч в инкубаторе при 37 градусах По Цельсия и 5% CO2.
  7. Удалить трафарет PDMS и добавить по крайней мере 2 мл средств массовой информации в чашку Петри. Погрузите трафарет PDMS в 10x трипсин, чтобы удалить любые прикрепленные клетки и стерилизовать путем распыления с 70% этанола, а затем размещение под ультрафиолетовым светом в течение 5 мин.
  8. Поместите чашку Петри в инкубатор и подождите не менее 36 ч или пока не будет наблюдаться сольственный монослой.

6. 2,5 дигидроксихалкона для лечения Cx43 нарушения

  1. Растворите 2,5 дигидроксихалкона (халкон) в диметилсульфокиде (ДМСО), чтобы сделать раствор запаса 0,1875 мг/мл.
  2. Разбавить стоковый раствор с помощью средств массовой информации клеточной культуры, чтобы сделать слабую концентрацию халкона (0,2 мкг/мл) аликот и высокую концентрацию халкона (2 мкг/мл) аликот.

7. Приобретение данных

  1. Найдите клеточные острова с микроскопом.
  2. Приобрести фазовую контрастность и изображения биса для морфологии клеток изображения и смещения гидрогеля, соответственно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе использовалась 10-разная цель для получения данных.
  3. В конце эксперимента отсоединяют клетки с 10-x трипсином и приобретают изображение поверхности геля без клеток (ссылка на изображение).

8. Иммуностоинирование

  1. Зафиксировать монослой с 4% формальдегидом и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 15 мин.
  2. Удалить 4% формальдегида и добавить 0,2% Тритон X-100 в течение 5 мин при 37 Градусов по Цельсию в пермяки клеток.
  3. Удалить 0,2% Triton X-100 и промыть монослой pbS 2x-3x.
  4. Обложка монослой с 2% бычьей сыворотки альбумина (BSA) раствор для 45 мин при 37 градусов по Цельсию.
  5. Удалите 2% раствор BSA и промыть монослой PBS 2x-3x.
  6. Добавьте первичные антитела Cx43 в концентрации 1:400 в образец и инкубировать на ночь при 4 градусах Цельсия.
  7. Удалите первичные антитела и промыть образец с PBS 2x-3x.
  8. Добавить вторичные антитела в концентрации 3:200 и инкубировать в течение 2 ч при 37 градусов по Цельсию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы должны быть покрыты для предотвращения фотоотбеления.
  9. Удалить вторичные антитела и промыть PBS 2x-3x.
  10. Накрыть образец монтажной средой (Fluromount-G DAPI) и уплотнить 18-мм крышкой.

9. Внедрение микроскопии силы тяги (TFM) и монослойной микроскопии стресса (MSM)

  1. Расчет деформации гидрогеля
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ниже приведена пошаговая процедура расчета смещения с использованием MATLAB.
    1. Откройте основной файл traction.m в MATLAB (для всех процедур MATLAB см. Дополнительные материалы).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте инструкциям, приведенным в коде для установки каталога MATLAB.
    2. Определите следующие переменные: формат изображения, преобразование пикселя к микрон, модуля Янга, соотношение Пуассона и цель микроскопа.
    3. Найдите бисин, изображение трипсина и фазовое изображение с помощью подпрограммы OpenFiles.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для больших наборов данных лучше всего называть файлы в последовательном порядке. Например, файлы должны называться "filename1.tif", "filename2.tif" и т.д.
    4. Определите квадратную рентабельность инвестиций (регион интереса) вокруг монослойячейки и выполните подпрограмму cell-cropper для обрезки исходного изображения.
    5. Выполните подпрограмму смещения для вычисления перемещений.
    6. Выполните подпрограмму Dedrift, чтобы удалить любые дополнительные неклеточные перемещения, которые могут быть вызваны дрейфом стадии микроскопа.
  2. Вычисление тяги
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь, неограниченные tractions рассчитываются с помощью нашей пользовательской процедуры MATLAB. Шаг за шагом тяги вычислений с использованием процедуры MATLAB ранее упоминалось приведено ниже.
    1. Определите следующие переменные в рамках процедуры traction.m: состояние границы, толщина геля, высота геля и сдрифтер.
    2. Выполните подпрограмму тяги и поиска для расчета тяги и выполнения подпрограммы plot'traction для сюжета. Все тяги в X-направлении (Tx) и y-направление (Ty) вместе с соответствующими местоположениями пикселей можно найти в файле traction.dat, который будет сгенерирован кодом.
  3. Вычисление межклеточных стрессов
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг за шагом инструкции для межклеточного стресса вычислений с использованием процедуры MATLAB ранее упоминалось приведены ниже.
    1. Выполните подпрограмму mark'circular-domain для указания границы монослой. Эта процедура подскажет всем обрезанным изображениям фазы последовательно для пользователя вручную нарисовать границу вокруг монослой. Храните в виду nXPts, генерируемые в окне команды, и используйте их позже в качестве параметров сетки как в оси X, так и в оси Y для анализа FEM (см. шаг 9.3.2).
    2. Выполняйте Run-StressCode для расчета межклеточных стрессов. Эта подзаоражая непосредственно считывает параметры из файла "model.in" и выполняет "island.exe" для выполнения анализа FEM. Перед запуском этой рутины убедитесь, что все параметры в model.in файле, т.е. параметры сетки в X и Y, преобразование пикселя в микрон, модуль Янга геля, соотношение Пуассона, высота монослой и монослойный узор (полоса или отверстие) редактируются Правильно.
    3. Участок все результаты FEM с помощью подпрограммы plot-FEM'results.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все генерируемые результаты будут автоматически храниться в папке «Результаты» в каталоге MATLAB.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Фазовые контрастные изображения контроля, 0,2 мкг/мл и 2 мкг/мл халкона, обработанные монослойными, были сделаны за 30 минут до обработки чалконей(рисунок 1A-C)и через 2 часа после лечения чалконом(рисунок 1D-F). Клеточные индуцированные смещения биса (мкм) наблюдалось снижение как в низкой дозе халкона и высоких дозах халкон условиях(Рисунок 2E,F) по сравнению с контролем HUVEC монослойных(Рисунок 2D). До лечения чалконе, rms tractions были около 51 и 8 Pa(Рисунок 3A-C) для всех условий. После лечения чалконе, было небольшое увеличение rms tractions до 59 и 11 Па в низкой дозе мелкона лечение монослойных(Рисунок 3E) и почти в 2 раза снижение рмс тяги до 18 и 2 в высоких дозах халкон лечение монослойных ( Рисунок 3F) по сравнению с контролем(Рисунок 3D). До лечения чалконе, средние нормальные межклеточные напряжения были около 220 и 66 Pa(Рисунок 4A-C). После лечения чалконе, было увеличение средней нормальной межклеточной величины стресса до 285 и 75 Па с низкой дозой лечения халкона(Рисунок 4E), но значительное снижение средней нормальной межклеточной величины стресса до 106 4 Па с высокой дозой лечения чалконе(Рисунок 4F) по сравнению с контролем среднего нормального межклеточного напряжения (235 и 18 Па, Рисунок 4D). Максимальный сдвига межклеточных напряжений были около 241 и 30 Па (Рисунок 5A-C) до лечения чалконе, но после лечения чалконе, было снижение до 227 и 20 Па при низкой концентрации шалкона(Рисунок 5E) и дальнейшее снижение максимальной величины сдвига межклеточного стресса до 91 и 6 Па при высокой концентрации халкона(Рисунок 5F) по сравнению с контролем максимального сдвига межклеточных стрессов (270 й 30 Pa, Рисунок 5D ). Анализ тяги и межклеточных стрессов представлен на рисунке 6A-C. Все построенные результаты были проверены на статистическую значимость (тест и один фактор ANOVA тест), и в обоих тестах результаты были признаны статистически значимыми(p qlt; 0.05) при независимом сравнении 0,2 мкг/мл концентрации халкона и 2 мкг/мл халкон для контроля условий (без халкона).

Figure 1
Рисунок 1: Репрезентативные фазовые контрастные изображения монослойных HUVEC. Пример фазовых контрастных изображений контрольных HUVECs на 30 мин (A) и 2 ч (D), фазовые контрастные изображения HUVECs обработаны 0,2 мкг /мл чалконе на 30 мин (B) и 2 ч (E), и фазовые контрастные изображения HUVECs, обработанных с 2 мг/мл чалконе на 30 мин (C) и 2 ч (F) начала эксперимента. Шкала бар представляет собой монослой диаметром 1,25 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: Иллюстрация поля смещения, производимого монослойами HUVEC. Представитель смещений (мкм) контроля HUVECs на 30 мин (A) и 2 ч (D), HUVECs лечение 0,2 мкг /мл халкона на 30 мин (B) и 2 ч (E), и HUVECs лечение 2 мкг /мл халкона на 30 мин (C) и 2 ч (F) эксперимент начала. Панель масштаба представляет собой монослой диаметром 1,25 мм. Цветовая панель представляет собой смещения в мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Распределение тяги RMS в монослойах HUVEC. Пример rms tractions (Pa) контроля, 0,2 мкг/мл чалкона и 2 мкг/мл халкона HUVECs до лечения чалкона(A-C) и после часа лечения чалконей(D-F),соответственно. Шкала бар представляет монослой диаметром 1,25 мм. Цвет бар представляет RMS tractions в Pa. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: Среднее нормальное распределение межклеточного стресса в монослойах HUVEC. Среднее нормальное межклеточное напряжение (Па) распределение контроля HUVECs на 30 мин (A) и 2 ч (D), HUVECs лечение 0,2 мкг /мл чалконе на 30 мин (B) и 2 ч (E), и HUVECs лечение с 2 мкг / мл чалконе на 30 мин (C) и 2 ч (F). Шкала бар представляет собой монослой диаметром 1,25 мм. Цвет бар представляет собой подчеркивает сявок в Pa. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: Максимальное распределение межклеточного стресса в монослойах HUVEC. Максимальное распределение сдвига между целлюлозным стрессом (Па) контрольных HUVECs на 30 мин (A) и 2 ч (D), HUVECs лечение 0,2 мг/мл халкона на 30 мин (B) и 2 ч (E), и HUVECs лечение 2 мкг /мл чалкон на 30 мин (C) и 2 ч(F). Шкала бар представляет собой монослой диаметром 1,25 мм. Цвет бар представляет собой подчеркивает сявок в Pa. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6: Сравнение RMS tractions и межклеточных стрессов в монослойах HUVEC и влияние лечения чалконом на структуры разрыва HUVEC Cx43. Участки среднего нормального межклеточного стресса(A), максимальный сдвига межклеточного стресса (B) и RMS tractions (C) показывают влияние дозы халкона (0,2 мкг/мл и 2 мкг/мл) на монослой HUVEC по сравнению с контролем. Ошибки баров показывают стандартную ошибку. Результаты оказались статистически значимыми (размер выборки - 6 островов, с уровнем достоверности 95%) используя оба t-теста по сравнению с управлением(p qlt; 0.05) и одним фактором ANOVA(p qlt; 0.05). В отдельных блюдах иммуностоинг проводился 5 ч после добавления препарата для островов клеток, проживающих на мягких гидрогелях 1,2 кПа. Зеленый цвет представляет Cx43, а синий — DAPI (ядро). Панель D изображает следующее: контроль (E,H), 0,2 мкг/мл чалконеобработанные клетки (F,I) и 2 мкг/мл чалконе обработанных клеток(G, J). Шкала бар 200 мкм, цель 20x. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Supplementary Figure 1
Дополнительная фигура 1: Окрашивание Cx43 высокого разрешения в монослойах HUVEC. Фиксированные монослойы HUVEC были окрашены для Cx43 (зеленый) и ядро (DAPI, синий) для наблюдения дозо-зависимый эффект халкона. Изображения с более высоким увеличением (63x цель) показывают локализацию Cx43 в основном вокруг ядра (очевидно, от интенсивности зеленой флуоресценции). Показаны контроль (A-C), 0,2 мкг/мл чалконеобработанные клетки(D-F) и 2 мкг/мл чалконеобработанные клетки(G-I). Шкала бар 100 мкм, объективное погружение масла 63x. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

1200 Па 870 Па 1 кПа 4 кПа 6.3 кПа 11 кПа 90 кПа 150 кПа
Состав раствора 0,05% БИС 0,1% БИС 0,03% Бис 0,1% БИС 0,03% Бис 0,07% БИС 0,3% БИС 0,6% БИС
5,5% Акрил 2% Акрил 5% Акрил 5% Акрил 10% Акрил 10% Акрил 12% Акрил 12% Акрил
Ультра чистая вода 12.49 мл 13,38 мл л. 12,78 мл л. 12,255 мл л. 10.905 мл 10,63 мл л. 8.30 мл 5,9 мл
40% Акриламид 2,062 мл л. 750 л 1,875 мл л. 1,875 мл л. 3,75 мл 3,75 мл л. 4,5 мл л. 4,5 мл л.
2% BIS Акриламид 375 л 750 л 225 л 750 л 225 л 525 л 2,12 мл л. 4,5 мл л.
Флуростесцентные бусы (0,2 мкм или 0,5 мкм) 80 зл 80 зл 80 зл 80 зл 80 зл 80 зл 80 зл Тракции не поддаются измерению

Таблица 1: Полякриламид гель решений формулировки для различных модули молодых.

Объем Толщина Обложка
20-мм sl хорошо Толстые 500 л 1 мм 25 мм
Тонкий 24 зл. 100 мкм 18 мм
14-мм sl хорошо Толстые 175 л 700 мкм 18 мм
Тонкий 10,3 л 100 мкм 12 мм
14 мм 6-колодец Толстые 280 л 1,5 мм 18 мм

Таблица 2: объем геля и толщина.

Дополнительный файл: Матлаб Рутины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот файл (Право нажмите, чтобы скачать).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Наша группа, как и другие, успешно использует TFM и MSM для зондирования влияния клеточных соединений в различных патологических и физиологических клеточных процессах in vitro7,15,18,27 . Например, Hardin et al. представили очень проницательное исследование, которое предлагает межклеточной передачи стресса руководства параклеточного разрыва формирования в эндотелиальных клетках15. Хотя можно связать изменения, связанные с Cx43, мы сообщаем здесь с изменениями, о которых сообщил Hardin et al., мы конкретно не рассматриваем образование параклеточного разрыва в этом протоколе. Здесь мы представили протокол на основе механики, специально ориентированный на разрывный узел Cx43 и исследуем его влияние на эндотелиальную биомеханику.

Чтобы сделать этот протокол успешным, было несколько проблем, которые мы должны были преодолеть, некоторые из которых могут возникнуть, если другие исследователи решат принять наш протокол для аналогичных исследований. Основная проблема заключалась в том, чтобы найти оптимальный диапазон дозы chalcone, где экспрессия Cx43 может быть ингибирована, сохраняя при этом наши эндотелиальные монослои нетронутыми. IC50 из chalcone для HUVECs ранее сообщалось, что 10,01 мкг/мл28. Однако, когда мы подвергли наших монослой HUVEC множественным концентрациям халкона в диапазоне от 0,2 мкг/мл до 20 мкг/мл, мы обнаружили, что концентрация халкона в 2 мкг/мл является самой высокой концентрацией, которой могут выдержать наши монослои, оставаясь при этом сливающейся. Для этого протокола необходим сольственный монослой, так как для измерения межклеточных стрессов с помощью МСМ требуется монослой. Затем мы провели иммунофлуоресценцию, чтобы определить, если выбранные дозы халкона успешно нарушили структуру Cx43 или очевидное выражение. Наш результат показал, что в то время как нарушение структуры Cx43 с 0,2 мкг/мл чалконе было визуально трудно отличить от контроля, клетки, обработанные 2 мкг/мл чалкона, как представляется, показывают очевидную разницу в структуре Cx43 и потенциальном выражении ( Рисунок 6D и дополнительная диаграмма 1). Кроме того, наши результаты показали, что нарушение Cx43 действительно влияет на эндотелиальную биомеханику за счет снижения тяги и межклеточных напряжений при самой высокой концентрации. Эти выводы в согласии с Bazellieres и др., которые показали молчание Cx43 с siRNA также уменьшить тяги и межклеточные стрессы, но в листе эпителиальных клеток27. Хотя наши результаты находятся в согласии с другими следует отметить, что молекула, которую мы использовали, чтобы нарушить экспрессию Cx43, chalcone, также было предложено влиять на активацию MAPK и NFkB в дополнение к Cx43 нарушение26. Поэтому, поскольку мы специально не смотрели на вышеупомянутые молекулы или связанные с ними пути, мы не можем исключить влияние потенциального возмущения MAPK и NFkB может оказать на эндотелиальную биомеханику.

Еще один ключевой момент стоит отметить, что восстановленные тяги и межклеточные стрессы 2D в природе и игнорировать из плоскости (z-направление) тяги и межклеточных напряжений12,13. Хотя есть небольшая ошибка, связанная с игнорированием вне плоскости напряжений, эта ошибка является незначительной13. Кроме того, боковое измерение монослой достаточно велико (1,25 мм) относительно высоты монослойной высоты (5 мкм), так что мы не ожидаем значительных перемещений в z-направлении. Кроме того, расчет МСМ предлагает ошибку на монослойной границе12,13. Тем не менее, Tambe et al. экспериментально показали, что ошибки являются самыми высокими на оптических краях (т.е. монослойной границе) и распадается быстро дистальной от границы края13. Мы выполняем микропаттернирование, а затем вычисляем межклеточные напряжения всего монослой, чтобы избежать ошибок границ, которые могут возникнуть во время межклеточных вычислений напряжения.

Монослойная микроскопия стресса используется в этом протоколе, как межклеточная информация стресса, полученная от этого метода имеет важное значение для того, чтобы иметь более полное понимание роли разрыв разрыв разрыв имеет на эндотелиальной биомеханики. Кроме того, было предложено, чтобы межклеточные стрессы были важны в функции эндотелиальных барьеров, как это было предложено Хардином и др.15 и Кришнаном и др.17,например. Кроме того, в то время как межклеточные стрессы были связаны с tractions в представленных здесь репрезентативных данных, это не всегда так в зависимости от стимула. В исследовании Стюард и др., например, эндотелиальные межклеточные напряжения были показаны, чтобы уменьшить под сдвига жидкости, в то время как тяги остались относительно неизменными7. Кроме того, протокол, который мы представляем здесь, не допускает одновременного измерения механических сил, полученных из клеток, и окрашивания соединений и очаговых спаек, но такое дополнение было бы бесплатным к этому протоколу. В заключение, протокол, который мы представляем здесь, описывает метод, основанный на механике, чтобы исследовать влияние Cx43 исключительно на эндотелиальную биомеханику, в частности эндотелиальные силы, полученные из клеток. Мы считаем, что наш протокол на основе механики может быть использован в сочетании с существующими в настоящее время биологическими протоколами, чтобы обеспечить действительно новаторскую работу в этой области.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Университета Центральной Флориды стартовых фондов и Национального сердца, легких, и крови института Национального института здравоохранения в соответствии с наградой K25HL132098.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 mm coverslip ThermoFisher 18CIR-1 Essential to flatten polyacrylamide gels
2% bis-acrylamide BIO-RAD 1610143 Component of polyacrylamide gel
2′,5′-Dihydroxychalcone SIGMA IDF00046 To disrupt Cx43 structure
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate SIGMA 2530-85-0 Stock solution to make bind silane mixture with acetic acid and ultra-pure water
40% Acrylamide BIO-RAD 1610140 Component of polyacrylamide gel
Acetic acid Fisher-Sceintific 64-19-7 Essential to make bind saline solution
Alexa Fluro 488 goat anti-mouse IgG; ThermoFisher Catalog # A-11001 Secondary antibody
Ammonium persulfate BIO-RAD 1610700 Polyacrylamide gel polymerizing agent
Bovine Serum Albumin (BSA) SIGMA 9048-46-8 To make blocking solution
Bovine Type I Atelo-Collagen Solution, 3 mg/mL, 100 mL Advance Biomatrix 5005-100ML Use as a extracellular matrix
Corning Cell Culture Phosphate Buffered Saline (1x) Fisher-Sceintific 21040CV Buffer Saline needed for cell culture
Dimethyl Sulfoxide, Fisher BioReagents Fisher-Sceintific 67-68-5 To dissolve chalcone and make stock solution
Fluoromount-G with DAPI ThermoFisher 00-4959-52 Mounting medium for immunostaing used to stain for DAPI
Fluroscent microsphere Carboxylate-modified beads ThermoFisher F8812 0.5 micron carboxylate-modified beads (red), 2% solids
HEPES buffer solution 1 M SIGMA 7365-45-9 Essential to
LVES ThermoFisher A1460801 Essential HUEVC media 200 supplement
Medium 200 ThermoFisher M200500 Essential media for HUVEC cell culture
Mouse monoclonal Cx43 antibody (CX - 1B1) ThermoFisher Catalog #13-8300 Primary antibody for Cx43
Petri dish (35 mm dia) CellVis D35-20-1.5H 35 mm petri dish with a 20 mm center well
Sulfo-SANPAH Crosslinker 100 mg Proteochem 102568-43-4 Essential to functionalize polyacrylamide gel surface
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit DOW corning 2646340 Silicon elastomer with curing agent to make PDMS
TEMED BIO-RAD 1610801 Polyacrylamide gel polymerizing agent
Triton-X 100 SIGMA 9002-93-1 To permeabilize cells
Trypsin -EDTA ThermoFisher 25300054 Used to detach cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mammoto, T., Mammoto, A., Ingber, D. E. Mechanobiology and developmental control. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 27-61 (2013).
  2. Schwarz, U. S., Soine, J. R. Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances. Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (11 Pt B), 3095-3104 (2015).
  3. Style, R. W., et al. Traction force microscopy in physics and biology. Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).
  4. Colin-York, H., et al. Super-Resolved Traction Force Microscopy (STFM). Nano Letters. 16 (4), 2633-2638 (2016).
  5. Zimmermann, J., et al. Intercellular stress reconstitution from traction force data. Biophysical Journal. 107 (3), 548-554 (2014).
  6. Islam, M. M. Recent Advances in Experimental Methods of Cellular Force Sensing. Biomedical Journal of Science & Technical Research. 17 (3), (2019).
  7. Steward Jr, R., Tambe, D., Hardin, C. C., Krishnan, R., Fredberg, J. J. Fluid shear, intercellular stress, and endothelial cell alignment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 308 (8), C657-C664 (2015).
  8. Trepat, X., et al. Physical forces during collective cell migration. Nature Physics. 5, 426-430 (2009).
  9. Li, Z., et al. Cellular traction forces: a useful parameter in cancer research. Nanoscale. 9 (48), 19039-19044 (2017).
  10. Brugues, A., et al. Forces driving epithelial wound healing. Nature Physics. 10 (9), 683-690 (2014).
  11. Pasqualini, F. S., et al. Traction force microscopy of engineered cardiac tissues. PLoS One. 13 (3), e0194706 (2018).
  12. Tambe, D. T., et al. Collective cell guidance by cooperative intercellular forces. Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).
  13. Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PLoS One. 8 (2), e55172 (2013).
  14. Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), C595-C605 (2002).
  15. Hardin, C. C., et al. Long-range stress transmission guides endothelial gap formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 749-754 (2018).
  16. Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer. Molecular Biology of the Cell. 29 (19), 2292-2302 (2018).
  17. Krishnan, R., et al. Substrate stiffening promotes endothelial monolayer disruption through enhanced physical forces. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), C146-C154 (2011).
  18. Islam, M. M., Steward, R. L. Probing Endothelial Cell Mechanics through Connexin 43 Disruption. Experimental Mechanics. 59, 327 (2019).
  19. Figueroa, X. F., Duling, B. R. Gap junctions in the control of vascular function. Antioxidants & Redox Signaling. 11 (2), 251-266 (2009).
  20. Nielsen, M. S., et al. Gap junctions. Comprehensive Physiology. 2 (3), 1981-2035 (2012).
  21. Sohl, G., Willecke, K. Gap junctions and the connexin protein family. Cardiovascular Research. 62 (2), 228-232 (2004).
  22. Haefliger, J. A., Nicod, P., Meda, P. Contribution of connexins to the function of the vascular wall. Cardiovascular Research. 62 (2), 345-356 (2004).
  23. Marquez-Rosado, L., Solan, J. L., Dunn, C. A., Norris, R. P., Lampe, P. D. Connexin43 phosphorylation in brain, cardiac, endothelial and epithelial tissues. Biochimica et Biophysica Acta. 1818 (8), 1985-1992 (2012).
  24. Liao, Y., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. Endothelial cell-specific knockout of connexin 43 causes hypotension and bradycardia in mice. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9989-9994 (2001).
  25. Walker, D. L., Vacha, S. J., Kirby, M. L., Lo, C. W. Connexin43 deficiency causes dysregulation of coronary vasculogenesis. Developmental Biology. 284 (2), 479-498 (2005).
  26. Lee, Y. N., et al. 2',5'-Dihydroxychalcone down-regulates endothelial connexin43 gap junctions and affects MAP kinase activation. Toxicology. 179 (1-2), 51-60 (2002).
  27. Bazellieres, E., et al. Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome. Nature Cell Biology. 17 (4), 409-420 (2015).
  28. Nam, N. H., et al. Synthesis and cytotoxicity of 2,5-dihydroxychalcones and related compounds. Archives of Pharmacal Research. 27 (6), 581-588 (2004).

Tags

Биохимия Выпуск 152 микроскопия силы тяги монослойная микроскопия стресса механобиология разрыв соединения Cx43 межклеточный стресс
Возмущение эндотелиальной биомеханики через Connexin 43 Структурные нарушения
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Islam, M. M., Steward, Jr., R. L.… More

Islam, M. M., Steward, Jr., R. L. Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption. J. Vis. Exp. (152), e60034, doi:10.3791/60034 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter