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Biochemistry

Biomeccanica edonteliale perturbatrice tramite Connexin 43 Disgregazione strutturale

doi: 10.3791/60034 Published: October 4, 2019

Summary

Qui, presentiamo un protocollo basato sulla meccanica per interrompere la giunzione gap connexin 43 e misurare l'impatto successivo che questo ha sulla biomeccanica endoteliale attraverso l'osservazione di trazioni e sollecitazioni intercellulari.

Abstract

Sono state create cellule endoteliali per generare sollecitazioni e trazioni intercellulari, ma il ruolo delle giunzioni gap giocate nella generazione di stress e trazione intercellulare endoteliale è attualmente sconosciuto. Pertanto, presentiamo qui un protocollo basato sulla meccanica per sondare l'influenza della giunzione gap connexin 43 (Cx43) ha sulla biomeccanica endoteliale esponendo monostrati endoteliali confluenti a un noto inibitore Cx43 2,5-dihydroxychalcone (chalcone) e misurando l'impatto di questo inibitore sulle trazioni e sulle sollecitazioni intercellulari. Vi presentiamo risultati rappresentativi, che mostrano una diminuzione sia delle trazioni che delle sollecitazioni intercellulari sotto un alto dosaggio di chalcone (2 g/mL) rispetto al controllo. Questo protocollo può essere applicato non solo a Cx43, ma anche ad altre giunzioni di gap, supponendo che venga utilizzato l'inibitore appropriato. Crediamo che questo protocollo sarà utile nei campi della ricerca cardiovascolare e meccanobiologia.

Introduction

Il campo che si riferisce allo studio degli effetti delle forze fisiche e delle proprietà meccaniche sulla fisiologia e patologia cellulare e tissutale è noto come meccanobiologia1. Alcune tecniche utili che sono state utilizzate nella meccanobiologia sono la microscopia a stress monostrato e la microscopia a forza di trazione. La microscopia a forza di trazione consente il calcolo delle trazioni generate nell'interfaccia del substrato cellulare, mentre la microscopia a sollecitazione del monostrato consente il calcolo delle sollecitazioni intercellulari generate tra celle adiacenti all'interno di un monostrato2 ,3,4,5,6. I risultati ottenuti dai metodi precedenti hanno suggerito che le sollecitazioni meccaniche derivate dalle cellule svolgono un ruolo cruciale nel determinare il destino di una serie di processi cellulari3,4,5. Ad esempio, dopo l'esposizione a una forza meccanica esterna, un gruppo di cellule che migrano collettivamente può alterare la loro morfologia e polarizzare la loro forma per allineare e migrare lungo la direzione della forza applicata, in parte, generando trazioni7, 8. Le trazioni forniscono una metrica che può essere utilizzata per valutare la contrattilità delle celle e vengono calcolate utilizzando la microscopia della forza di trazione (TFM). La microscopia della forza di trazione (TFM) inizia con la determinazione delle deformazioni del substrato indotte dalle cellule seguita dal calcolo del campo di trazione utilizzando un approccio computazionale matematicamente rigoroso e basato sulla meccanica. Dal momento che la capacità di calcolare le trazioni è stata intorno per un bel po 'di tempo, i ricercatori hanno utilizzato TFM per rivelare l'impatto che le trazioni hanno su una serie di processi, tra cui il cancro9, guarigione della ferita10 e valutazione del cardiaco ingegnerizzato tessuto11.

L'implementazione di TFM e MSM insieme può essere suddivisa in tre fasi essenziali che devono essere eseguite nel seguente ordine: in primo luogo, vengono determinate le deformazioni dell'idrogel prodotte dalle cellule; in secondo luogo, le trazioni vengono recuperate dalle deformazioni degli idrogel; e terzo, un approccio a elemento finito viene utilizzato per calcolare le sollecitazioni intercellulari normali e di taglio all'interno dell'intero monostrato. Per calcolare gli spostamenti di gel, le immagini di perline di fluorescenza con le cellule sono state confrontate con l'immagine di perline di riferimento (senza cellule) utilizzando una routine di velocitàmetria dell'immagine di particella (PIV) scritta su misura. Le dimensioni e la sovrapposizione della finestra di correlazione incrociata per l'analisi PIV sono state scelte rispettivamente per 32 x 32 pixel e 0,5. A questo punto, gli spostamenti dei pixel sono stati convertiti in micron moltiplicandosi con un fattore di conversione da pixel a micron (per il nostro microscopio, questo fattore di conversione è 0,65) per ottenere spostamenti in piano. Gli errori associati all'ignorare gli spostamenti fuori piano sono trascurabili12,13. Dopo il calcolo degli spostamenti in gel, ci sono due tipi di misurazioni di trazione che possono essere utilizzate, trazioni vincolate e trazioni non vincolate8,14. Le trazioni non vincolate forniscono il campo di trazione per l'intero campo visivo (comprese le regioni con e senza celle), mentre le trazioni vincolate forniscono il campo di trazione solo per le regioni che includono le celle14. Quindi, le sollecitazioni intercellulari vengono calcolate utilizzando la microscopia a stress monomero (MSM), che è un'estensione della microscopia a forza di trazione. L'attuazione di MSM si basa sull'assunto che le trazioni locali esercitate da un monostrato di cellule nell'interfaccia cellulare-substrato devono essere bilanciate da forze meccaniche trasmesse tra le cellule all'interfaccia cellulare, come richiesto dalle leggi di Newton7 ,12,13. Un presupposto chiave qui è che il monostrato cellulare può essere trattato come un foglio elastico sottile perché la distribuzione di trazione nel monostrato è nota e l'equilibrio di forza non dipende dalle proprietà del materiale cellulare. Un'altra ipotesi chiave è che le forze di trazione sono bilanciate da sollecitazioni intercellulari locali all'interno del campo visivo ottico (all'interno del monostrato) e l'influenza di questo equilibrio di forza è minima nella regione distale (al di fuori del monostrato)13. Pertanto, le condizioni di contorno definite da sollecitazioni intercellulari, spostamenti o una combinazione di entrambi al limite del monostrato sono cruciali per eseguire MSM13. Tenendo conto delle informazioni di cui sopra, utilizziamo MSM per eseguire un'analisi degli elementi finiti (FEM) per recuperare la sollecitazione massima principale(-max) e la sollecitazione principale minima(zmin)ruotando il piano di sollecitazione in ogni punto all'interno del Monostrato. Queste sollecitazioni principali vengono successivamente utilizzate per calcolare la media 2Ddella normale sollecitazione intercellulare [(((max 12,13. Questa procedura è descritta in dettaglio da Tambe etal.

La microscopia a stress monostrato (MSM) consente il calcolo delle sollecitazioni intercellulari cellulari generate all'interno di un monostrato6,7,8,12,13. Questi stress intercellulari sono stati suggeriti per essere importanti per la crescita e la riparazione dei tessuti, la guarigione delle ferite e la metastasi del cancro12,15,16,17. Inoltre, le sollecitazioni intercellulari sono state suggerite per essere importanti anche nella migrazione delle cellule endoteliali e nella funzione di barriera endoteliale17,18. Mentre le giunzioni cellulari-cellule come giunzioni strette e giunzioni di adesione sono state entrambe suggerite per svolgere un ruolo critico nella generazione e trasmissione della sollecitazione intercellulare endoteliale, il ruolo delle giunzioni gap rimane sfuggente. Le giunzioni gap collegano fisicamente celle adiacenti e forniscono un percorso per la corrente elettrica e le molecole (<1 KDa) per passare tra le celle vicine19,20,21. Sebbene le cellule endoteliali esprimano le giunzioni gap Cx37, Cx40 e Cx4319,22, Cx43 è probabilmente la più importante in termini di progressione della malattia23. Prova dell'importanza di Cx43 può essere trovato nel fatto che la delezione genetica di Cx43 nei topi si traduce in ipotensione24 e ha effetti negativi sull'angiogenesi25. Inoltre, Cx43 è stato documentato per essere importante per la migrazione cellulare e la proliferazione e nella progressione dell'aterosclerosi18,22,23,24,25 .

In questo protocollo, abbiamo usato TFM e MSM per studiare se la generazione di trazione e stress intercellulare all'interno del monostrato confluente e endoteliale sarebbe stata influenzata dall'interruzione della giunzione del gap endoteliale Cx43. Abbiamo interrotto Cx43 con 2,5-dihydroxychalcone (chalcone), una molecola documentata per inibire l'espressione Cx4326. Chalcone è stato usato per interrompere cx43 invece di siRNA come chalcone è stato segnalato in precedenza da Lee et al. per interrompere l'espressione Cx4326. Inoltre, eravamo particolarmente interessati all'influenza di chalcone sull'endotelio in quanto è stato anche segnalato per essere un composto anti-infiammatorio e anti-platelet che può essere potenzialmente utilizzato per la prevenzione e il trattamento di vari vascolari patologie26. I trattamenti Chalcone sono stati eseguiti un'ora dopo l'inizio dell'esperimento, i monostrati trattati con chalcone sono stati immagini per un totale di sei ore e l'elaborazione delle immagini è stata eseguita con un codice MATLAB scritto su misura per determinare le trazioni e successivamente intercellulare Sottolinea. I nostri risultati hanno mostrato una diminuzione complessiva delle trazioni e delle sollecitazioni intercellulari, suggerendo che il Cx43 gioca un ruolo chiave nella biomeccanica endoteliale.

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Protocol

1. Produrre gel poliacrilammide (PA)

  1. Preparazione del piatto Petri
    1. Preparare la soluzione legare la soluzione silarante mescolando 200 mL di acqua ultrapura con 80 .L acido acetico e 50 .L di 3-(trimethoxysilyl)methacrylato. Bind silane è una soluzione utilizzata per funzionalizzare la superficie della piastra Petri fondo di vetro per l'attacco idrogel.
    2. Mescolare la soluzione di sbarramento su una piastra di mescolare per almeno 1 h.
    3. Trattare il pozzo centrale della piastra Petri con soluzione silano a scalo per 45 min.
    4. Rimuovere la soluzione silaceri di rilegamento e sciacquare la piastra Petri con acqua ultra-pura 2x-3x.
    5. Asciugare la superficie del piatto Petri e conservarla a temperatura ambiente per un uso futuro.
  2. Preparazione della soluzione idrogel
    1. Mescolare acqua ultra-pura, 40% acrilammide e 2% bis-acrilamide in un tubo di centrifuga di 15 mL secondo la tabella 1.
    2. Aggiungere 80 gradi di perline fluorescenti alla soluzione idrogel.
    3. Scuotere delicatamente il tubo per mescolare le perline con la soluzione di gel.
    4. Stringere leggermente il tappo del tubo sul tubo di centrifuga e posizionarlo in una camera a vuoto.
    5. Degas la soluzione gel per almeno 45 min nella camera a vuoto.
  3. Polimerizzazione idrogel
    1. In primo luogo, aggiungere 75 L del 10% di persolto di ammonio (disciolto in acqua ultrapura) e poi aggiungere 8 -L di TEMED (N,N,N',N'-tetramethylethane-1,2-diamine) alla soluzione idrogel.
    2. Collocare 24 - L di soluzione idrogel al centro del piatto Petri (vedi tabella 2).
    3. Utilizzare un coperchio da 18 mm per appiattire l'idrogel. Questo darà un'altezza di 100 m.
    4. Attendere almeno 30-40 min per la polimerizzazione gel.
    5. Immergere l'idrogel polimerizzato in acqua ultrapura per prevenire la disidratazione del gel.
    6. Coprire il piatto Petri con un foglio di alluminio per evitare il fotosbiancamento di perline fluorescenti e conservare a 4 gradi centigradi.
      NOTA: Gli idrogel possono essere conservati per un periodo fino a 3 mesi, ma si suggerisce che questi gel siano utilizzati non più di 1 settimana dopo la fabbricazione per ottenere i migliori risultati.

2. Cultura cellulare

  1. Coltura cellule endoteliali ombelicali (HUVEC) nel mezzo di coltura cellulare 200 (vedi Tabella dei materiali) integrato con 1% penicillina-streptomicina su flaconi rivestiti di gelatina 0.1% a 37 gradi centigradi e 5% CO2.

3. Preparazione stencil Micropattern

  1. Curare un sottile strato di polidimetetiloxane (PDMS) in una parabola Petri da 100 mm mescolando la base in silicone con l'agente di polimerazione in silicone a un rapporto di 20:1 (base: agente di polimerità).
    NOTA: È possibile utilizzare altri rapporti agente di base (ad es. 10:1 o 30:1). Tuttavia, un rapporto tra base e agente di polimerità inferiore produrrà un modello più rigido, mentre un rapporto base-agente di stagionatura più alto produrrà un modello più morbido.
  2. Preparare una soluzione PDMS 20:1 (agente di base:stagionatura) e mescolare con cura in un tubo di centrifuga di 50 mL. Invertire il tubo capovolto e agitare vigorosamente più volte per garantire una corretta miscelazione della soluzione PDMS, in quanto la miscelazione non uniforme si tradurrà in una polimerizzazione incompleta.
  3. Rimuovere le bolle introdotte dal passaggio precedente centrifudendo la soluzione PDMS per 1 min a 190 x g.
  4. Versare 5-6 mL di soluzione PDMS al centro di una parabola Petri da 100 mm e agitare il piatto fino a quando la soluzione PDMS copre l'intera superficie della piastra Petri.
  5. Curare la soluzione PDMS durante la notte a 50-60 gradi centigradi. Il PDMS può anche essere curato a temperatura ambiente.
  6. Rimuovere uno stencil PDMS circolare di 16 mm di diametro con un perforatore.
  7. Utilizzare un punzone biopsia per creare piccoli fori nello stencil PDMS. Questo protocollo utilizza un punzone biopsia di 1,25 mm di diametro.
  8. Sterilizzare gli stencil PDMS prima immergendoli nel 70% di etanolo per 2-3 min, aspirando l'etanolo in eccesso e quindi posizionando sotto una luce UV per 5 min.

4. Rivestimento idrogel collagen-i

  1. Togliere il coperchio dall'idrogel e aspirare qualsiasi liquido in eccesso.
  2. Posizionare lo stencil PDMS sulla superficie dell'idrogel.
    NOTA: Le pinzette possono essere utilizzate per applicare una leggera pressione allo stencil PDMS per garantire una tenuta a tenuta d'acqua tra lo stencil PDMS e la superficie idrogel. I nostri stencil PDMS sono a tenuta d'acqua e quindi impediscono l'accesso all'acqua tra la superficie superiore del gel e la superficie inferiore dello stencil PDMS. Inoltre, la rigidità dell'idrogel non deve essere regolata rispetto alla rigidità del PDMS.
  3. Coprire la superficie idrogel con sulfosucciminimidyl-6-(4-azido-2-nitrophelamino) esanotato (sulfo-SANPAH) sciolto in una soluzione cuscinetto da 0,1 M HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinethanethanesulfonic) con una concentrazione di 1 : 1000 e posta sotto uv lampada (potenza 36 W) per 8 min.
  4. Aspirati la soluzione solfo-SANPAH e HEPES in eccesso e risciacquano due volte l'idrogel con 0,1 M DI HEPES seguiti da altri due risciacquo con acqua ultra-pura.
  5. Aspirare l'acqua ultrapura e gli idrogel del mantello con 0,1 mg/mL di collagene-I durante la notte a 4 gradi centigradi.
  6. Coprire i piatti e proteggere le perline fluorescenti dal fotosbiancamento.
    NOTA: gli stencil PDMS vengono utilizzati per creare monostrati micromodellati. I monostrati micropattern sono utilizzati in quanto consentono di osservare contemporaneamente più monostrati della stessa geometria e delle stesse dimensioni durante ogni esperimento. Tuttavia, se i micromodelli non sono desiderati, i passaggi precedenti possono essere seguiti con l'eccezione del passaggio 4.2.

5. Creazione di monostrati HUVEC su idrogel

  1. Utilizzare 1x di prova per staccare le cellule dai flaconi di coltura tissutale per 3-5 min nell'incubatrice.
  2. Dopo la prova, aggiungere i supporti di coltura cellulare alla soluzione trypsin e aggiungere al tubo di centrifuga di 15 mL.
  3. Centrifugare la soluzione cellulare per 3 min a 1710 x g. Un piccolo pellet bianco di cellule dovrebbe essere visibile nella parte inferiore del tubo di centrifuga.
  4. Aspirare il supernatante e risospendere le cellule nei media ad una concentrazione di 50 x 104 cellule / mL.
  5. Rimuovere il collagene-I dall'idrogel e risciacquare 1x con PBS.
  6. Aggiungete 75 x 103 celle nella parte superiore dello stencil PDMS e permettete alle cellule di attaccarsi alla superficie dell'idrogel per almeno 1 h nell'incubatrice a 37 e 5% di CO2.
  7. Rimuovere lo stencil PDMS e aggiungere almeno 2 mL di supporti al piatto Petri. Immergere lo stencil PDMS in 10x trypsin per rimuovere eventuali cellule collegate e sterilizzare spruzzando con 70% etanolo e poi mettendo sotto la luce UV per 5 min.
  8. Mettere il piatto Petri nell'incubatrice e attendere almeno 36 h o fino a quando non viene osservato un monostrato confluente.

6. 2,5 trattamento dihydroxychalcone per l'interruzione di Cx43

  1. Sciogliere 2,5 dihydroxychalcone (chalcone) in ditilfossido di dimetilzot (DMSO) per creare una soluzione stock da 0,1875 mg/mL.
  2. Diluire la soluzione di stock con i mezzi di coltura cellulare per creare una bassa concentrazione di chalcone (0,2 g/mL) e un'alta concentrazione di chalcone (2 g/mL) aliquota.

7. Acquisizione dei dati

  1. Individuare le isole cellulari con un microscopio.
  2. Acquisire il contrasto di fase e le immagini di perline per la morfologia delle cellule di immagine e spostamenti di idrogel, rispettivamente.
    NOTA: questo protocollo utilizzava un obiettivo 10x per l'acquisizione dei dati.
  3. Alla fine dell'esperimento, scollegare le cellule con 10x trypsin e acquisire un'immagine della superficie del gel senza cellule (immagine di riferimento).

8. Immunostaining

  1. Fissare monostrati con 4% formaldeide e incubare a 37 gradi centigradi per 15 min.
  2. Rimuovere il 4% di formaldeide e aggiungere 0.2% Triton X-100 per 5 min a 37 gradi centigradi per permeabilizzare le cellule.
  3. Rimuovere lo 0,2% Triton X-100 e risciacquare i monostrati con PBS 2x-3x.
  4. Coprire il monostrato con la soluzione 2% di albumina di siero bovino (BSA) per 45 min a 37 gradi centigradi.
  5. Rimuovere la soluzione BSA del 2% e risciacquare i monostrati con PBS 2x-3x.
  6. Aggiungere al campione l'anticorpo primario Cx43 ad una concentrazione di 1:400 e incubare pertutta la notte.
  7. Rimuovere l'anticorpo primario e risciacquare il campione con PBS 2x-3x.
  8. Aggiungere l'anticorpo secondario ad una concentrazione di 3:200 e incubare per 2 h a 37 .
    NOTA: i campioni devono essere coperti per evitare il fotosbiancamento.
  9. Rimuovere l'anticorpo secondario e risciacquare con PBS 2x-3x.
  10. Campione di copertura con supporto di montaggio (Fluromount-G DAPI) e guaritivo con coperchio da 18 mm.

9. Implementazione della microscopia a forza di trazione (TFM) e della microscopia a stress monostrato (MSM)

  1. Calcolo della deformazione dell'idrogel
    NOTA: di seguito è riportata una procedura di calcolo dello spostamento passo-passo utilizzando MATLAB.
    1. Aprire il file traction.m principale in MATLAB (per tutte le routine MATLAB vedere Materiali supplementari).
      NOTA: seguire le istruzioni fornite nel codice per impostare la directory MATLAB.
    2. Definisci le seguenti variabili: formato immagine, conversione pixel-micron, modulo di Young, rapporto di Poisson e obiettivo del microscopio.
    3. Individuate il tallone, l'immagine trypsin e l'immagine di fase utilizzando la subroutine OpenFiles.
      NOTA: per set di dati di grandi dimensioni, è consigliabile denominare i file in ordine sequenziale. Ad esempio, i file devono essere denominati "nomefile1.tif", "nomefile2.tif" e così via.
    4. Definire un ROI quadrato (regione di interesse) intorno al monostrato di cella ed eseguire la subroutine cell_cropper per ritagliare l'immagine originale.
    5. Eseguire la subroutine di displacement_finder per calcolare gli spostamenti.
    6. Eseguire la subroutine Dedrift per rimuovere eventuali spostamenti non cellulari aggiuntivi che possono essere dovuti alla deriva dello stadio al microscopio.
  2. Calcolo delle trazioni
    NOTA: Qui, le trazioni non vincolate vengono calcolate utilizzando la nostra routine MATLAB scritta su misura. Il calcolo della trazione passo dopo passo utilizzando la routine MATLAB menzionata in precedenza è riportato di seguito.
    1. Definire le seguenti variabili all'interno della routine traction.m: condizione limite, spessore del gel, altezza del gel e dedrift.
    2. Eseguire la subroutine traction_finder per calcolare le trazioni ed eseguire la subroutine plot_traction per tracciare le trazioni. Tutte le trazioni in direzione x (Tx) e direzione y (Ty) insieme alle corrispondenti posizioni dei pixel possono essere trovate in un file traction.dat che verrà generato dal codice.
  3. Calcolo delle sollecitazioni intercellulari
    NOTA: Di seguito sono riportate le istruzioni passo passo per il calcolo della sollecitazione intercellulare utilizzando la routine MATLAB menzionata in precedenza.
    1. Eseguite la subroutine mark_circular_domain per specificare il limite del monostrato. Questa routine richiederà all'utente di disegnare manualmente un contorno intorno al monostrato per tutte le immagini di fase ritagliate in sequenza. Nota gli nXPt generati nella finestra di comando e usali in un secondo momento come parametri della griglia sia nell'asse X che nell'asse Y per l'analisi FEM (vedere il passaggio 9.3.2).
    2. Eseguire Run_StressCode per calcolare le sollecitazioni intercellulari. Questa subroutine legge direttamente i parametri dal file "model.in" ed esegue "island.exe" per eseguire l'analisi FEM. Prima di eseguire questa routine, assicurarsi che tutti i parametri nel file model.in, ad esempio i parametri della griglia nella conversione X e Y, pixel a micron, modulo di Young del gel, rapporto di Poisson, altezza del monostrato e pattern monostrato (striscia o foro), siano modificati Correttamente.
    3. Tracciate tutti i risultati FEM utilizzando la subroutine plot_FEM_results.
      NOTA: tutti i risultati generati verranno automaticamente memorizzati nella cartella Risultati nella directory MATLAB.

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Representative Results

Le immagini a contrasto di fase del controllo, 0,2 g/mL e 2 monostrati di chalcone trattati con chalcone di fase sono state scattate 30 minuti prima del trattamento dei chalcone (Figura 1A-C) e 2 ore dopo il trattamento dei chalcone (Figura 1D-F). Sono stati osservati spostamenti di perline indotta da cellule (m) diminuire sia nelle condizioni di chalcone a bassa dose che in condizioni di chalcone ad alta dose (Figura 2E,F) rispetto al controllo dei monostrati HUVEC (Figura 2D). Prima del trattamento con i chalcone, le trazioni di rms erano di circa 51 x 8 Pa (Figura 3A-C) per tutte le condizioni. Dopo il trattamento delle chalcone, c'è stato un piccolo aumento delle trazioni di rms a 59 x 11 Pa in un calcare trattato a bassa dose (Figura 3E) e una diminuzione quasi 2 volte delle trazioni rms a 18 2 in chalcone ad alta dose - monostrati trattati con chalcone ( Figura 3F) rispetto al controllo (Figura 3D). Prima del trattamento con i chalcone, le sollecitazioni intercellulari medie normali erano di circa 220 x 66 Pa (Figura 4A-C). Dopo il trattamento con chalcone, c'è stato un aumento della magnitudine media normale di stress intercellulare a 285 x 75 Pa con trattamento con calce a bassa dose (Figura 4E),ma una significativa diminuzione della magnitudine media normale normale di stress intercellulare a 106 4 Pa con trattamento con chalcone ad alta dose (Figura 4F) rispetto al controllo delle sollecitazioni intercellulari normali medie (235 x 18 Pa, Figura 4D). Le sollecitazioni intercellulari massime di taglio erano di circa 241 x 30 Pa (Figura 5A-C) prima del trattamento dei chalcone, ma dopo il trattamento con chalcone, c'è stata una diminuzione a 227 x 20 Pa a bassa concentrazione di chalcone (Figura 5E) e un'ulteriore diminuzione della magnitudine massima di sollecitazione intercellulare di taglio a 91 x 6 Pa a un trattamento ad alta concentrazione di chalcone (Figura 5F) rispetto al controllo delle sollecitazioni intercellulari massime di taglio (270 x 30 Pa, Figura 5D ). L'analisi delle trazioni e delle sollecitazioni intercellulari è presentata nella Figura 6A-C. Tutti i risultati tracciati sono stati testati per la significatività statistica (test t e test ANOVA a fattore singolo), e in entrambi i test i risultati sono risultati statisticamente significativi (p < 0,05) quando confrontano in modo indipendente la concentrazione di 0,2 g/mL chalcone e 2 g/mL chalcone per controllare le condizioni (senza chalcone).

Figure 1
Figura 1: Immagini a contrasto di fase rappresentative dei monostrati HUVEC. Immagini a contrasto di fase egustative di controllo HUVEC a 30 min (A) e 2 h (D), immagini a contrasto di fase di HUVEC trattate con 0,2 sg/mL chalcone a 30 min (B) e 2 h (E) e immagini a contrasto di fase di HUVEC trattati con 2 sg/mL chalcone a 30 min (C) e 2 h (F) di insorgenza dell'esperimento. Barra della scala rappresenta il diametro del monostrato di 1,25 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Illustrazione del campo di spostamento prodotto dai monostrati HUVEC. Spostamenti rappresentativi (m) di controllo HUVEC a 30 min (A) e 2 h (D), HUVEC trattati con 0,2 g/mL di chalcone a 30 min (B) e 2 h (E) e HUVEC trattati con 2 g/mL di chalcone a 30 min (C) e 2 h (F) di l'insorgenza dell'esperimento. La barra della scala rappresenta il diametro del monostrato di 1,25 mm. La barra dei colori rappresenta gli spostamenti in zm.

Figure 3
Figura 3: Distribuzione della trazione RMS nei monostrati HUVEC. Esempio di mozzare le trazioni di controllo, 0,2 g/mL chalcone e 2 HUVEC chalcone di g/mL rispettivamente prima del trattamento dei chalcone (A-C) e dopo un'ora di trattamento con chalcone (D-F). La barra della scala rappresenta il diametro del monostrato di 1,25 mm. La barra dei colori rappresenta le trazioni RMS in Pa. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Distribuzione media dello stress intercellulare normale nei monostrati HUVEC. Distribuzione media della sollecitazione intercellulare normale (Pa) degli HUVEC di controllo a 30 min (A) e 2 h (D), HUVEC trattati con 0,2 sg/mL di chalcone a 30 min (B) e 2 h (E) e HUVEC trattati con 2 g/mL di chalcone a 30 min (C) e 2 h (F). La barra della scala rappresenta il diametro del monostrato di 1,25 mm. La barra colore rappresenta le sollecitazioni in Pa. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Distribuzione massima della sollecitazione intercellulare di taglio nei monostrati HUVEC. Massima sollecitazione intercellulare di taglio (Pa) distribuzione dei HUVEC di controllo a 30 min (A) e 2 h (D), HUVEC trattati con 0,2 g/mL chalcone a 30 min ( B ) e 2 h ( E ) e HUVEC trattati con 2 g/mL di chalcone a 30 min ( C ) e 2 h (E) e HUVEC trattati con 2 g/mL di chalcone a 30 min (C) e 2 h (E) e HUVEC trattati con 2 2 h (F). La barra della scala rappresenta il diametro del monostrato di 1,25 mm. La barra colore rappresenta le sollecitazioni in Pa. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Confronto tra tradizioni RMS e stress intercellulari nei monostrati HUVEC e impatto del trattamento delle calcae sulle strutture Cx43 della giunzione gap HUVEC. I grafici di sollecitazione intercellulare normale media (A), sollecitazione intercellulare massima (B) e trazioni RMS (C) mostrano l'impatto delle dosi di chalcone (0,2 g/mL e 2 g/mL) sui monostrati HUVEC rispetto al controllo. Le barre di errore mostrano un errore standard. I risultati sono risultati statisticamente significativi (dimensioni del campione : 6 isole, con un livello di confidenza del 95%) utilizzando entrambi i test t rispetto al controllo (p < 0.05) e ANOVA a fattore singolo (p < 0,05). In piatti separati, l'immunostaining è stato eseguito 5 h dopo l'aggiunta del farmaco per le isole di cellule che risiedano su idrogel morbidi 1,2 kPa. Il colore verde rappresenta Cx43 e il blu rappresenta DAPI (nucleo). Il Pannello D illustra quanto segue: controllo (E,H), 0,2 celle trattate con chalcone di g/mL (F, I) e cellule trattate 2 g/mL di chalcone (G,J). Barra di scala : 200 m, obiettivo 20x. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Supplementary Figure 1
Figura supplementare Figura 1: colorazione Cx43 ad alta risoluzione nei monostrati HUVEC. I monostrati HUVEC fissi sono stati macchiati per Cx43 (verde) e nucleo (DAPI, blu) per osservare l'effetto dipendente dalla dose di chalcone. Immagini di ingrandimento più elevato (obiettivo 63x) rivelano la localizzazione Cx43 per lo più intorno al nucleo (evidente dall'intensità della fluorescenza verde). Le celle trattate con chalcone (A-C), 0,2 g/mL di chalcone (D-F) e 2 cellule trattate con chalcone g/mL (G-I). Barra di scala 100 m, obiettivo: 63x immersione dell'olio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1200 Pa 870 Pa 1 kPa 4 kPa 6.3 kPa 11 kPa 90 kPa 150 kPa
Composizione della soluzione 0,05% BIS 0.1% BIS 0,03% BIS 0.1% BIS 0,03% BIS 0,07% BIS 0.3% BIS 0,6% BIS
5.5% Acrilla 2% Acrile 5% Acrile 5% Acrile 10% Acrileno 10% Acrileno 12% Acrillo 12% Acrillo
Acqua ultra pura 12,49 mL 13,38 mL 12,78 mL 12.255 mL 10.905 mL 10,63 mL 8,30 mL 5,9 mL
40% Acrilammide 2.062 mL 750 ll 1.875 mL 1.875 mL 3,75 ml 3,75 mL 4,5 mL 4,5 mL
2% BIS Acrilamide 375 ll 750 ll 225 ll 750 ll 225 ll 525 ll 2,12 mL 4,5 mL
Perline fluorescenti (0,2 m o 0,5 m) 80 ll 80 ll 80 ll 80 ll 80 ll 80 ll 80 ll Le trazioni non sono misurabili

Tabella 1: Gel di poliacrilammide che formula per la moduli di diversi Giovani.

volume Spessore Coverslip
20 mm sl bene spesso 500 lL 1 mm 25 mm
sottile 24 ll 100 usd di m 18 mm
14-mm sl bene spesso 175 lL 700 usd di m 18 mm
sottile 10,3 L L 100 usd di m 12 mm
14 mm 6-bene spesso 280 ll 1,5 mm 18 mm

Tabella 2: Volume e spessore del gel.

File supplementare: MATLAB Routines. Fare clic qui per visualizzare questo file (fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare).

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Discussion

Il nostro gruppo, così come altri, ha utilizzato con successo TFM e MSM per sondare l'influenza delle giunzioni cellula-cellula in vari processi cellulari patologici e fisiologici in vitro7,15,18,27 . Per esempio, Hardin e altri hanno presentato uno studio molto approfondito che suggerisce guide di trasmissione intercellulare della trasmissione della stress la formazione di gap paracellulare nelle cellule endoteliali15. Sebbene sia possibile mettere in relazione i cambiamenti correlati al Cx43 che riportiamo qui ai cambiamenti riportati da Hardin et al., non affrontiamo specificamente la formazione di gap paracellulare in questo protocollo. Qui, abbiamo presentato un protocollo basato sulla meccanica per indirizzare specificamente la giunzione gap Cx43 e studiare la sua influenza sulla biomeccanica endoteliale.

Per rendere questo protocollo di successo, ci sono state alcune sfide che abbiamo dovuto superare, alcune delle quali potrebbero verificarsi se altri ricercatori decidessero di adottare il nostro protocollo per studi simili. Una delle principali sfide è stata quella di trovare una gamma di dosi ottimali di chalcone in cui l'espressione Cx43 potesse essere inibita, mantenendo contemporaneamente intatte le nostre monostrati endoteliali. L'IC50 di chalcone per HUVEC è stato precedentemente segnalato per essere 10.01 g/mL28. Tuttavia, quando abbiamo esposto i nostri monostrati HUVEC a più concentrazioni di chalcone che vanno da 0,2 g/mL a 20 g/mL, abbiamo trovato una concentrazione di chalcone di 2 g/mL come la più alta concentrazione che i nostri monostrati potrebbero sopportare pur rimanendo confluenti. Un mostrato confluente era essenziale per questo protocollo, in quanto è necessario un monostrato per misurare le sollecitazioni intercellulari usando MSM. Successivamente, abbiamo eseguito un test di immunofluorescenza per determinare se le dosi selezionate di chalcone hanno interrotto con successo la struttura Cx43 o l'espressione apparente. Il nostro risultato ha rivelato che, sebbene l'interruzione della struttura Cx43 con chalcone di 0,2 g/mL fosse visivamente difficile da distinguere dal controllo, le cellule trattate con 2 g/mL di chalcone sembravano mostrare un'apparente differenza nella struttura e nella potenziale espressione di Cx43 ( Figura 6D e Figura supplementare 1). Inoltre, i nostri risultati hanno mostrato che la rottura del Cx43 influenza infatti la biomeccanica endoteliale riducendo le trazioni e le sollecitazioni intercellulari alla sua massima concentrazione. Questi risultati sono in accordo con Bazellieres et al. che ha mostrato il silenziamento di Cx43 con siRNA per ridurre anche le trazioni e le sollecitazioni intercellulari, ma in un foglio di cellule epiteliali27. Anche se i nostri risultati sono in accordo con gli altri, va notato che la molecola che abbiamo usato per interrompere l'espressione Cx43, chalcone, è stato anche suggerito di influenzare l'attivazione di MAPK e NFkB oltre alla rottura Cx4326. Pertanto, poiché non abbiamo esaminato specificamente le molecole di cui sopra o le loro vie associate, non possiamo escludere l'influenza che una potenziale perturbazione mapK e NFkB può avere anche sulla biomeccanica endoteliale.

Un altro punto chiave degno di nota è che le trazioni recuperate e le sollecitazioni intercellulari sono di natura 2D e ignorano le trazioni del piano (direzione z) e le sollecitazioni intercellulari12,13. Sebbene vi sia un piccolo errore associato all'ignorare le sollecitazioni fuori piano, questo errore è trascurabile13. Inoltre, la dimensione laterale del monostrato è sufficientemente grande (1,25 mm) rispetto all'altezza del monostrato (5 m) in modo tale da non aspettarci spostamenti significativi nella direzione z. Inoltre, il calcolo MSM offre un errore al limite del monostrato12,13. Tuttavia, Tambe et al. sperimentalmente hanno mostrato che gli errori sono più alti ai bordi ottici (cioè il confine del monostrato) e decadimenti rapidamente distale dai bordi limite13. Eseguiamo micropatterning e quindi calcoliamo le sollecitazioni intercellulari dell'intero mostrato per evitare errori di confine che possono verificarsi durante il calcolo della sollecitazione intercellulare.

La microscopia a stress monostrato viene utilizzata in questo protocollo in quanto le informazioni di stress intercellulare fornite da questo metodo sono essenziali per avere una comprensione più completa del ruolo che l'interruzione del gap ha sulla biomeccanica endotele. Inoltre, le sollecitazioni intercellulari sono state suggerite come importanti nella funzione di barriera endoteliale, come suggerito da Hardin et al.15 e Krishnan et al.17, per esempio. Inoltre, mentre le sollecitazioni intercellulari sono state correlate alle trazioni nei dati rappresentativi qui presentati, questo non è sempre il caso a seconda dello stimolo. Nello studio di Steward et al., ad esempio, le sollecitazioni intercellulari endoteliali sono diminuite sotto taglio fluido, mentre le trazioni sono rimaste relativamente invariate7. Inoltre, il protocollo che presentiamo qui non consente la misurazione simultanea delle forze meccaniche derivate dalle cellule e la colorazione delle giunzioni e delle adere, ma tale aggiunta sarebbe complementare a questo protocollo. In chiusura, il protocollo che presentiamo qui descrive un metodo basato sulla meccanica per studiare l'influenza che Cx43 ha esclusivamente sulla biomeccanica endoteliale, in particolare sulle forze derivate dalle cellule endoteliche. Crediamo che il nostro protocollo basato sulla meccanica possa essere utilizzato in combinazione con i protocolli basati sulla biologica attualmente esistenti per fornire un lavoro davvero innovativo sul campo.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi di start-up dell'Università della Florida centrale e dal National Heart, Lung, And Blood Institute del National Institute of Health sotto il premio K25HL132098.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18 mm coverslip ThermoFisher 18CIR-1 Essential to flatten polyacrylamide gels
2% bis-acrylamide BIO-RAD 1610143 Component of polyacrylamide gel
2′,5′-Dihydroxychalcone SIGMA IDF00046 To disrupt Cx43 structure
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate SIGMA 2530-85-0 Stock solution to make bind silane mixture with acetic acid and ultra-pure water
40% Acrylamide BIO-RAD 1610140 Component of polyacrylamide gel
Acetic acid Fisher-Sceintific 64-19-7 Essential to make bind saline solution
Alexa Fluro 488 goat anti-mouse IgG; ThermoFisher Catalog # A-11001 Secondary antibody
Ammonium persulfate BIO-RAD 1610700 Polyacrylamide gel polymerizing agent
Bovine Serum Albumin (BSA) SIGMA 9048-46-8 To make blocking solution
Bovine Type I Atelo-Collagen Solution, 3 mg/mL, 100 mL Advance Biomatrix 5005-100ML Use as a extracellular matrix
Corning Cell Culture Phosphate Buffered Saline (1x) Fisher-Sceintific 21040CV Buffer Saline needed for cell culture
Dimethyl Sulfoxide, Fisher BioReagents Fisher-Sceintific 67-68-5 To dissolve chalcone and make stock solution
Fluoromount-G with DAPI ThermoFisher 00-4959-52 Mounting medium for immunostaing used to stain for DAPI
Fluroscent microsphere Carboxylate-modified beads ThermoFisher F8812 0.5 micron carboxylate-modified beads (red), 2% solids
HEPES buffer solution 1 M SIGMA 7365-45-9 Essential to
LVES ThermoFisher A1460801 Essential HUEVC media 200 supplement
Medium 200 ThermoFisher M200500 Essential media for HUVEC cell culture
Mouse monoclonal Cx43 antibody (CX - 1B1) ThermoFisher Catalog #13-8300 Primary antibody for Cx43
Petri dish (35 mm dia) CellVis D35-20-1.5H 35 mm petri dish with a 20 mm center well
Sulfo-SANPAH Crosslinker 100 mg Proteochem 102568-43-4 Essential to functionalize polyacrylamide gel surface
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit DOW corning 2646340 Silicon elastomer with curing agent to make PDMS
TEMED BIO-RAD 1610801 Polyacrylamide gel polymerizing agent
Triton-X 100 SIGMA 9002-93-1 To permeabilize cells
Trypsin -EDTA ThermoFisher 25300054 Used to detach cells

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References

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Biomeccanica edonteliale perturbatrice tramite Connexin 43 Disgregazione strutturale
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Islam, M. M., Steward, Jr., R. L. Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption. J. Vis. Exp. (152), e60034, doi:10.3791/60034 (2019).More

Islam, M. M., Steward, Jr., R. L. Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption. J. Vis. Exp. (152), e60034, doi:10.3791/60034 (2019).

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