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JoVE Journal Biochemistry
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Biochemistry

Perturbing Biomécanique endothéliale via Connexin 43 Structural Disruption

Published: October 4, 2019 doi: 10.3791/60034
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Mechanical and Aerospace Engineering, University of Central Florida, 2Burnett School of Biomedical Sciences, College of Medicine, University of Central Florida

Summary

Ici, nous présentons un protocole mécanique pour perturber la connexine de jonction d'écart 43 et mesurer l'impact ultérieur ceci a sur la biomécanique endothéliale par l'observation des tractions et des contraintes intercellulaires.

Abstract

Des cellules endothéliales ont été établies pour produire des contraintes et des tractions intercellulaires, mais les jonctions de fossé de rôle jouent dans le stress intercellulaire endothélial et la génération de traction sont actuellement inconnues. Par conséquent, nous présentons ici un protocole mécanique-basé pour sonder l'influence de connexin 43 de jonction d'écart (Cx43) a sur la biomécanique endothéliale en exposant des monocouches endotenoles à un inhibiteur connu de Cx43 2,5-dihydroxychalcone (chalcone) et mesure de l'impact de cet inhibiteur sur les tractions et les contraintes intercellulaires. Nous présentons des résultats représentatifs, qui montrent une diminution des tractions et des contraintes intercellulaires sous une dose élevée de chalcone (2 g/mL) par rapport au contrôle. Ce protocole peut être appliqué non seulement à Cx43, mais aussi à d'autres jonctions d'écart, en supposant que l'inhibiteur approprié est utilisé. Nous croyons que ce protocole sera utile dans les domaines de la recherche cardiovasculaire et mécanobiologie.

Introduction

Le champ qui se réfère à l'étude des effets des forces physiques et des propriétés mécaniques sur la physiologie et la pathologie cellulaires et tissulaires est connu sous le nom de mécanobiologie1. Quelques techniques utiles qui ont été utilisées dans la mécanobiologie sont la microscopie de contrainte de monocouche et la microscopie de force de traction. La microscopie de force de traction permet le calcul des tractions générées à l'interface cellule-substrat, tandis que la microscopie de contrainte de monocouche permet le calcul des contraintes intercellulaires générées entre les cellules adjacentes dans une monocouche2 ,3,4,5,6. Les résultats obtenus à partir de méthodes antérieures ont suggéré que les contraintes mécaniques d'origine cellulaire jouent un rôle crucial dans la détermination du sort d'une foule de processus cellulaires3,4,5. Par exemple, lors de l'exposition à une force mécanique externe, un groupe de cellules qui migrent en tant que collectif peut modifier leur morphologie et polariser leur forme pour s'aligner et migrer le long de la direction de la force appliquée en générant, en partie, des tractions7, 8. Les tractions fournissent une mesure qui peut être utilisée pour évaluer la contractilité cellulaire et sont calculées à l'aide de la microscopie de force de traction (TFM). La microscopie de force de traction (TFM) commence par la détermination des déformations de substrats induites par les cellules suivies du calcul du champ de traction à l'aide d'une approche computationnelle mathématiquement rigoureuse et basée sur la mécanique. Depuis la capacité de calculer les tractions a été autour depuis un certain temps, les chercheurs ont utilisé TFM pour révéler l'impact des tractions ont sur une foule de processus, y compris le cancer9, la cicatrisation des plaies10 et l'évaluation de l'ingénierie cardiaque tissu11.

La mise en œuvre de TFM et de MSM ensemble peut être divisée en trois étapes essentielles qui doivent être exécutées dans l'ordre suivant : premièrement, les déformations d'hydrogel produites par les cellules sont déterminées ; deuxièmement, les tractions sont récupérées à partir de déformations hydrogel; et troisièmement, une approche d'élément fini est employée pour calculer les contraintes intercellulaires normales et de cisaillement dans le monocouche entier. Pour calculer les déplacements de gel, des images de perles de fluorescence avec des cellules ont été comparées à l'image de perle de référence (sans cellules) en utilisant une routine de vélocimétrie d'image de particule sur mesure (PIV). La taille et le chevauchement des fenêtres de corrélation croisée pour l'analyse PIV ont été choisis pour être de 32 x 32 pixels et 0,5, respectivement. À cette époque, les changements de pixels ont été convertis en microns en se multipliant avec un facteur de conversion pixel-micron (pour notre microscope, ce facteur de conversion est de 0,65) pour obtenir des déplacements dans les avions. Les erreurs associées à l'ignorance des déplacements hors avion sont négligeables12,13. Après le calcul des déplacements de gel, il y a deux types de mesures de traction qui peuvent être employées, tractions contraintes et tractions sans contrainte8,14. Les tractions sans contrainte fournissent le champ de traction pour l'ensemble du champ de vision (y compris les régions avec et sans cellules), tandis que les tractions contraintes fournissent le champ de traction uniquement pour les régions qui incluent les cellules14. Ensuite, les contraintes intercellulaires sont calculées à l'aide de la microscopie de contrainte monocouche (MSM), qui est une extension de la microscopie de force de traction. La mise en œuvre de MSM est basée sur l'hypothèse que les tractions locales exercées par une monocouche de cellules à l'interface cellule-substrat doivent être équilibrées par des forces mécaniques transmises entre les cellules à l'interface cellule-cellule comme l'exigent les lois de Newton7 ,12,13. Une hypothèse clé ici est que la monocouche cellulaire peut être traitée comme une mince feuille élastique parce que la distribution de traction dans la monocouche est connue et l'équilibre de force ne dépend pas des propriétés du matériau cellulaire. Une autre hypothèse clé est que les forces de traction sont équilibrées par des contraintes intercellulaires locales dans le champ de vision optique (dans le monocouche) et l'influence de cet équilibre de force est minime dans la région distale (en dehors de la monocouche)13. Par conséquent, les conditions limites définies par les contraintes intercellulaires, les déplacements ou une combinaison des deux à la limite de la monocouche sont cruciales pour effectuer MSM13. En tenant compte des informations ci-dessus, nous utilisons MSM pour effectuer une analyse d'éléments finis (FEM) pour récupérer le stress principal maximum(max) et le stress principal minimum(min)en faisant pivoter le plan de stress à chaque point dans le Monocouche. Ces contraintes principales sont ensuite utilisées pour calculer le stress intercellulaire normal moyen 2D [(max'min) /2] et le stress intercellulaire maximum de cisaillement 2D [(max- min) /2] dans la monocouche entière 12,13. Cette procédure est décrite plus en détail par Tambe et al.12,13

La microscopie de contrainte monocouche (MSM) permet le calcul des contraintes intercellulaires de cellules-cellules générées dans un monolayer6,7,8,12,13. Ces contraintes intercellulaires ont été suggérées pour être importantes pour la croissance et la réparation de tissu, la guérison de blessure, et la métaste de cancer12,15,16,17. En outre, les contraintes intercellulaires ont été suggérées pour être également importantes dans la migration endothéliale de cellules et la fonction de barrière endothéliale17,18. Tandis que les jonctions de cellules-cellules telles que les jonctions serrées et les jonctions d'adhérents ont été suggérées pour jouer un rôle critique dans la génération et la transmission intercellulaires de stress endothélial, le rôle des jonctions d'écart demeure insaisissable. Les jonctions d'écart relient physiquement les cellules adjacentes et fournissent une voie pour que le courant électrique et les molécules (lt;1 KDa) passent entre les cellules voisines19,20,21. Bien que les cellules endothéliales expriment Cx37, Cx40, et Cx43 jonctions d'écart19,22, Cx43 est sans doute le plus important en termes de progression de la maladie23. L'évidence de l'importance de Cx43 peut être trouvée dans le fait que la suppression génétique de Cx43 chez les souris a des résultats dans l'hypotension24 et a des effets défavorables sur l'angiogenèse25. En outre, Cx43 a été documenté pour être important pour la migration cellulaire et la prolifération et dans la progression de l'athérosclérose18,22,23,24,25 .

Dans ce protocole, nous avons utilisé TFM et MSM pour étudier si la traction et la génération de stress intercellulaire dans le confluent, monolayer endothélial serait affectée par la perturbation de la jonction endothéliale de jonction d'écart Cx43. Nous avons perturbé Cx43 avec 2,5-dihydroxychalcone (chalcone), une molécule documentée pour inhiber l'expression Cx4326. Chalcone a été utilisé pour perturber Cx43 au lieu de siRNA que le chalcone a été signalé précédemment par Lee et al. pour perturber l'expression Cx4326. En outre, nous avons été particulièrement intéressés par l'influence du chalcone sur l'endothélium car il a également été signalé comme étant un composé anti-inflammatoire et antiplaquettaire qui peut potentiellement être utilisé pour la prévention et le traitement de divers vasculaires pathologies26. Les traitements de Chalcone ont été exécutés une heure après le début de l'expérience, les monocouches chalcone-traités ont été imaged pendant un total de six heures, et le traitement d'image a été exécuté avec un code personnalisé de MATLAB pour déterminer des tractions et plus tard intercellulaire Souligne. Nos résultats ont montré une diminution globale des tractions et des contraintes intercellulaires, suggérant que Cx43 joue un rôle clé dans la biomécanique endothéliale.

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Protocol

1. Fabrication de gels polyacrylamide (PA)

  1. Préparation du plat Petri
    1. Préparer la solution de silane de liaison en mélangeant 200 ml d'eau ultrapure avec de l'acide acétique de 80 l et 50 l de méthacrylate de 3-(trimethoxysilyl)propyl. Bind silane est une solution utilisée pour fonctionnaliser la surface du plat Petri à fond de verre pour l'attachement hydrogel.
    2. Remuer la solution de silane de liaison sur une plaque à remuer pendant au moins 1 h.
    3. Traiter le centre du plat Petri avec une solution de silane de liaison pendant 45 min.
    4. Retirer la solution de silane de liaison et rincer le plat Petri avec de l'eau ultra-pure 2x-3x.
    5. Séchez la surface du plat Petri et conservez-la à température ambiante pour une utilisation future.
  2. Préparation de la solution hydrogel
    1. Mélanger l'eau ultra-pure, 40% d'acrylamide, et 2% de bis-acrylamide dans un tube centrifugeuse de 15 ml selon le tableau 1.
    2. Ajouter 80 l de perles fluorescentes à la solution hydrogel.
    3. Secouez doucement le tube pour mélanger les perles avec la solution de gel.
    4. Resserrer légèrement le bouchon du tube sur le tube de centrifugeuse et placer dans une chambre à vide.
    5. Degas la solution de gel pendant au moins 45 min dans la chambre à vide.
  3. Polymérisation hydrogel
    1. Tout d'abord, ajouter 75 l de persulfate d'ammonium de 10 % (dissous dans de l'eau ultra-pure) et ajouter 8 L de TEMED (N,N,N',N',N'-tetramethylethane-1,2-diamine) à la solution hydrogel.
    2. Placer 24 ll de solution hydrogel au centre du plat Petri (voir tableau 2).
    3. Utilisez un bordereau de 18 mm pour aplatir l'hydrogel. Cela donnera une hauteur de 100 m.
    4. Attendez au moins 30-40 min pour la polymérisation de gel.
    5. Immerger l'hydrogel polymétédans dans de l'eau ultra-pure pour prévenir la déshydratation des gels.
    6. Couvrir le plat Petri de papier d'aluminium pour éviter le photoblanchiment des perles fluorescentes et conserver à 4 oC.
      REMARQUE: Les hydrogels peuvent être stockés sur une période allant jusqu'à 3 mois, mais il est suggéré que ces gels ne soient pas utilisés plus d'une semaine après la fabrication pour obtenir les meilleurs résultats.

2. Culture cellulaire

  1. Culture cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVECs) dans la culture cellulaire moyenne 200 (voir Tableau des matériaux) complétée par 1% pénicilline-streptomycine sur 0,1% flacons recouverts de gélatine à 37 oC et 5% CO2.

3. Préparation au pochoir Micropattern

  1. Cure d'une fine couche de polydiméthylsiloxane (PDMS) dans un plat Petri de 100 mm en mélangeant la base de silicone avec l'agent de durcissement en silicone à un rapport de 20:1 (base : agent de durcissement).
    REMARQUE : Il est possible d'utiliser d'autres ratios de base pour guérir les agents (p. ex. 10:1 ou 30:1). Cependant, une base inférieure au rapport d'agent de durcissement donnera un modèle plus rigide, alors qu'une base plus élevée au rapport d'agent de traitement produira un modèle plus doux.
  2. Préparer une solution PDMS de 20:1 (agent de traitement de base) et mélanger soigneusement dans un tube de centrifugeuse de 50 ml. Inverser le tube à l'envers et secouer vigoureusement plusieurs fois pour assurer un bon mélange de la solution PDMS, car le mélange non uniforme entraînera une polymérisation incomplète.
  3. Enlever les bulles qui ont été introduites de l'étape ci-dessus en centrifuge antaissant la solution PDMS pendant 1 min à 190 x g.
  4. Verser 5-6 ml de solution PDMS au centre d'un plat Petri de 100 mm et agiter le plat jusqu'à ce que la solution PDMS couvre toute la surface du plat Petri.
  5. Cure de la solution PDMS pendant la nuit à 50-60 oC. Le PDMS peut également être guéri à température ambiante.
  6. Retirez un pochoir PDMS circulaire de 16 mm de diamètre à l'air d'un perforateur à trous.
  7. Utilisez un poinçon de biopsie pour créer de petits trous dans le pochoir PDMS. Ce protocole utilise un poinçon de biopsie de 1,25 mm de diamètre.
  8. Stériliser les pochoirs PDMS en les submergeant d'abord dans 70 % d'éthanol pendant 2-3 min, en aspirant l'excès d'éthanol, puis en les plaçant sous une lumière UV pendant 5 min.

4. Enduit d'hydrogel De collagène-I

  1. Retirer la glissière de couverture de l'hydrogel et aspirer tout excès de liquide.
  2. Placez le pochoir PDMS sur la surface de l'hydrogel.
    REMARQUE : Les pinces peuvent être utilisées pour appliquer une pression légère sur le pochoir PDMS afin d'assurer un joint étanche entre le pochoir PDMS et la surface de l'hydrogel. Nos pochoirs PDMS sont étanches à l'eau et empêchent ainsi l'accès à l'eau entre la surface supérieure du gel et la surface inférieure du pochoir PDMS. En outre, la rigidité hydrogel n'a pas besoin d'être ajusté en ce qui concerne la rigidité PDMS.
  3. Couvrir la surface de l'hydrogel avec sulfosuccinimidyl-6-(4-azido-2-nitrophenylamino) hexanoate (sulfo-SANPAH) dissous dans un HEPES de 0,1 M (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulsulfonic acide) à une concentration de 1 : 1000 et place sous un UV lampe (puissance 36 W) pendant 8 min.
  4. Aspirez l'excès de sulfo-SANPAH et de la solution HEPES et rincez l'hydrogel deux fois avec 0,1 M HEPES suivi de deux rinçages supplémentaires avec de l'eau ultra-pure.
  5. Aspirez l'excès d'eau ultra-pure et enrobez les hydrogels avec 0,1 mg/mL de collagène-I pendant la nuit à 4 oC.
  6. Couvrez la vaisselle et protégez les perles fluorescentes contre le photoblanchiment.
    REMARQUE : Les pochoirs PDMS sont utilisés pour créer des monocouches à micromotif. Les monocouches à micromodèle sont utilisées car elles permettent d'observer simultanément plusieurs monocouches de la même géométrie et des dimensions au cours de chaque expérience. Toutefois, si les micromodèles ne sont pas désirés, les étapes ci-dessus peuvent être suivies à l'exception de l'étape 4.2.

5. Création de monocouches HUVEC sur hydrogels

  1. Utilisez 1x trypsine pour détacher les cellules des flacons de culture tissulaire pendant 3-5 min dans l'incubateur.
  2. Après la trypsinisation, ajouter le support de culture cellulaire à la solution trypsine et ajouter au tube de centrifugeuse de 15 ml.
  3. Centrifugeuse la solution cellulaire pendant 3 min à 1710 x g. Une petite pastille blanche de cellules doit être visible au bas du tube de centrifugeuse.
  4. Aspirer le supernatant et resuspendre les cellules dans les médias à une concentration de 50 x 104 cellules/mL.
  5. Retirer le collagène-I de l'hydrogel et rincer 1x avec PBS.
  6. Ajouter 75 x 103 cellules au sommet du pochoir PDMS et laisser les cellules se fixer à la surface de l'hydrogel pendant au moins 1 h dans l'incubateur à 37 oC et 5 % de CO2.
  7. Retirer le pochoir PDMS et ajouter au moins 2 ml de support au plat Petri. Immerger le pochoir PDMS dans 10x trypsine pour enlever les cellules attachées et stériliser en pulvérisant avec 70% d'éthanol, puis en plaçant sous la lumière UV pendant 5 min.
  8. Placer le plat Petri dans l'incubateur et attendre au moins 36 h ou jusqu'à ce qu'une monocouche confluente soit observée.

6. 2,5 traitement à la dihydroxychalcone pour la perturbation du Cx43

  1. Dissoudre 2,5 dihydroxychalcone (chalcone) dans le diméthylsulfoxide (DMSO) pour faire une solution de stock de 0,1875 mg/mL.
  2. Diluer la solution de stock avec le support de culture cellulaire pour faire une faible concentration de chalcone (0,2 g/mL) aliquot et une concentration élevée de chalcone (2 g/mL) aliquot.

7. Acquisition de données

  1. Localiser les îles cellulaires à l'école avec un microscope.
  2. Acquérir des images de contraste de phase et de perles pour imager la morphologie cellulaire et les déplacements d'hydrogel, respectivement.
    REMARQUE : Ce protocole a utilisé un objectif de 10x pour l'acquisition de données.
  3. À la fin de l'expérience, détacher les cellules avec 10x trypsine et acquérir une image de la surface du gel sans cellules (image de référence).

8. Immunostaining

  1. Fixer les monocouches avec 4 % de formaldéhyde et incuber à 37 oC pendant 15 min.
  2. Retirer 4 % du formaldéhyde et ajouter 0,2 % de Triton X-100 pendant 5 min à 37 oC pour perméabiliser les cellules.
  3. Retirez 0,2 % Triton X-100 et rincez les monocouches avec PBS 2x-3x.
  4. Cochez la monocouche avec une solution d'albumine de sérum bovin (BSA) de 2 % pendant 45 min à 37 oC.
  5. Retirez la solution BSA à 2 % et rincez les monocouches avec PBS 2x-3x.
  6. Ajouter l'anticorps primaire Cx43 à une concentration de 1:400 à l'échantillon et incuber toute la nuit à 4 oC.
  7. Retirez l'anticorps primaire et rincez l'échantillon avec PBS 2x-3x.
  8. Ajouter les anticorps secondaires à une concentration de 3:200 et incuber pendant 2 h à 37 oC.
    REMARQUE : Les échantillons doivent être couverts pour éviter le photoblanchiment.
  9. Retirez l'anticorps secondaire et rincez avec PBS 2x-3x.
  10. Couvrir l'échantillon avec le milieu de montage (Fluromount-G DAPI) et sceller avec un bordereau de couverture de 18 mm.

9. Mise en œuvre de la microscopie de force de traction (TFM) et de la microscopie de contrainte monocouche (MSM)

  1. Calcul de la déformation d'hydrogel
    REMARQUE : Une procédure de calcul du déplacement étape par étape à l'aide de MATLAB est donnée ci-dessous.
    1. Ouvrez le fichier traction.m principal dans MATLAB (pour toutes les routines MATLAB voir Matériaux supplémentaires).
      REMARQUE : Suivez les instructions fournies dans le code pour définir l'annuaire MATLAB.
    2. Définissez les variables suivantes : format d'image, conversion pixel-micron, modulus de Young, ratio de Poisson et objectif microscope.
    3. Localisez la perle, l'image trypsine et l'image de phase à l'aide de la sous-routine OpenFiles.
      REMARQUE : Pour les grands ensembles de données, il est préférable de nommer les fichiers dans l'ordre séquentiel. Par exemple, les fichiers doivent être nommés "filename1.tif", "filename2.tif", etc.
    4. Définir un roi-retour carré (région d'intérêt) autour de la monocouche cellulaire et exécuter la sous-routine de la cellule cropper pour recadrer l'image originale.
    5. Exécutez la sous-routine de déplacement-finder pour calculer les déplacements.
    6. Exécutez la sous-routine Dedrift pour éliminer tout déplacement non cellulaire supplémentaire qui pourrait être dû à la dérive au stade du microscope.
  2. Calcul des tractions
    REMARQUE : Ici, les tractions sans contrainte sont calculées à l'aide de notre routine MATLAB personnalisée. Le calcul de traction étape par étape à l'aide de la routine MATLAB mentionnée précédemment est donné ci-dessous.
    1. Définissez les variables suivantes dans la routine traction.m : état limite, épaisseur de gel, hauteur de gel, et dérivation.
    2. Exécutez la sous-routine de traction-finder pour calculer les tractions et exécutez la sous-routine de traction de parcelle pour tracer des tractions. Toutes les tractions dans la direction x (Tx) et y-direction (Ty) ainsi que leurs emplacements de pixels correspondants peuvent être trouvés dans un fichier traction.dat qui sera généré par le code.
  3. Calcul des contraintes intercellulaires
    REMARQUE : Les instructions étape par étape pour le calcul du stress intercellulaire à l'aide de la routine MATLAB mentionnée précédemment sont données ci-dessous.
    1. Exécutez la sous-routine de la marque-circular-domaine pour spécifier la limite de monocouche. Cette routine incitera toutes les images de phase recadrées séquentiellement pour l'utilisateur à tracer manuellement une limite autour de la monocouche. Gardez une note des nXPts générés dans la fenêtre de commande et utilisez-les plus tard comme paramètres de grille dans l'axe X et l'axe Y pour l'analyse FEM (voir l'étape 9.3.2).
    2. Exécutez Run-StressCode pour calculer les contraintes intercellulaires. Cette sous-routine lit directement les paramètres du fichier "model.in" et exécute "island.exe" pour effectuer l'analyse FEM. Avant d'exécuter cette routine, assurez-vous que tous les paramètres du fichier model.in, c'est-à-dire les paramètres de grille en X et Y, la conversion pixel à micron, le modulus du gel de Young, le ratio de Poisson, la hauteur de la monocouche et le motif monocouche (bande ou trou), sont modifiés correctement.
    3. Tracez tous les résultats DE la FEM à l'aide de la sous-routine de l'intrigue FEM.-
      REMARQUE : Tous les résultats générés seront automatiquement stockés dans le dossier Résultats dans l'annuaire MATLAB.

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Representative Results

Des images de contraste de phase du contrôle, 0,2 g/mL, et 2 monocouches traitées au chalcone de g/mL ont été prises 30 minutes avant le traitement à la chalcone (figure 1A-C) et 2 heures après le traitement à la chalcone (figure 1D-F). Des déplacements de perles induits par les cellules (m) ont été observés pour diminuer dans les conditions de chalcone à faible dose et de chalcone à forte dose(figure 2E,F) par rapport aux monocouches DE huVEC témoins(figure 2D). Avant le traitement à la chalcone, les tractions de rms étaient autour de 51 à 8 Pa(figure 3A-C)pour toutes les conditions. Après le traitement à la chalcone, il y a eu une légère augmentation des tractions rms à 59 à 11 Pa dans un monocouches traités à faible dose de chalcone (Figure 3E) et une diminution de près de 2 fois des tractions rms à 18 à 2 dans les monocouches traitées à la chalcone à forte dose ( Figure 3F) par rapport au contrôle (Figure 3D). Avant le traitement à la chalcone, le stress intercellulaire normal moyen était d'environ 220 à 66 Pa(figure 4A-C). Après le traitement de chalcone, il y avait une augmentation de la magnitude normale moyenne d'effort intercellulaire à 285 - 75 Pa avec le traitement à faible dose de chalcone (figure 4E) mais une diminution significative de la magnitude normale normale moyenne de stress à 106 4 Pa avec traitement à haute dose de chalcone (Figure 4F) par rapport au contrôle des contraintes intercellulaires normales (235 à 18 Pa, Figure 4D). Les contraintes intercellulaires maximales de cisaillement étaient d'environ 241 à 30 Pa(figure 5A-C) avant le traitement à la chalcone, mais après le traitement à la chalcone, il y avait une diminution à 227 à 20 Pa à faible concentration de chalcone (figure 5E) et une nouvelle diminution de la magnitude maximale du stress intercellulaire de cisaillement à 91 et 6 Pa au traitement à forte concentration de chalcone (Figure 5F) par rapport au contrôle des contraintes intercellulaires maximales de cisaillement (270 à 30 Pa, figure 5D ). L'analyse des tractions et des contraintes intercellulaires est présentée à la figure 6A-C. Tous les résultats tracés ont été testés pour la signification statistique (t-test et test aNO facteur unique), et dans les deux tests, les résultats se sont avérés statistiquement significatifs(p 'lt; 0.05) en comparant indépendamment la concentration de chalcone de 0,2 g/mL et 2 chalcone g/mL pour contrôler les conditions (sans chalcone).

Figure 1
Figure 1 : Images contrastées de phase représentative des monocouches HUVEC. Exemple d'images de contraste de phase de HUVECs de commande à 30 min (A) et 2 h (D), images de contraste de phase des HUVECs traités avec 0.2 'g/mL chalcone à 30 min (B) et 2 h (E), et images de contraste de phase des HUVECs traités avec 2 'g/mL chalcone à 30 min (C) et 2 h (F) de début d'expérience. La barre d'échelle représente le diamètre monocouche de 1,25 mm. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Illustration du champ de déplacement produit par les monocouches HUVEC. Déplacements représentatifs (m) de contrôle HUVECs à 30 min (A) et 2 h (D), HUVECs traités avec 0.2 'g/mL chalcone à 30 min (B) et 2 h (E), et HUVECs traités avec 2 'g/mL chalcone à 30 min (C) et 2 h (F) de l'expérience. La barre d'échelle représente le diamètre monocouche de 1,25 mm. La barre de couleur représente les déplacements en m. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Distribution de traction RMS dans les monocouches HUVEC. Exemple de tractions rms (Pa) de contrôle, 0,2 g/mL de chalcone, et 2 HUVECs de chalcone de g/mL avant le traitement de chalcone (A-C) et après une heure de traitement de chalcone (D-F),respectivement. La barre d'échelle représente le diamètre monocouche de 1,25 mm. La barre de couleur représente les tractions RMS dans Pa. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Distribution normale moyenne de stress intercellulaire dans les monocouches HUVEC. Tension intercellulaire normale moyenne (Pa) distribution des HUVECtémoins témoins à 30 min (A) et 2 h (D), HUVECs traités avec 0,2 g/mL de chalcone à 30 min (B) et 2 h (E), et HUVECs traités avec 2 'g/mL chalcone à 30 min (C) ) et 2 h (F). La barre d'échelle représente le diamètre de monocouche de 1,25 mm. La barre de couleur représente des contraintes dans Pa. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Distribution maximale de stress intercellulaire de cisaillement dans les monocouches HUVEC. Stress intercellulaire maximum de cisaillement (Pa) distribution des HUVEC témoins à 30 min (A) et 2 h (D), HUVECs traités avec 0.2 g/mL chalcone à 30 min (B) et 2 h (E), et HUVECs traités avec 2 'g/mL chalcone à 30 min (C) et 2 h (F). La barre d'échelle représente le diamètre de monocouche de 1,25 mm. La barre de couleur représente des contraintes dans Pa. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6 : Comparaison des tractions RMS et des contraintes intercellulaires dans les monocouches HUVEC et impact du traitement de chalcone sur les structures Cx43 de jonction d'écart de HUVEC. Les parcelles de stress intercellulaire normal moyen (A), stress intercellulaire maximum de cisaillement (B) et les tractions RMS (C) montrent l'impact des doses de chalcone (0,2 g/mL et 2 g/mL) sur les monocouches HUVEC par rapport au contrôle. Les barres d'erreur affichent l'erreur standard. Les résultats se sont avérés statistiquement significatifs (taille de l'échantillon et 6 îles, avec un niveau de confiance de 95 %) à l'aide des deux t-tests par rapport au contrôle(p lt; 0,05) et facteur unique ANOVA(p 'lt; 0.05). Dans des plats séparés, l'immunostaining a été exécuté 5 h après l'addition du médicament pour des îles des cellules résidant sur les hydrogels mous de 1.2 kPa. La couleur verte représente Cx43 et le bleu représente DAPI (noyau). Le panneau D représente ce qui suit : contrôle (E,H), 0,2 g/mL de cellules traitées au chalcone (F,I) et cellules traitées à la chalcone de 2 g/mL (G,J). Barre d'échelle de 200 m, objectif 20x. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Supplementary Figure 1
Figure supplémentaire 1 : coloration Cx43 haute résolution dans les monocouches HUVEC. Des monocouches ponctuelles fixes de HUVEC ont été tachées pour Cx43 (vert) et noyau (DAPI, bleu) pour observer l'effet dose-dépendant du chalcone. Des images de grossissement plus élevées (objectif 63x) révèlent la localisation Cx43 principalement autour du noyau (évident de l'intensité de fluorescence verte). Sont montrés le contrôle (A-C), 0.2 cellules traitées de chalcone de g/mL (D-F) et 2 cellules traitées de chalcone de 'g/mL (G-I). Barre d'échelle de 100 m, objectif 63x immersion d'huile. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

1200 Pa 870 Pa (en) 1 kPa 4 kPa 6,3 kPa 11 kPa 90 kPa 150 kPa
Composition de la solution 0,05% BIS 0,1% BIS 0,03% BIS 0,1% BIS 0,03% BIS 0,07% BIS 0,3% BIS 0,6 % BIS
5,5% Acryl 2% Acryl 5% Acryl 5% Acryl 10% Acryl 10% Acryl 12% Acryl 12% Acryl
Eau ultra pure 12,49 ml 13,38 ml 12,78 ml 12,255 ml 10,905 ml 10,63 ml 8,30 ml 5,9 ml
40% d'acrylamide 2,062 ml 750 l 1.875 ml 1.875 ml 3,75 ml 3,75 ml 4,5 ml 4,5 ml
2% BRI Acrylamide 375 l 750 l 225 l 750 l 225 l 525 l 2,12 ml 4,5 ml
Perles fluroscentes (0,2 m ou 0,5 m) 80 l 80 l 80 l 80 l 80 l 80 l 80 l Les tractions ne sont pas mesurables

Tableau 1 : Gel polyacrylamide fabriquant des formulations pour différents moduli de Young.

volume épaisseur Lamelle
20 mm sl bien bête 500 l 1 mm 25 mm
mince 24 l 100 m 18 mm
14 mm sl bien bête 175 l 700 m 18 mm
mince 10,3 l 100 m 12 mm
14 mm 6-bien bête 280 l 1,5 mm 18 mm

Tableau 2 : Volume et épaisseur du gel.

Fichier supplémentaire: Routines MATLAB. S'il vous plaît cliquez ici pour voir ce fichier (Clic droit pour télécharger).

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Discussion

Notre groupe, ainsi que d'autres, a été avec succès l'aide de TFM et MSM pour sonder l'influence des jonctions cellules-cellules dans divers processus cellulaires pathologiques et physiologiques in vitro7,15,18,27 . Par exemple, Hardin et coll. ont présenté une étude très perspicace qui suggère que la transmission intercellulaire du stress guide la formation de lacunes paracellulaires dans les cellules endothéliales15. Bien qu'il soit possible de relier les changements liés au Cx43, nous rapportons ici aux changements signalés par Hardin et coll., nous ne nous attaquons pas spécifiquement à la formation d'écartparique s'il y a des écarts paracellulaires dans ce protocole. Ici, nous avons présenté un protocole basé sur la mécanique pour cibler spécifiquement la jonction d'écart Cx43 et étudier son influence sur la biomécanique endothéliale.

Pour que ce protocole soit couronné de succès, il y avait quelques défis que nous devions surmonter, dont certains pourraient se produire si d'autres chercheurs décidaient d'adopter notre protocole pour des études similaires. Un défi majeur était de trouver une gamme optimale de dose de chalcone où l'expression Cx43 pourrait être inhibée, tout en gardant simultanément nos monocouches endothéliales intactes. L'IC50 de chalcone pour les HUVECs a déjà été rapporté à 10,01 g/mL28. Cependant, lorsque nous avons exposé nos monocouches HUVEC à de multiples concentrations de chalcone allant de 0,2 g/mL à 20 g/mL, nous avons constaté qu'une concentration de chalcone de 2 g/mL était la concentration la plus élevée que nos monocouches pouvaient supporter tout en restant confluent. Un monocouches confluent était essentiel pour ce protocole, car un monocouche est nécessaire pour mesurer les contraintes intercellulaires à l'aide de MSM. Ensuite, nous avons effectué un test d'immunofluorescence pour déterminer si les doses sélectionnées de chalcone ont avec succès perturbé la structure de Cx43 ou l'expression apparente. Notre résultat a révélé que, bien que la perturbation de la structure du Cx43 avec un chalcone de 0,2 g/mL ait été visuellement difficile à distinguer du contrôle, les cellules traitées avec 2 g/mL de chalcone semblaient montrer une différence apparente dans la structure et potentiellement l'expression de Cx43 ( Figure 6D et figure supplémentaire 1). En outre, nos résultats ont montré que la perturbation de Cx43 influence en effet la biomécanique endothéliale en réduisant des tractions et des contraintes intercellulaires à sa concentration la plus élevée. Ces résultats sont en accord avec Bazellieres et autres qui ont montré le silence de Cx43 avec le siRNA pour également réduire des tractions et des contraintes intercellulaires, mais dans une feuille de cellules épithéliales27. Bien que nos résultats soient en accord avec d'autres, il convient de noter que la molécule que nous avons utilisé pour perturber l'expression Cx43, chalcone, a également été suggéré d'influencer l'activation de MAPK et NFkB en plus de la perturbation Cx4326. Par conséquent, puisque nous n'avons pas examiné spécifiquement les molécules mentionnées ci-dessus ou leurs voies associées, nous ne pouvons pas exclure l'influence qu'une perturbation potentielle de MAPK et de NFkB peut avoir sur la biomécanique endothéliale aussi bien.

Un autre point clé à mentionner est que les tractions récupérées et les contraintes intercellulaires sont 2D dans la nature et ignorent hors du plan (z-direction) tractions et contraintes intercellulaires12,13. Bien qu'il y ait une petite erreur associée à l'ignorance des contraintes hors plan, cette erreur est négligeable13. En outre, la dimension latérale de la monocouche est suffisamment grande (1,25 mm) par rapport à la hauteur de la monocouche (5 m) de sorte que nous ne nous attendrions pas à des déplacements significatifs dans la direction z. En outre, le calcul MSM offre l'erreur à la limite monocouche12,13. Cependant, Tambe et coll. ont montré expérimentalement que les erreurs sont les plus élevées aux bords optiques (c.-à-d. la limite monocouche) et se désintègrent rapidement des bords de limite13. Nous effectuons le micropatterning et calculons alors des contraintes intercellulaires de la monocouche entière pour éviter des erreurs de limite qui peuvent se produire pendant le calcul intercellulaire de contrainte.

La microscopie de contrainte de monocouche est employée dans ce protocole car l'information intercellulaire de contrainte rapportée de cette méthode est essentielle afin d'avoir une compréhension plus complète de la perturbation de jonction d'écart de rôle a sur la biomécanique endothéliale. En outre, on a suggéré que les contraintes intercellulaires soient importantes dans la fonction de barrière endothéliale, comme le suggèrent Hardin et coll.15 et Krishnan et al.17, par exemple. En outre, bien que les contraintes intercellulaires aient été corrélées aux tractions dans les données représentatives présentées ici, ce n'est pas toujours le cas en fonction du stimulus. Dans l'étude de Steward et coll., par exemple, les contraintes intercellulaires endothéliales ont diminué sous le cisaillement des fluides, tandis que les tractions sont demeurées relativement inchangées7. En outre, le protocole que nous présentons ici ne permet pas la mesure simultanée des forces mécaniques dérivées des cellules et la coloration des jonctions et des adhérences focales, mais un tel ajout serait complémentaire à ce protocole. En conclusion, le protocole que nous présentons ici décrit une méthode basée sur la mécanique pour étudier l'influence cx43 a uniquement sur la biomécanique endothéliale, spécifiquement les forces endothéliales dérivées des cellules. Nous croyons que notre protocole basé sur la mécanique peut être utilisé en conjonction avec les protocoles biologiques existants pour fournir un travail véritablement révolutionnaire dans le domaine.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par les fonds de démarrage de l'Université de Floride centrale et le National Heart, Lung, And Blood Institute du National Institute of Health sous le prix K25HL132098.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 mm coverslip ThermoFisher 18CIR-1 Essential to flatten polyacrylamide gels
2% bis-acrylamide BIO-RAD 1610143 Component of polyacrylamide gel
2′,5′-Dihydroxychalcone SIGMA IDF00046 To disrupt Cx43 structure
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate SIGMA 2530-85-0 Stock solution to make bind silane mixture with acetic acid and ultra-pure water
40% Acrylamide BIO-RAD 1610140 Component of polyacrylamide gel
Acetic acid Fisher-Sceintific 64-19-7 Essential to make bind saline solution
Alexa Fluro 488 goat anti-mouse IgG; ThermoFisher Catalog # A-11001 Secondary antibody
Ammonium persulfate BIO-RAD 1610700 Polyacrylamide gel polymerizing agent
Bovine Serum Albumin (BSA) SIGMA 9048-46-8 To make blocking solution
Bovine Type I Atelo-Collagen Solution, 3 mg/mL, 100 mL Advance Biomatrix 5005-100ML Use as a extracellular matrix
Corning Cell Culture Phosphate Buffered Saline (1x) Fisher-Sceintific 21040CV Buffer Saline needed for cell culture
Dimethyl Sulfoxide, Fisher BioReagents Fisher-Sceintific 67-68-5 To dissolve chalcone and make stock solution
Fluoromount-G with DAPI ThermoFisher 00-4959-52 Mounting medium for immunostaing used to stain for DAPI
Fluroscent microsphere Carboxylate-modified beads ThermoFisher F8812 0.5 micron carboxylate-modified beads (red), 2% solids
HEPES buffer solution 1 M SIGMA 7365-45-9 Essential to
LVES ThermoFisher A1460801 Essential HUEVC media 200 supplement
Medium 200 ThermoFisher M200500 Essential media for HUVEC cell culture
Mouse monoclonal Cx43 antibody (CX - 1B1) ThermoFisher Catalog #13-8300 Primary antibody for Cx43
Petri dish (35 mm dia) CellVis D35-20-1.5H 35 mm petri dish with a 20 mm center well
Sulfo-SANPAH Crosslinker 100 mg Proteochem 102568-43-4 Essential to functionalize polyacrylamide gel surface
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit DOW corning 2646340 Silicon elastomer with curing agent to make PDMS
TEMED BIO-RAD 1610801 Polyacrylamide gel polymerizing agent
Triton-X 100 SIGMA 9002-93-1 To permeabilize cells
Trypsin -EDTA ThermoFisher 25300054 Used to detach cells

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References

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Biochimie Numéro 152 Microscopie de force de traction microscopie de contrainte de monocouche mécanobiologie jonction d'écart Cx43 stress intercellulaire
Perturbing Biomécanique endothéliale via Connexin 43 Structural Disruption
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Islam, M. M., Steward, Jr., R. L.… More

Islam, M. M., Steward, Jr., R. L. Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption. J. Vis. Exp. (152), e60034, doi:10.3791/60034 (2019).

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