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Biochemistry

Störende Endothelial Biomechanik über Connexin 43 Strukturelle Störung

doi: 10.3791/60034 Published: October 4, 2019

Summary

Hier stellen wir ein mechanikbasiertes Protokoll vor, um den Spaltknoten-Anschluss 43 zu stören und die daraus resultierenden Auswirkungen auf die endotheliale Biomechanik durch Beobachtung von Traktionen und interzellulären Spannungen zu messen.

Abstract

Endothelzellen wurden etabliert, um interzelluläre Spannungen und Traktionen zu erzeugen, aber die Rolle, die Lückenknoten bei endothelialen interzellulären Spannungen und Traktionsgenerierung spielen, ist derzeit nicht bekannt. Daher stellen wir hier ein mechanikbasiertes Protokoll vor, um den Einfluss des Spaltknotens Connexin 43 (Cx43) auf die endotheliale Biomechanik zu untersuchen, indem konfluente endotheliale Monolayer einem bekannten Cx43-Inhibitor 2,5-Dihydroxychalcon (Chalcon) und Messung der Auswirkungen dieses Inhibitors auf Traktionen und interzelluläre Spannungen. Wir präsentieren repräsentative Ergebnisse, die eine Abnahme sowohl der Traktionen als auch der interzellulären Spannungen unter einer hohen Chalcon-Dosierung (2 g/ml) im Vergleich zur Kontrolle zeigen. Dieses Protokoll kann nicht nur auf Cx43 angewendet werden, sondern auch auf andere Spaltknoten, vorausgesetzt, der entsprechende Inhibitor wird verwendet. Wir glauben, dass dieses Protokoll in den Bereichen kardiovaskuläre und mechanobiologische Forschung nützlich sein wird.

Introduction

Das Feld, das sich auf die Untersuchung der Auswirkungen physikalischer Kräfte und mechanischer Eigenschaften auf die Zell- und Gewebephysiologie und Pathologie bezieht, ist als Mechanobiologie1bekannt. Ein paar nützliche Techniken, die in der Mechanobiologie verwendet wurden, sind Monolayer-Stressmikroskopie und Traktionskraftmikroskopie. Die Traktionskraftmikroskopie ermöglicht die Berechnung von Traktionen, die an der Zell-Substrat-Schnittstelle erzeugt werden, während die monoschichtige Spannungsmikroskopie die Berechnung interzellulärer Spannungen ermöglicht, die zwischen benachbarten Zellen innerhalb einer Monoschicht erzeugt werden2 ,3,4,5,6. Die Ergebnisse früherer Methoden deuten darauf hin, dass zellabgeleitete mechanische Spannungen eine entscheidende Rolle bei der Bestimmung des Schicksals einer Vielzahl zellulärer Prozessespielen 3,4,5. Wenn z. B. eine externe mechanische Kraft ausgesetzt wird, kann eine Gruppe von Zellen, die als Kollektiv migrieren, ihre Morphologie verändern und ihre Form polarisieren, um die Richtung der angewendeten Kraft auszurichten und zu migrieren, indem sie teilweise Traktionen erzeugen7, 8. Traktionen bieten eine Metrik, die zur Bewertung der Zellkontraktilität verwendet werden kann und mittels Traktionskraftmikroskopie (TFM) berechnet wird. Die Traktionskraftmikroskopie (TFM) beginnt mit der Bestimmung zellinduzierter Substratverformungen, gefolgt von der Berechnung des Traktionsfeldes unter Verwendung eines mathematisch strengen, mechanikbasierten Berechnungsansatzes. Da die Fähigkeit, Traktionen zu berechnen, schon seit geraumer Zeit besteht, haben Forscher TFM genutzt, um die Auswirkungen von Traktionen auf eine Vielzahl von Prozessen zu offenbaren, einschließlich Krebs9,Wundheilung10 und Bewertung von technischen Herz Gewebe11.

Die Implementierung von TFM und MSM kann in drei wesentliche Schritte unterteilt werden, die in der folgenden Reihenfolge ausgeführt werden müssen: Erstens werden die von den Zellen erzeugten Hydrogelverformungen bestimmt; zweitens werden Traktionen aus Hydrogelverformungen zurückgewonnen; und drittens wird ein Finite-Elemente-Ansatz verwendet, um normale und scherende interzelluläre Spannungen innerhalb der gesamten Monolayer zu berechnen. Um Gelverschiebungen zu berechnen, wurden Fluoreszenzperlenbilder mit Zellen mit dem Referenzperlenbild (ohne Zellen) verglichen, indem eine benutzerdefinierte Partikelbild-Velocimetrie (PIV)-Routine verwendet wurde. Die Kreuzkorrelationsfenstergröße und -überlappung für die PIV-Analyse wurden für 32 x 32 Pixel bzw. 0,5 ausgewählt. Zu diesem Zeitpunkt wurden Pixelverschiebungen in Mikrometer umgewandelt, indem sie mit einem Pixel-zu-Mikron-Umrechnungsfaktor multipliziert wurden (für unser Mikroskop beträgt dieser Umrechnungsfaktor 0,65), um Verschiebungen in der Ebene zu erhalten. Fehler, die mit dem Ignorieren von Verschiebungen a-ebener Weise verbunden sind, sind vernachlässigbar12,13. Nach der Berechnung von Gelverschiebungen gibt es zwei Arten von Traktionsmessungen, die verwendet werden können, eingeschränkte Traktionen und uneingeschränkte Traktionen8,14. Unbeschränkte Traktionen stellen das Traktionsfeld für das gesamte Sichtfeld (einschließlich Regionen mit und ohne Zellen) bereit, während eingeschränkte Traktionen das Traktionsfeld nur für Regionen bereitstellen, die Zellen14enthalten. Anschließend werden interzelluläre Spannungen mittels Monolayer-Stressmikroskopie (MSM) berechnet, was eine Erweiterung der Traktionskraftmikroskopie darstellt. Die Implementierung von MSM basiert auf der Annahme, dass lokale Traktionen, die von einer Monoschicht von Zellen an der Zell-Substrat-Schnittstelle ausgeübt werden, durch mechanische Kräfte ausgeglichen werden müssen, die zwischen den Zellen an der Zell-Zell-Schnittstelle übertragen werden, wie es in Newtons Gesetzen gefordert wird7 ,12,13. Eine wichtige Annahme ist dabei, dass die Zellmonoschicht als dünnes elastisches Blatt behandelt werden kann, da die Traktionsverteilung in der Monoschicht bekannt ist und die Kraftbalance nicht von den Zellmaterialeigenschaften abhängt. Eine weitere wichtige Annahme ist, dass die Zugkräfte durch lokale interzelluläre Spannungen innerhalb des optischen Sichtfeldes (innerhalb der Monoschicht) ausgeglichen werden und der Einfluss dieses Kraftgleichgewichts im distalen Bereich (außerhalb der Monolayer) minimal ist13. Daher sind die Randbedingungen, die durch interzelluläre Spannungen, Verschiebungen oder eine Kombination aus beidem an der Einschichtgrenze definiert sind, entscheidend für die Ausführung von MSM13. Unter Berücksichtigung der oben genannten Informationen verwenden wir MSM, um eine Finite-Elemente-Analyse (FEM) durchzuführen, um die maximale Hauptspannung(max.) und die minimale Hauptspannung(min) durch Drehen der Spannungsebene an jedem Punkt innerhalb des Monolayer. Diese Hauptspannungen werden anschließend verwendet, um die durchschnittliche durchschnittliche normale interzelluläre Spannung von 2D [(max +min) /2] und die maximale 2D-Scherspannung[(max -min) /2] innerhalb der gesamten Monolayer zu berechnen. 12,13. Dieses Verfahren wird von Tambe et al.12,13 näher beschrieben.

Die Monolayer-Stressmikroskopie (MSM) ermöglicht die Berechnung von zellzellulären Spannungen, die in einer Monoschicht6,7,8,12,13erzeugt werden. Diese interzellulären Spannungen wurden vorgeschlagen, wichtig für Gewebewachstum und -reparatur, Wundheilung und Krebsmetastasen12,15,16,17zu sein. Darüber hinaus wurden interzelluläre Spannungen vorgeschlagen, auch bei der Endothelzellmigration und endotheliale Barrierefunktion17,18wichtig zu sein. Während Zell-Zell-Kreuzungen wie enge Kreuzungen und Adhäsivverbindungen beide als eine entscheidende Rolle bei der erzeugung und Transmission von endothelialen interzellulären Spannungen vorgeschlagen wurden, bleibt die Rolle von Spaltknoten schwer fassbar. Lückenknoten verbinden benachbarte Zellen physisch und bieten einen Weg für elektrischen Strom und Moleküle (<1 KDa), um zwischen benachbarten Zellen19,20,21zu passieren. Obwohl Endothelzellen Cx37, Cx40 und Cx43 Spaltknoten19,22ausdrücken, ist Cx43 wohl die wichtigste in Bezug auf die Krankheitsprogression23. Ein Beweis für die Bedeutung von Cx43 kann in der Tatsache gefunden werden, dass die genetische Deletion von Cx43 bei Mäusen zu Hypotonie24 führt und nachteilige Auswirkungen auf die Angiogenese25hat. Darüber hinaus wurde cx43 als wichtig für die Zellmigration und Proliferation und im Fortschreiten der Arteriosklerose18,22,23,24,25 .

In diesem Protokoll untersuchten wir mit TFM und MSM, ob Traktion und interzelluläre Spannungserzeugung innerhalb der konfluenten, endotheliaalen Monolayer durch die Störung der endotheliale Spaltkreuzung Cx43 beeinträchtigt würden. Wir störten Cx43 mit 2,5-Dihydroxychalcon (Chalcon), einem Molekül, das dokumentiert ist, um die Cx43-Expression26zu hemmen. Chalcone wurde verwendet, um Cx43 anstelle von siRNA zu stören, da Chalcone zuvor von Lee et al. berichtet wurde, um cx43 Expression26zu stören. Darüber hinaus waren wir besonders an chalcones Einfluss auf das Endothel interessiert, da es auch als entzündungshemmende und thromboplättliche Verbindung berichtet wurde, die potenziell zur Vorbeugung und Behandlung verschiedener Pathologien26. Chalcone-Behandlungen wurden eine Stunde nach Beginn des Experiments durchgeführt, mit Chalcone behandelte Monolayer wurden insgesamt sechs Stunden lang abgebildet, und die Bildverarbeitung wurde mit einem kundenspezifischen MATLAB-Code durchgeführt, um Traktionen und anschließend interzelluläre Betont. Unsere Ergebnisse zeigten eine allgemeine Abnahme der Traktionen und interzellulären Spannungen, was darauf hindeutet, dass Cx43 eine Schlüsselrolle in der endothelialen Biomechanik spielt.

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Protocol

1. Herstellung von Polyacrylamid (PA) Gelen

  1. Zubereitung der Petrischale
    1. Bereiten Sie die Silanlösung bereit, indem Sie 200 ml Reinstwasser mit 80 l Essigsäure und 50 l 3-(Trimethoxysilyl)propylmethacrylat mischen. Bind Silan ist eine Lösung zur Funktionalisierung der Glasboden Petrischale Oberfläche für Hydrogel-Befestigung.
    2. Die Bindesilanlösung mindestens 1 h auf einer Rührplatte rühren.
    3. Behandeln Sie die Mitte gut der Petrischale mit Bindung Silanlösung für 45 min.
    4. Entfernen Sie die Silanlösung binden und spülen Sie die Petrischale mit ultrareinem Wasser 2x-3x ab.
    5. Trocknen Sie die Petrischale Oberfläche und lagern Sie bei Raumtemperatur für die zukünftige Verwendung.
  2. Aufbereitung einer Hydrogellösung
    1. Mischen Sie ultrareines Wasser, 40% Acrylamid und 2% Bisacrylamid in einem 15 ml Zentrifugenrohr gemäß Tabelle 1.
    2. Fügen Sie der Hydrogellösung 80 L fluoreszierende Perlen hinzu.
    3. Schütteln Sie das Rohr vorsichtig, um Perlen mit der Gellösung zu mischen.
    4. Ziehen Sie die Rohrkappe am Zentrifugenrohr leicht fest und legen Sie sie in eine Vakuumkammer.
    5. Entgasen Sie die Gellösung für mindestens 45 min in der Vakuumkammer.
  3. Hydrogelpolymerisation
    1. Zuerst 75 l 10% Ammoniumpersulfat (in reinem Reinstwasser gelöst) und dann 8 l TEMED (N,N,N',N'-Tetramethylethan-1,2-diamine) in die Hydrogellösung geben.
    2. Platzieren Sie 24 L Hydrogellösung in der Mitte der Petrischale (siehe Tabelle 2).
    3. Verwenden Sie einen 18 mm Deckelschlupf, um das Hydrogel abzuflachen. Dadurch wird eine Höhe von 100 m erreicht.
    4. Warten Sie mindestens 30-40 min auf die Gelpolymerisation.
    5. Tauchen Sie das polymerisierte Hydrogel in reines Reinstwasser ein, um eine Gelaustrocknung zu verhindern.
    6. Bedecken Sie die Petrischale mit Aluminiumfolie, um das Photobleichen von fluoreszierenden Perlen zu verhindern und bei 4 °C aufzubewahren.
      HINWEIS: Hydrogele können einen Zeitraum von bis zu 3 Monaten gelagert werden, aber es wird vorgeschlagen, dass diese Gele nicht länger als 1 Woche nach der Herstellung verwendet werden, um die besten Ergebnisse zu erzielen.

2. Zellkultur

  1. Kultur menschliche Nabelvenen-Endothelzellen (HUVECs) im Zellkulturmedium 200 (siehe Materialtabelle) ergänzt mit 1% Penicillin-Streptomycin auf 0,1% gelatinebeschichteten Kolben bei 37 °C und 5%CO2.

3. Mikromuster Schablonenvorbereitung

  1. Eine dünne Schicht Aus polydimethylsiloxan (PDMS) in einer 100 mm Petrischale aushärten, indem sie die Silikonbasis mit dem Silikonhärtungsmittel im Verhältnis 20:1 (Basis: Härtungsmittel) mischen.
    HINWEIS: Es ist möglich, andere Basis-zu-Härtungsmittel-Verhältnisse zu verwenden (z. B. 10:1 oder 30:1). Ein niedrigeres Verhältnis zwischen Basis zu Härtungsmittel ergibt jedoch ein steiferes Muster, während ein höheres Verhältnis zwischen Basis- und Härtungsmittel zu einem weicheren Muster führt.
  2. Bereiten Sie eine 20:1 (Base:curing Agent) PDMS-Lösung vor und mischen Sie sie sorgfältig in einem 50 ml Zentrifugenrohr. Invertieren Sie das Rohr auf den Kopf und schütteln Sie kräftig mehrmals, um eine ordnungsgemäße Durchmischung der PDMS-Lösung zu gewährleisten, da eine ungleichmäßige Vermischung zu einer unvollständigen Polymerisation führt.
  3. Entfernen Sie Blasen, die aus dem obigen Schritt durch Zentrifugieren der PDMS-Lösung für 1 min bei 190 x geingeführt wurden.
  4. 5-6 ml PDMS-Lösung in die Mitte einer 100 mm Petrischale gießen und die Schale aufregen, bis die PDMS-Lösung die gesamte Petrischalenoberfläche abdeckt.
  5. Härten Sie die PDMS-Lösung über Nacht bei 50-60 °C. PDMS kann auch bei Raumtemperatur ausgehärtet werden.
  6. Entfernen Sie eine kreisförmige PDMS-Schablone mit 16 mm Durchmesser mit einem Lochstanzer.
  7. Verwenden Sie einen Biopsiespunsch, um kleine Löcher in der PDMS-Schablone zu erstellen. Dieses Protokoll verwendet einen Biopsie-Punch mit einem Durchmesser von 1,25 mm.
  8. Sterilisieren Sie PDMS-Schablonen, indem Sie sie zunächst in 70% Ethanol für 2-3 min tauchen, überschüssiges Ethanol absanieren und dann 5 min unter UV-Licht stellen.

4. Kollagen-I Hydrogelbeschichtung

  1. Entfernen Sie den Deckelrutsch vom Hydrogel und saugen Sie überschüssige Flüssigkeit an.
  2. Legen Sie die PDMS-Schablone auf die Hydrogeloberfläche.
    HINWEIS: Pinzette kann verwendet werden, um leichten Druck auf PDMS Schablone anzuwenden, um eine wasserdichte Abdichtung zwischen der PDMS-Schablone und der Hydrogeloberfläche zu gewährleisten. Unsere PDMS-Schablonen sind wasserdicht und verhindern so den Wasserzugang zwischen der Gel-Oberfläche und der PDMS-Schablonenbodenoberfläche. Auch die Hydrogelsteifigkeit muss in Bezug auf die PDMS-Steifigkeit nicht angepasst werden.
  3. Die Hydrogeloberfläche mit Sulfosuccinimidyl-6-(4-Azido-2-nitrophenylamino)-Hexanoat (Sulfo-SANPAH) in einer 0,1 M HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinesulfonsäure) gelösten Pufferlösung in einer Konzentration von 1 : 1000 Lampe (Leistung 36 W) für 8 min.
  4. Die überschüssige Sulfo-SANPAH- und HEPES-Lösung ansaugen und das Hydrogel zweimal mit 0,1 M HEPES abspülen, gefolgt von zwei zusätzlichen Spülungen mit reinem Reinen.
  5. Überschüssiges reines Wasser ansaugen und Hydrogele mit 0,1 mg/ml Kollagen-I über Nacht bei 4 °C beschichten.
  6. Bedecken Sie die Gerichte und schützen Sie fluoreszierende Perlen vor Photobleichmittel.
    HINWEIS: PDMS-Schablonen werden verwendet, um mikrogemusterte Monolayer zu erstellen. Mikrogemusterte Monolayer werden verwendet, da sie es ermöglichen, mehrere Monolayer derselben Geometrie und Abmessungen gleichzeitig während jedes Experiments zu beobachten. Sollten jedoch Mikromuster nicht gewünscht werden, können die oben genannten Schritte mit Ausnahme von Schritt 4.2 befolgt werden.

5. Erstellen von HUVEC-Monolayern auf Hydrogelen

  1. Verwenden Sie 1x Trypsin, um Zellen von Gewebekulturkolben für 3-5 min im Inkubator zu lösen.
  2. Fügen Sie der Trypsin-Lösung nach der Trypsinisierung Zellkulturmedien hinzu und fügen Sie das 15 ml Zentrifugenrohr hinzu.
  3. Zentrifugieren Sie die Zelllösung für 3 min bei 1710 x g. Ein kleines, weißes Zellpellet sollte an der Unterseite des Zentrifugenrohrs sichtbar sein.
  4. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie Zellen in Medien auf eine Konzentration von 50 x 104 Zellen/ml aus.
  5. Entfernen Sie Kollagen-I vom Hydrogel und spülen Sie 1x mit PBS ab.
  6. Fügen Sie 75 x 103 Zellen an die Oberseite der PDMS-Schablone und lassen Sie Zellen an der Hydrogeloberfläche für mindestens 1 h im Inkubator bei 37 °C und 5%CO2anhaften.
  7. Entfernen Sie die PDMS-Schablone, und fügen Sie der Petrischale mindestens 2 ML Medien hinzu. Tauchen Sie die PDMS-Schablone in 10x Trypsin ein, um alle angeschlossenen Zellen zu entfernen und durch Sprühen mit 70% Ethanol zu sterilisieren und dann 5 min unter das UV-Licht zu stellen.
  8. Legen Sie die Petrischale in den Inkubator und warten Sie mindestens 36 h oder bis eine konfluente Monoschicht beobachtet wird.

6. 2,5 Dihydroxychalcon-Behandlung bei Cx43-Störung

  1. 2,5 Dihydroxychalcon (Chalcon) in Dimethylsulfoxid (DMSO) auflösen, um eine 0,1875 mg/ml-Stammlösung herzustellen.
  2. Verdünnen Sie die Stammlösung mit Zellkulturmedien, um eine niedrige Chalconkonzentration (0,2 g/ml) aliquot und eine hohe Chalconkonzentration (2 g/ml) aliquot zu bilden.

7. Datenerfassung

  1. Suchen Sie Zellinseln mit einem Mikroskop.
  2. Erfassen Sie Phasenkontrast- und Perlenbilder zur Bildzellmorphologie bzw. Hydrogelverschiebungen.
    HINWEIS: Dieses Protokoll verwendete ein 10-faches Ziel für die Datenerfassung.
  3. Am Ende des Experiments lösen Sie Zellen mit 10x Trypsin und erfassen Sie ein Bild der Geloberfläche ohne Zellen (Referenzbild).

8. Immunostaining

  1. Monolayer mit 4% Formaldehyd fixieren und 15 min bei 37 °C brüten.
  2. Entfernen Sie 4% Formaldehyd und fügen Sie 0,2% Triton X-100 für 5 min bei 37 °C, um Zellen zu permeabilisieren.
  3. Entfernen Sie 0.2% Triton X-100 und spülen Monolayer mit PBS 2x-3x.
  4. Cover Monolayer mit 2% Rinderserumalbumin (BSA) Lösung für 45 min bei 37 °C.
  5. Entfernen Sie die 2% BSA-Lösung und spülen Sie Monolayer mit PBS 2x-3x.
  6. Primären Cx43-Antikörper in einer Konzentration von 1:400 in die Probe geben und über Nacht bei 4 °C inkubieren.
  7. Entfernen Sie primärer Antikörper und spülen Sie die Probe mit PBS 2x-3x.
  8. Sekundärantikörper in einer Konzentration von 3:200 hinzufügen und 2 h bei 37 °C brüten.
    HINWEIS: Proben sollten abgedeckt werden, um Photobleichungen zu verhindern.
  9. Sekundären Antikörper entfernen und mit PBS 2x-3x ausspülen.
  10. Abdeckmuster mit Montagemedium (Fluromount-G DAPI) und Dichtung mit 18 mm Abdeckschlupf.

9. Implementierung der Traktionskraftmikroskopie (TFM) und der Monolayer-Stressmikroskopie (MSM)

  1. Hydrogel-Deformationsberechnung
    HINWEIS: Im Folgenden wird eine Schritt-für-Schritt-Verschiebungsberechnungsprozedur mit MATLAB beschrieben.
    1. Öffnen Sie die Hauptdatei traction.m in MATLAB (für alle MATLAB-Routinen siehe Ergänzende Materialien).
      HINWEIS: Befolgen Sie die Anweisungen im Code, um das MATLAB-Verzeichnis festzulegen.
    2. Definieren Sie die folgenden Variablen: Bildformat, Pixel-zu-Mikron-Konvertierung, Young-Modul, Poissons Verhältnis und Mikroskopobjektiv.
    3. Suchen Sie die Perle, das Trypsin-Bild und das Phasenbild mit der OpenFiles-Unterroutine.
      HINWEIS: Bei großen Datensätzen ist es am besten, Dateien in sequenzieller Reihenfolge zu benennen. Beispielsweise sollten Dateien den Namen "filename1.tif", "filename2.tif" usw. haben.
    4. Definieren Sie einen quadratischen ROI (Interessenbereich) um die Zellmonolayer, und führen Sie die Cell_cropper-Unterroutine aus, um das Originalbild zuzuschneiden.
    5. Führen Sie die Unterroutine displacement_finder aus, um Verschiebungen zu berechnen.
    6. Führen Sie die Dedrift-Unterroutine aus, um zusätzliche nichtzelluläre Verschiebungen zu entfernen, die auf die Drift des Mikroskopstadiums zurückzuführen sein können.
  2. Berechnung der Traktionen
    HINWEIS: Hier werden uneingeschränkte Traktionen mit unserer kundenspezifischen MATLAB-Routine berechnet. Schritt für Schritt wird die Traktionsberechnung mit der oben erwähnten MATLAB-Routine unten angegeben.
    1. Definieren Sie die folgenden Variablen innerhalb der traction.m-Routine: Randbedingung, Geldicke, Gelhöhe und Dedrift.
    2. Führen Sie die Unterroutine traction_finder aus, um Traktionen zu berechnen, und führen Sie die Unterroutine plot_traction aus, um Traktionen zu zeichnen. Alle Traktionen in x-Richtung (Tx) und y-Richtung (Ty) zusammen mit den entsprechenden Pixelpositionen finden Sie in einer traction.dat-Datei, die vom Code generiert wird.
  3. Berechnung interzellulärer Spannungen
    HINWEIS: Schritt für Schritt Anweisungen für die interzelluläre Spannungsberechnung mit der matLAB-Routine, die bereits erwähnt wurde, sind unten aufgeführt.
    1. Führen Sie die Unterroutine mark_circular_domain aus, um die Einlayer-Grenze anzugeben. Diese Routine fordert alle zugeschnittenen Phasenbilder sequenziell auf, damit der Benutzer manuell eine Grenze um die Monolayer zeichnen kann. Notieren Sie sich die im Befehlsfenster generierten nXPts und verwenden Sie sie später als Rasterparameter in der X-Achse und der Y-Achse für die FEM-Analyse (siehe Schritt 9.3.2).
    2. Führen Sie Run_StressCode aus, um interzelluläre Spannungen zu berechnen. Diese Unterroutine liest direkt Parameter aus der Datei "model.in" und führt "island.exe" aus, um eine FEM-Analyse durchzuführen. Stellen Sie vor dem Ausführen dieser Routine sicher, dass alle Parameter in der model.in Datei, d. h. Rasterparameter in X und Y, Pixel-zu-Mikron-Konvertierung, Youngs Gelmodul, Poissons Verhältnis, Monolayer-Höhe und Monolayer-Muster (Streifen oder Loch), bearbeitet werden. richtig.
    3. Zeichnen Sie alle FEM-Ergebnisse mit der Unterroutine plot_FEM_results.
      HINWEIS: Alle generierten Ergebnisse werden automatisch im Ordner Ergebnisse im Verzeichnis MATLAB gespeichert.

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Representative Results

Phasenkontrastbilder der Steuerung, 0,2 g/ml und 2 g/ml-Chalcone-behandelte Monolayer wurden 30 Minuten vor der Chalcon-Behandlung (Abbildung 1A-C) und 2 Stunden nach der Chalcon-Behandlung (Abbildung 1D-F) aufgenommen. Es wurden zellinduzierte Perlenverschiebungen (m) beobachtet, die sowohl bei niedrig dosierten Chalcone- als auch bei hochdosierten Chalcon-Bedingungen abnehmen (Abbildung 2E,F) im Vergleich zur Kontroll-HUVEC-Monolayer (Abbildung 2D). Vor der Chalcone-Behandlung lagen die Rms-Traktionen für alle Bedingungen bei etwa 51 x 8 Pa (Abbildung 3A-C). Nach der Chalcone-Behandlung gab es eine geringfügige Zunahme der rms-Traktionen auf 59 x 11 Pa in einem niedrig dosierten, mit Chalcon behandelten Monolayern (Abbildung 3E) und eine fast 2-fache Abnahme der rms-Traktionen auf 18 x 2 in hochdosierten, mit Chalcon behandelten Monolayern ( Abbildung 3F) im Vergleich zum Steuerelement (Abbildung 3D). Vor der Chalcone-Behandlung lagen die durchschnittlichen normalen interzellulären Spannungen bei etwa 220 x 66 Pa (Abbildung 4A-C). Nach der Chalcon-Behandlung gab es einen Anstieg der durchschnittlichen normalen interzellulären Spannungsgröße auf 285 x 75 Pa mit niedrig dosierter Chalcon-Behandlung (Abbildung 4E), aber eine signifikante Abnahme der durchschnittlichen normalen interzellulären Spannungsgröße auf 106 4 Pa mit hochdosierter Chalcone-Behandlung (Abbildung 4F) im Vergleich zur Kontrolle der durchschnittlichen normalen interzellulären Spannungen (235 x 18 Pa, Abbildung 4D). Die maximalen interzellulären Spannungen lagen vor der Chalcon-Behandlung bei etwa 241 x 30 Pa (Abbildung 5A-C), aber nach der Chalcon-Behandlung gab es eine Abnahme auf 227 x 20 Pa bei niedriger Chalcone-Konzentration (Abbildung 5E) und eine weitere Abnahme der maximalen interzellulären Spannung auf 91 x 6 Pa bei behandlung mit hoher Chalcone-Konzentration (Abbildung 5F) im Vergleich zur Kontrolle der maximalen interzellulären Spannungen der Scher (270 x 30 Pa, Abbildung 5D) ). Die Analyse von Traktionen und interzellulären Spannungen ist in Abbildung 6A-Cdargestellt. Alle dargestellten Ergebnisse wurden auf statistische Signifikanz getestet (t-Test und Single-Faktor-ANOVA-Test), und in beiden Tests wurden die Ergebnisse als statistisch signifikant(p < 0,05) beim unabhängigen Vergleich der 0,2 g/ml-Chalcone-Konzentration und 2 zur Kontrolle der Bedingungen (ohne Chalcon).

Figure 1
Abbildung 1: Repräsentative Phasenkontrastbilder von HUVEC-Monolayern. Beispielphasenkontrastbilder von Steuer-HUVECs bei 30 min (A) und 2 h (D), Phasenkontrastbilder von HUVECs, die mit 0,2 g/ml-Chalconbei bei 30 min (B) und 2 h (E) behandelt wurden, und Phasenkontrastbilder von HUVECs, die mit 2 g/ml Chalcone behandelt wurden bei 30 min (C) und 2 h (F) des Experimentsbeginns. Die Maßstabsleiste stellt den Monolayerdurchmesser von 1,25 mm dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Abbildung des von HUVEC-Monolayern erzeugten Verschiebungsfeldes. Repräsentative Verschiebungen (m) von Kontroll-HUVECs bei 30 min (A) und 2 h (D), HUVECs, die mit 0,2 g/ml-Chalcon bei 30 min (B) und 2 h (E) behandelt werden, und HUVECs, die mit 2 g/mL-Chalcon bei 30 min (C) und 2 h (F) behandelt werden, Experimentbeginn. Die Maßstabsleiste stellt den Monolayerdurchmesser von 1,25 mm dar. Farbbalken stellen Verschiebungen in m dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: RMS-Traktionsverteilung in HUVEC-Monolayern. Beispiel für rms Traktionen (Pa) der Kontrolle, 0,2 g/ml Chalcone und 2 g/ml Chalcone HUVECs vor der Chalcone-Behandlung (A-C) bzw. nach einer Stunde Chalcon-Behandlung (D-F). Die Maßstabsleiste stellt den Monolayerdurchmesser von 1,25 mm dar. Farbbalken stellen RMS-Traktionen in Pa dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Durchschnittliche normale interzelluläre Spannungsverteilung in HUVEC-Monolayern. Durchschnittliche normale interzelluläre Spannungsverteilung (Pa) der Kontroll-HUVECs bei 30 min (A) und 2 h (D), HUVECs, die mit 0,2 g/mL-Chalcon bei 30 min (B) und 2 h (E) behandelt wurden, und HUVECs, die mit 2 g/ml Chalcon bei 30 min (C) behandelt wurden und 2 h (F). Die Maßstabsleiste stellt den Monolayerdurchmesser von 1,25 mm dar. Farbbalken stellen Spannungen in Pa dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Maximale Shear Interzelluläre Spannungsverteilung in HUVEC-Monolayern. Maximale Scher-Interzelluläre Spannung (Pa) Verteilung der Kontroll-HUVECs bei 30 min (A) und 2 h (D), HUVECs, die mit 0,2 g/mL-Chalcon bei 30 min (B) und 2 h (E) behandelt werden, und HUVECs, die mit 2 g/mL Chalcon bei 30 min (C) und 2 h (F). Die Maßstabsleiste stellt den Monolayerdurchmesser von 1,25 mm dar. Farbbalken stellen Spannungen in Pa dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Vergleich von RMS-Traktionen und interzellulären Spannungen in HUVEC-Monolayern und Auswirkungen der Chalcone-Behandlung auf HUVEC-Spaltknoten Cx43-Strukturen. Diagramme der durchschnittlichen normalen interzellulären Spannung (A), der maximalen interzellulären Spannung der Scherspannung (B) und der RMS-Traktionen (C) zeigen die Auswirkungen der Chalcon-Dosen (0,2 g/ml und 2 g/ml) auf HUVEC-Monolayer im Vergleich zur Kontrolle. Fehlerbalken zeigen Standardfehler an. Es wurde festgestellt, dass die Ergebnisse statistisch signifikant waren (Stichprobengröße = 6 Inseln, mit einem Konfidenzniveau von 95%) verwendungsweisen sowohl t-Tests im Vergleich zu Control (p < 0.05) als auch Single Factor ANOVA (p < 0.05). In separaten Gerichten wurde die Immunfärbung 5 h nach der Zugabe des Medikaments für Inseln von Zellen durchgeführt, die auf weichen 1,2 kPa Hydrogelen leben. Die grüne Farbe steht für Cx43 und Blau für DAPI (Kern). Panel D zeigt Folgendes: Steuerung (E,H), 0,2 g/ml chalcone behandelte Zellen (F,I) und 2 g/ml chalcone behandelte Zellen (G,J). Skala bar = 200 'm, objektiv = 20x. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Supplementary Figure 1
Ergänzende Abbildung 1: Hochauflösende Cx43 Färbung in HUVEC-Monolayern. Feste HUVEC-Monolayer wurden für Cx43 (grün) und Kern (DAPI, blau) gebeizt, um die dosisabhängige Wirkung von Chalcon zu beobachten. Höhere Vergrößerungsbilder (63x Objektiv) zeigen die Cx43-Lokalisierung hauptsächlich um den Kern herum (offensichtlich aus der grünen Fluoreszenzintensität). Gezeigt werden Kontrollzellen (A-C), 0,2 g/ml chalcone behandelte Zellen (D-F) und 2 g/ml chalcone behandelte Zellen (G-I). Skala bar = 100 'm, objektiv = 63x Öleintauchen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Pa Pa 1 kPa 4 kPa 6,3 kPa 11 kPa 90 kPa 150 kPa
Lösungszusammensetzung 0,05% BIS 0,1% BIS 0,03% BIS 0,1% BIS 0,03% BIS 0,07% BIS 0,3% BIS 0,6% BIS
5,5% Acryl 2% Acryl 5% Acryl 5% Acryl 10% Acryl 10% Acryl 12% Acryl 12% Acryl
Ultrareines Wasser 12,49 ml 13,38 ml 12,78 ml 12.255 ml 10.905 ml 10,63 ml 8,30 ml 5,9 ml
40% Acrylamid 2.062 ml 750 l 1.875 ml 1.875 ml 3,75 ml 3,75 ml 4,5 ml 4,5 ml
2% BIS Acrylamid 375 l 750 l 225 l 750 l 225 l 525 l 2,12 ml 4,5 ml
Fluroszierende Perlen (0,2 m oder 0,5 m) 80 l 80 l 80 l 80 l 80 l 80 l 80 l Traktionen sind nicht messbar

Tabelle 1: Polyacrylamid-Gel-Formulierungen für verschiedene Young-Moduli.

Volumen dichte Coverslip
20-mm-sl-Brunnen dicht 500 l 1 mm 25 mm
dünn 24 l 100 m 18 mm
14-mm-sl-Brunnen dicht 175 l 700 €m 18 mm
dünn 10,3 l 100 m 12 mm
14 mm 6-well dicht 280 l 1,5 mm 18 mm

Tabelle 2: Gelvolumen und -dicke.

Ergänzende Datei: MATLAB Routinen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei anzuzeigen (Rechtsklick zum Herunterladen).

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Discussion

Unsere Gruppe, wie auch andere, hat erfolgreich TFM und MSM verwendet, um den Einfluss von Zell-Zell-Verbindungen in verschiedenen pathologischen und physiologischen zellulären Prozessen in vitro7,15,18,27 zu untersuchen . Zum Beispiel präsentierten Hardin et al. eine sehr aufschlussreiche Studie, die interzelluläre Spannungsübertragung schlägt parazelluläre Spaltbildung in Endothelzellen15. Während es möglich ist, die Cx43-bezogenen Änderungen, die wir hier berichten, mit den von Hardin et al. berichteten Änderungen in Beziehung zu setzen, befassen wir uns nicht speziell mit der parazellulären Lückenbildung in diesem Protokoll. Hier haben wir ein mechanikbasiertes Protokoll vorgestellt, das speziell auf die Spaltkreuzung Cx43 ausgerichtet ist und deren Einfluss auf die endotheliale Biomechanik untersucht.

Um dieses Protokoll erfolgreich zu machen, gab es einige Herausforderungen, die wir überwinden mussten, von denen einige auftreten könnten, wenn andere Forscher beschließen sollten, unser Protokoll für ähnliche Studien zu übernehmen. Eine große Herausforderung bestand darin, einen optimalen Chalcon-Dosisbereich zu finden, in dem die Cx43-Expression gehemmt werden konnte, während gleichzeitig unsere endotheliale Monolayer intakt blieben. Der IC50 von Chalcone für HUVECs wurde zuvor mit 10,01 g/ml28gemeldet. Als wir unsere HUVEC-Monolayer jedoch mehreren Chalcone-Konzentrationen von 0,2 g/ml bis 20 g/ml aussetzten, stellten wir fest, dass eine Chalcon-Konzentration von 2 g/ml die höchste Konzentration war, der unsere Monolayer standhalten konnten, während sie noch konfluent blieben. Eine konfluente Monoschicht war für dieses Protokoll unerlässlich, da eine Monoschicht erforderlich ist, um interzelluläre Spannungen mit MSM zu messen. Als nächstes führten wir einen Immunfluoreszenz-Test durch, um festzustellen, ob die ausgewählten Dosen von Chalcone erfolgreich die Cx43-Struktur oder die scheinbare Expression gestört haben. Unser Ergebnis zeigte, dass die Störung der Cx43-Struktur mit 0,2 g/ml-Chalcon zwar optisch schwer von der Kontrolle zu unterscheiden war, dass jedoch Zellen, die mit 2 g/ml Chalcon behandelt wurden, einen offensichtlichen Unterschied in der Cx43-Struktur und potenzieller Expression aufwiesen ( Abbildung 6D und Ergänzende Abbildung 1). Darüber hinaus zeigten unsere Ergebnisse, dass die Cx43-Störung tatsächlich die endotheliale Biomechanik beeinflusst, indem sie Traktionen und interzelluläre Spannungen in höchster Konzentration reduziert. Diese Ergebnisse sind im Einvernehmen mit Bazellieres et al., die zeigten, dass das Silencing von Cx43 mit siRNA auch Traktionen und interzelluläre Spannungen reduziert, aber in einem Blatt Epithelzellen27. Obwohl unsere Ergebnisse im Einvernehmen mit anderen sind, sollte angemerkt werden, dass das Molekül, das wir zur Störung der Cx43-Expression, Chalcon, verwendet haben, auch vorgeschlagen wurde, die Aktivierung von MAPK und NFkB zusätzlich zu Cx43-Störung26zu beeinflussen. Da wir uns daher nicht speziell mit den oben genannten Molekülen oder den zugehörigen Bahnen befliegt haben, können wir nicht ausschließen, welchen Einfluss eine mögliche MAPK- und NFkB-Störung auch auf die endotheliale Biomechanik haben kann.

Ein weiterer wichtiger Punkt, der erwähnenswert ist, ist, dass die wiedergewonnenen Traktionen und interzellulären Spannungen 2D in der Natur sind und a-plane (z-Richtung) Traktionen und interzelluläre Spannungen12,13ignorieren. Obwohl ein kleiner Fehler mit dem Ignorieren von A-ebenen Spannungen verbunden ist, ist dieser Fehler vernachlässigbar13. Darüber hinaus ist die seitliche Dimension der Monoschicht im Verhältnis zur Monolayer-Höhe (ca. 5 m) ausreichend groß (1,25 mm), so dass wir keine signifikanten Verschiebungen in Z-Richtung erwarten würden. Darüber hinaus bietet die MSM-Berechnung Fehler an der Monolayer-Grenze12,13. Tambe et al. zeigten jedoch experimentell, dass Fehler an den optischen Rändern (d.h. der Einschichtgrenze) am höchsten sind und sich schnell von den Grenzkanten13distalieren. Wir führen Mikromuster durch und berechnen dann interzelluläre Spannungen der gesamten Monoschicht, um Grenzfehler zu vermeiden, die bei der interzellulären Spannungsberechnung auftreten können.

Die monoschichtige Stressmikroskopie wird in diesem Protokoll verwendet, da die interzellulären Spannungsinformationen, die aus dieser Methode hervorgebracht werden, unerlässlich sind, um ein vollständigeres Verständnis der Rollenlücken-Kreuzungsstörung auf die endotheliale Biomechanik zu haben. Darüber hinaus wurden interzelluläre Spannungen als wichtig für die Endothelbarrierefunktion vorgeschlagen, wie von Hardin et al.15 und Krishnan et al.17vorgeschlagen, zum Beispiel. Während in den hier vorgestellten repräsentativen Daten auch interzelluläre Spannungen mit Traktionen korreliert waren, ist dies nicht immer je nach Stimulus der Fall. In der Studie von Steward et al. wurden beispielsweise endotheliale interzelluläre Spannungen unter Flüssigkeitsscherung gezeigt, während die Traktionen relativ unverändert blieben7. Auch das Protokoll, das wir hier vorstellen, erlaubt keine gleichzeitige Messung von zellabgeleiteten mechanischen Kräften und Färbung von Knoten und Fokaladesionen, aber eine solche Ergänzung wäre komplementär zu diesem Protokoll. Abschließend beschreibt das Protokoll, das wir hier vorstellen, eine mechanikbasierte Methode zur Untersuchung des Einflusses, den Cx43 ausschließlich auf die endotheliale Biomechanik hat, insbesondere auf endotheliale Zell-abgeleitete Kräfte. Wir glauben, dass unser mechanikbasiertes Protokoll in Verbindung mit derzeit bestehenden biologisch basierten Protokollen verwendet werden kann, um wirklich bahnbrechende Arbeit auf diesem Gebiet zu bieten.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von den Start-up-Fonds der University of Central Florida und dem National Heart, Lung, And Blood Institute des National Institute of Health unter der Auszeichnung K25HL132098 unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 mm coverslip ThermoFisher 18CIR-1 Essential to flatten polyacrylamide gels
2% bis-acrylamide BIO-RAD 1610143 Component of polyacrylamide gel
2′,5′-Dihydroxychalcone SIGMA IDF00046 To disrupt Cx43 structure
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate SIGMA 2530-85-0 Stock solution to make bind silane mixture with acetic acid and ultra-pure water
40% Acrylamide BIO-RAD 1610140 Component of polyacrylamide gel
Acetic acid Fisher-Sceintific 64-19-7 Essential to make bind saline solution
Alexa Fluro 488 goat anti-mouse IgG; ThermoFisher Catalog # A-11001 Secondary antibody
Ammonium persulfate BIO-RAD 1610700 Polyacrylamide gel polymerizing agent
Bovine Serum Albumin (BSA) SIGMA 9048-46-8 To make blocking solution
Bovine Type I Atelo-Collagen Solution, 3 mg/mL, 100 mL Advance Biomatrix 5005-100ML Use as a extracellular matrix
Corning Cell Culture Phosphate Buffered Saline (1x) Fisher-Sceintific 21040CV Buffer Saline needed for cell culture
Dimethyl Sulfoxide, Fisher BioReagents Fisher-Sceintific 67-68-5 To dissolve chalcone and make stock solution
Fluoromount-G with DAPI ThermoFisher 00-4959-52 Mounting medium for immunostaing used to stain for DAPI
Fluroscent microsphere Carboxylate-modified beads ThermoFisher F8812 0.5 micron carboxylate-modified beads (red), 2% solids
HEPES buffer solution 1 M SIGMA 7365-45-9 Essential to
LVES ThermoFisher A1460801 Essential HUEVC media 200 supplement
Medium 200 ThermoFisher M200500 Essential media for HUVEC cell culture
Mouse monoclonal Cx43 antibody (CX - 1B1) ThermoFisher Catalog #13-8300 Primary antibody for Cx43
Petri dish (35 mm dia) CellVis D35-20-1.5H 35 mm petri dish with a 20 mm center well
Sulfo-SANPAH Crosslinker 100 mg Proteochem 102568-43-4 Essential to functionalize polyacrylamide gel surface
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit DOW corning 2646340 Silicon elastomer with curing agent to make PDMS
TEMED BIO-RAD 1610801 Polyacrylamide gel polymerizing agent
Triton-X 100 SIGMA 9002-93-1 To permeabilize cells
Trypsin -EDTA ThermoFisher 25300054 Used to detach cells

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References

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Störende Endothelial Biomechanik über Connexin 43 Strukturelle Störung
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Islam, M. M., Steward, Jr., R. L. Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption. J. Vis. Exp. (152), e60034, doi:10.3791/60034 (2019).More

Islam, M. M., Steward, Jr., R. L. Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption. J. Vis. Exp. (152), e60034, doi:10.3791/60034 (2019).

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