Summary
Hier presenteren we een op mechanica gebaseerd protocol om de gap junction connexin 43 te verstoren en de daaropvolgende impact te meten die dit heeft op endotheliale biomechanica via observatie van tracties en intercellulaire spanningen.
Abstract
Endotheelcellen zijn opgericht voor het genereren van intercellulaire spanningen en tractie's, maar de rol gap knooppunten spelen in endotheliale intercellulaire stress en tractie generatie is momenteel onbekend. Daarom presenteren we hier een op mechanica gebaseerd protocol om de invloed van Gap Junction connexin 43 (Cx43) op endotheliale biomechanica te hebben door de confluente endotheliale monolagen bloot te stellen aan een bekende Cx43 remmer 2,5-dihydroxychalcone (chalcone) en meten van de impact van deze remmer op tractie en intercellulaire spanningen. We presenteren representatieve resultaten, die een afname vertonen in zowel tractie en intercellulaire spanningen onder een hoge Chalcon dosering (2 μg/ml) in vergelijking met controle. Dit protocol kan worden toegepast op niet alleen Cx43, maar ook op andere tussen punten, mits de juiste remmer wordt gebruikt. Wij geloven dat dit protocol nuttig zal zijn op het gebied van cardiovasculaire en mechanobiologie onderzoek.
Introduction
Het veld dat verwijst naar de studie van de effecten van fysieke krachten en van mechanische eigenschappen op cellulaire en weefsel fysiologie en pathologie staat bekend als Mechanobiology1. Een paar nuttige technieken die zijn gebruikt in de mechanobiologie zijn monolaag stress microscopie en tractiekracht microscopie. Tractiekracht microscopie maakt het mogelijk voor de berekening van tracties gegenereerd op de celsubstraat interface, terwijl monolaag stress microscopie maakt het mogelijk voor de berekening van intercellulaire spanningen gegenereerd tussen aangrenzende cellen binnen een monolaag2 ,3,4,5,6. Resultaten opgeleverd uit eerdere methoden hebben gesuggereerd dat cel-afgeleide mechanische spanningen spelen een cruciale rol bij het bepalen van het lot van een groot aantal cellulaire processen3,4,5. Bijvoorbeeld, bij blootstelling aan een externe mechanische kracht, een groep cellen migreren als een collectief kan hun morfologie veranderen en polariseren hun vorm te uitlijnen en te migreren langs de richting van de toegepaste kracht door, gedeeltelijk, het genereren van tractie7, 8. Tractions bieden een metriek die kan worden gebruikt voor het evalueren van de contractiliteit van de cel en worden berekend met behulp van tractiekracht microscopie (TFM). Tractiekracht microscopie (TFM) begint met de bepaling van celgeïnduceerde substraat vervormingen gevolgd door de berekening van het tractie veld met behulp van een wiskundig rigoureuze, op mechanica gebaseerde computationele benadering. Aangezien de mogelijkheid om te berekenen tractie al geruime tijd is geweest, onderzoekers hebben gebruikt tfm om te onthullen de impact tractie hebben op een groot aantal processen, met inbegrip van kanker9, wondgenezing10 en beoordeling van engineered cardiale weefsel11.
De implementatie van TFM en MSM samen kan worden onderverdeeld in drie essentiële stappen die in de volgende volgorde moeten worden uitgevoerd: ten eerste worden de door de cellen geproduceerde hydrogel vervormingen bepaald; Ten tweede worden tracties teruggewonnen uit hydrogel vervormingen; en ten derde wordt een eindige-element benadering gebruikt om de normale en shear intercellulaire spanningen binnen de gehele monolayer te berekenen. Om gelverplaatsingen te berekenen werden fluorescentie kraal beelden met cellen vergeleken met de referentie kraal afbeelding (zonder cellen) met behulp van een aangepaste-geschreven partikel afbeelding velocimetrie (PIV) routine. De cross-correlatie window grootte en overlapping voor PIV analyse werden gekozen als 32 x 32 pixels en 0,5, respectievelijk. Op dit moment werden pixel verschuivingen omgezet in micron door vermenigvuldiging met een pixel-naar-micron conversiefactor (voor onze Microscoop, deze omrekeningsfactor is 0,65) om in-plane verplaatsingen te verkrijgen. Fouten in verband met het negeren van verplaatsingen buiten het vlak zijn verwaarloosbaar12,13. Na de berekening van de gelverplaatsingen zijn er twee soorten tractie metingen die kunnen worden gebruikt, beperkte tracties en onbelemmerd tractie8,14. Onbeperkte tracties bieden het veld tractie voor het hele gezichtsveld (inclusief regio's met en zonder cellen), terwijl beperkte tractie het tractie veld alleen bieden voor regio's met cellen14. Vervolgens worden intercellulaire spanningen berekend met behulp van monolaag stress microscopie (MSM), wat een Verleng deel is van de tractiekracht microscopie. De implementatie van MSM is gebaseerd op de veronderstelling dat lokale tracties die worden uitgeoefend door een monolaag van cellen op de celsubstraat interface moeten worden afgewogen door mechanische krachten die worden overgebracht tussen cellen op de celcelinterface, zoals vereist door de wetten van Newton7 ,12,13. Een belangrijke aanname hier is dat de celmonolayer kan worden behandeld als een dun elastisch blad omdat de tractie verdeling in de monolaag bekend is en de kracht balans niet afhankelijk is van eigenschappen van het celmateriaal. Een andere belangrijke aanname is dat de tractie krachten worden gecompenseerd door lokale intercellulaire spanningen binnen het optische gezichtsveld (binnen de monolayer) en de invloed van deze kracht balans is minimaal in de distale regio (buiten de monolayer)13. Daarom zijn de grens omstandigheden die worden gedefinieerd door intercellulaire spanningen, verplaatsingen of een combinatie van beide op de monolaag-grens cruciaal voor het uitvoeren van MSM13. Rekening houdend met de bovenstaande informatie gebruiken we MSM om een eindige-elementanalyse (FEM) uit te voeren om de maximale hoofdspanning (σMax) en minimale hoofdbelasting (σmin) te herstellen door het stress vlak op elk punt in de monolaag. Deze belangrijkste spanningen worden vervolgens gebruikt om de gemiddelde normale intercellulaire stress van het 2D te berekenen [(σMax + σmin)/2] en 2D maximale shear intercellulaire stress [(σMax -σmin)/2] binnen de gehele monolaag 12,13. Deze procedure wordt uitvoeriger beschreven door tambe et al.12,13
Monolaag stress microscopie (MSM) zorgt voor de berekening van cel-cel intercellulaire spanningen gegenereerd binnen een monolaag6,7,8,12,13. Deze intercellulaire spanningen zijn gesuggereerd belangrijk voor weefsel groei en herstel, wondgenezing, en kanker metastasen12,15,16,17. Bovendien, intercellulaire spanningen zijn voorgesteld om ook belangrijk in de endotheliale Celmigratie en endotheliale barrièrefunctie17,18. Hoewel er beide zijn gesuggereerd om een cruciale rol te spelen in de endotheliale intercellulaire stress generatie en-transmissie, blijft de rol van de kloof knooppunten ongrijpbaar, terwijl de knooppunten van de celcellen, zoals nauwe kruisingen en aanhekings knooppunten, allebei een Gap-knooppunten verbinden fysiek aangrenzende cellen en zorgen voor een pad voor elektrische stroom en moleculen (< 1 kDa) om tussen de naburige cellen19,20,21te passeren. Hoewel endotheelcellen Express Cx37, Cx40, en Cx43 gap-knooppunten19,22, Cx43 is aantoonbaar de belangrijkste in termen van ziekteprogressie23. Bewijs van Cx43's belang kan worden gevonden in het feit dat genetische deletie van Cx43 in muizen resulteert in hypotensie24 en nadelige effecten heeft op angiogenese25. Daarnaast is Cx43 gedocumenteerd om belangrijk te zijn voor Celmigratie en proliferatie en in de progressie van atherosclerose18,22,23,24,25 .
In dit protocol gebruikten we tfm en MSM om te onderzoeken of tractie en intercellulaire stress generatie binnen de confluente, endotheliale monolaag zou worden beïnvloed door de verstoring van de endotheliale gap junction Cx43. We verstoorde Cx43 met 2,5-dihydroxychalcone (chalcone), een molecuul gedocumenteerd voor de remming van Cx43 expressie26. Chalcon werd gebruikt om Cx43 te verstoren in plaats van siRNA, omdat Chalcon eerder werd gerapporteerd door Lee et al. om Cx43 uitdrukking26te verstoren. Daarnaast waren we vooral geïnteresseerd in de invloed van chalcone op het endotheel omdat het ook is gemeld dat het een anti-inflammatoire en anti-bloedplaatjes verbinding is die mogelijk kan worden gebruikt voor de preventie en behandeling van verschillende vasculaire pathologieën26. Chalcone behandelingen werden uitgevoerd een uur na het begin van het experiment, chalcone-behandelde monolagen werden afbeelding gemaakt voor een totaal van zes uur, en beeldverwerking werd uitgevoerd met een aangepaste geschreven MATLAB code om te bepalen tractie en vervolgens intercellulaire Benadrukt. Onze resultaten toonden een algehele afname van de tractie en intercellulaire spanningen, wat suggereert dat Cx43 een sleutelrol speelt in de endotheliale biomechanica.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Polyacrylamide (PA) gels maken
-
Voorbereiding van Petri schaaltje
- Bereid BIND silaan oplossing door het mengen van 200 mL ultrapuur water met 80 μL azijnzuur en 50 μL 3-(trimethoxysilyl) Propylmethacrylaat. BIND silaan is een oplossing die wordt gebruikt voor het functionaliseren van het glasbodem Petri schaaloppervlak voor hydrogel bevestiging.
- Roer de BIND silaan-oplossing op een roer plaat gedurende ten minste 1 uur.
- Behandel het centrum goed van de Petri schaal met BIND silaan oplossing voor 45 min.
- Verwijder BIND silaan oplossing en spoel de Petri schaal af met ultra zuiver water 2x-3x.
- Droog het Petri schaaloppervlak en bewaar bij kamertemperatuur voor toekomstig gebruik.
-
Bereiding van de hydrogel oplossing
- Meng ultrazuiver water, 40% acrylamide en 2% bis-acrylamide in een centrifugebuis van 15 mL volgens tabel 1.
- Voeg 80 μL fluorescerende kralen toe aan de hydrogel oplossing.
- Schud de buis zachtjes om kralen te mengen met de geloplossing.
- Draai de buisdop op de centrifugebuis lichtjes aan en plaats deze in een vacuümkamer.
- Degas de gel-oplossing voor ten minste 45 min in vacuümkamer.
-
Hydrogel polymerisatie
- Voeg eerst 75 μL van 10% ammonium persulfaat toe (opgelost in ultra zuiver water) en voeg vervolgens 8 μL TEMED (N, N, N ', N'-Tetramethylethane-1,2-diamine) toe aan de hydrogel oplossing.
- Plaats 24 μL hydrogel oplossing in het midden van de Petri schaal (Zie tabel 2).
- Gebruik een 18 mm afdek om de hydrogel plat te maken. Dit geeft een hoogte van ~ 100 μm.
- Wacht minstens 30-40 min voor de polymerisatie van de gel.
- Dompel de gepolymeriseerde hydrogel in ultra zuiver water in om gel uitdroging te voorkomen.
- Bedek de Petri schaal met aluminiumfolie om fotobleking van fluorescerende kralen te voorkomen en op te slaan bij 4 °C.
Let op: hydrogels kunnen een periode van maximaal 3 maanden worden bewaard, maar er wordt gesuggereerd dat deze gels niet langer dan 1 week na de fabricage worden gebruikt om de beste resultaten te verkrijgen.
2. celcultuur
- Cultuur humane navelstreng ader endotheliale cellen (huvecs) in celkweekmedium 200 (Zie tabel van de materialen) aangevuld met 1% penicillaire-streptomycine op 0,1% gelatine gecoate kolven bij 37 °c en 5% Co2.
3. micro patroon stencil voorbereiding
- Genees een dun laagje Polydimethylsiloxaan (PDM'S) in een 100 mm Petri schaaltje door het siliconen onderstel te mengen met het siliconen Verhardend middel in een verhouding van 20:1 (basis: Uithardings middel).
Opmerking: het is mogelijk om andere basis verhoudingen te gebruiken (bijv. 10:1 of 30:1). Echter, een lagere basis om te genezen agent ratio zal een stijvere patroon opleveren, terwijl een hogere basis tot genezen agent ratio een zachter patroon zal produceren. - Bereid een 20:1 (Base: Cure agent) PDMS oplossing en meng voorzichtig in een 50 mL centrifugebuis. Keer de buis ondersteboven en schud krachtig meerdere malen om een goede menging van de PDMS-oplossing te verzekeren, omdat niet-uniforme menging resulteert in onvolledige polymerisatie.
- Verwijder bubbels die zijn geïntroduceerd uit de bovenstaande stap door de PDMS-oplossing gedurende 1 minuut te centrifugeren bij 190 x g.
- Giet 5-6 mL PDMS oplossing in het midden van een 100 mm Petri schaaltje en roer het gerecht tot de PDMS oplossing het gehele Petri schaaloppervlak bedekt.
- De PDMS oplossing 's nachts op 50-60 °C genezen. PDM'S kunnen ook op kamertemperatuur worden genezen.
- Verwijder een cirkelvormig, 16 mm diameter PDMS stencil met een perforatie Puncher.
- Gebruik een biopsie punch om kleine gaten te maken in de PDMS stencil. Dit protocol maakt gebruik van een 1,25 mm diameter biopsie Punch.
- Steriliseer PDMS stencils door ze eerst in te voegen in 70% ethanol voor 2-3 min, aspireren van overtollige ethanol en vervolgens plaatsen onder een UV-licht voor 5 min.
4. collageen-I hydrogel coating
- Verwijder de dekslip van de hydrogel en aspiraat overtollige vloeistof.
- Plaats de PDMS stencil op het hydrogel oppervlak.
Opmerking: pincet kan worden gebruikt om licht druk toe te passen op PDMS stencil om een waterdichte afdichting tussen de PDMS stencil en hydrogel oppervlak te garanderen. Onze PDMS stencils zijn waterdicht en voorkomen zo water toegang tussen de gel top oppervlak en PDMS stencil bodemoppervlak. Ook de hydrogel stijfheid hoeft niet aangepast te worden aan de PDMS stijfheid. - Bedek het hydrogel oppervlak met sulfosuccinimidyl-6-(4-azido-2-nitrofenylamino) hexanoaat (sulfo-SANPAH) opgelost in een 0,1 M HEPES (4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfoninezuur) bufferoplossing bij een concentratie van 1:1000 en plaats onder een UV- lamp (vermogen 36 W) gedurende 8 min.
- Aspireren de overmaat sulfo-SANPAH en HEPES oplossing en spoel de hydrogel tweemaal met 0,1 M HEPES gevolgd door een extra twee spoelen met ultra zuiver water.
- Aspirate overtollige Ultra-zuiver water en vacht hydrogels met 0,1 mg/mL collageen-ik overnacht bij 4 °C.
- Bedek de gerechten en Bescherm fluorescerende kralen tegen fotobleaching.
Opmerking: PDMS-stencils worden gebruikt om monolayers met micro patronen te maken. Micro-patroon monolagen worden gebruikt omdat ze toestaan dat meerdere monolagen van dezelfde geometrie en afmetingen gelijktijdig worden geobserveerd tijdens elk experiment. Echter, moeten micro patronen niet worden gewenst de bovenstaande stappen kunnen worden gevolgd met uitzondering van stap 4,2.
5. creëren van huvec monolagen op hydrogels
- Gebruik 1x trypsine om cellen los te maken van weefselkweek kolven voor 3-5 min in de incubator.
- Voeg na trypsinisatie celkweek media toe aan de trypsine-oplossing en voeg deze toe aan de centrifugebuis van 15 mL.
- Centrifugeer de celoplossing 3 min bij 1710 x g. Een kleine, witte pellet van cellen moet zichtbaar zijn aan de onderkant van de centrifugebuis.
- Aspireren de supernatant en respenderen cellen in de media tot een concentratie van 50 x 104 cellen/ml.
- Verwijder collageen-I uit de hydrogel en spoel 1x met PBS.
- Voeg 75 x 103 cellen toe aan de bovenkant van het PDMS stencil en laat cellen ten minste 1 uur in de incubator bij 37 °c en 5% Co2hechten aan het hydrogel oppervlak.
- Verwijder het PDMS stencil en voeg ten minste 2 mL media toe aan de Petri schaal. Dompel de PDMS stencil in 10x trypsine om eventuele bijgevoegde cellen te verwijderen en te steriliseren door te spuiten met 70% ethanol en vervolgens 5 minuten onder het UV-licht te plaatsen.
- Plaats de Petri schaal in de incubator en wacht minstens 36 uur of totdat er een confluente monolaag wordt waargenomen.
6.2,5 dihydroxychalcone behandeling voor Cx43 verstoring
- Los 2,5 dihydroxychalcone (chalcone) op in dimethylsulfoxide (DMSO) om een 0,1875 mg/mL stamoplossing te maken.
- Verdun de stamoplossing met celkweek media om een lage Chalcon concentratie (0,2 μg/ml) aliquot en een hoge Chalcon concentratie (2 μg/ml) aliquot te maken.
7. gegevensverzameling
- Lokaliseer de celeilanden met een microscoop.
- Verwerven fase contrast en kraal beelden aan beeld cellen morfologie en hydrogel verplaatsingen, respectievelijk.
Opmerking: dit protocol gebruikt een 10x-doelstelling voor het verzamelen van gegevens. - Maak aan het einde van het experiment cellen los met 10x trypsine en verkrijg een afbeelding van het geloppervlak zonder cellen (referentiebeeld).
8. immunokleuring
- Fixeer monolagen met 4% formaldehyde en inincuberen bij 37 °C gedurende 15 minuten.
- Verwijder 4% formaldehyde en Voeg 0,2% Triton X-100 gedurende 5 min bij 37 °C toe aan permeabilize cellen.
- Verwijder 0,2% Triton X-100 en spoel monolagen af met PBS 2x-3x.
- Bedek monolaag met 2% boviene serumalbumine (BSA) oplossing voor 45 min bij 37 °c.
- Verwijder de 2% BSA-oplossing en spoel de monolagen af met PBS 2x-3x.
- Voeg primair Cx43 antilichaam toe met een concentratie van 1:400 tot het monster en inincubatie 's nachts bij 4 °C.
- Verwijder primair antilichaam en spoel het monster af met PBS 2x-3x.
- Voeg secundair antilichaam toe met een concentratie van 3:200 en inincubatie gedurende 2 uur bij 37 °C.
Opmerking: monsters moeten worden bedekt om fotobleking te voorkomen. - Verwijder secundair antilichaam en spoel af met PBS 2x-3x.
- Afdek monster met afdekmedium (Fluromount-G DAPI) en afdichting met een afdekplaat van 18 mm.
9. implementatie van tractiekracht microscopie (tfm) en monolaag stress microscopie (MSM)
-
Berekening hydrogel vervorming
Opmerking: een stap-voor-stap verplaatsings procedure met behulp van MATLAB wordt hieronder gegeven.- Open het hoofdbestand Traction. m in MATLAB (voor alle MATLAB-routines Zie aanvullende materialen).
Opmerking: Volg de instructies in de code om de MATLAB-map in te stellen. - Definieer de volgende variabelen: afbeeldingsformaat, pixel-naar-micron conversie, jeugdige modulus, Poisson-ratio en Microscoop-doelstelling.
- Zoek de kraal, trypsine-afbeelding en fase-afbeelding met behulp van de Open files subroutine.
Opmerking: voor grote gegevenssets is het het beste om bestanden in sequentiële volgorde te noemen. Bestanden moeten bijvoorbeeld de naam ' bestandsnaam1. TIF ', ' bestandsnaam2. TIF ', enzovoort hebben. - Definieer een vierkante ROI (regio van belang) rond de monolaag van de cel en voer de cell_cropper subroutine uit om de oorspronkelijke afbeelding uit te snijden.
- Voer de displacement_finder subroutine uit om verplaatsingen te berekenen.
- Voer de Dedrift -subroutine uit om eventuele extra niet-cellulaire verplaatsingen te verwijderen die het gevolg kunnen zijn van een Microscoop-fase drift.
- Open het hoofdbestand Traction. m in MATLAB (voor alle MATLAB-routines Zie aanvullende materialen).
-
Berekening van de tracties
Opmerking: hier worden onbeperkte tractie berekend met behulp van onze op maat gemaakte MATLAB-routine. Stap voor stap tractie berekening met de eerder genoemde MATLAB-routine wordt hieronder gegeven.- Definieer de volgende variabelen binnen de tractie. m routine: randvoorwaarde, geldikte, gelhoogte en dedrift.
- Voer de traction_finder subroutine uit om tractie te berekenen en voer de plot_traction subroutine uit om tractie te plotten. Alle tracties in x-Direction (TX) en y-Direction (Ty) samen met de bijbehorende pixel locaties kunnen worden gevonden in een bestand Traction. dat dat wordt gegenereerd door de code.
-
Berekening van intercellulaire spanningen
Opmerking: stap voor stap instructies voor intercellulaire stress berekening met behulp van de eerder genoemde MATLAB-routine worden hieronder gegeven.- Voer de mark_circular_domain subroutine uit om de grens van de monolaag op te geven. Deze routine zal alle bijgesneden fase beelden opeenvolgend te vragen voor de gebruiker om handmatig een grens rond de monolayer tekenen. Houd een notitie bij van de nXPts die zijn gegenereerd in het opdrachtvenster en gebruik ze later als raster parameters in zowel de X-as als de Y-as voor FEM-analyse (zie stap 9.3.2).
- Voer Run_StressCode uit om intercellulaire spanningen te berekenen. Deze subroutine direct leest parameters van "model.in" bestand en voert "Island. exe" om FEM-analyse uit te voeren. Voordat u deze routine uitvoert, moet u ervoor zorgen dat alle parameters in het bestand model.in , d.w.z. raster parameters in X en Y, pixel-naar-micron-conversie, jeugdige modulus van de gel, Poisson-verhouding, monolaag-hoogte en monolaag-patroon (strip of gat), worden bewerkt Correct.
- Plot alle FEM-resultaten met behulp van de plot_FEM_results subroutine.
Opmerking: alle gegenereerde resultaten worden automatisch opgeslagen in de map Results in de map MATLAB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fase contrast beelden van controle, 0,2 μg/ml, en 2 μg/ml Chalcon behandelde monolagen werden 30 minuten voor Chalcon behandeling (Figuur 1A-C) en 2 uur na Chalcon behandeling (figuur1D-F) genomen. Cel-geïnduceerde kraal verplaatsingen (μm) werden waargenomen te verminderen in zowel de lage dosis Chalcon en hoge dosis Chalcon voorwaarden (Figuur 2E, F) in vergelijking met controle huvec monolagen (Figuur 2D). Vóór de Chalcon-behandeling waren de RMS-tracties ongeveer 51 ± 8 PA (Figuur 3A-C) voor alle omstandigheden. Na Chalcon behandeling was er een kleine toename in RMS-tracties tot 59 ± 11 pa in een lage dosis Chalcon behandelde monolagen (Figuur 3E) en een bijna 2-voudige afname in RMS-tracties tot 18 ± 2 in hoge dosis Chalcon behandelde monolagen ( Figuur 3F) vergeleken met de controle (Figuur 3D). Voorafgaand aan Chalcon behandeling, gemiddelde normale intercellulaire spanningen waren rond 220 ± 66 PA (Figuur 4A-C). Na Chalcon behandeling was er een toename in gemiddelde normale intercellulaire stress magnitude tot 285 ± 75 PA met lage dosis Chalcon behandeling (Figuur 4E) maar een significante afname van gemiddelde normale intercellulaire stress magnitude tot 106 ± 4 PA met hoge dosis Chalcon behandeling (Figuur 4F) in vergelijking met de controle gemiddelde normale intercellulaire spanningen (235 ± 18 PA, Figuur 4D). Maximale shear intercellulaire spanningen waren rond 241 ± 30 PA (Figuur 5A-C) vóór Chalcon behandeling, maar na de Chalcon behandeling, er was een afname van 227 ± 20 Pa bij lage Chalcon concentratie (Figuur 5E) en een verdere afname van de maximale shear intercellulaire stress magnitude tot 91 ± 6 pa bij hoge Chalcon concentratie behandeling (Figuur 5F) in vergelijking met controle maximale shear intercellulaire spanningen (270 ± 30 PA, Figuur 5D ). De analyse van tracties en intercellulaire spanningen wordt weergegeven in Figuur 6A-C. Alle uitgezette resultaten werden getest op statistische significantie (t-test en single factor ANOVA-test), en in beide testresultaten bleek statistisch significant (p < 0,05) bij een onafhankelijke vergelijking van 0,2 μg/ml Chalcon concentratie en 2 μg/ml Chalcon om de omstandigheden te beheersen (zonder Chalcon).
Figuur 1: representatieve fase contrast beelden van HUVEC monolayers. Voorbeeld fase contrast beelden van Control huvecs op 30 min (A) en 2 h (D), fase contrast beelden van huvecs behandeld met 0,2 μg/ml Chalcon op 30 min (B) en 2 h (E), en fase contrast beelden van huvecs behandeld met 2 μg/ml Chalcon op 30 min (C) en 2 h (F) van het begin van het experiment. Schaalbalk vertegenwoordigt de monolaag diameter van 1,25 mm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: illustratie van het verplaatsings veld geproduceerd door HUVEC monolayers. Representatieve verplaatsingen (μm) van de controle huvecs op 30 min (A) en 2 h (D), huvecs behandeld met 0,2 μg/ml Chalcon op 30 min (B) en 2 h (E), en huvecs behandeld met 2 μg/ml Chalcon op 30 min (C) en 2 h (F) van begin van het experiment. Schaalbalk vertegenwoordigt de monolaag diameter van 1,25 mm. de kleur balk vertegenwoordigt verplaatsingen in μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: RMS tractie verdeling in HUVEC monolayers. Voorbeeld van RMS-tracties (PA) van controle, 0,2 μg/ml Chalcon, en 2 μg/ml Chalcon huvecs vóór Chalcon behandeling (A-C) en na een uur van chalcon behandeling (D-F), respectievelijk. Schaalbalk vertegenwoordigt de monolaag diameter van 1,25 mm. Color Bar vertegenwoordigt RMS-tractie in PA. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: gemiddelde normale intercellulaire spanningsverdeling in HUVEC-monolagen. Gemiddelde normale intercellulaire stress (PA) verdeling van de controle huvecs op 30 min (A) en 2 h (D), huvecs behandeld met 0,2 μg/ml Chalcon op 30 min (B) en 2 h (E), en huvecs behandeld met 2 μg/ml Chalcon op 30 min (C) en 2 h (F). Schaalbalk vertegenwoordigt de monolaag diameter van 1,25 mm. Color Bar vertegenwoordigt spanningen in PA. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: maximale shear intercellulaire spanningsverdeling in HUVEC monolayers. Maximale shear intercellulaire stress (PA) verdeling van de controle huvecs op 30 min (a) en 2 h (D), huvecs behandeld met 0,2 μg/ml Chalcon op 30 min (B) en 2 h (E), en huvecs behandeld met 2 μg/ml Chalcon op 30 min (C) en 2 h (F). Schaalbalk vertegenwoordigt de monolaag diameter van 1,25 mm. Color Bar vertegenwoordigt spanningen in PA. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: vergelijking van RMS-tracties en intercellulaire spanningen in monolagen van huvec en impact van chalcon-behandeling op huvec gap junction Cx43 structures. Plots van gemiddelde normale intercellulaire stress (A), maximale shear intercellulaire stress (B) en RMS-tracties (C) tonen de impact van chalcon-doses (0,2 μg/ml en 2 μg/ml) op huvec-monolagen in vergelijking met controle. Foutbalken geven standaardfout weer. De resultaten bleken statistisch significant (steekproefgrootte = 6 eilanden, met een betrouwbaarheidsniveau van 95%) met behulp van beide t-tests ten opzichte van controle (p < 0,05) en enkelvoudige factor ANOVA (p < 0,05). In afzonderlijke gerechten werd immunokleuring 5 uur na toevoeging van het medicijn uitgevoerd voor eilanden van cellen die op zachte 1,2 kPa-hydrogels woonden. De groene kleur staat voor Cx43 en blauw staat voor DAPI (Nucleus). Panel D toont het volgende: Control (E, H), 0,2 μg/ml Chalcon behandelde cellen (F, I) en 2μg/ml Chalcon behandelde cellen (G, J). Schaalbalk = 200 μm, objectief = 20x. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend figuur 1: hoge resolutie Cx43 kleuring in monolagen van HUVEC. Vaste huvec monolagen werden gekleurd voor Cx43 (groen) en Nucleus (DAPI, blauw) om het dosisafhankelijke effect van chalcone te observeren. Hogere vergrotings beelden (63x objectief) onthullen Cx43 lokalisatie meestal rond de Nucleus (duidelijk uit de intensiteit van de groene fluorescentie). Weergegeven zijn controle (a-C), 0,2 μg/ml Chalcon behandelde cellen (D-F) en 2 μg/ml Chalcon behandelde cellen (G-I). Schaal staaf = 100 μm, objectief = 63x olie onderdompeling. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| 1200 pa | 870 pa | 1 kPa | 4 kPa | 6,3 kPa | 11 kPa | 90 kPa | 150 kPa | |
| Samenstelling van de oplossing | 0,05% BIS | 0,1% BIS | 0,03% BIS | 0,1% BIS | 0,03% BIS | 0,07% BIS | 0,3% BIS | 0,6% BIS |
| 5,5% acryl | 2% acryl | 5% acryl | 5% acryl | 10% acryl | 10% acryl | 12% acryl | 12% acryl | |
| Ultra zuiver water | 12,49 mL | 13,38 mL | 12,78 mL | 12,255 mL | 10,905 mL | 10,63 mL | 8,30 mL | 5,9 mL |
| 40% acrylamide | 2,062 mL | 750 μL | 1,875 mL | 1,875 mL | 3,75 ml | 3,75 mL | 4,5 mL | 4,5 mL |
| 2% BIS acrylamide | 375 μL | 750 μL | 225 μL | 750 μL | 225 μL | 525 μL | 2,12 mL | 4,5 mL |
| Fluroscent kralen (0,2 μm of 0,5 μm) | 80 μL | 80 μL | 80 μL | 80 μL | 80 μL | 80 μL | 80 μL | Tracties zijn niet meetbaar |
Tabel 1: polyacrylamidegel maken van formuleringen voor verschillende jonge moduli.
| Volume | Dikte | Afdek | ||
| 20-mm SL-put | Dikke | 500 μL | ~ 1 mm | 25 mm |
| Dunne | 24 μL | ~ 100 μm | 18 mm | |
| 14-mm SL-put | Dikke | 175 μL | ~ 700 μm | 18 mm |
| Dunne | 10,3 μL | ~ 100 μm | 12 mm | |
| 14 mm 6-well | Dikke | 280 μL | ~ 1,5 mm | 18 mm |
Tabel 2: volume en dikte van de gel.
Aanvullend bestand: MATLAB-routines. Klik hier om dit bestand te bekijken (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Onze groep, evenals anderen, heeft met succes tfm en MSM gebruikt om de invloed van celcelknooppunten in verschillende pathologische en fysiologische cellulaire processen in vitro7,15,18,27 te sonde . Bijvoorbeeld, Hardin et al. presenteerde een zeer inzichtelijke studie die suggereert intercellulaire stress transmissie begeleidt paracellulaire gap vorming in endotheliale cellen15. Hoewel het mogelijk is om de Cx43-gerelateerde wijzigingen te relateren, rapporteren we hier aan de wijzigingen die zijn gerapporteerd door Hardin et al., we zijn niet specifiek gericht op de vorming van paracellulaire kloof in dit protocol. Hier presenteerden we een op mechanica gebaseerd protocol om specifiek de gap junction Cx43 te targeten en de invloed ervan op endotheliale biomechanica te onderzoeken.
Om dit protocol succesvol te maken, waren er een paar uitdagingen die we moesten overwinnen, waarvan sommige zouden kunnen optreden als andere onderzoekers besluiten om ons protocol voor soortgelijke studies aan te nemen. Een grote uitdaging was het vinden van een optimaal Chalcon doseringsbereik waarbij Cx43 expressie geremd zou kunnen worden, terwijl tegelijkertijd onze endotheelmonolagen intact blijven. De IC50 van chalcon voor huvecs is eerder gerapporteerd als 10,01 μg/ml28. Toen we echter onze huvec-monolagen bloot stelden aan meerdere Chalcon concentraties variërend van 0,2 μg/ml tot 20 μg/ml, vonden we een Chalcon concentratie van 2 μg/ml om de hoogste concentratie te zijn die onze monolagen konden weerstaan terwijl ze nog steeds Confluent bleven. Een confluente monolaag was essentieel voor dit protocol, omdat een monolaag nodig is om intercellulaire spanningen te meten met MSM. Vervolgens hebben we een immunofluorescentietest uitgevoerd om te bepalen of de geselecteerde doses van chalcon met succes Cx43 structuur of schijnbare uitdrukking verstoorde. Ons resultaat toonde aan dat terwijl verstoring van Cx43 structuur met 0,2 μg/ml Chalcon visueel moeilijk te onderscheiden van de controle was, cellen behandeld met 2 μg/ml Chalcon leek een schijnbare verschil in Cx43 structuur en potentieel uitdrukking ( Figuur 6D en aanvullend figuur 1). Bovendien toonden onze resultaten aan dat Cx43 verstoring inderdaad de endotheliale biomechanica beïnvloedt door het verminderen van de tracties en intercellulaire spanningen bij de hoogste concentratie. Deze bevindingen zijn in overeenstemming met bazellieres et al. wie toonde geluids dempings van Cx43 met siRNA om ook het verminderen van tracties en intercellulaire spanningen, maar in een blad van epitheelcellen27. Hoewel onze resultaten in overeenstemming zijn met anderen, moet worden opgemerkt dat het molecuul dat we gebruikten om Cx43 expressie te verstoren, chalcone, ook is gesuggereerd om de activering van MAPK en NFkB te beïnvloeden naast Cx43 verstoring26. Daarom, omdat we niet specifiek kijken naar de bovengenoemde moleculen of de bijbehorende trajecten, we kunnen niet uit te buiten de invloed van een potentiële MAPK en nfkb perturbatie kan hebben op endotheliale biomechanica ook.
Een ander belangrijk punt Vermeldenswaard is dat de herstelde tractie en intercellulaire spanningen zijn 2D in de natuur en negeren buiten het vliegtuig (z-richting) tractie en intercellulaire spanningen12,13. Hoewel er een kleine fout is in verband met het negeren van buiten het vlak spanningen, deze fout is verwaarloosbaar13. Bovendien is de laterale afmeting van de monolaag voldoende groot (1,25 mm) ten opzichte van de monolaag hoogte (~ 5 μm), zodat we geen significante verplaatsingen in de z-richting verwachten. Bovendien biedt de MSM-berekening een fout op de monolaag-grens12,13. Tambe et al. experimentaal toonde echter aan dat fouten het hoogst zijn bij de optische randen (d.w.z. de monolaag-grens) en vervalt snel uit grens randen13. We voeren micropatterning uit en berekenen vervolgens de intercellulaire spanningen van de gehele monolaag om grens fouten te voorkomen die tijdens de berekening van de intercellulaire stress kunnen optreden.
Monolayer stress microscopie wordt gebruikt in dit protocol als de intercellulaire stress-informatie opgeleverd van deze methode is essentieel om een vollediger begrip van de rol kloof splitsing verstoring heeft op endotheliale biomechanica. Bovendien, intercellulaire spanningen zijn gesuggereerd om belangrijk te zijn in de endotheliale barrièrefunctie, zoals gesuggereerd door Hardin et al.15 en Krishnan et al.17, bijvoorbeeld. Bovendien, terwijl de intercellulaire spanningen werden gecorreleerd aan tractie in de representatieve gegevens die hier gepresenteerd, dit is niet altijd het geval afhankelijk van de stimulus. In de studie van Steward et al., bijvoorbeeld, werd aangetoond dat endotheliale intercellulaire spanningen onder vloeistof afschuiving afnemen, terwijl tracties relatief onveranderd7bleven. Ook is het protocol dat we hier presenteren niet toegestaan voor de gelijktijdige meting van door cellen afgeleide mechanische krachten en kleuring van knooppunten en focale verklevingen, maar een dergelijke toevoeging zou gratis zijn voor dit protocol. Tot slot beschrijft het protocol dat we hier presenteren een op mechanica gebaseerde methode om de invloed Cx43 heeft uitsluitend op endotheliale biomechanica, met name endotheliale celafgeleide krachten, te onderzoeken. Wij geloven dat ons op mechanica gebaseerde protocol kan worden gebruikt in combinatie met bestaande biologisch gebaseerde protocollen om echt baanbrekend werk te leveren in het veld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de University of Central Florida start-up funds en het National Heart, Lung en Blood Institute van het National Institute of Health under Award K25HL132098.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 mm coverslip | ThermoFisher | 18CIR-1 | Essential to flatten polyacrylamide gels |
| 2% bis-acrylamide | BIO-RAD | 1610143 | Component of polyacrylamide gel |
| 2′,5′-Dihydroxychalcone | SIGMA | IDF00046 | To disrupt Cx43 structure |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | SIGMA | 2530-85-0 | Stock solution to make bind silane mixture with acetic acid and ultra-pure water |
| 40% Acrylamide | BIO-RAD | 1610140 | Component of polyacrylamide gel |
| Acetic acid | Fisher-Sceintific | 64-19-7 | Essential to make bind saline solution |
| Alexa Fluro 488 goat anti-mouse IgG; | ThermoFisher | Catalog # A-11001 | Secondary antibody |
| Ammonium persulfate | BIO-RAD | 1610700 | Polyacrylamide gel polymerizing agent |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | SIGMA | 9048-46-8 | To make blocking solution |
| Bovine Type I Atelo-Collagen Solution, 3 mg/mL, 100 mL | Advance Biomatrix | 5005-100ML | Use as a extracellular matrix |
| Corning Cell Culture Phosphate Buffered Saline (1x) | Fisher-Sceintific | 21040CV | Buffer Saline needed for cell culture |
| Dimethyl Sulfoxide, Fisher BioReagents | Fisher-Sceintific | 67-68-5 | To dissolve chalcone and make stock solution |
| Fluoromount-G with DAPI | ThermoFisher | 00-4959-52 | Mounting medium for immunostaing used to stain for DAPI |
| Fluroscent microsphere Carboxylate-modified beads | ThermoFisher | F8812 | 0.5 micron carboxylate-modified beads (red), 2% solids |
| HEPES buffer solution 1 M | SIGMA | 7365-45-9 | Essential to |
| LVES | ThermoFisher | A1460801 | Essential HUEVC media 200 supplement |
| Medium 200 | ThermoFisher | M200500 | Essential media for HUVEC cell culture |
| Mouse monoclonal Cx43 antibody (CX - 1B1) | ThermoFisher | Catalog #13-8300 | Primary antibody for Cx43 |
| Petri dish (35 mm dia) | CellVis | D35-20-1.5H | 35 mm petri dish with a 20 mm center well |
| Sulfo-SANPAH Crosslinker 100 mg | Proteochem | 102568-43-4 | Essential to functionalize polyacrylamide gel surface |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | DOW corning | 2646340 | Silicon elastomer with curing agent to make PDMS |
| TEMED | BIO-RAD | 1610801 | Polyacrylamide gel polymerizing agent |
| Triton-X 100 | SIGMA | 9002-93-1 | To permeabilize cells |
| Trypsin -EDTA | ThermoFisher | 25300054 | Used to detach cells |
References
- Mammoto, T., Mammoto, A., Ingber, D. E. Mechanobiology and developmental control. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 27-61 (2013).
- Schwarz, U. S., Soine, J. R. Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances. Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (11 Pt B), 3095-3104 (2015).
- Style, R. W., et al. Traction force microscopy in physics and biology. Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).
- Colin-York, H., et al. Super-Resolved Traction Force Microscopy (STFM). Nano Letters. 16 (4), 2633-2638 (2016).
- Zimmermann, J., et al. Intercellular stress reconstitution from traction force data. Biophysical Journal. 107 (3), 548-554 (2014).
- Islam, M. M. Recent Advances in Experimental Methods of Cellular Force Sensing. Biomedical Journal of Science & Technical Research. 17 (3), (2019).
- Steward Jr, R., Tambe, D., Hardin, C. C., Krishnan, R., Fredberg, J. J. Fluid shear, intercellular stress, and endothelial cell alignment. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 308 (8), C657-C664 (2015).
- Trepat, X., et al. Physical forces during collective cell migration. Nature Physics. 5, 426-430 (2009).
- Li, Z., et al. Cellular traction forces: a useful parameter in cancer research. Nanoscale. 9 (48), 19039-19044 (2017).
- Brugues, A., et al. Forces driving epithelial wound healing. Nature Physics. 10 (9), 683-690 (2014).
- Pasqualini, F. S., et al. Traction force microscopy of engineered cardiac tissues. PLoS One. 13 (3), e0194706 (2018).
- Tambe, D. T., et al. Collective cell guidance by cooperative intercellular forces. Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).
- Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PLoS One. 8 (2), e55172 (2013).
- Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), C595-C605 (2002).
- Hardin, C. C., et al. Long-range stress transmission guides endothelial gap formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 749-754 (2018).
- Cho, Y., Son, M., Jeong, H., Shin, J. H. Electric field-induced migration and intercellular stress alignment in a collective epithelial monolayer. Molecular Biology of the Cell. 29 (19), 2292-2302 (2018).
- Krishnan, R., et al. Substrate stiffening promotes endothelial monolayer disruption through enhanced physical forces. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), C146-C154 (2011).
- Islam, M. M., Steward, R. L. Probing Endothelial Cell Mechanics through Connexin 43 Disruption. Experimental Mechanics. 59, 327 (2019).
- Figueroa, X. F., Duling, B. R. Gap junctions in the control of vascular function. Antioxidants & Redox Signaling. 11 (2), 251-266 (2009).
- Nielsen, M. S., et al. Gap junctions. Comprehensive Physiology. 2 (3), 1981-2035 (2012).
- Sohl, G., Willecke, K. Gap junctions and the connexin protein family. Cardiovascular Research. 62 (2), 228-232 (2004).
- Haefliger, J. A., Nicod, P., Meda, P. Contribution of connexins to the function of the vascular wall. Cardiovascular Research. 62 (2), 345-356 (2004).
- Marquez-Rosado, L., Solan, J. L., Dunn, C. A., Norris, R. P., Lampe, P. D. Connexin43 phosphorylation in brain, cardiac, endothelial and epithelial tissues. Biochimica et Biophysica Acta. 1818 (8), 1985-1992 (2012).
- Liao, Y., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. Endothelial cell-specific knockout of connexin 43 causes hypotension and bradycardia in mice. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (17), 9989-9994 (2001).
- Walker, D. L., Vacha, S. J., Kirby, M. L., Lo, C. W. Connexin43 deficiency causes dysregulation of coronary vasculogenesis. Developmental Biology. 284 (2), 479-498 (2005).
- Lee, Y. N., et al. 2',5'-Dihydroxychalcone down-regulates endothelial connexin43 gap junctions and affects MAP kinase activation. Toxicology. 179 (1-2), 51-60 (2002).
- Bazellieres, E., et al. Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome. Nature Cell Biology. 17 (4), 409-420 (2015).
- Nam, N. H., et al. Synthesis and cytotoxicity of 2,5-dihydroxychalcones and related compounds. Archives of Pharmacal Research. 27 (6), 581-588 (2004).
