Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

الخلايا الجذعية المشتقة الفيروسية Ag محددة T الخلايا الليمفاوية قمع النسخ المتماثل HBV في الفئران

Published: September 25, 2019 doi: 10.3791/60043
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M University Health Science Center, 2Department of Ophthalmology, Harvard Medical School

Summary

يعرض هنا بروتوكول للقمع الفعال لفيروس التهاب الكبد B (HBV) النسخ المتماثل في الفئران باستخدام نقل الخلايا بالتبني (ACT) من الخلايا الجذعية المشتقة من الخلايا الجذعية مستضد الفيروسي (Ag) محددة T الخلايا الليمفاوية. يمكن تكييف هذا الإجراء للعلاج المناعي المحتمل القائم على ACT للعدوى بفيروس التهاب الكبد V.

Abstract

عدوى فيروس التهاب الكبد B هي قضية صحية عالمية. مع إصابة أكثر من 350 مليون شخص في جميع أنحاء العالم، لا تزال عدوى فيروس التهاب الكبد V السبب الرئيسي لسرطان الكبد. وهذا مصدر قلق كبير، لا سيما في البلدان النامية. فشل الجهاز المناعي في تركيب استجابة فعالة ضد فيروس التهاب الكبد V يؤدي إلى العدوى المزمنة. وعلى الرغم من وجود لقاح فيروس التهاب الكبد B ويجري إنشاء أدوية جديدة مضادة للفيروسات، فإن القضاء على خلايا خزان الفيروس لا يزال موضوعاً صحياً رئيسياً. يرد موضح هنا طريقة لتوليد مستضد فيروسي (Ag) محدد CD8+ الخلايا الليمفاوية T السامة للخلايا (CTLs) المستمدة من الخلايا الجذعية متعددة القوى المستحثة (iPSCs) (أي iPSC-CTLs)، والتي لديها القدرة على قمع النسخ المتماثل HBV. يتم إجراء النسخ المتماثل للفيروس HBV بكفاءة في الفئران من خلال الحقن الهيدرودينامي لبلازميد تعبير HBV، pAAV/HBV1.2، في الكبد. ثم، يتم نقل سطح HBV Ag-Specific الماوس iPSC-CTLs بالتبني، مما يمنع إلى حد كبير النسخ المتماثل HBV في الكبد والدم، فضلا عن يمنع HBV التعبير Ag سطح في خلايا الكبد. يوضح هذا الأسلوب النسخ المتماثل HBV في الفئران بعد الحقن الهيدرودينامي وأن الخلايا الجذعية المشتقة من الخلايا الجذعية الفيروسية Ag-Specific CTLs يمكن منع النسخ المتماثل HBV. يوفر هذا البروتوكول طريقة مفيدة للعلاج المناعي HBV.

Introduction

بعد العدوى الحادة، يتحكم الجهاز المناعي التكيفي (أي الحصانة الفكاهية والخلوية) في الجزء الأكبر من التهاب الكبد الوبائي الحاد المرتبط بـ HBV. ومع ذلك، لا يستطيع عدد من الناس في المناطق الموبوءة بفيروس التهاب الكبد الحلقي V القضاء على الفيروسات ثم تحويلها كأفراد مزمنين. أكثر من 25٪ من المرضى المزمنين (>250 مليون شخص) في جميع أنحاء العالم تطوير مرض الكبد التدريجي، مما أدى إلى تليف الكبد و / أو سرطان الخلايا الكبدية (HCC)1. ونتيجة لذلك، لا يزال القضاء على الخلايا المصابة بإصرار يمثل مشكلة صحية عامة، على الرغم من وجود لقاح متاح2 ويجري تطوير العديد من الأدوية المضادة للفيروسات. يشمل العلاج القياسي لعدوى فيروس التهاب الكبد متعدد السنوات IFN-α، والنيوكليوزيد، ونظائرها النيوكليوتيدات. هذه العوامل لديها نشاط مضاد للفيروسات مباشرة وقدرات التحوير المناعي. ومع ذلك، يظهر التحويل المصلي لمستضد HBe (Ag)+ الناقلين مع الأجسام المضادة للحمض الهيدروكلوريك (Ab) وفقدان حمض الديوكسيريبونوكليك المصلي بشكل فردي في حوالي 20٪ من المرضى المعالجين، والسيطرة المناعية الكاملة للفيروس التحقق من الحرمان من HBsAg لا يزيد عن 5٪3. وعلاوة على ذلك، فإن الاستجابة للعلاج في كثير من الأحيان ليست دائمة. التطعيم الوقائي مع HBs Ag المؤتلف فعال للغاية في الوقاية من العدوى، ولكن التطعيم العلاجي HBs Ag غير فعال. ومن الواضح أن الاستجابات المناعية التي تتوسط فيها الخلايا T تلعب دوراً حاسماً في السيطرة على عدوى فيروس التهاب الكبد V وضعف الكبد. ومع ذلك، في مرضى التهاب الكبد المزمن، وغالبا ما يتم حذف خلايا T HBV التفاعلية، مختلة وظيفيا، أو تحويل استنفدت4،5،6. وبالتالي، في الأفراد المصابين بعدوى فيروس التهاب الكبد متعدد الكلور المستمر، لم تنجح أي محاولات لإعادة المناعة الخاصة بفيروس التهاب الكبد الفيروسي (أي الحصانة القائمة على الخلايا T) عن طريق العلاج المضاد للفيروسات، أو السيتوكينات المناعية، أو التحصين العلاجي.

نقل الخلايا بالتبني (ACT) من خلايا T Ag Ag هو علاج فعال موجهة للقضاء في نهاية المطاف على الخلايا الكبدية المتبقية wih HBV7،8. وقد تبين أن إصابة الفئران المصابة بفيروس التهاب الكبد الوبائي تسبب التهاب الكبد الوبائي العابر والمعتدل، وانخفاض كبير في نسخ حمض الريبونوكليك (RNA) في خلايا الكبد. في هذه الدراسات، لم تمنع CTLs نسخ جينات التهاب الكبد V ولكنها عززت تدهور نصوص فيروس التهاب الكبد1 9. الـ HBV CtLs مهم لمنع العدوى الفيروسية والتوسط لإزالة فيروس التهاب الكبد10و11. بالنسبة للعلاجات المستندة إلى ACT، اقترح التوسع في المختبر لخلايا T الخاصة بـ HBV مع تفاعل عال لإعادة التوطين في الجسم الحي لتكون طريقة مثالية12،13،14؛ ومع ذلك، فإن النهج الحالية مقيدة فيما يتعلق بقدراتها على توليد وفصل وزراعة الكميات والصفات المناسبة من الخلايا T الخاصة بفيروس التهاب الكبد الغذائي من المرضى للعلاجات المحتملة.

على الرغم من أن التجارب السريرية تقدم السلامة، وإمكانية التطبيق العملي، والنشاط العلاجي المحتمل للعلاجات القائمة على الخلايا عن طريق الخلايا T المهندسة التي هي محددة لخلايا الكبد المصابة بفيروس التهاب الكبد، وهناك مخاوف بشأن الآثار غير المواتية التي تحدث من استجابات المناعة الذاتية بسبب التفاعل المتبادل من مستقبلات الخلايا T الاقتران (TCR)15،16، خارج الهدف Ag الاعتراف من قبل TCR غير محددة17 وعلى الهدف خارج السمية من قبل مستقبلات Ag chimeric (CAR) 18 سنة , 19 مع الأنسجة الصحية. حاليا، الخلايا T المعدلة وراثيا، والتي لديها فقط استمرار على المدى القصير في الجسم الحي، وعادة ما تكون متوسطة أو في وقت لاحق الخلايا T. حتى الآن، الخلايا الجذعية متعددة القوى (PSCs) هي المصدر الوحيد المتاح لتوليد أعداد عالية من الخلايا T من نوع واحد Ag السذاجة20،21،22،23. يتم تحويل PSCs المستحثة (iPSCs) ببساطة من الخلايا الجسدية للمريض من خلال استخدام تحويل الجينات من عدة عوامل النسخ. ونتيجة لذلك، فإن الـ iPSCs لها خصائص مماثلة لخصائص الخلايا الجذعية الجنينية (ESCs)24. بسبب المرونة والإمكانية للقدرة اللانهائية على التجديد الذاتي، بالإضافة إلى استبدال الأنسجة، يمكن تطبيق العلاجات المستندة إلى iPSC على نطاق واسع في الطب التجديدي. وعلاوة على ذلك، فإن الأفواج التي تقوم عليها هذه المراكز قد تحسن إلى حد كبير العلاجات الحالية القائمة على الخلايا.

والهدف العام لهذه الطريقة هو توليد كمية كبيرة من CTLs الخاصة بفيروس التهاب الكبد متعدد الكلور من iPSCs (أي iPSC-CTLs) للعلاج المناعي القائم على ACT. المزايا على التقنيات البديلة هي أن HBV محددة iPSC-CTLs لديها TCR من نوع واحد والنمط الظاهري السذاجة، مما يؤدي إلى مزيد من الذاكرة T خلية التنمية بعد ACT. ومن الواضح أن ACT من فيروس التهاب الكبد CV محددة iPSC-CTLs يزيد من هجرة خلايا CD8+ T وظيفية في الكبد ويقلل من النسخ المتماثل HBV في كل من الكبد والدم من الفئران تدار. هذه الطريقة تكشف عن إمكانية استخدام الفيروسية Ag محددة iPSC-CTLs للعلاج المناعي HBV ويمكن تكييفها لتوليد خلايا أخرى الفيروسية Ag محددة iPSC-T للعلاج المناعي الفيروسي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تتم الموافقة على جميع التجارب الحيوانية من قبل لجنة رعاية الحيوانات في جامعة تكساس A&M (IACUC; #2018-0006) ويتم إجراؤها وفقا للمبادئ التوجيهية لرابطة تقييم واعتماد العناية بالحيوانات المختبرية. يتم استخدام الفئران خلال 6-9 أسابيع من العمر.

1. توليد خلاياCD8 وT الفيروسية الخاصة بAg من iPSCs (iPSC-CD8+ الخلايا T)

  1. إنشاء المنشآت الرجعية
    ملاحظة: ترتبط جينات TCR α وβ بتسلسل 2A الذاتي الشق. ناقلات الفيروسات الرجعية MSCV-IRES-DsRed (MiDR) هو DsRed+ 23.
    1. [سوب-ريبّر] [هبس]183-191 ([فلّتريلتي]) [ا-سوبّوند] [أ2-سوبّوند] [هووس-مورين] هجين [تّر] ([س183] [تكر]) مورثات ([ف33] و [فه28]) داخل ال [مندر] أن يخلق ال [س183] [ميدر] بناء(الشكل 1[ا])25.
  2. الانتراب الفيروسي
    ملاحظة: تستخدم خلايا Platinum-E (Plat-E) في تغليف الفيروسات الرجعية (التي تحمل جينات S183 TCR)، والتي سيتم استخدامها في الترانسدوكتيون. خلايا Plat-E هي خلايا التعبئة والتغليف الرجعية فعالة الكامنة وراء الخلايا 293T, التي تم تطويرها عن طريق بنيات التعبئة والتغليف فريدة من نوعها عن طريق المروج EF1α للتعبير عن البروتين بنية الرجعية, بما في ذلك هفوة, بول, وenv ecotropic.
    1. على طبق ثقافة 100 مم، البذور 3 × 106 خلايا Plat-E في 8 مل من DMEM ثقافة المتوسطة التي تحتوي على 10٪ مصل العجل الجنين (FCS) في حاضنة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2، 1 يوم قبل الانعراض.
    2. في اليوم 0، transfect s183 MiDR بناء في خلايا Plat-E باستخدام كاشف الحمض النووي transfection25.
    3. في اليوم الأول، البذور 1 × 106 iPSCs (GFP+) في لوحة ثقافة الجيلاتين المغلفة مسبقا.
    4. في الأيام 2-3، جمع الفيروسات الرجعية التي تحتوي على supernatant من ثقافة الخلية Plat-E لتبديل iPSCs مع S183 TCR في وجود 1,6-dibromohexane الحل25.
    5. في اليوم 4، trypsinize s183 TCR الجينات المنقولة iPSCs، الطرد المركزي في 400 × ز لمدة 5 دقائق والبذور 3 × 105 iPSCs في طبق ثقافة 100 مم المغلفة مسبقا مع 3 × 10 6 206/7 (irSNL76/7) خلايا التغذية25.
    6. في اليوم 5 أو 6 من التقاء، trypsinize الخلايا، الطرد المركزي في 400 × ز لمدة 5 دقائق وعملية لفرز الخلايا. التطفل على الخلايا الحية، وفرز GFP وDsRED الخلايا المزدوجة الإيجابية (s183 TCR الجينات التي تنتقل عن طريق الجينات iPSCs) باستخدام فارز الخلايا عالية السرعة. على غرار الخطوة 1.2.5، شارك في زراعة الخلايا التي تم فرزها على خلايا التغذية irSNL76/7 للاستخدام في المستقبل25.
  3. تمايز خلايا iPSC-CD8+ T الخاصة بـ HBV
    ملاحظة: يمكن للخلايا سترومال OP9-DL1/DL4 overexpress كل من الشق ligands DL1 و DL4، وiPSCs المشاركة في الزراعة مع iPSCs يمكن تعزيز الشق الإشارات بوساطة T خلية التمايز26.
    1. تنمو s183 TCR الجينات المستحثة iPSCs (s183/iPSCs) في أحادية الخلية OP9-DL1-DL4 في وسائل الإعلام المتوسطة الأساسية α-الحد الأدنى (MEM) التي تحتوي على 20٪ مصل البقر الجنيني (FBS)27. إدراج murine Flt3 ligand (mFlt-3L؛ التركيز النهائي = 5 نانوغرام/مل) في الثقافة.
    2. في اليوم 0، البذور 0.5-1.0 × 105 S183/iPSCs في طبق ثقافة 10 سم نمت سابقا مع خلايا OP9-DL1-DL4. التحقق من أن الخلايا OP9-DL1-DL4 في حالة من الملاءمة 80-90%.
    3. في اليوم 5، شطف iPSCs مع 10 مل من الفوسفات المخزنة مؤقتا المالحة (PBS)، يستنشق قبالة PBS، إضافة هذا إلى 4 مل من 0.25٪ تريبسين، وحضانة في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. تتراكم جميع الحلول الهضمية التي تحتوي على الخلايا والطرد المركزي في 400 × ز لمدة 5 دقائق في 15-30 درجة مئوية.
    4. قم بإستقان الخلايا الفائقة وإعادة تعليقها في 10 مل من وسائل الإعلام iPSC. نقل تعليق الخلية إلى لوحة بيتري 10 سم جديدة وحضانة في حاضنة لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية.
    5. بعد 30 دقيقة، جمع وسائط iPSC التي تحتوي على الخلايا العائمة. تمرير تعليق الخلية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر وحساب رقم الخلية.
    6. البذور 5 × 105 خلايا في طبق الثقافة نمت سابقا خلايا OP9-DL1-DL4 مع حالة من 80٪ -90٪ مترافق كما هو موضح في الخطوة 1.3.1.
      ملاحظة: تمايز الخلايا T كل 2-3 أيام الخلايا المشتقة من iPSC تحتاج إلى إعادة البذور مع طبقة جديدة من الخلايا OP9-DL1-DL4.
  4. التقييم
    1. التغيرات المورفولوجية للمركبات iPSCs المُنَمَلّة
      1. مراقبة الخلايا تحت المجهر في أيام مختلفة.
        ملاحظة: بحلول اليوم 5، المستعمرات لها خصائص تشبه mesoderm، وتظهر مورفولوجيا كلاسيكية على شكل المغزل تشبه الخلايا الليفية الجلدية البشرية والنمو المستدام في المختبر. بحلول اليوم 8، تبدأ مجموعات صغيرة مستديرة من الخلايا في الظهور.
    2. تحليل iPSCs المختلفة عن طريق قياس التدفق
      1. في أيام مختلفة من الثقافة المشتركة، وتحليل الخلايا المشتقة من iPSC كما هو موضح سابقا25 (الشكل 1B، C).
    3. التحليل الوظيفي للمراكز المتوسطة من أجل الصحة والإدارة للإعلام المُمَرَفَلة
      1. في اليوم 28 من الثقافة المشتركة، وجمع الخلايا iPSC-CD8+ T من الثقافات من خلال حصاد الخلايا العائمة، trypsinize الخلايا المتبقية مع 0.25٪ تريبسين، إعادة تعليق في 8 مل من وسائل الإعلام iPSC، الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 400 × ز في 15-30 درجة مئوية، وإزالة وسائل الإعلام، ثم إعادة تعليق الخلايا في 10 مل من وسائل الإعلام.
      2. احتفظ بالخلايا المعاد تعليقها في طبق طازج بحجم 10 سم في حاضنة بزاوية 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ولتجميع الخلايا العائمة. ثم شطف الخلايا مرة واحدة مع PBS الباردة.
      3. احتضان 3 × 106 T الخلايا المستنفدة splenocytes (CD4-CD8-) من الطحال من الفئة H-2 I بالضربة القاضية، HLA-A2.1-المعدلة وراثيا (HHD) الفئران مع 5 ميكرومتر s183 الببتيد (FLLTRILTI) في 200 ميكرولتر من وسائل الإعلام في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
      4. إنتاج خليط من الخلايا iPSC-CD8+ T مع الخلايا البراقة النبضية مع الببتيد s183 (الخلايا T: الخلايا الصفرة = 1:4؛ استخدام 0.75 × 106 خلايا T). احتضان خليط من الخلايا في 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 لمدة 40 ساعة. خلال آخر 7 ساعة، إضافة 4 ميكرولتر من بريفيلدين A المخففة في الثقافة (التركيز النهائي من 1000x، والتي سيتم تخفيفها في وسائل الإعلام ثقافة 1X) لمنع عمليات النقل أثناء تنشيط الخلية.
      5. وصمة عار الخلايا وإجراء تحليل التدفق الخلوي من IFN-γ داخل الخلايا كما هو موضح سابقا(الشكل 2).

2- الحث على تكرار فيروس التهاب الكبد B من خلال التسليم الهيدرودينامي لبلازميد HBV

ملاحظة: تم إنشاء pAAV/HBV1.2 كما هو موضح مسبقًا9. يتم دمج الحمض النووي الكامل HBV 1.2 في pAAV المتجه.

  1. الشحنات الهيدروديناميكية من بلازميد HBV من خلال الوريد الذيل
    1. تسخين الفئران HHD باستخدام مصباح الحرارة لمدة 5 دقائق في القفص من أجل مد الوريد الذيل.
    2. احتجاز الحيوان عن طريق مقيد، وذيول الماوس نظيفة مع رذاذ الإيثانول 70٪.
    3. تسليم البلازميد في الكبد.
    4. قياس وزن جسم الماوس باستخدام مقياس قياس.
    5. تخفيف 10 ميكروغرام من بلازميد HBV في ما يعادل 8٪ من كتلة الجسم PBS (على سبيل المثال، 1.6 مل للماوس 20 غرام). تحميل بلازميد المخفف في حقنة 3 مل مع 26 G × 1×2"(0.45 × 12 ملم) إبرة تحت الجلد.
    6. حدد موقع أحد الأوردة الخلفية الجانبية في الثلث الأوسط من الذيل ووضع الإبرة في أي من الوريد الجانبي. إدارة الحقن التي تحتوي على بلازميد HBV من خلال الوريد الذيل في غضون 3 - 5 s.
  2. القياس الكمي لفيرميا من مصل الدم للفئران المصابة
    ملاحظة: يحدث النسخ المتماثل HBV من اليوم 3-35 في مصل الماوس. يُعد ّ نسخ الحمض النووي ذروته في اليوم السابع ويقلل تدريجيًا. لا يتم مسح الحمض النووي HBV من المصل حتى اليوم 35.
    1. جمع مصل الدم من الفئران المصابة
      1. جمع ما يقرب من 0.1 مل من الدم في أنبوب الطرد المركزي الصغير من كل فأر في 3، 5، 7، و 10 أيام بعد العدوى عن طريق نزيف الرجعية المدارية في أنبوب الطرد المركزي الصغير 1.5 مل، ثم احتضان في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 20 دقيقة.
      2. طرد مركزي العينة في 6000 × ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية وجمع supernatant المصل بعد الطرد المركزي.
    2. تنقية الحمض النووي من مصل الدم باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي المتاحة تجاريا بناء على توصيات الشركة المصنعة. وباختصار، تسى الخلايا في عمود يستند إلى السيليكا، وأداء الغسل، واستخراج الحمض النووي عن طريق إضافة الإيثانول 100٪ إلى عمود elution والطرد المركزي في 6000 × ز لمدة 1 دقيقة.
    3. استخدام 100 نانوغرام من الحمض النووي HBV من elution لتحليل PCR في الوقت الحقيقي. استخدام التمهيديات التالية وتحقيقات: إلى الأمام 5 'TAGGAGGCTGTGTAATAAtTGG 3 '؛ عكس 5 'GCACAGCTTGGAGGCTTGT 3 '؛ التحقيق 5 'TCACCTCTGCCTAATC 3'.
      1. استخدام جينوم HBV المحتوي على بلازميد (pAAV/HBV1.2) للمنحنى القياسي وإجراء PCR في الوقت الحقيقي في حجم إجمالي قدره 10 ميكرولتر(الشكل 3).
    4. إعداد تفاعل PCR في حجم إجمالي قدره 10 ميكرولتر كما هو موضح في الجدول 1.
    5. إعداد برنامج PCR في الدراجات الحرارية كما هو موضح في الجدول 2. معدل الانتقال إلى درجة الحرارة المبرمجة هو 20 درجة مئوية / ث لإزالة النضريز / الصلب و 5 درجة مئوية / ث للتمديد. قياس الفلورة في نهاية مرحلة الصلب لكل دورة لرصد PCR في الوقت الحقيقي.

3. الحد من النسخ المتماثل HBV عن طريق ACT من الخلايا الفيروسية Ag محددة iPSC-CD8+ T

  1. نقل الخلايا بالتبني (ACT)
    1. تمييز s183/iPSCs (1.3.7) على الخلايا سترومال OP9-DL1-DL4 في وجود mFlt-3L و mIL-7 لمدة 8 أيام على النحو المبين في القسم 1.3.
    2. في اليوم 22، جمع الخلايا iPSC-CD8+ T من لوحة 10 سم مع التربسين، ثم يغسل ويعلق كل لوحة 10 سم في 10 مل من وسائل الإعلام الطازجة. إضافة الخلايا إلى لوحة 10 سم جديدة والعودة إلى الحاضنة لمدة 30 دقيقة كما هو الحال في القسم 1.3. بعد 30 دقيقة، وجمع الخلايا العائمة.
    3. استخدام مصفاة النايلون 70 م لتمرير الخلايا للقضاء على مجموعات الخلايا وعد رقم الخلية. تكييف الخلايا إلى تركيز 1.5 × 107 خلايا / مل في حل PBS الباردة واستخدام مصفاة النايلون 70 م لتمرير الخلايا للقضاء على مجموعات الخلايا مرة أخرى إذا لزم الأمر. إبقاء الخلايا على الجليد حتى ACT.
    4. حقن تعليق الخلايا 200 ميكرولتر (3 × 106 خلايا) في 4-6 أسابيع من العمر الفئران HHD من خلال الوريد الذيل.
  2. تحريض النسخ المتماثل للفيروس التهاب الكبد V
    1. في اليوم 14 بعد نقل الخلية، قم بإجراء التسليم الهيدرودينامي لبلازميد HBV من خلال الوريد الذيل كما هو موضح في القسم 2.1.
  3. الكشف عن بروتين الفيروس من الكبد المصاب
    1. التضحية الفئران في الأيام 3 و 5 و 7 و 14 و 21 بعد العدوى. للقتل الرحيم، في كل قفص، استخدم 1-2 لتر من ثاني أكسيد الكربون (CO2)في المرحلة الأولى. عندما يتطور الحيوان فقدان الوعي، كسب معدلتدفق ثاني أكسيد الكربون حول 4-5 لتر / دقيقة.
    2. فصل الكبد عن طريق قطع الجلد السطحي من البريطون باستخدام مقص وملقط وسحب قليلا الكبد مرة أخرى للكشف عن بطانة الجلد الداخلية تجويف البريكوني. جمع وقطع عينات الكبد (طول × عرض × ارتفاع = 0.5 سم × 0.5 سم × 0.3 سم) من الفئران المصابة لتناسب بسهولة في شريط التضمين وكتلة في 10٪ محايدة العازلة فورمالين لمدة 4-24 ساعة.
    3. الشارات عينات الكبدباستخدام 2.5 M حمض الفورميك؛ شطف في الزيلين لمدة 3 دقائق، شطف 2X في 100٪ الإيثانول، شطف 2X في 95٪ الإيثانول، شطف 2X في الماء منزوع الأيونات (DI) لمدة 2 دقيقة، ثم decalcify عينات الكبد في 1 m حمض الإيثيلينديامينيتيتيك (EDTA) في المقابل. التعامل مع في درجة حرارة شبه الغليان (90 درجة مئوية) لمدة 20 دقيقة.
    4. تبريد أنسجة الكبد الثابتة لمدة 30 دقيقة. تجفيف الأنسجة في سلسلة من تركيزات متزايدة من الإيثانول لتحل محل الماء، ومن ثم تزج في الغمر الزيلين. تضمين الأنسجة المتسللة في كتل الشمع. جعل بالتساوي عمودي وأفقي المقطع للتلطيخ. إعداد 4 أقسام ميكروتومي مع ميكروتومي انزلاق.
    5. تمرير المقاطع من خلال deparaffinization والإماهة باستخدام الزيلين والإيثانول، ثم تنفيذ تلطيخ الفلورسنت المناعي من الأقسام.
    6. وصمة عار المقاطع مع 200 درجة مئوية من سطح HBV Ag-Specific الأجسام المضادة (1:100 تخفيف في حل حظر). قم باحتضان الأقسام مع الجسم المضاد لمدة 2 ساعة في RT في غرفة رطبة بنسبة 75%-100%، واغسل 5x في 1x PBS لمدة 5 دقائق.
    7. استخدم كاشفمضاد للتلاشي يحتوي على 4'، 6-دياميدينو-2-فينيليندول (DAPI) للتلطيخ النووي لمكافحة وصمة عار الشرائح. إضافة غطاء مع حوالي 300 درجة مئوية من محلول تلطيخ DAPI المخفف (300 nM في 1X PBS) والتحقق من صحة غطاء كامل تغطية. إبقاء الشرائح في الظلام في 4 درجة مئوية حتى التفتيش تحت المجهر الفلورسنت.
  4. تسلل الخلايا الالتهابية في الفئران المصابة
    1. التضحية الفئران كما هو موضح في الخطوة 3.3.1. جمع الكبد وجعل المقاطع كما هو موضح في الخطوة 3.3.4.
    2. وصمة عار القسم مع هيماتوكسيلين ويوسين (H & E) لتقييم تسلل الخلايا الالتهابية في الكبد.
    3. تخزين الشرائح في الظلام في 4 درجة مئوية حتى مزيد من التحليل تحت المجهر الفلورسنت.
    4. تصور الشرائح تحت المجهر الفلوري للكشف عن تسلل الخلايا الالتهابية إلى الكبد(الشكل 4).
  5. الكشف عن الحمض النووي HBV الكبد المصاب
    1. عزل الحمض النووي الفيروسي.
    2. قتل الفئران وجمع عينات الكبد وفقا للقسم 3-3.
    3. Lyse أنسجة الكبد في Nonindet P-40 (NP-40) الليسيس العازلة (50 mM Tris-HCL، 1 MM EDTA، 1٪ NP-40) التي تحتوي على كوكتيل مثبطات البروتياز.
    4. لفترة وجيزة الطرد المركزي في 16،000 × ز لإزالة النوى والحطام الخلية.
    5. احتضان السيتوبلازممع مع النوكسيال المجهري (نوكليس S7؛ 150 وحدة / مل) وCaCl2 (5 MM) في 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة لتحلل حمض النوى خارج النوى (NC).
    6. تعطيل nuclease S7 بإضافة 10 MM EDTA.
    7. يعجل النوكليوكابسيس مع البولي ايثيلين غليكول (PEG)، وتعطيل بنسبة 0.5٪ كبريتات دودسيل الصوديوم (SDS)، وهضم مع 0.6 ملغ / مل proteinase K (PK) في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    8. استعادة الأحماض النووية الفيروسية عن طريق استخراج الكلوروفورم الفينول وهطول الأمطار الإيثانول.
    9. حل الحمض النووي الفيروسي المستخرج على هلام أغاروز 1.2٪ والكشف عن طريق تحليل وصمة عار الجنوبية القياسية باستخدام32 P-المسمى HBV الحمض النووي التحقيق.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

كما هو موضح هنا، يتم إنشاء خلايا HBV الفيروسية Ag-CD8-CD8+ T بواسطة نظام زراعة في المختبر. بعد ACT من هذه الفيروسية Ag-Specific iPSC-CD8+ T الخلايا منع إلى حد كبير النسخ المتماثل HBV في نموذج murine (ملف تكميلي 1). يتم نقل iPSC الماوس مع MIDR البنى الرجعية ترميز الجين الهجين HBV HCR الإنسان الماوس (HBs183-191محددة، S183)، ثم يتم زرع iPSCs التي يسببها الجينات مع خلايا OP9-DL1/DL4 التعبير عن ligands الشق (كل من DL1 و DL4) الجزيئات في وجود rFlt3L و rIL-7. في اليوم 28 من الثقافة المشتركة في المختبر، تعبر الخلايا المشتقة من iPSC بشكل كبير CD3 وTCR الخاصة بـ Ag (علامات الخلايا T). يظهر تحليل مقياس التدفق لـ CD3+CD8+ عدد السكان أن انتقال فيروس HBV TCR يزيد بشكل كبير من توليد خلايا CD8+ T الخاصة بـ s183 الفيروسية (الشكل 1).

في اليوم 28 من الثقافة المشتركة في المختبر، يتم عزل CD4-CD8+ واحد إيجابي (SP) iPSC-CD8+ T الخلايا وحفزها من قبل الخلايا المعبأة T المنضب ة نابضة بالببتيد s183، ويتم تقييم إنتاج السيتوكين. وتنتج الـ iPSC-CTLs كميات كبيرة من IL-2 وIFN-Υ كما تم الكشف عنها عن طريق تلطيخ داخل الخلايا أو ELISA(الشكل 2). يتم حث عدوى فيروس التهاب الكبد B في الفئران المعدلة وراثيا HLA-A2.1 (HHD) عن طريق الحقن الهيدرودينامي من 10 ميكروغرام من pAAV /HBV1.2 بلازميد الحمض النووي من خلال عروق الذيل من الفئران. يتم الكشف عن النسخ المتماثل HBV من اليوم 3-21 في مصل الفئران HHD. ويتصدر النسخ المتماثل للحمض النووي ذروته في اليوم السادس ويقلل تدريجياً من استخدام تحليل PCR في الوقت الحقيقي(الشكل 3).

بعد أسبوعين من ACT، يتم تحدي الفئران مع حقن الهيدروديناميكية من pAAV / HBV1.2 بلازميد الحمض النووي. يتم قياس التتر فيروسي عن طريق PCR في الوقت الحقيقي من المصل في نقاط زمنية مختلفة بعد الحقن. وتبين النتائج أن النسخ المتماثل الفيروسي ينخفض بشكل كبير في جميع النقاط الزمنية في الفئران التي تتلقى خلايا T الفيروسية Ag-Ag مقارنة مع الفئران التي تتلقى خلايا التحكم(الشكل 4A). كما يتم فحص تعبير البروتين السطحي HBV في الكبد في الإعداد أعلاه من العلاج. يتم قتل الفئران في أيام مختلفة بعد حقن فيروس التهاب الكبد، ويتم عزل عينات الكبد لفحص الأنسجة. عينات ملطخة للبروتين سطح HBV وفحصها تحت المجهر الفلوري. ويلاحظ أن بروتين سطح فيروس التهاب الكبد B انخفض بشكل كبير في الفئران التي تتلقى فيروس التهاب الكبد B الفيروسي Ag-CtLs الخاص بـ Ag، مقارنة بالفئران التي تتلقى خلايا التحكم(الشكل 4باء). توضح هذه التجربة بوضوح أن الخلايا الفيروسية iPSC-CD8+ T لديها القدرة على تقليل النسخ المتماثل HBV في نموذج murine.

Figure 1
الشكل 1: توليد خلايا فيروس التهاب الكبد الفيروسي الفيروسي ة - IPSC-CD8+ T.
يتم نقل iPSCs الماوس مع المنشآت الفيروسية الرجعية التالية: HBs183-91 TCR (MiDR-s183 TCR) أو OVA257-264 TCR (MiDR-OVA TCR)، ويتم زراعة iPSCs المستحثة مع الخلايا سترومال OP9-DL1/DL4 لتمايز النسب T. (أ)التمثيل التخطيطي للبنية الرجعية MiDR-s183 TCR التعبير عن S183 محددة TCR. ( = إشارة التعبئة والتغليف؛ 2A = بيكورنافيروس الذاتي شق 2A تسلسل; LTR = تكرار المحطة الطرفية الطويلة. (ب)مورفولوجيا تمايز الخلايا T في الأيام 0 و 7 و 14 و 22. (C)تحليل مقياس التدفق للخلايا المشتقة من iPSC في اليوم 28. يتم مسور CD3+CD8+ الخلايا (يسار) كما هو مبين وتحليلها للتعبير عن CD8 و TCRVβ28 (يمين). والبيانات المعروضة تمثل ثلاث تجارب فردية. القيم تمثل المتوسط ± SD (**p < 0.01; المقترنة t-الاختبارات). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: التحليل الوظيفي للخلايا الفيروسية من نوع HBV IPSC-CD8+ T.
في اليوم 28 من الثقافة المشتركة في المختبر، يتم فرز SP CD8+s183 TCR pentamer+ خلايا iPSC-T. يتم تحفيز الخلايا iPSC-T وCD8+ الخلايا T التي يتم نقلها باستخدام MiDR-s183 TCR بواسطة الخلايا البراقة المنضبة T (APCs) من الفئران HHD ونابضة ببتيد s183 (FLLTRILTI). (أ)تلطيخ داخل الخلايا من IFN-Υ بعد 7 ح (مسور على CD8+ خلايا) (T / APCs = 1:4). (ب)ELISA من IFN-γ بعد 40 ح. البيانات المعروضة هي ممثلة لثلاث تجارب فردية. القيم تمثل يعني ± SD (n.s., p > 0.05; المقترنة t-الاختبارات). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: حث النسخ المتماثل للفيروس HBV في فئران HHD عن طريق الحقن الهيدرودينامي.
الفئران HHD هي i.v. تدار مع بلازميد HBV عن طريق حقن الوريد الذيل الهيدروديناميكية. يتم حقن 10 ميكروغرام من بلازميد مع 8٪ من مجموع كتلة الجسم PBS. في نقاط الوقت المشار إليها بعد الحقن، يتم عزل المصل من الدم ويتم استخراج الحمض النووي لPCR في الوقت الحقيقي. والبيانات المعروضة تمثل ثلاث تجارب فردية. القيم تمثل يعني ± SD. البيانات هي ممثلة لخمسة فئران لكل مجموعة من ثلاث تجارب مستقلة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: الحد من النسخ المتماثل للفيروس المضاد للفيروسات الكُسد بواسطة ACT للخلايا الفيروسية التي تحمل نوع Ag-CD8+ T.
يتم نقل الفئران HHD بالتبني مع الفيروسية Ag محددة iPSC-CD8+ T خلية الذرية (في اليوم 22 من الثقافة في المختبر) وتدار مع بلازميد HBV في الأسبوع 2 بعد نقل الخلية. (أ)سيروم HBV نسخ. في الوقت المشار إليه بعد الحقن، يتم عزل المصل من الدم، ويتم استخراج الحمض النووي لتحليل PCR في الوقت الحقيقي. والبيانات المعروضة تمثل ثلاث تجارب فردية. القيم تمثل يعني ± SD.(B)أنسجة الكبد الأنسجة. يتم قتل الفئران في اليوم 8 بعد الإصابة بفيروس التهاب الكبد V. عينات الكبد معزولة وملطخة لفحص الأنسجة. تُظهر اللوحة العلوية تعبير بروتين HBsAg في الفئران المصابة (تلطيخ IHC) وتظهر اللوحة السفلية تسلل الخلايا الالتهابية (تلطيخ HE-staining). البيانات تمثل خمسة فئران لكل مجموعة من ثلاث تجارب مستقلة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

قالب الحمض النووي 2 مل
خليط التهجين الرئيسي للحمض النووي ((بوليميراز الحمض النووي من طاقة، المخزن المؤقت لرد الفعل PCR، 10 مل مكل 2، وخليط dNTP) 1 مل
25 مليون متر مربع 0.8 مل
0.3 μM التحقيق 3 مل
5 ميكرومتر من كل التمهيدي 3.2 مل
مجموع 10 مل

الجدول 1: حجم تفاعل تفاعل PCR

درجه الحراره الوقت
التناطور 95 درجة مئوية 5 s
الصلب 53 درجة مئوية 10 s
ملحق 72 درجة مئوية 20 s
5 درجة مئوية

الجدول 2: برنامج PCR

الملف التكميلي 1: الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يقدم هذا البروتوكول أسلوب لإنشاء CTLs iPSC-CTLs خاص بـ Ag الفيروسية لاستخدامها كـ ACT لمنع النسخ المتماثل HBV في طراز murine. في عدوى فيروس التهاب الكبد الفيروسي المزمن، يشكل الجينوم الفيروسي كروموسوم صغير مستقر، الحمض النووي الدائري المغلق بشكل مشترك (cccDNA) الذي يمكن أن يستمر طوال عمر الخلايا الكبدية. استهداف إزالة الكروموسوم الصغير الفيروسي قد يؤدي إلى علاج عدوى فيروس التهاب الكبد الفيروسي المزمن. يستهدف العلاج المضاد للفيروسات الحالي النسخ العكسي للفيروس ولكنه نادراً ما يؤسس السيطرة المناعية على تكرار فيروس التهاب الكبد الفيروسي مدفوعاً بـ cccDNA. يمكن CD8+ CTLs محددة HBV التوسط في قتل خلايا الكبد المصابة وتسريع إزالة cccDNA. ومع ذلك، يتم حذف CTLs الخاصة بـ HBV، أو خلل وظيفي، أو الخضوع للإرهاق في المرضى الذين يعانون من عدوى فيروس التهاب الكبد B المزمن. ACT مع CTLs الخاصة بالتهاب الكبد متعدد الفولت هو علاج مناسب للعدوى المزمنة HBV28،29. الخلايا الليمفاوية T المشتقة من الخلايا T السذاجة أو المركزية (أي الخلايا المناعية شديدة التفاعل) هي المفعول المثالي للعلاجات المستندة إلى ACT بسبب انتشارها الكبير، وانخفاض الميل إلى الموت مقارنة بالخلايا المتمايزة بشكل نهائي، وممتازة القدرة على الاستجابة للسيتوكينات المثلية. ومع ذلك، فإن مثل هذا ACT لم يكن ممكناً في كثير من الأحيان بسبب الصعوبات في الحصول على أعداد كافية من CTLs من المرضى. وقد تبين سابقا أن إعادة برمجة CTLs Ag محددة أو Tregs من iPSCs يمكن استخدامها للعلاجات القائمة على الخلايا20،23،27،30. يوضح هذا التقرير طريقة لتوليد الفيروسية الخاصة بـ Ag-CTLS واستخدام هذه الخلايا للعلاج المناعي المستند إلى ACT في نموذج murine من النسخ المتماثل HBV.

على الرغم من أن هناك نماذج الماوس المعدلة وراثيا من النسخ المتماثل HBV، وهذه النماذج هي صعبة لأن التسامح المركزي الناجم عن منتجات الجينات المعدلة وراثيا يسبب الفئران أن تكون محصنة متسامحة مع HBV Ags. بالإضافة إلى ذلك، الفئران المعدلة وراثيا ليست مناسبة لرصد إزالة الفيروسية كما الجينوم HBV المتكاملة لا تزال قائمة في كل خلية الماوس31،32. أيضا، على الرغم من أنه تم تطوير لقاحات ناجحة للوقاية من العدوى، لم يتم تطوير العلاج أو العلاج المناعي بعد الإصابة بفيروس التهاب الكبد B. وعلاوة على ذلك، أعيقت النُهج التجريبية لمسببات الأمراض ضد فيروس التهاب الكبد Hb لأن النطاق المضيف لعدوى فيروس التهاب الكبد V يقتصر على الرجال والشمبانزي، كما أن نظام الثقافة في المختبر لنشر فيروس التهاب الكبد. CD8+ T الخلايا هي خلايا تأثير واعدة ضد أنواع مختلفة من العدوى الفيروسية; ومع ذلك، استجابة الخلية T ضد HBV ليست وفيرة. قد تكون الخصوصية والأداء وعدم وجود أعداد كافية لتركيب استجابة مناعية هي السبب. يكشف هذا التقرير عن طريقة الحقن الهيدرودينامي الذي يحفز بكفاءة النسخ المتماثل HBV في الفئران. تسمح هذه الطريقة بإيصال كمية كبيرة من بلازميد HBV مباشرة إلى الكبد. يعرض النموذج فيرميا مستمرة لأكثر من 8 أسابيع مع الكشف عن فيروس التهاب الكبد B mRNA, البروتين, والحمض النووي في أيام مختلفة بعد الحقن. هذه الطريقة للنسخ المتماثل HBV في الفئران مفيدة للعلاج المناعي HBV.

وباختصار، تم بنجاح إجراء النسخ المتماثل للفيروس المضاد للفيروسات الأوعية في الفئران من خلال إجراء الحقن الهيدرودينامي، واستخدمت الخصائص الفيروسية الخاصة بـ iPSC-CTLs كعلاج مناعي لتكرار فيروس التهاب الكبد. ومع ذلك، هناك حدان من الطريقة: (1) أكثر من ثلاثة أسابيع من التمايز في الخلايا T في المختبر قد يقلل من التطبيقات الترجمة للخلايا T التي تم إنشاؤها لACT; و (2) حقن الهيدروديناميك HBV يمكن أن تحفز بكفاءة النسخ المتماثل HBV في الكبد؛ ومع ذلك، فإنه لا يشكل cccDNA، وهو السبب الرئيسي للعدوى HBV المستمرة. ومع ذلك، توفر هذه الطريقة نهجاً بديلاً لتكرار فيروس التهاب الكبد V وعلاجه. ومن المرجح أن يؤدي نظام الجمع باستخدام العقاقير المضادة لفيروس التهاب الكبد الغذائي وACT من الأمراض المضادة للفيروسات الكمرة وCTLs الفيروسية الخاصة بـ Ag إلى الحد من خزانات فيروس نقص المناعة البشرية، مما يؤدي إلى علاج للإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية المزمن.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

يشكر المؤلفون الدكتور آدم ج غيرينغ من معهد أبحاث مستشفى تورونتو العام على توفير الـ cDNA لـ HBs183-91 (s183) (FLLTRILTI)- الجينات الهجينة التي تم تقييدها من قبل الإنسان والمورين، والدكتور بي جير تشين من جامعة تايوان الوطنية لتوفيره pAAV/HBV 1.2 بناء. ويدعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للصحة منحR01AI121180، R01CA221867 و R21AI109239 إلى J. S.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HHD mice Institut Pasteur, Paris, France H-2 class I knockout, HLA-A2.1-transgenic (HHD) mice
iPS-MEF-Ng-20D-17 RIKEN Cell Bank APS0001
SNL76/7 ATCC SCRC-1049
OP9 ATCC CRL-2749
pAAV/HBV1.2 plasmid Dr. Dr. Pei-Jer Chen (National Taiwan University Hospital, Taiwan) HBV DNA construct
HBs183-91(s183) (FLLTRILTI)-specific TCR genes Dr. Adam J Gehring (Toronto General Hospital Research Institute, Toronto, Canada) FLLTRILTI-specific A2-restricted human-murine hybrid TCR genes (Vα34 and Vβ28)
OVA257–264-specific TCR genes Dr. Dario A. Vignali (University of Pittsburgh, PA) SIINFEKL-specific H-2Kb-restricted TCR genes
Anti-CD3 (17A2) antibody Biolegend 100236
Anti-CD44 (IM7) antibody BD Pharmingen 103012
Anti-CD4 (GK1.5) antibody Biolegend 100408
Anti-CD8 (53-6.7) antibody Biolegend 100732
Anti-IFN-γ (XMG1.2) antibody Biolegend 505810
Anti-TNF-a (MP6-XT22) antibody Biolegend 506306
α-MEM Invitrogen A10490-01
Anti-HBs antibody Thermo Fisher MA5-13059
ACK Lysis buffer Lonza 10-548E
Brefeldin A Sigma B7651
DMEM Invitrogen ABCD1234
FBS Hyclone SH3007.01
FACSAria Fusion cell sorter BD 656700
Gelatin MilliporeSigma G9391
GeneJammer Agilent 204130
HLA-A201-HBs183-91-PE pentamer Proimmune F027-4A - 27
HRP Anti-Mouse Secondary Antibody Invitrogen A27025
mFlt-3L Peprotech 250-31L
mIL-7 Peprotech 217-17
Nuclease S7 Roche 10107921001
Paraformaldehyde MilliporeSigma P6148-500G Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic
Permeabilization buffer Biolegend 421002
Polybrene MilliporeSigma 107689
ProLong™ Gold Antifade Mountant with DAPI Invitrogen P36931
QIAamp MinElute Virus Spin Kit Qiagen 57704

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Scaglione, S. J., Lok, A. S. Effectiveness of hepatitis B treatment in clinical practice. Gastroenterology. 142 (6), 1360-1368 (2012).
  2. Osiowy, C. From infancy and beyond... ensuring a lifetime of hepatitis B virus (HBV) vaccine-induced immunity. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (8), 2093-2097 (2018).
  3. Gish, R. G., et al. Loss of HBsAg antigen during treatment with entecavir or lamivudine in nucleoside-naive HBeAg-positive patients with chronic hepatitis B. Journal of Viral Hepatitis. 17 (1), 16-22 (2010).
  4. Kurktschiev, P. D., et al. Dysfunctional CD8+ T cells in hepatitis B and C are characterized by a lack of antigen-specific T-bet induction. Journal of Experimental Medicine. 211 (10), 2047-2059 (2014).
  5. Fisicaro, P., et al. Antiviral intrahepatic T-cell responses can be restored by blocking programmed death-1 pathway in chronic hepatitis B. Gastroenterology. 138 (2), 682-693 (2010).
  6. Schurich, A., et al. The third signal cytokine IL-12 rescues the anti-viral function of exhausted HBV-specific CD8 T cells. PLoS Pathogens. 9 (3), 1003208 (2013).
  7. Gehring, A. J., et al. Engineering virus-specific T cells that target HBV infected hepatocytes and hepatocellular carcinoma cell lines. Journal of Hepatology. 55 (1), 103-110 (2011).
  8. Xia, Y., et al. Interferon-gamma and Tumor Necrosis Factor-alpha Produced by T Cells Reduce the HBV Persistence Form, cccDNA, Without Cytolysis. Gastroenterology. 150 (1), 194-205 (2016).
  9. Huang, L. R., Wu, H. L., Chen, P. J., Chen, D. S. An immunocompetent mouse model for the tolerance of human chronic hepatitis B virus infection. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 103 (47), 17862-17867 (2006).
  10. Wong, P., Pamer, E. G. CD8 T cell responses to infectious pathogens. Annual Review of Immunology. 21, 29-70 (2003).
  11. Murray, J. M., Wieland, S. F., Purcell, R. H., Chisari, F. V. Dynamics of hepatitis B virus clearance in chimpanzees. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 102 (49), 17780-17785 (2005).
  12. Hinrichs, C. S., et al. Adoptively transferred effector cells derived from naive rather than central memory CD8+ T cells mediate superior antitumor immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 106 (41), 17469-17474 (2009).
  13. Hinrichs, C. S., et al. Human effector CD8+ T cells derived from naive rather than memory subsets possess superior traits for adoptive immunotherapy. Blood. 117 (3), 808-814 (2011).
  14. Kerkar, S. P., et al. Genetic engineering of murine CD8+ and CD4+ T cells for preclinical adoptive immunotherapy studies. Journal of Immunotherapy. 34 (4), 343-352 (2011).
  15. Kuball, J., et al. Facilitating matched pairing and expression of TCR chains introduced into human T cells. Blood. 109 (6), 2331-2338 (2007).
  16. van Loenen, M. M., et al. Mixed T cell receptor dimers harbor potentially harmful neoreactivity. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107 (24), 10972-10977 (2010).
  17. Cameron, B. J., et al. Identification of a Titin-derived HLA-A1-presented peptide as a cross-reactive target for engineered MAGE A3-directed T cells. Science Translational Medicine. 5 (197), (2013).
  18. Fedorov, V. D., Themeli, M., Sadelain, M. PD-1- and CTLA-4-based inhibitory chimeric antigen receptors (iCARs) divert off-target immunotherapy responses. Science Translational Medicine. 5 (215), (2013).
  19. Maus, M. V., et al. T cells expressing chimeric antigen receptors can cause anaphylaxis in humans. Cancer Immunolology Research. 1 (1), 26-31 (2013).
  20. Haque, R., et al. Programming of regulatory T cells from pluripotent stem cells and prevention of autoimmunity. Journal of Immunology. 189 (3), 1228-1236 (2012).
  21. Vizcardo, R., et al. Regeneration of human tumor antigen-specific T cells from iPSCs derived from mature CD8(+) T cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 31-36 (2013).
  22. Nishimura, T., et al. Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12 (1), 114-126 (2013).
  23. Lei, F., et al. In vivo programming of tumor antigen-specific T lymphocytes from pluripotent stem cells to promote cancer immunosurveillance. Cancer Research. 71 (14), 4742-4747 (2011).
  24. Kim, J. B., et al. Oct4-induced pluripotency in adult neural stem cells. Cell. 136 (3), 411-419 (2009).
  25. Lei, F., Haque, R., Xiong, X., Song, J. Directed differentiation of induced pluripotent stem cells towards T lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (63), e3986 (2012).
  26. Lei, F., Haque, M., Sandhu, P., Ravi, S., Ni, Y., Zheng, S., Fang, D., Jia, H., Yang, J. M., Song, J. Development and characterization of naive single-type tumor antigen-specific CD8+ T lymphocytes from murine pluripotent stem cells. OncoImmunology. 6, (2017).
  27. Haque, M., et al. Melanoma Immunotherapy in Mice Using Genetically Engineered Pluripotent Stem Cells. Cell Transplantation. 25 (5), 811-827 (2016).
  28. Tan, A. T., et al. Use of Expression Profiles of HBV DNA Integrated Into Genomes of Hepatocellular Carcinoma Cells to Select T Cells for Immunotherapy. Gastroenterology. , (2019).
  29. Wu, L. L., et al. Ly6C(+) Monocytes and Kupffer Cells Orchestrate Liver Immune Responses Against Hepatitis B Virus in Mice. Hepatology. , (2019).
  30. Haque, M., et al. Stem cell-derived tissue-associated regulatory T cells suppress the activity of pathogenic cells in autoimmune diabetes. Journal of Clinical Investigation Insights. , (2019).
  31. Chisari, F. V., et al. Structural and pathological effects of synthesis of hepatitis B virus large envelope polypeptide in transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 84 (19), 6909-6913 (1987).
  32. Wirth, S., Guidotti, L. G., Ando, K., Schlicht, H. J., Chisari, F. V. Breaking tolerance leads to autoantibody production but not autoimmune liver disease in hepatitis B virus envelope transgenic mice. Journal of Immunology. 154 (5), 2504-2515 (1995).

Tags

علم المناعة والعدوى العدد 151 الخلايا الجذعية HBV العلاج المناعي نقل الخلايا بالتبني النسخ المتماثل الفيروسي الماوس
الخلايا الجذعية المشتقة الفيروسية Ag محددة T الخلايا الليمفاوية قمع النسخ المتماثل HBV في الفئران
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xiong, X., Lei, F., Haque, M., Song, … More

Xiong, X., Lei, F., Haque, M., Song, J. Stem Cell-Derived Viral Ag-Specific T Lymphocytes Suppress HBV Replication in Mice. J. Vis. Exp. (151), e60043, doi:10.3791/60043 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter