Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול מבוסס מכניקה כדי לשבש את צומת הפער קונשין 43 ולמדוד את ההשפעה הבאה זה יש על ביומכניקה של אנדותל באמצעות התבוננות של מעקב ומדגיש התרבות.
Abstract
תאי האנדותל הוקמו כדי ליצור מתחים ומלחצים בין-סלולאריים, אך הצמתים הפערים בתפקיד משחקים במתח הבינתאי וביצירת המתיחה כרגע לא ידוע. לכן, אנו מציגים כאן פרוטוקול מבוסס מכניקה כדי לחקור את ההשפעה של הצומת הפער קונשין 43 (Cx43) יש על ביומכניקה אנדותל על ידי חשיפת confluent אנדותל מונולאיירס מCx43 הידוע 2, 5-דיהידרוטסטוסטרון (chalחרוט) ו מדידת ההשפעה המדכא הזה יש על מדידות ומדגיש התרבות. אנו מציגים תוצאות הנציג, אשר מראים ירידה הן מעקב ומדגיש בין התאים תחת מינון כלקון גבוה (2 μg/mL) בהשוואה לשליטה. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם לא רק Cx43, אלא גם מצמתי פער אחרים, בהנחה שניתן להשתמש במדכא המתאים. אנו מאמינים שפרוטוקול זה יהיה שימושי בתחומים של מחקר כללי וכלי דם ומכניאוביולוגיה.
Introduction
השדה המתייחס לחקר ההשפעות של הכוחות הפיזיים והתכונות המכאניות של הפיזיולוגיה והפתולוגיה של רקמות הסלולר והרקמה מכונה בביולוגיה מכנית1. מספר טכניקות שימושיות שנוצלו באמצעות מכניאולוגיה הן מיקרוסקופ מתח מונאולייר ומיקרוסקופ כוח גרירה. מיקרוסקופ כוח גרירה מאפשר מיחשוב של מסקות שנוצרו בממשק התא-מצע, בעוד מיקרוסקופ הלחץ דופלקס מאפשר מיחשוב של מתחים בין תאיים שנוצר בין תאים סמוכים בתוך מונאולייר2 ,3,4,5,6 תוצאות הניבו מהשיטות הקודמות הציעו כי מדגיש מכני סלולרי לשחק תפקיד מכריע בקביעת גורלם של שורה של תהליכים סלולריים3,4,5. לדוגמה, בעת חשיפה לכוח מכני חיצוני, קבוצה של תאים העוברים כקולקטיב יכולה לשנות את המבנה שלהם ואת הצורה שלהם כדי ליישר ולהעביר לאורך כיוון הכוח המוחל על ידי, בין השאר, הפקת מעקב7, שמונה. Tractions מספקים מדד שניתן להשתמש בו להערכת כושר התאים ומחושבים באמצעות מיקרוסקופ כוח המתיחה (TFM). מיקרוסקופ כוח המתיחה (tfm) מתחיל עם הנחישות של המצע המושרה תאים דפורמציות ואחריו את החישוב של שדה המתיחה באמצעות מתמטית קפדנית, מכניקה מבוססי גישה חישובית. מאז היכולת לחשב תיחות כבר סביב די הרבה זמן, החוקרים משתמשים tfm לחשוף את תיחות ההשפעה יש על שורה של תהליכים, כולל סרטן9, פצע ריפוי10 והערכה של הלב מהונדסים . רקמה11
ניתן לחלק את יישום TFM ו-MSM ביחד לשלושה צעדים חיוניים שיש לבצע בסדר הבא: הראשון, הידרוג'ל דפורמציות המיוצרים על ידי התאים נקבעים; שנית, העקבות משוחזרים מתוך דפורמציות הידרוג'ל; ושלישית, גישה לאלמנט סופי משמשת לחישוב מתחים נורמליים ולהטיה בין-תאיים בתוך המונאולייר כולו. כדי לחשב את ג'ל displacements, תמונות הזריחה חרוז עם תאים הושוו עם תמונה חרוז התייחסות (ללא תאים) באמצעות מותאם אישית כתוב חלקיקים התמונה (PIV) השגרה. הקשר בין גודל חלון מתאם חפיפה עבור ניתוח PIV נבחרו להיות 32 x 32 פיקסלים ו 0.5, בהתאמה. בשלב זה, משמרות פיקסל הומרו מיקרון על ידי הכפלת עם מקדם פיקסל מיקרון המרה (עבור המיקרוסקופ שלנו, גורם ההמרה הזה הוא 0.65) כדי להשיג displacements המטוס. שגיאות המשויכות להתעלמות מdisplacements מחוץ למישור הן12,13. לאחר חישוב של ג'ל displacements, ישנם שני סוגים של מדידות המתיחה שיכול להיות מנוצל, הפרשות מוגבלו תיחות בלתימוגבל 8,14. תיחות לא מוגבל לספק את שדה המתיחה עבור השדה כולו של התצוגה (כולל אזורים עם וללא תאים), בעוד תיחות מוגבלת לספק את שדה המתיחה רק עבור אזורים הכוללים תאים14. לאחר מכן, הלחצים הבין-סלולאריים מחושבים באמצעות מיקרוסקופ לחץ מונאולייר (MSM), שהוא הרחבה של מיקרוסקופ כוח המתיחה. יישום ה-MSM מבוסס על ההנחה כי הפרשות המקומיות שהופעלו על ידי מונאולייר של תאים בממשק התא-מצע חייבים להיות מאוזנים על ידי כוחות מכניים ששודרו בין תאים בממשק תא התא כפי שדרש חוקי ניוטון7 ,12,13. ההנחה המפתח כאן היא כי המונרוייר התא יכול להיות מטופל כמו סדין אלסטי דק כי התפלגות המתיחה במונאולייר ידוע ומאזן הכוח אינו תלוי במאפייני חומר התא. ההנחה המפתח הנוסף היא כי כוחות המתיחה מאוזנים על ידי מדגיש בין הסלולר המקומי בתוך השדה האופטי של השקפה (בתוך המונאולייר) ואת ההשפעה של מאזן כוח זה הוא מינימלי באזור המרוחק (מחוץ המונאולייר)13. לכן, תנאי הגבול שהוגדרו על-ידי הלחצים הבינתאיים, הdisplacements, או שילוב של שניהם בגבול המונאולייר הינם חיוניים לביצוע MSM-13. בהתחשב במידע הנ ל, אנו משתמשים ב-MSM כדי לבצע ניתוח אלמנט סופי (פמ) כדי לשחזר את המתח העיקרי המקסימלי (σmax) והלחץ העיקרי מינימלי (σmin) על ידי סיבוב מטוס הלחץ בכל נקודה בתוך ה דופלקס. מדגיש אלה משמשים לאחר מכן כדי לחשב את ממוצע 2d המתח הבין-סלולארי נורמלי [(σmax + σmin)/2] ו-2d להטות מקסימום מתח התרבות [(σmax -σmin)/2] בתוך כל המונאולייר כולו 12,13. הליך זה מתואר ביתר פירוט על-ידי tambe et al.12,13
מיקרוסקופ מונאולייר לחץ (MSM) מאפשר חישוב של מדגיש תאי תא בתא שנוצר בתוך מונאולייר6,7,8,12,13. אלה מדגיש התרבות הוצעו להיות חשובים לצמיחה רקמות ותיקון, הפצע ריפוי, סרטן גרורות12,15,16,17. בנוסף, הוצעו מתחים בין-סלולאריים להיות חשובים גם בהעברת תאים אנדותל ובפונקציית המכשול האנדותל17,18. בעוד שצמתים בתאי תא כגון צמתים הדוקים וצמתים מדומה, שניהם הוצעו לשחק תפקיד קריטי ביצירת מתח בין התאים הבינתאיים ושידור, התפקיד של צמתי הפער נשאר חמקמק. הפער בצמתים לחבר את התאים הסמוכים ולספק מסלול עבור זרם חשמלי ומולקולות (ב< 1 kda) לעבור בין תאים שכנים19,20,21. למרות התאים האנדותל אקספרס Cx37, Cx40, ו Cx43 הפער צמתים19,22, Cx43 הוא ללא ספק החשוב ביותר במונחים של התקדמות המחלה23. ראיות של חשיבות Cx43's ניתן למצוא בעובדה כי מחיקה גנטית של Cx43 בעכברים תוצאות לחץ דם24 ויש לו השפעות שליליות על אנגיוגנזה25. בנוסף, Cx43 תועד להיות חשוב עבור הגירה תא והתפשטות ובהתקדמות של טרשת עורקים18,22,23,24,25 .
בפרוטוקול זה, השתמשנו ב-TFM ו-MSM כדי לחקור אם המתיחה ויצירת הלחץ הבין-תאי בתוך הקשר, היתה מושפעים מהפרעה לצומת הפער האנדותל Cx43. אנחנו שיבשו Cx43 עם 2, 5-דיהידרוטסטוסטרון (chalחרוט), מולקולה מתועדת לעכב Cx43 ביטוי26. Chalcone שימש לשבש Cx43 במקום siRNA כמו chalcone כבר דיווחו בעבר על ידי לי et al. כדי לשבש את ביטוי Cx4326. בנוסף, התעניינו במיוחד בהשפעת הצ על האנדותל כפי שהיא גם דווחה כתרכובת אנטי-דלקתית ואנטי-טסיות שעלולה לשמש למניעה וטיפול בכלי דם שונים פתווגיות26. טיפולים chalcone בוצעו כשעה לאחר הופעת הניסוי, החלב שטופלו monolayers היו תמונות עבור סך של שש שעות, עיבוד תמונה בוצעה עם קוד מותאם אישית כתוב MATLAB כדי לקבוע מעקב ולאחר מכן התרבות דגיש. התוצאות שלנו הראו ירידה כוללת של מתחים והלחצים הבינתאיים, הרומז Cx43 ממלאת תפקיד מרכזי בביומכניקה של האנדותל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ייצור ג'לים פוליאקרילאמיד (פי אי)
-
הכנת צלחת פטרי
- להכין את הפתרון לאגד silane על ידי ערבוב 200 mL המים אלקטרופורזה עם 80 μl חומצה אצטית 50 μl של 3-(טרימתאוקסיסילקסיל) פרופיל מתיונין. Bind silane הוא פתרון המשמש לתפקד בתחתית הזכוכית משטח צלחת פטרי עבור הידרוג'ל מצורף.
- מערבבים את הפתרון לאגד silane על צלחת מהומה עבור לפחות 1 h.
- לטפל היטב במרכז צלחת פטרי עם פתרון לאגד silane עבור 45 דקות.
- הסר את הפתרון bind silane ולשטוף את צלחת פטרי עם מים אולטרה טהור 2x-3x.
- נגב את משטח הצלחת פטרי ואחסן בטמפרטורת החדר לשימוש עתידי.
-
הכנת תמיסת הידרוג'ל
- מערבבים מים אולטרה טהורים, 40% אקרילאמיד, ו 2% bis-אקרילאמיד ב 15 מ ל שפופרת צנטריפוגה לפי לוח 1.
- הוסף 80 μL של חרוזי פלורסנט לפתרון ההידרוג'ל.
- לטלטל בעדינות את הצינור כדי לערבב חרוזים עם התמיסה ג'ל.
- הדקו בקלילות את מכסה הצינור בשפופרת הצנטריפוגה והניחו בתוך תא ריק.
- דגה את הפתרון ג'ל עבור לפחות 45 דקות בחדר ואקום.
-
הידרוג'ל פולימוניזציה
- ראשית, להוסיף 75 μl של 10% אמוניום פרסולפט (מומס במים אולטרה טהור) ולאחר מכן להוסיף 8 μl של temed (n, n, n ', n'-טטרמתיונין-1, 2-diamine) לפתרון הידרוג'ל.
- מניחים 24 μL של תמיסת הידרוג'ל במרכז צלחת פטרי (ראו טבלה 2).
- השתמש שמיכות 18 מ"מ כדי לשטח את ההידרוג'ל. זה ייתן גובה של ~ 100 μm.
- המתן לפחות 30-40 דקות עבור ג'ל פולימור.
- יש לטבול את ההידרוג'ל הפילמור במים טהורים במיוחד כדי למנוע התייבשות ג'ל.
- מכסים את צלחת פטרי עם רדיד אלומיניום כדי למנוע הלבנת של חרוזי פלורסנט ולאחסן ב -4 ° c.
הערה: הידרולים ניתן לאחסן תקופה של עד 3 חודשים, אבל זה הציע כי ג'לים אלה להיות בשימוש לא יותר משבוע 1 לאחר הייצור כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר.
2. תרבית תאים
- תרבות הטבור האנושית תאים אנדותל (HUVECs) בתרבות התא בינונית 200 (ראה טבלת חומרים) שיושלם עם 1% פניצילין-סטרפטומיצין על 0.1% ג'לטין מצופה מבחנות ב 37 ° צ' ו 5% CO2.
3. הכנה לסטנסיל מיקרותבנית
- לרפא שכבה דקה של polydiמתיל siloxane (PDMS) בצלחת פטרי 100 מ"מ על ידי ערבוב בסיס הסיליקון עם הסוכן לריפוי סיליקון ביחס של 20:1 (בסיס: ריפוי הסוכן).
הערה: ניתן להשתמש בבסיס אחר כדי לרפא יחסי סוכן (ex. 10:1 או 30:1). עם זאת, בסיס נמוך יותר לריפוי יחס הסוכן תניב דפוס התפר, בעוד בסיס גבוה יותר לריפוי יחס הסוכן יפיק דפוס רך יותר. - הכינו 20:1 (בסיס: ריפוי הסוכן) PDMS פתרון ולערבב בקפידה בתוך שפופרת צנטריפוגה mL 50. הפוך את הצינור הפוך וטלטל מספר פעמים במרץ כדי להבטיח ערבוב נכון של פתרון PDMS, כמו ערבוב לא אחיד יגרום לפילמור שלמים.
- הסרת בועות שהוצגו מהשלב שלעיל על ידי תפרידו הפתרון PDMS עבור 1 דקות ב 190 x g.
- יוצקים 5-6 mL של פתרון PDMS במרכז של 100 מ"מ צלחת פטרי מתפרעים את המנה עד הפתרון PDMS מכסה את פני השטח של צלחת פטרי כולה.
- לרפא את פתרון PDMS לילה ב 50-60 ° c. ניתן גם לרפא את PDMS בטמפרטורת החדר.
- הסר מעגלי, 16 בקוטר מילימטר PDMS עם מנקב חור.
- השתמש בניקוב ביופסיה כדי ליצור חורים קטנים בסטנסיל של PDMS. פרוטוקול זה משתמש בפונץ ' ביופסיה בקוטר 1.25 מ"מ.
- לחטא סטנסילים pdms על ידי הראשון שוקע יזוג אותם ב 70% אתנול עבור 2-3 דקות, להוריד את האתנול עודף ולאחר מכן הצבת תחת אור UV עבור 5 דקות.
4. כיסוי קולגן-I הידרוג'ל
- הסירו את הכיסויים מההידרוג'ל. והוציאו נוזלים מכל נוזל עודף
- הצב את הסטנסיל של PDMS על משטח ההידרוג'ל.
הערה: ניתן להשתמש בפינצטה כדי להחיל לחץ קל על סטנסיל PDMS כדי להבטיח חותמת מים הדוקה בין הסטנסיל של PDMS לבין משטח הידרוג'ל. הסטנסילים שלנו PDMS הם מים הדוקים ובכך למנוע גישה למים בין המשטח ג'ל העליון ו-PDMS משטח התחתון של הסטנסיל. כמו כן, אין צורך לכוונן את קשיות ההידרוג'ל ביחס לנוקשות של PDMS. - לכסות את משטח ההידרוג'ל עם sulfoסוכות-6-(4-azido-2-ניטרופנימימינו) הקסאנואט (sulfo-SANPAH) הומס a 0.1 M PES (4-(2-הידרוקסיל) -1-piperazineethfonic חומצה) מאגר פתרון בריכוז של 1:1000 ומקום תחת UV מנורה (power 36 W) עבור 8 דקות.
- משטיפות את sulfo-sanpah ואת הפתרון hepes ולשטוף את ההידרוג'ל פעמיים עם 0.1 M hepes ואחריו שני טיפות נוספים עם מים אולטרה טהורים.
- מנושף את עודפי המים האולטרה-טהורים והידרו-מעילים עם 0.1 מ"ג/mL קולגן-אני לילה ב 4 ° c.
- כסו את הכלים והגנו על חרוזי פלורסנט מתוך פוטוהלבנה.
הערה: סטנסילים מסוימים של PDMS משמשים ליצירת מונואולאיירס מיקרותבנית. מיקרופולנה monolayers מנוצלים כפי שהם מאפשרים monolayers מרובים של הגיאומטריה ומימדים זהה להיות נצפה בו זמנית במהלך כל ניסוי. עם זאת, מיקרודפוסים לא להיות רצוי השלבים לעיל יכול להיות בעקבות למעט שלב 4.2.
5. יצירת HUVEC monolayers על הידרוג'לים
- השתמש ב-1x טריפסין כדי לנתק תאים מצלוחיות של תרבית רקמות עבור 3-5 דקות בחממה.
- לאחר טריזיסיזציה, הוסיפו את מדיית תרבות התא לטריפסין והוסיפו לצינור הצנטריפוגה של 15 מ"ל.
- צנטריפוגה את פתרון התא עבור 3 דקות ב 1710 x g. קטן, גלולה לבנה של תאים צריך להיות גלוי בתחתית הצינורית צנטריפוגה.
- מזף את הסופר ומשהה את התאים החוזרים במדיה לריכוז של 50 x 104 תאים/mL.
- הסרת קולגן-I מן ההידרוג'ל ולשטוף 1x עם PBS.
- הוסף 75 x 103 תאים לחלק העליון של הסטנסיל pdms ולאפשר לתאים לצרף למשטח ההידרוג'ל עבור לפחות 1 h בחממה ב 37 ° צ' ו 5% CO2.
- הסר את סטנסיל PDMS והוסף לפחות 2 מ ל של מדיה לצלחת פטרי. להטביע את הסטנסיל PDMS ב-10x טריפסין כדי להסיר את כל התאים המחוברים ולעקר על ידי ריסוס עם 70% אתנול ולאחר מכן הצבת תחת אור UV עבור 5 דקות.
- מניחים את צלחת פטרי בחממה ולחכות לפחות 36 h או עד מונאולייר שוטפת נצפתה.
6.2, 5 הטיפול הדהידרוקסילקונוס לשיבוש Cx43
- התמוססות 2, 5 דיהידרוטסטוסטרון (chalחרוט) ב dimethylsulfoxide (DMSO) כדי לבצע פתרון מניות 0.1875 mg/mL.
- לדלל את הפתרון מניות עם מדיה תרבות התא כדי להפוך ריכוז chalcone נמוך (0.2 μg/ml) סדרת מחלקים ו ריכוז chalcone גבוה (2 μg/ml) סדרת מחלקים.
7. רכישת נתונים
- אתר את איי התאים עם מיקרוסקופ.
- לרכוש ניגודיות שלב ותמונות חרוז למבנה התא התמונה הידרוג'ל displacements, בהתאמה.
הערה: פרוטוקול זה השתמש במטרה 10x לרכישת נתונים. - בסוף הניסוי, ניתוק תאים בעזרת טריפסין 10x ולרכוש תמונה של משטח ג'ל ללא תאים (תמונת ייחוס).
8. כתמים חיסוני
- תקן monolayers עם 4% פורמלדהיד ו-דגירה ב 37 ° c עבור 15 דקות.
- להסיר 4% פורמלדהיד ולהוסיף 0.2% טריטון X-100 עבור 5 דקות ב 37 ° צ' כדי לחדור תאים.
- הסר 0.2% טריטון X-100 ולשטוף monolayers עם PBS 2x-3x.
- כיסוי מונאולייר עם 2% בסרום (BSA) פתרון עבור 45 דקות ב 37 ° c.
- הסר את הפתרון 2% BSA ולשטוף monolayers עם PBS 2x-3x.
- הוספת נוגדן Cx43 עיקרי בריכוז של 1:400 למדגם ו-הדגירה הלילה ב 4 ° c.
- להסיר את הנוגדן הראשוני לשטוף את המדגם עם PBS 2x-3x.
- הוסף נוגדן משני בריכוז של 3:200 ו-דגירה של 2 h ב 37 ° c.
הערה: יש לכסות דגימות כדי למנוע הלבנה. - להסיר את הנוגדן המשני ולשטוף עם PBS 2x-3x.
- מדגם כיסוי עם הרכבה בינונית (פלוררומנט-G DAPI) וחותם עם תגית כיסוי של 18 מ"מ.
9. יישום של מיקרוסקופ כוח המתיחה (TFM) ומיקרוסקופ מונאולייר לחץ (MSM)
-
חישוב דפורמציה של הידרוג'ל
הערה: שגרת חישוב של הזחה צעד אחר צעד באמצעות MATLAB ניתנת להלן.- פתח את הקובץ הראשי של המתיחה. m ב- MATLAB (עבור כל רוטינות MATLAB ראה חומרים משלימים).
הערה: בצע את ההוראות המופיעות בקוד כדי להגדיר את הספריה MATLAB. - הגדירו את המשתנים הבאים: תבנית תמונה, המרת פיקסל למייקרון, המודולולוס של יאנג, יחס פואסון ומטרת המיקרוסקופ.
- אתר את התמונה חרוז, טריפסין ותמונת פאזה באמצעות שיגרת המשנה Openfiles .
הערה: עבור ערכות נתונים גדולות, מומלץ לקרוא לקבצים בסדר רציף. לדוגמה, על הקבצים להיות מקבלים את השם "filename1. tif", "filename2. tif" וכו '. - הגדר ROI מרובע (אזור מעניין) סביב תא מונאולייר והפעל את רוטינת הcell_cropper כדי לחתוך את התמונה המקורית.
- בצע את רוטינת הdisplacement_finder כדי לחשב את displacements.
- לבצע את רוטינת Dedrift כדי להסיר כל displacements נוספים שאינם סלולריים שעשויים לנבוע מיקרוסקופ שלב הסחף.
- פתח את הקובץ הראשי של המתיחה. m ב- MATLAB (עבור כל רוטינות MATLAB ראה חומרים משלימים).
-
חישוב העקבות
הערה: כאן, מעקב בלתי מוגבל מחושבים באמצעות שגרת MATLAB כתובה אישית שלנו. צעד אחר צעד המתיחה חישוב באמצעות שגרת MATLAB שהוזכרו בעבר הוא נתון להלן.- הגדר את המשתנים הבאים בתוך שגרת הגרירה. m : תנאי גבול, עובי ג'ל, גובה ג'ל, ו dedrift.
- בצע את רוטינת הtraction_finder כדי לחשב מטרייסי ולבצע את רוטינת הplot_traction להתוויה. כל העקבות ב-x-כיוון (Tx) ו-y כיוון (טיי) יחד עם מיקומי הפיקסל המתאימים שלהם ניתן למצוא בקובץ המתיחה. dat שיופק על ידי הקוד.
-
חישוב הלחצים הבינתאיים
הערה: צעד אחר צעד הוראות לחישוב מאמץ אינטרתאי באמצעות שגרת MATLAB שהוזכרה קודם לכן מקבלים להלן.- בצע את רוטינת הmark_circular_domain כדי לציין את גבול המונאולייר. שגרה זו תנחה את כל התמונות בשלב החתוך ברציפות כדי שהמשתמש יצייר באופן ידני את הגבול סביב המונאולייר. שמור את הפתק של nXPts שנוצר בחלון הפקודה והשתמש בהם מאוחר יותר כפרמטרי רשת בציר X ובציר Y עבור ניתוח של פמ (ראה שלב 9.3.2).
- בצע Run_StressCode כדי לחשב מתחים בין-סלולאריים. רוטינת משגרה זו קוראת ישירות את הפרמטרים מהקובץ "model.in" ומפעילה את "island. exe" כדי לבצע ניתוח של פמ. לפני הפעלת שגרה זו, ודא שכל הפרמטרים בקובץ model.in , כלומר פרמטרי רשת ב-X ו-Y, פיקסל מיקרון המרה, מודול הג של יאנג של הג, היחס של פואסון, גובה מונאולייר, ודפוס מונאולייר (רצועה או חור), נערכים כראוי.
- התווה את כל תוצאות ה-פמ באמצעות שיגרת הplot_FEM_results .
הערה: כל התוצאות שייווצרו יאוחסנו באופן אוטומטי בתיקיית התוצאות בספריה MATLAB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
חדות הפאזה תמונות של שליטה, 0.2 μg/mL, ו 2 μg/mL chalcone טופלו monolayers נלקחו 30 דקות לפני הטיפול chalcone (איור 1א-ג) ו 2 שעות לאחר טיפול chalcone (איור 1D-F). המושרה displacements חרוז (μm) נצפו כדי להקטין את שניהם חלב במינון נמוך ומינון גבוה התנאים chalcone (איור 2E, F) כאשר לעומת השליטה huvec monolayers (איור 2ד). לפני הטיפול chalcone, התיחות היו סביב 51 ± 8 האבא (איור 3A-C) לכל התנאים. לאחר טיפול chalcone, היתה עלייה קטנה תיחות ל 59 ± 11 האבא במינון נמוך chalcone מטופל monolayers (איור 3E) ו כמעט 2-קיפול ירידה ב תיחות rms כדי 18 ± 2 במינון גבוה chalcone מטופל monolayers ( איור 3F) לעומת השליטה (איור 3ד). לפני טיפול chalcone, ממוצע מדגיש התרבות נורמלי היו סביב 220 ± 66 Pa (איור 4A-C). לאחר טיפול chalcone, היתה עלייה בגודל הממוצע מתח התרבות בהיקף כדי 285 ± 75 Pa עם מינון נמוך טיפול chalcone (איור 4E) אבל ירידה משמעותית בהיקף הממוצע הרגיל של מתח התרבות ל106 ± 4 pa עם טיפול במינון גבוה chalcone (איור 4F) כאשר לעומת לשלוט בממוצע מדגיש התרבות נורמלי (235 ± 18 Pa, איור 4ד). מקסימום להטות מדגיש התרבות היו סביב 241 ± 30 Pa (איור 5A-C) לפני טיפול chalcone, אבל לאחר הטיפול chalcone, הייתה ירידה ל 227 ± 20 Pa ב הריכוז chalcone נמוך (איור 5E) וירידה נוספת בגודל מירבי להטות התקשורת הבין-תאית ל91 ± 6 Pa בטיפול בריכוז החלב הגבוה (איור 5F) כאשר לעומת שליטה מקסימלית להטות מדגיש התרבות (270 ± 30 Pa, איור 5ד ). באיור 6א-גמוצגים הניתוחים והלחצים הבינתאיים. כל התוצאות המותוות נבדקו לגבי משמעות סטטיסטית (מבחן t ו-מבחן ANOVA בודד), ובשתי תוצאות נמצאו משמעותיות מבחינה סטטיסטית (p < 0.05) כאשר באופן עצמאי להשוות 0.2 μg/mL ריכוז chalcone ו 2 μg/mL כדי לשלוט בתנאים (ללא chalcone).
איור 1: בניגוד לשלב המייצג תמונות של HUVEC monolayers. לדוגמה תמונות ניגודיות שלב של שליטה HUVECs ב 30 דקות (A) ו 2 h (ד), בחדות שלב תמונות של huvecs שטופלו עם 0.2 μg/mL chalcone ב 30 דקות (ב) ו 2 h (E), ותמונות חדות פאזה של Huvecs מטופלים עם 2 μg/mL chalcone ב -30 דקות (ג) ו-2 h (F) של התפרצות הניסוי. סרגל קנה המידה מייצג את קוטר המונאולייר של 1.25 מ"מ. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: איור של שדה עקירה המיוצר על ידי HUVEC monolayers. נציג displacements (μm) של שליטה HUVECs ב 30 דקות(A) ו 2 h (ד), huvecs שטופלו עם 0.2 μg/mL chalcone ב 30 דקות (ב) ו 2 h (E), ו huvecs מטופלים עם 2 μg/mL chalcone ב 30 דקות (ג) ו 2 h (F) של תחילת ניסוי. סרגל קנה המידה מייצג את קוטר המונאולייר של 1.25 מ"מ. סרגל צבע מייצג displacements ב-μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הפצת המתיחה של RMS ב-HUVEC monolayers. דוגמה של תיחות של rms (הרשות) של השליטה, 0.2 μg/ml, ו 2 μg/ml חלב huvecs לפני טיפול chalcone (A-C) ואחרי שעה של טיפול chalcone (D-F), בהתאמה. סרגל קנה המידה מייצג את קוטר המונאולייר של 1.25 מ"מ. סרגל הצבעים מייצג את הקיצורים של RMS ב-Pa. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: התפלגות ממוצעת נורמלית Intercellular הפצה ב HUVEC monolayers. ממוצע המתח האינטרתאי הממוצע (Pa) התפלגות שליטה HUVECs ב 30 דקות (A) ו 2 h (ד), huvecs שטופלו עם 0.2 μg/mL chalcone ב 30 דקות (ב) ו 2 h (E), ו huvecs מטופלים עם 2 μg/mL chalcone ב 30 דקות (ג) ו-2 h (ו). סרגל קנה המידה מייצג את קוטר המונאולייר של 1.25 מ"מ. סרגל צבע מייצג מתחים ב-Pa. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: מקסימום הטיה התקשורת הבינתאית התפלגות ב HUVEC monolayers. מקסימוםלהטות התקשורת הבינתאית (הרשות) התפלגות השליטה huvecs ב 30 דקות (A) ו 2 h (ד), huvecs מטופלים עם 0.2 μg/ml chalcone ב 30 דקות (ב) ו 2 h (E), ו huvecs מטופלים עם 2 μg/mL chalcone ב 30 דקות (ג) ו 2 h (ו). סרגל קנה המידה מייצג את קוטר המונאולייר של 1.25 מ"מ. סרגל צבע מייצג מתחים ב-Pa. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: השוואת תיחות של RMS ומלחצים אינטרתאיים ב huvec monolayers וההשפעה של טיפול chalcone על הצומת הפער huvec Cx43 מבנים. מגרשים של מתח ממוצע אינטרתאי הממוצע (A), מקסימום להטות את הלחץ הבינתאי (ב) ו תיחות (ג) להראות את ההשפעה של מינונים chalcone (0.2 μg/ml ו 2 μg/ml) על huvec monolayers לעומת שליטה. קווי שגיאה מציגים שגיאה סטנדרטית. נמצאו תוצאות משמעותיות סטטיסטית (גודל לדוגמה = 6 איים, עם רמת ביטחון של 95%) באמצעות t-בדיקות בהשוואה לשליטה (p < 0.05) וגורם בודד ANOVA (p < 0.05). במנות נפרדות, בוצעה הבחינה החיסונית 5 שעות לאחר התוספת של התרופה עבור איים של תאים המתגוררים על רכים 1.2 kPa הידרולים. הצבע הירוק מייצג Cx43 וכחול מייצג DAPI (גרעין). פאנל D מתארת את הפרטים הבאים: שליטה (E, H), 0.2 μg/ml מטופלים תאים (F, I) ו-2μg/ml מטופלים תאים (G, J). סרגל בקנה מידה = 200 μm, המטרה = 20x. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים 1: ברזולוציה גבוהה Cx43 צביעת ב HUVEC monolayers. קבוע HUVEC monolayers היו מוכתם עבור Cx43 (ירוק) ו הגרעין (DAPI, כחול) כדי להתבונן את ההשפעה תלויי המינון של chalcone. תמונות בהגדלה גבוהה יותר (המטרה 63 x) לחשוף Cx43 לוקליזציה בעיקר סביב הגרעין (ניכר מעוצמת הקרינה הירוקה). המוצג הם שליטה (A-C), 0.2 Μg/ml מטופלים תאים (D-F) ו 2 μg/ml תאים מטופלים (G-I). סרגל בקנה מידה = 100 μm, המטרה = הטבילה בשמן 63 x. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| 1200 | 870 | 1 כיצד | 4 מיכל הקפה | 6.3 | שלמה שלמה | 90 | 150 | |
| הרכב פתרון | 0.05% BIS | 0.1% BIS | 0.03% BIS | 0.1% BIS | 0.03% BIS | 0.07% BIS | 0.3% BIS | 0.6% BIS |
| 5.5% אקריל | 2% אקריל | 5% אקריל | 5% אקריל | 10% אקריל | 10% אקריל | 12% אקריל | 12% אקריל | |
| מים טהורים במיוחד | 12.49 מ ל | 13.38 מ ל | 12.78 מ ל | 12.255 מ ל | 10.905 מ ל | 10.63 מ ל | 8.30 מ ל | 5.9 מ ל |
| 40% אקרילאמיד | 2.062 מ ל | 750 מיקרומטר | 1.875 מ ל | 1.875 מ ל | 3.75 מ ל | 3.75 מ ל | 4.5 מ ל | 4.5 מ ל |
| 2%-אקרילאמיד | 375 מיקרומטר | 750 מיקרומטר | 225 מיקרומטר | 750 מיקרומטר | 225 מיקרומטר | 525 מיקרומטר | 2.12 מ ל | 4.5 מ ל |
| מחרוזות פלורובריח (0.2 יקרומטר או 0.5 יקרומטר) | 80 מיקרומטר | 80 מיקרומטר | 80 מיקרומטר | 80 מיקרומטר | 80 מיקרומטר | 80 מיקרומטר | 80 מיקרומטר | הtractions מדידים |
שולחן 1: ג'ל פוליאקרילאמיד היוצר ניסוחים למודוללי שונות של צעירים.
| אמצעי אחסון | עובי | כיסוי מחליק | ||
| 20-mm sl טוב | עבה | 500 מיקרומטר | ~ 1 מ"מ | 25 מ"מ |
| דק | 24 μL | ~ 100 יקרומטר | 18 ממ ' | |
| 14-mm sl טוב | עבה | 175 מיקרומטר | ~ 700 יקרומטר | 18 ממ ' |
| דק | 10.3 מיקרומטר | ~ 100 יקרומטר | 12 מ"מ | |
| 14 מ"מ 6-ובכן | עבה | 280 מיקרומטר | ~ 1.5 מ"מ | 18 ממ ' |
שולחן 2: ג'ל נפח ועובי.
קובץ משלים: MATLAB שגרות. אנא לחץ כאן כדי להציג קובץ זה (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הקבוצה שלנו, כמו גם אחרים, כבר בהצלחה באמצעות tfm ו MSM כדי לחקור את ההשפעה של צמתים תא תא בתהליכים הסלולריים הפתולוגיים והפיסיולוגיים שונים בתוך מבחנה7,15,18,27 . לדוגמה, הארדין ואח ' הציג מחקר תובנה מאוד המציעה מדריכים העברת מתח התקשורת הבינתאית היווצרות הפער בתאי האנדותל15. בעוד שניתן לקשר את השינויים הקשורים Cx43 אנו מדווחים כאן לשינויים שדווחו על ידי הארדין ואח ', אנחנו לא מתייחסים באופן ספציפי היווצרות הפער בפרוטוקול זה. כאן, הצגנו פרוטוקול מבוסס מכניקה למקד במיוחד את צומת הפער Cx43 ולחקור את השפעתה על ביומכניקה של האנדותל.
כדי להפוך פרוטוקול זה למוצלח, היו כמה אתגרים שנאלצנו להתגבר עליהם, שחלקם עלולים להתרחש כאשר חוקרים אחרים מחליטים לאמץ את הפרוטוקול שלנו למחקרים דומים. האתגר העיקרי היה למצוא את הטווח האופטימלי מינון החלב שבו Cx43 ביטוי יכול להיות מעוכב, בעוד במקביל לשמור האנדותל שלנו monolayers ללא פגע. IC50 של chalcone עבור HUVECs דווחה בעבר להיות 10.01 μg/mL28. עם זאת, כאשר אנו חשופים שלנו HUVEC monolayers לריכוזי chalcone מרובים החל מ 0.2 μg/mL כדי 20 μg/mL, מצאנו ריכוז chalcone של 2 μg/mL להיות הריכוז הגבוה ביותר monolayers שלנו יכול לעמוד בעוד שנשאר confluent. מונאולייר שוטפת היה חיוני לפרוטוקול זה, כמונאולייר נדרש למדוד מתחים בין-סלולאריים באמצעות MSM. בשלב הבא, ביצעו את המבנה האימונולומיאואלי כדי לקבוע אם המינון הנבחר של chalcone שיבש בהצלחה Cx43 מבנה או ביטוי לכאורה. התוצאה שלנו חשפה כי בעוד הפרעה של Cx43 מבנה עם 0.2 μg/mL chalcone היה קשה ויזואלית להבדיל משליטה, תאים שטופלו 2 μg/mL של chalcone הופיעו להראות הבדל גלוי במבנה Cx43 ופוטנציאל הביטוי ( איור 6יח ' ואיור משלים 1). בנוסף, התוצאות שלנו הראו כי הפרעה Cx43 אכן משפיע על ביומכניקה של האנדותל על ידי הפחתת הפרשות ומתחים בין-תאיים בריכוז הגבוה ביותר שלו. ממצאים אלה מסכימים עם בזלאלימרים ואח '. שהראה השתקה של Cx43 עם sirna גם להפחית תיחות ומדגיש התרבות, אבל בגיליון של תאים אפיתל27. למרות התוצאות שלנו הם בהסכמה עם אחרים יש לציין כי המולקולה שנהגנו לשבש Cx43 ביטוי, chalcone, יש גם הציע להשפיע על הפעלה של MAPK ו NFkB בנוסף Cx43 הפרעה26. לכן, מכיוון שאנחנו לא מסתכלים במפורש על המולקולות הנ ל או מסלולים הקשורים שלהם, אנחנו לא יכולים לשלול את ההשפעה הפוטנציאלית של MAPK ו-NFkB יכול להיות על ביומכניקה של אנדותל גם.
נקודת מפתח נוספת שכדאי להזכיר היא שהמסקות המשוחזרות והלחצים הבינסלולאריים הם 2d בטבע, ולהתעלם מהטיסות והלחצים הבינתאיים שלהם12,13. בעוד יש שגיאה קטנה הקשורה להתעלמות מחוץ למטוס מדגיש, שגיאה זו היא זניחה13. בנוסף, המימד הרוחבי של המונאולייר גדול מספיק (1.25 מ"מ) ביחס לגובה המונאולייר (~ 5 μm) כך שלא ציפינו לdisplacements משמעותיות בכיוון z. יתרה מזאת, חישוב MSM מציע שגיאה בגבול מונאולייר12,13. עם זאת, Tambe ואח ' המחקר הראה כי שגיאות הן הגבוהות ביותר בקצוות האופטיים (כלומר, הגבול המונאולייר) והדהר במהירות מגבולות הגבול13. אנו מבצעים מיקרופנינג ולאחר מכן מחשבים מתחים בין-סלולאריים של המונאולייר כולו כדי למנוע שגיאות גבולות שעלולות להתרחש במהלך חישוב מתחים בין-סלולאריים.
מיקרוסקופ מונאולייר מתח מנוצל בפרוטוקול זה כמו מידע הלחץ הבינתאי הניב משיטה זו היא חיונית כדי לקבל הבנה מלאה יותר של הפרעה בצומת הפער התפקיד יש על ביומכניקה של אנדותל. בנוסף, הוצעו מתחים בין-סלולאריים המוצעים להיות חשובים בפונקציית המכשול האנדותל, כפי שהוצע על ידי הארדין ואח '15 וקרינן ואח '17, למשל. יתרה מזאת, בעוד שהמתחים הבינתאיים היו מתואמים לעקבות הנתונים הנציגים שהוצגו כאן, זה לא תמיד המקרה תלוי בגירוי. בחקר המלון, למשל, הוכחו הלחצים הבינתאיים באנדותל לירידה תחת הטיית הנוזלים, בעוד שהטראסיםנשארו ללאשינוי באופן יחסי. כמו כן, הפרוטוקול שאנו מציגים כאן אינו מאפשר את המדידה הזמנית של כוחות מכניים הנגזרים מתאי וכתמים של צמתים והידקויות מיקוד, אך תוספת כזו תהיה מחמיאה לפרוטוקול זה. בסיכום, הפרוטוקול שאנו מציגים כאן מתאר שיטה המבוססת על מכניקה לחקור את ההשפעה Cx43 יש רק על ביומכניקה של אנדותל, במיוחד על כוחות התאים הנגזרים. אנו מאמינים שהפרוטוקול המבוסס על המכניקה שלנו יכול לשמש בשילוב עם הפרוטוקולים הביולוגיים הקיימים הנוכחיים כדי לספק עבודה פורצת דרך בתחום.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי אוניברסיטת מרכז פלורידה הסטארט-up ואת הלב הלאומי, ריאות, ובדם המכון של המכון הלאומי לבריאות תחת הפרס K25HL132098.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 mm coverslip | ThermoFisher | 18CIR-1 | Essential to flatten polyacrylamide gels |
| 2% bis-acrylamide | BIO-RAD | 1610143 | Component of polyacrylamide gel |
| 2′,5′-Dihydroxychalcone | SIGMA | IDF00046 | To disrupt Cx43 structure |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | SIGMA | 2530-85-0 | Stock solution to make bind silane mixture with acetic acid and ultra-pure water |
| 40% Acrylamide | BIO-RAD | 1610140 | Component of polyacrylamide gel |
| Acetic acid | Fisher-Sceintific | 64-19-7 | Essential to make bind saline solution |
| Alexa Fluro 488 goat anti-mouse IgG; | ThermoFisher | Catalog # A-11001 | Secondary antibody |
| Ammonium persulfate | BIO-RAD | 1610700 | Polyacrylamide gel polymerizing agent |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | SIGMA | 9048-46-8 | To make blocking solution |
| Bovine Type I Atelo-Collagen Solution, 3 mg/mL, 100 mL | Advance Biomatrix | 5005-100ML | Use as a extracellular matrix |
| Corning Cell Culture Phosphate Buffered Saline (1x) | Fisher-Sceintific | 21040CV | Buffer Saline needed for cell culture |
| Dimethyl Sulfoxide, Fisher BioReagents | Fisher-Sceintific | 67-68-5 | To dissolve chalcone and make stock solution |
| Fluoromount-G with DAPI | ThermoFisher | 00-4959-52 | Mounting medium for immunostaing used to stain for DAPI |
| Fluroscent microsphere Carboxylate-modified beads | ThermoFisher | F8812 | 0.5 micron carboxylate-modified beads (red), 2% solids |
| HEPES buffer solution 1 M | SIGMA | 7365-45-9 | Essential to |
| LVES | ThermoFisher | A1460801 | Essential HUEVC media 200 supplement |
| Medium 200 | ThermoFisher | M200500 | Essential media for HUVEC cell culture |
| Mouse monoclonal Cx43 antibody (CX - 1B1) | ThermoFisher | Catalog #13-8300 | Primary antibody for Cx43 |
| Petri dish (35 mm dia) | CellVis | D35-20-1.5H | 35 mm petri dish with a 20 mm center well |
| Sulfo-SANPAH Crosslinker 100 mg | Proteochem | 102568-43-4 | Essential to functionalize polyacrylamide gel surface |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | DOW corning | 2646340 | Silicon elastomer with curing agent to make PDMS |
| TEMED | BIO-RAD | 1610801 | Polyacrylamide gel polymerizing agent |
| Triton-X 100 | SIGMA | 9002-93-1 | To permeabilize cells |
| Trypsin -EDTA | ThermoFisher | 25300054 | Used to detach cells |
References
- Mammoto, T., Mammoto, A., Ingber, D. E. Mechanobiology and developmental control. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 27-61 (2013).
- Schwarz, U. S., Soine, J. R. Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances. Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (11 Pt B), 3095-3104 (2015).
- Style, R. W., et al. Traction force microscopy in physics and biology. Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).
- Colin-York, H., et al. Super-Resolved Traction Force Microscopy (STFM). Nano Letters. 16 (4), 2633-2638 (2016).
- Zimmermann, J., et al. Intercellular stress reconstitution from traction force data. Biophysical Journal. 107 (3), 548-554 (2014).
- Islam, M. M. Recent Advances in Experimental Methods of Cellular Force Sensing. Biomedical Journal of Science & Technical Research. 17 (3), (2019).
- Steward Jr, R., Tambe, D., Hardin, C. C., Krishnan, R., Fredberg, J. J. Fluid shear, intercellular stress, and endothelial cell alignment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 308 (8), C657-C664 (2015).
- Trepat, X., et al. Physical forces during collective cell migration. Nature Physics. 5, 426-430 (2009).
- Li, Z., et al. Cellular traction forces: a useful parameter in cancer research. Nanoscale. 9 (48), 19039-19044 (2017).
- Brugues, A., et al. Forces driving epithelial wound healing. Nature Physics. 10 (9), 683-690 (2014).
- Pasqualini, F. S., et al. Traction force microscopy of engineered cardiac tissues. PLoS One. 13 (3), e0194706 (2018).
- Tambe, D. T., et al. Collective cell guidance by cooperative intercellular forces. Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).
- Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PLoS One. 8 (2), e55172 (2013).
- Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), C595-C605 (2002).
- Hardin, C. C., et al. Long-range stress transmission guides endothelial gap formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 749-754 (2018).
- Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer. Molecular Biology of the Cell. 29 (19), 2292-2302 (2018).
- Krishnan, R., et al. Substrate stiffening promotes endothelial monolayer disruption through enhanced physical forces. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), C146-C154 (2011).
- Islam, M. M., Steward, R. L. Probing Endothelial Cell Mechanics through Connexin 43 Disruption. Experimental Mechanics. 59, 327 (2019).
- Figueroa, X. F., Duling, B. R. Gap junctions in the control of vascular function. Antioxidants & Redox Signaling. 11 (2), 251-266 (2009).
- Nielsen, M. S., et al. Gap junctions. Comprehensive Physiology. 2 (3), 1981-2035 (2012).
- Sohl, G., Willecke, K. Gap junctions and the connexin protein family. Cardiovascular Research. 62 (2), 228-232 (2004).
- Haefliger, J. A., Nicod, P., Meda, P. Contribution of connexins to the function of the vascular wall. Cardiovascular Research. 62 (2), 345-356 (2004).
- Marquez-Rosado, L., Solan, J. L., Dunn, C. A., Norris, R. P., Lampe, P. D. Connexin43 phosphorylation in brain, cardiac, endothelial and epithelial tissues. Biochimica et Biophysica Acta. 1818 (8), 1985-1992 (2012).
- Liao, Y., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. Endothelial cell-specific knockout of connexin 43 causes hypotension and bradycardia in mice. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9989-9994 (2001).
- Walker, D. L., Vacha, S. J., Kirby, M. L., Lo, C. W. Connexin43 deficiency causes dysregulation of coronary vasculogenesis. Developmental Biology. 284 (2), 479-498 (2005).
- Lee, Y. N., et al. 2',5'-Dihydroxychalcone down-regulates endothelial connexin43 gap junctions and affects MAP kinase activation. Toxicology. 179 (1-2), 51-60 (2002).
- Bazellieres, E., et al. Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome. Nature Cell Biology. 17 (4), 409-420 (2015).
- Nam, N. H., et al. Synthesis and cytotoxicity of 2,5-dihydroxychalcones and related compounds. Archives of Pharmacal Research. 27 (6), 581-588 (2004).
