Summary
Aquí, presentamos un protocolo basado en la mecánica para interrumpir la conexión de separación de la conexión 43 y medir el impacto posterior que esto tiene en la biomecánica endotelial a través de la observación de tracciones y tensiones intercelulares.
Abstract
Las células endoteliales se han establecido para generar tensiones y tracción intercelulares, pero actualmente se desconoce el papel que desempeñan las uniones de brecha en la generación de tensión y tracción intercelular endotelial. Por lo tanto, presentamos aquí un protocolo basado en la mecánica para sondear la influencia de la unión de brecha connexina 43 (Cx43) tiene en la biomecánica endotelial mediante la exposición de monocapas endoteliales confluentes a un conocido inhibidor Cx43 2,5-dihydroxychalcone (chalcone) y medir el impacto que este inhibidor tiene en las tracciones y tensiones intercelulares. Presentamos resultados representativos, que muestran una disminución en las tracciones y tensiones intercelulares bajo una dosis alta de chalcone (2 g/ml) en comparación con el control. Este protocolo se puede aplicar no sólo a Cx43, sino también a otros cruces de separación, suponiendo que se utilice el inhibidor adecuado. Creemos que este protocolo será útil en los campos de la investigación cardiovascular y mecanobiología.
Introduction
El campo que se refiere al estudio de los efectos de las fuerzas físicas y de las propiedades mecánicas en la fisiología celular y tisular y la patología se conoce como mecanobiología1. Algunas técnicas útiles que se han utilizado en la mecanobiología son la microscopía de tensión monocapa y la microscopía de fuerza de tracción. La microscopía de fuerza de tracción permite el cálculo de las tracciones generadas en la interfaz célula-sustrato, mientras que la microscopía de tensión monocapa permite el cálculo de tensiones intercelulares generadas entre células adyacentes dentro de una monocapa2 ,3,4,5,6. Los resultados obtenidos de métodos anteriores han sugerido que las tensiones mecánicas derivadas de células desempeñan un papel crucial en la determinación del destino de una serie de procesos celulares3,4,5. Por ejemplo, al exponerse a una fuerza mecánica externa, un grupo de células que migran como colectivo puede alterar su morfología y polarizar su forma para alinear y migrar a lo largo de la dirección de la fuerza aplicada, en parte, generando tracción7, 8. Las tracciones proporcionan una métrica que se puede utilizar para evaluar la contractilidad celular y se calculan mediante microscopía de fuerza de tracción (TFM). La microscopía de fuerza de tracción (TFM) comienza con la determinación de deformaciones de sustrato inducidas por células seguidas por el cálculo del campo de tracción utilizando un enfoque computacional matemáticamente riguroso y basado en la mecánica. Dado que la capacidad de calcular las tracciones ha existido durante bastante tiempo, los investigadores han utilizado TFM para revelar el impacto que las tracciones tienen en una serie de procesos, incluyendo el cáncer9,la cicatrización de heridas10 y la evaluación de tejido11.
La implementación de TFM y MSM juntos se puede dividir en tres pasos esenciales que deben ejecutarse en el siguiente orden: primero, se determinan las deformaciones de hidrogel producidas por las células; en segundo lugar, las tracciones se recuperan de las deformaciones de hidrogel; y en tercer lugar, se utiliza un enfoque de elementos finitos para calcular tensiones intercelulares normales y cortantes dentro de toda la monocapa. Para calcular los desplazamientos de gel, las imágenes de perlas de fluorescencia con células se compararon con la imagen del cordón de referencia (sin celdas) mediante una rutina de velocimetría de imagen de partículas (PIV) escrita a medida. El tamaño de la ventana de correlación cruzada y la superposición para el análisis PIV se eligieron para ser de 32 x 32 píxeles y 0,5, respectivamente. En este momento, los cambios de píxeles se convirtieron en micras multiplicando con un factor de conversión de píxel a micra (para nuestro microscopio, este factor de conversión es 0,65) para obtener desplazamientos en el plano. Los errores asociados con ignorar desplazamientos fuera del plano son insignificantes12,13. Después del cálculo de los desplazamientos de gel, hay dos tipos de mediciones de tracción que se pueden utilizar, tracciones restringidas y tracciones sin restricciones8,14. Las tracciones sin restricciones proporcionan el campo de tracción para todo el campo de visión (incluidas las regiones con y sin celdas), mientras que las tracciones restringidas proporcionan el campo de tracción solo para las regiones que incluyen las celdas14. A continuación, las tensiones intercelulares se calculan mediante microscopía de tensión monocapa (MSM), que es una extensión de la microscopía de fuerza de tracción. La implementación de MSM se basa en la suposición de que las tracciones locales ejercidas por una monocapa de células en la interfaz célula-sustrato deben equilibrarse mediante fuerzas mecánicas transmitidas entre células en la interfaz de células celulares según lo exigido por las leyes 7 de Newton ,12,13. Una suposición clave aquí es que la monocapa de celda se puede tratar como una hoja elástica delgada porque se conoce la distribución de tracción en la monocapa y el equilibrio de fuerza no depende de las propiedades del material celular. Otra suposición clave es que las fuerzas de tracción están equilibradas por tensiones intercelulares locales dentro del campo de visión óptico (dentro de la monocapa) y la influencia de este equilibrio de fuerza es mínima en la región distal (fuera de la monocapa)13. Por lo tanto, las condiciones límite definidas por tensiones intercelulares, desplazamientos o una combinación de ambos en el límite monocapa son cruciales para realizar MSM13. Teniendo en cuenta la información anterior, utilizamos MSM para realizar un análisis de elementos finitos (FEM) para recuperar la tensión principal máxima(máx.)y la tensión principal mínima(min)girando el plano de tensión en cada punto dentro del Monocapa. Estas tensiones principales se utilizan posteriormente para calcular la tensión intercelular normal promedio 2D [((max + ?min) /2] y la tensión intercelular de cizallamiento máxima 2D [(máx. -min) /2] dentro de toda la monocapa 12,13. Este procedimiento es descrito con más detalle por Tambe et al.12,13
La microscopía de tensión monocapa (MSM) permite el cálculo de tensiones intercelulares de células celulares generadas dentro de una monocapa6,7,8,12,13. Estas tensiones intercelulares se han sugerido para ser importantes para el crecimiento y reparación de tejidos, cicatrización de heridas, y metástasis de cáncer12,15,16,17. Además, se ha sugerido que las tensiones intercelulares también son importantes en la migración de células endoteliales y la función de barrera endotelial17,18. Mientras que las uniones de células celulares tales como uniones estrechas y uniones adheridas han sido sugeridas para desempeñar un papel crítico en la generación y transmisión de estrés intercelular endotelial, el papel de las uniones de separación sigue siendo esquivo. Las uniones de brecha conectan físicamente las células adyacentes y proporcionan una vía para que la corriente eléctrica y las moléculas (<1 KDa) pasen entre las células vecinas19,20,21. Aunque las células endoteliales expresan las uniones de brecha Cx37, Cx40 y Cx4319,22, Cx43 es posiblemente la más importante en términos de progresión de la enfermedad23. La evidencia de la importancia de Cx43 se puede encontrar en el hecho de que la eliminación genética de Cx43 en ratones resulta en hipotensión24 y tiene efectos adversos sobre la angiogénesis25. Además, se ha documentado que Cx43 es importante para la migración y proliferación celular y para la progresión de la aterosclerosis18,22,23,24,25 .
En este protocolo, utilizamos TFM y MSM para investigar si la tracción y la generación de tensión intercelular dentro del confluente, monocapa endotelial se vería afectada por la interrupción de la unión de brecha endotelial Cx43. Interrumpimos Cx43 con 2,5-dihydroxychalcone (chalcone), una molécula documentada para inhibir cx43 expresión26. Chalcone se utilizó para interrumpir Cx43 en lugar de siRNA como chalcone ha sido reportado previamente por Lee y otros para interrumpir la expresión26de Cx43. Además, estábamos particularmente interesados en la influencia de chalcone en el endotelio, ya que también se ha informado de que es un compuesto antiinflamatorio y antiplaquetario que potencialmente se puede utilizar para la prevención y el tratamiento de varios vasculares patologías26. Los tratamientos de Chalcone se realizaron una hora después del inicio del experimento, se tomaron imágenes monocapas tratadas con chalcone durante un total de seis horas, y el procesamiento de imágenes se realizó con un código MATLAB escrito a medida para determinar las tracciones y, posteriormente, intercelulares Tensiones. Nuestros resultados mostraron una disminución general en las tracciones y tensiones intercelulares, lo que sugiere que Cx43 desempeña un papel clave en la biomecánica endotelial.
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Protocol
1. Fabricación de geles de poliacrilamida (PA)
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Preparación de plato de Petri
- Preparar la solución de silano de unión mezclando 200 ml de agua ultrapura con ácido acético de 80 ml y 50 s de metacrilato de propilo de 3(trimetoxisilo). Bind silane es una solución utilizada para funcionalizar la superficie de la placa Petri inferior de vidrio para la fijación de hidrogel.
- Agitar la solución de silano de unión en una placa de agitación durante al menos 1 h.
- Tratar el pozo central de la placa Petri con solución de silano de unión durante 45 min.
- Retire la solución de silano de unión y enjuague la placa Petri con agua ultrapura 2x-3x.
- Seque la superficie del plato Petri y guárdela a temperatura ambiente para su uso futuro.
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Preparación de la solución de hidrogel
- Mezclar agua ultrapura, 40% acrilamida y 2% bis-acrilamida en un tubo centrífugo de 15 ml según la Tabla 1.
- Añadir 80 l de perlas fluorescentes a la solución de hidrogel.
- Agitar suavemente el tubo para mezclar las perlas con la solución de gel.
- Apriete ligeramente la tapa del tubo en el tubo de centrífuga y colóquela en una cámara de vacío.
- Desgasifique la solución de gel durante al menos 45 minutos en cámara de vacío.
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Polimerización de hidrogel
- En primer lugar, añadir 75 l de persulfato de amonio al 10% (disuelto en agua ultrapura) y luego añadir 8 l de TEMED (N,N,N',N'-tetrametiletano-1,2-diamina) a la solución de hidrogel.
- Colocar 24 l de solución de hidrogel en el centro de la placa Petri (ver Tabla 2).
- Utilice un cubreobjetos de 18 mm para aplanar el hidrogel. Esto dará una altura de 100 m.
- Espere al menos 30-40 min para la polimerización en gel.
- Sumerja el hidrogel polimerizado en agua ultrapura para evitar la deshidratación del gel.
- Cubra el plato Petri con papel de aluminio para evitar el fotoblanqueo de cuentas fluorescentes y guárdelo a 4 oC.
NOTA: Los hidrogeles se pueden almacenar un período de hasta 3 meses, pero se sugiere que estos geles se utilicen no más de 1 semana después de la fabricación para obtener los mejores resultados.
2. Cultivo celular
- Cultivo de células endoteliales de venas umbilicales humanas (HUVEC) en el medio de cultivo celular 200 (ver Tabla de Materiales)complementado con 1% penicilina-estreptomicina en matraces recubiertos de gelatina al 0,1% a 37oC y 5% CO2.
3. Preparación de la plantilla micropatrón
- Curar una fina capa de polidimetilsiloxano (PDMS) en una placa Petri de 100 mm mezclando la base de silicona con el agente de curado de silicona en una proporción de 20:1 (base: agente de curado).
NOTA: Es posible utilizar otras relaciones de base a agente de curado (por ejemplo, 10:1 o 30:1). Sin embargo, una relación de base más baja a agente de curado producirá un patrón más rígido, mientras que una relación de base a agente de curado más alta producirá un patrón más suave. - Prepare una solución PDMS 20:1 (base:agente de curado) y mezcle cuidadosamente en un tubo centrífugo de 50 ml. Invierta el tubo boca abajo y agite vigorosamente varias veces para asegurar una mezcla adecuada de la solución PDMS, ya que la mezcla no uniforme dará como resultado una polimerización incompleta.
- Elimine las burbujas que se han introducido desde el paso anterior centrifugando la solución PDMS durante 1 min a 190 x g.
- Vierta 5-6 ml de la solución PDMS en el centro de una placa Petri de 100 mm y agite el plato hasta que la solución PDMS cubra toda la superficie de la placa Petri.
- Curar la solución PDMS durante la noche a 50-60 oC. PDMS también se puede curar a temperatura ambiente.
- Retire una plantilla PDMS circular de 16 mm de diámetro con un perforador de orificios.
- Utilice un punzón de biopsia para crear pequeños agujeros en la galería de símbolos PDMS. Este protocolo utiliza un punzón de biopsia de 1,25 mm de diámetro.
- Sterilice las plantillas PDMS sumergiéndolas primero en etanol al 70% durante 2-3 min, aspirando el exceso de etanol y luego colocándolas bajo una luz UV durante 5 min.
4. Recubrimiento de hidrogel colágeno-I
- Retire el cubreobjetos del hidrogel y aspire cualquier exceso de líquido.
- Coloque la plantilla PDMS sobre la superficie del hidrogel.
NOTA: Las pinzas se pueden utilizar para aplicar presión lustral a la plantilla PDMS para garantizar un sello hermético entre la plantilla PDMS y la superficie del hidrogel. Nuestras plantillas PDMS son herméticas y, por lo tanto, evitan el acceso al agua entre la superficie superior del gel y la superficie inferior de la plantilla PDMS. Además, no es necesario ajustar la rigidez del hidrogel con respecto a la rigidez de PDMS. - Cubrir la superficie del hidrogel con hexanoato de sulfosuccinimidil-6-(4-azido-2-nitrofenilendamino) (sulfo-SANPAH) disuelto en una solución tampón HEPES de 0,1 M (4-(2-hidroxietilo)-1-piperazineethanesulfonic) a una concentración de 1 : 1000 y colocar bajo un ácido UV UV lámpara (potencia 36 W) durante 8 min.
- Aspirar el exceso de sulfo-SANPAH y HEPES solución y enjuagar el hidrogel dos veces con 0.1 M HEPES seguido de dos enjuagues adicionales con agua ultrapura.
- Aspirar el exceso de agua ultrapura e recubrir los hidrogeles con 0,1 mg/ml de colágeno-I durante la noche a 4oC.
- Cubrir los platos y proteger las cuentas fluorescentes de fotoblanqueo.
NOTA: Las plantillas PDMS se utilizan para crear monocapas micropatrónadas. Las monocapas micropatrónadas se utilizan, ya que permiten observar simultáneamente varias monocapas de la misma geometría y dimensiones durante cada experimento. Sin embargo, si no se desean micropatrones, los pasos anteriores se pueden seguir con la excepción del paso 4.2.
5. Creación de monocapas HUVEC en hidrogeles
- Use 1x trippsina para separar las células de los matraces de cultivo de tejido durante 3-5 minutos en la incubadora.
- Después de la trippsinización, agregue medios de cultivo celular a la solución de tripsina y agregue al tubo centrífugo de 15 ml.
- Centrifugar la solución celular durante 3 min a 1710 x g. Un pequeño pellet blanco de células debe ser visible en la parte inferior del tubo centrífugo.
- Aspirar las células sobrenadantas y resuspender en medios a una concentración de 50 x 104 células/ml.
- Retire el colágeno-I del hidrogel y enjuague 1x con PBS.
- Añadir 75 x 103 células a la parte superior de la plantilla PDMS y permitir que las células se adhieran a la superficie del hidrogel durante al menos 1 h en la incubadora a 37oC y 5%CO2.
- Retire la plantilla PDMS y añada al menos 2 ml de soporte a la placa Petri. Sumerja la plantilla PDMS en 10x trippsina para eliminar las células adheridas y esterilizar rociando con 70% de etanol y luego colocando bajo la luz UV durante 5 min.
- Coloque el plato Petri en la incubadora y espere al menos 36 h o hasta que se observe una monocapa confluente.
6. Tratamiento de 2,5 dihidroxichalcona para la interrupción de Cx43
- Disolver 2,5 dihidroxichalcona (chalcone) en dimetilsulfóxido (DMSO) para hacer una solución de stock de 0,1875 mg/ml.
- Diluir la solución de stock con medios de cultivo celular para hacer una alícuota baja en concentración de chalcone (0,2 g/ml) y una alícuota de alta concentración de chalcone (2 g/ml).
7. Adquisición de datos
- Localice las islas celulares con un microscopio.
- Adquiera imágenes de contraste de fase y cuentas para la morfología celular de la imagen y los desplazamientos de hidrogel, respectivamente.
NOTA: Este protocolo utilizaba un objetivo 10x para la adquisición de datos. - Al final del experimento, separe las células con 10x trippsina y adquiera una imagen de la superficie de gel sin células (imagen de referencia).
8. Inmunomanchación
- Arreglar monocapas con 4% de formaldehído e incubar a 37oC durante 15 min.
- Retire el 4% de formaldehído y agregue 0.2% Triton X-100 durante 5 min a 37 oC para permeabilizar las células.
- Retire 0.2% Triton X-100 y enjuague monocapas con PBS 2x-3x.
- Cubrir monocapa con 2% de solución de albúmina sérica bovina (BSA) durante 45 min a 37 oC.
- Retire la solución de BSA al 2% y enjuague las monocapas con PBS 2x-3x.
- Añadir el anticuerpo primario Cx43 a una concentración de 1:400 a la muestra e incubar durante la noche a 4oC.
- Retire el anticuerpo primario y enjuague la muestra con PBS 2x-3x.
- Añadir anticuerpo secundario a una concentración de 3:200 e incubar durante 2 h a 37oC.
NOTA: Las muestras deben cubrirse para evitar el fotoblanqueo. - Retire el anticuerpo secundario y enjuague con PBS 2x-3x.
- Cubra la muestra con medio de montaje (Fluromount-G DAPI) y selle con un resbalón de cubierta de 18 mm.
9. Implementación de microscopía de fuerza de tracción (TFM) y microscopía de tensión monocapa (MSM)
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Cálculo de deformación de hidrogel
NOTA: A continuación se muestra un procedimiento de cálculo de desplazamiento paso a paso mediante MATLAB.- Abra el archivo traction.m principal en MATLAB (para todas las rutinas de MATLAB, consulte Materiales complementarios).
NOTA: Siga las instrucciones proporcionadas en el código para establecer el directorio MATLAB. - Defina las siguientes variables: formato de imagen, conversión de píxel a micra, módulo de Young, relación de Poisson y objetivo del microscopio.
- Busque el cordón, la imagen de trippsina y la imagen de fase mediante la subrutina OpenFiles.
NOTA: Para grandes conjuntos de datos, es mejor nombrar archivos en orden secuencial. Por ejemplo, los archivos deben llamarse "filename1.tif", "filename2.tif", etc. - Defina un ROI cuadrado (región de interés) alrededor de la monocapa de celda y ejecute la subrutina cell_cropper para recortar la imagen original.
- Ejecute la subrutina displacement_finder para calcular los desplazamientos.
- Ejecute la subrutina Dedrift para eliminar cualquier desplazamiento no celular adicional que pueda deberse a la deriva de la etapa del microscopio.
- Abra el archivo traction.m principal en MATLAB (para todas las rutinas de MATLAB, consulte Materiales complementarios).
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Cálculo de las tracciones
NOTA: Aquí, las tracciones sin restricciones se calculan utilizando nuestra rutina MATLAB personalizada. A continuación se muestra el cálculo de la tracción paso a paso utilizando la rutina de MATLAB mencionada anteriormente.- Defina las siguientes variables dentro de la rutina traction.m: condición de contorno, espesor de gel, altura del gel y desderivación.
- Ejecute la subrutina traction_finder para calcular las tracciones y ejecute la subrutina plot_traction para trazar las tracciones. Todas las tracciones en dirección x (Tx) y dirección Y (Ty) junto con sus ubicaciones de píxeles correspondientes se pueden encontrar en un archivo traction.dat que será generado por el código.
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Cálculo de tensiones intercelulares
NOTA: A continuación se indican las instrucciones paso a paso para el cálculo de tensión intercelular utilizando la rutina de MATLAB mencionada anteriormente.- Ejecute la subrutina mark_circular_domain para especificar el límite de monocapa. Esta rutina solicitará todas las imágenes de fase recortadas secuencialmente para que el usuario dibuje manualmente un límite alrededor de la monocapa. Mantenga una nota de los nXPts generados en la ventana de comandos y utilícelos más adelante como parámetros de cuadrícula en el eje X y en el eje Y para el análisis FEM (consulte el paso 9.3.2).
- Ejecute Run_StressCode para calcular las tensiones intercelulares. Esta subrutina lee directamente los parámetros del archivo "model.in" y ejecuta "island.exe" para realizar el análisis FEM. Antes de ejecutar esta rutina, asegúrese de que todos los parámetros del archivo model.in, es decir, los parámetros de cuadrícula en X e Y, la conversión de píxela a micra, el módulo de Young del gel, la relación de Poisson, la altura de la monocapa y el patrón monocapa (tira o agujero), se editan Correctamente.
- Trazar todos los resultados de FEM utilizando la subrutina plot_FEM_results.
NOTA: Todos los resultados generados se almacenarán automáticamente en la carpeta Resultados del directorio MATLAB.
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Representative Results
Las imágenes de contraste de fase de control, 0,2 g/ml y 2 monocapas tratadas con chalcono de g/ml se tomaron 30 minutos antes del tratamiento con chalcone(Figura 1A-C)y 2 horas después del tratamiento con chalcone(Figura 1D-F). Se observó que los desplazamientos de perlas inducidos por células (m) disminuyeron tanto en condiciones de chalcona de dosis baja como de alta dosis de chalcona(Figura 2E,F)en comparación con el control de monocapas de HUVEC(Figura 2D). Antes del tratamiento con chalcone, las tracciones de rms eran de alrededor de 51 a 8 Pa(Figura 3A-C)para todas las condiciones. Después del tratamiento con chalcone, hubo un pequeño aumento en las tracciones de rms a 59 x 11 Pa en monocapas tratadas con baja dosis de chalcona(Figura 3E)y una disminución de casi 2 veces en las tracciones rms a 18 x 2 en monocapas tratadas con alta dosis de chalcone ( Figura 3F) en comparación con el control(Figura 3D). Antes del tratamiento con chalcone, las tensiones intercelulares normales promedio eran de alrededor de 220 a 66 Pa(Figura 4A-C). Después del tratamiento con chalcone, hubo un aumento en la magnitud media de la tensión intercelular normal a 285 a 75 Pa con tratamiento de baja dosis de chalcona(Figura 4E), pero una disminución significativa en la magnitud media de la tensión intercelular normal a 106 • 4 Pa con tratamiento de alta dosis de chalcone(Figura 4F) en comparación con el control de las tensiones intercelulares normales promedio (235 a 18 Pa, Figura 4D). Las tensiones intercelulares máximas de cizallamiento fueron de alrededor de 241 a 30 Pa(Figura 5A-C)antes del tratamiento con chalcone, pero después del tratamiento con chalcone, hubo una disminución a 227 a 20 Pa a baja concentración de chalcone(Figura 5E) y una nueva disminución de la magnitud máxima de la tensión intercelular de cizallamiento a 91 a 6 Pa en el tratamiento de concentración de alta chalcona(Figura 5F) en comparación con el control de las tensiones intercelulares de cizallamiento máximas (270 a 30 Pa, Figura 5D ). El análisis de las tracciones y las tensiones intercelulares se presenta en la Figura 6A-C. Todos los resultados trazados se probaron en busca de significancia estadística (prueba t y prueba de ANOVA de un solo factor), y en ambas pruebas se encontraron resultados estadísticamente significativos(p < 0.05) cuando se comparó de forma independiente la concentración de chalcone de 0,2 g/ml y 2 g/ml chalcone para controlar las condiciones (sin chalcone).
Figura 1: Imágenes representativas de contraste de fase de monocapas HUVEC. Ejemplo de imágenes de contraste de fase de LOS HUVEC de control a 30 min (A) y 2 h(D), imágenes de contraste de fase de HUVECtratados tratados con chalcono de 0,2 g/ml a 30 min (B) y 2 h (E), e imágenes de contraste de fase de HUVECs tratados con 2 g/ml de chalcone a 30 min(C) y 2 h (F) de inicio del experimento. La barra de escala representa el diámetro monocapa de 1,25 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Ilustración del campo de desplazamiento producido por monocapas HUVEC. Desplazamientos representativos (m) de HUVECs de control a 30 min (A) y 2 h (D), HUVECs tratados con chalcono de 0,2 g/ml a 30 min (B) y 2 h (E), y HUVECs tratados con 2 g/ml de chalcono a 30 min (C) y 2 h (F) de inicio del experimento. La barra de escala representa el diámetro monocapa de 1,25 mm. La barra de color representa los desplazamientos en m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Distribución de tracción RMS en monocapas HUVEC. Ejemplo de tracción rms (Pa) de control, 0,2 g/ml de chalcono y 2 MM de chalcono HUVECs antes del tratamiento con chalcone (A-C) y después de una hora de tratamiento con chalcone (D-F), respectivamente. La barra de escala representa el diámetro monocapa de 1,25 mm. La barra de color representa las tracciones RMS en Pa. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Distribución media de tensión intercelular normal en monocapas HUVEC. Distribución media de la tensión intercelular normal (Pa) de los HUVEC de control a 30 min(A) y 2 h(D),HUVECs tratados con chalcono de 0,2 g/ml a 30 min (B) y 2 h (E), y HUVECs tratados con 2 g/ml de chalcono a 30 min (C) y 2 h (F). La barra de escala representa el diámetro monocapa de 1,25 mm. La barra de color representa tensiones en Pa.
Figura 5: Distribución máxima de tensión intercelular de cizallamiento en monocapas HUVEC. Distribución máxima de tensión intercelular de cizallamiento (Pa) de los HUVEC de control a 30 min (A) y 2 h(D), HUVECtratados tratados con chalcono de 0,2 g/ml a 30 min (B) y 2 h ( E ), y HUVECs tratados con 2 g/ml de chalcone a 30 min (C) y 2 h ( E ), y HUVECs tratados con 2 g/ml de chalcone a 30 min (C) y 2 h ( E ), y HUVECs tratados con 2 g/ml de chalcone a 30 min(C)y 2 h (E) 2 h (F). La barra de escala representa el diámetro monocapa de 1,25 mm. La barra de color representa tensiones en Pa.
Figura 6: Comparación de tracciones RMS y tensiones intercelulares en monocapas HUVEC e impacto del tratamiento de chalcone en estructuras CX43 de unión de separación HUVEC. Las gráficas de tensión intercelular normal media(A),tensión intercelular de cizallamiento máximo(B) y tracción RMS(C)muestran el impacto de las dosis de chalcone (0,2 g/ml y 2 g/ml) en las monocapas de HUVEC en comparación con el control. Las barras de error muestran un error estándar. Se encontró que los resultados eran estadísticamente significativos (tamaño de la muestra 6 islas, con un nivel de confianza del 95%) utilizando tanto pruebas t en comparación con el control (p < 0.05) y ANOVA de un solo factor (p < 0.05). En platos separados, la inmunomancha se realizó 5 h después de la adición del fármaco para islas de células que residen en hidrogeles blandos de 1,2 kPa. El color verde representa Cx43 y el azul representa DAPI (núcleo). El panel D muestra lo siguiente: control (E,H), 0,2 g/ml de células tratadas con chalcone (F,I) y celdas tratadas con chalcono de 2 g/ml (G,J). Barra de escala a 200 m, objetivo 20x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura suplementaria 1: Tinción Cx43 de alta resolución en monocapas HUVEC. Se tiñó las monocapas HUVEC fijas para Cx43 (verde) y núcleo (DAPI, azul) para observar el efecto dependiente de la dosis de chalcone. Las imágenes de mayor aumento (objetivo 63x) revelan la localización de Cx43 principalmente alrededor del núcleo (evidente por la intensidad de la fluorescencia verde). Se muestran las células tratadas con chalcono(A-C),0,2 g/ml (D-F) y 2 células tratadas con chalcono g/ml (G-I). Barra de escala a 100 m, objetivo de inmersión en aceite de 63x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| 1200 Pa | 870 Pa | 1 kPa | 4 kPa | 6.3 kPa | 11 kPa | 90 kPa | 150 kPa | |
| Composición de la solución | 0.05% BIS | 0.1% BIS | 0.03% BIS | 0.1% BIS | 0.03% BIS | 0.07% BIS | 0.3% BIS | 0.6% BIS |
| 5.5% Acryl | 2% Acryl | 5% Acryl | 5% Acryl | 10% Acryl | 10% Acryl | 12% Acryl | 12% Acryl | |
| Agua ultra pura | 12,49 ml | 13.38 mL | 12,78 ml | 12.255 mL | 10.905 mL | 10,63 ml | 8.30 mL | 5,9 ml |
| 40% Acrilamida | 2.062 mL | 750 l | 1.875 mL | 1.875 mL | 3,75 ml | 3,75 ml | 4,5 ml | 4,5 ml |
| 2% Acrilamida BIS | 375 l | 750 l | 225 l | 750 l | 225 l | 525 l | 2.12 mL | 4,5 ml |
| Perlas de combustión (0,2 ám o 0,5 m) | 80 l | 80 l | 80 l | 80 l | 80 l | 80 l | 80 l | Las tracciones no son medibles |
Tabla 1: Formulaciones de gel de poliacrilamida para diferentes modulis de Young.
| Volumen | Grueso | Cubreobjetos | ||
| 20 mm sl bien | Grueso | 500 l | 1 mm | 25 mm |
| Delgada | 24 l | 100 m | 18 mm | |
| Pozo sl de 14 mm | Grueso | 175 l | 700 m | 18 mm |
| Delgada | 10,3 l | 100 m | 12 mm | |
| 14 mm 6-pozo | Grueso | 280 l | 1,5 mm | 18 mm |
Tabla 2: Volumen y grosor del gel.
Archivo Suplementario: Rutinas MATLAB. Haga clic aquí para ver este archivo (haga clic con el botón derecho para descargar).
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Discussion
Nuestro grupo, así como otros, ha estado utilizando con éxito TFM y MSM para sondear la influenciade las uniones celulares en diversos procesos celulares patológicos y fisiológicos in vitro7,15,18,27 . Por ejemplo, Hardin et al. presentaron un estudio muy perspicaz que sugiere que la transmisión de tensión intercelular guía la formación de brechas paracelulares en las células endoteliales15. Si bien es posible relacionar los cambios relacionados con Cx43 que informamos aquí con los cambios reportados por Hardin et al., no abordamos específicamente la formación de brechas paracelulares en este protocolo. Aquí, presentamos un protocolo basado en la mecánica para apuntar específicamente a la unión de brecha Cx43 e investigar su influencia en la biomecánica endotelial.
Para que este protocolo tuviera éxito, había algunos desafíos que teníamos que superar, algunos de los cuales podrían ocurrir si otros investigadores decidieran adoptar nuestro protocolo para estudios similares. Un desafío importante fue encontrar un rango óptimo de dosis de chalcone donde la expresión Cx43 pudiera ser inhibida, manteniendo al mismo tiempo nuestras monocapas endoteliales intactas. El IC50 de chalcone para HUVECs ha sido reportado previamente para ser 10.01 g/mL28. Sin embargo, cuando expusimos a nuestras monocapas huVEC a múltiples concentraciones de chalcone que van desde 0,2 g/ml a 20 g/ml, encontramos una concentración de chalcone de 2 g/ml para ser la concentración más alta que nuestras monocapas podían soportar sin dejar de ser confluentes. Una monocapa confluente era esencial para este protocolo, ya que se requiere una monocapa para medir las tensiones intercelulares usando MSM. A continuación, realizamos un ensayo de inmunofluorescencia para determinar si las dosis seleccionadas de chalcone interrumpieron con éxito la estructura cx43 o la expresión aparente. Nuestro resultado reveló que si bien la interrupción de la estructura de Cx43 con 0,2 g/ml de chalcone era visualmente difícil de distinguir del control, las células tratadas con 2 g/ml de chalcone parecían mostrar una diferencia aparente en la estructura de Cx43 y potencialmente la expresión ( Figura 6D y Figura Suplementaria 1). Además, nuestros resultados mostraron que la interrupción del Cx43 influye en la biomecánica endotelial al reducir las tracciones y las tensiones intercelulares en su mayor concentración. Estos hallazgos están de acuerdo con Bazellieres y otros que mostraron silenciamiento de Cx43 con siRNA para reducir también las tracciones y las tensiones intercelulares, pero en una hoja de células epiteliales27. Aunque nuestros resultados están de acuerdo con otros, cabe señalar que la molécula que usamos para interrumpir la expresión cx43, chalcone, también se ha sugerido para influir en la activación de MAPK y NFkB además de la interrupción Cx4326. Por lo tanto, dado que no examinamos específicamente las moléculas antes mencionadas o sus vías asociadas, no podemos descartar la influencia que una posible perturbación MAPK y NFkB puede tener en la biomecánica endotelial también.
Otro punto clave que vale la pena mencionar es que las tracciones recuperadas y las tensiones intercelulares son de naturaleza 2D e ignoran las tracciones fuera de plano (dirección z) y las tensiones intercelulares12,13. Si bien hay un pequeño error asociado con ignorar las tensiones fuera del plano, este error es insignificante13. Además, la dimensión lateral de la monocapa es lo suficientemente grande (1,25 mm) en relación con la altura de la monocapa , de tal manera que no esperaríamos desplazamientos significativos en la dirección z. Además, el cálculo MSM ofrece error en el límite monocapa12,13. Sin embargo, Tambe y otros demostraron experimentalmente que los errores son más altos en los bordes ópticos (es decir, el límite de monocapa) y descompone rápidamente distales de los bordes de los límites13. Realizamos micropatrones y luego calculamos las tensiones intercelulares de toda la monocapa para evitar errores de límite que pueden ocurrir durante el cálculo de tensión intercelular.
La microscopía de tensión monocapa se utiliza en este protocolo, ya que la información de tensión intercelular producida a partir de este método es esencial para tener una comprensión más completa de la función que la interrupción de la unión de brecha tiene en la biomecánica endotelial. Además, se ha sugerido que las tensiones intercelulares son importantes en la función de barrera endotelial, como sugieren Hardin et al.15 y Krishnan et al.17, por ejemplo. Además, si bien las tensiones intercelulares se correlacionaron con las tracciones en los datos representativos presentados aquí, esto no siempre es el caso dependiendo del estímulo. En el estudio de Steward et al., por ejemplo, se demostró que las tensiones intercelulares endoteliales disminuyen bajo cizallamiento fluido, mientras que las tracciones se mantuvieron relativamente inalteradas7. Además, el protocolo que presentamos aquí no permite la medición simultánea de las fuerzas mecánicas derivadas de células y la tinción de cruces y adherencias focales, pero tal adición sería gratuita a este protocolo. Para terminar, el protocolo que presentamos aquí describe un método basado en la mecánica para investigar la influencia que Cx43 tiene únicamente en la biomecánica endotelial, específicamente endotelial fuerzas derivadas de células. Creemos que nuestro protocolo basado en la mecánica se puede utilizar junto con los protocolos basados en la base biológica existentes actualmente para proporcionar un trabajo verdaderamente innovador en el campo.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por los fondos de la Start-up de la Universidad de Florida Central y el Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre del Instituto Nacional de Salud bajo el premio K25HL132098.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 mm coverslip | ThermoFisher | 18CIR-1 | Essential to flatten polyacrylamide gels |
| 2% bis-acrylamide | BIO-RAD | 1610143 | Component of polyacrylamide gel |
| 2′,5′-Dihydroxychalcone | SIGMA | IDF00046 | To disrupt Cx43 structure |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | SIGMA | 2530-85-0 | Stock solution to make bind silane mixture with acetic acid and ultra-pure water |
| 40% Acrylamide | BIO-RAD | 1610140 | Component of polyacrylamide gel |
| Acetic acid | Fisher-Sceintific | 64-19-7 | Essential to make bind saline solution |
| Alexa Fluro 488 goat anti-mouse IgG; | ThermoFisher | Catalog # A-11001 | Secondary antibody |
| Ammonium persulfate | BIO-RAD | 1610700 | Polyacrylamide gel polymerizing agent |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | SIGMA | 9048-46-8 | To make blocking solution |
| Bovine Type I Atelo-Collagen Solution, 3 mg/mL, 100 mL | Advance Biomatrix | 5005-100ML | Use as a extracellular matrix |
| Corning Cell Culture Phosphate Buffered Saline (1x) | Fisher-Sceintific | 21040CV | Buffer Saline needed for cell culture |
| Dimethyl Sulfoxide, Fisher BioReagents | Fisher-Sceintific | 67-68-5 | To dissolve chalcone and make stock solution |
| Fluoromount-G with DAPI | ThermoFisher | 00-4959-52 | Mounting medium for immunostaing used to stain for DAPI |
| Fluroscent microsphere Carboxylate-modified beads | ThermoFisher | F8812 | 0.5 micron carboxylate-modified beads (red), 2% solids |
| HEPES buffer solution 1 M | SIGMA | 7365-45-9 | Essential to |
| LVES | ThermoFisher | A1460801 | Essential HUEVC media 200 supplement |
| Medium 200 | ThermoFisher | M200500 | Essential media for HUVEC cell culture |
| Mouse monoclonal Cx43 antibody (CX - 1B1) | ThermoFisher | Catalog #13-8300 | Primary antibody for Cx43 |
| Petri dish (35 mm dia) | CellVis | D35-20-1.5H | 35 mm petri dish with a 20 mm center well |
| Sulfo-SANPAH Crosslinker 100 mg | Proteochem | 102568-43-4 | Essential to functionalize polyacrylamide gel surface |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | DOW corning | 2646340 | Silicon elastomer with curing agent to make PDMS |
| TEMED | BIO-RAD | 1610801 | Polyacrylamide gel polymerizing agent |
| Triton-X 100 | SIGMA | 9002-93-1 | To permeabilize cells |
| Trypsin -EDTA | ThermoFisher | 25300054 | Used to detach cells |
References
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