Summary
这里介绍了一个协议，通过利用干细胞衍生病毒抗原（Ag）特异性T淋巴细胞的采用细胞转移（ACT），有效抑制小鼠乙型肝炎病毒（HBV）复制。这个程序可以适应潜在的基于ACT的HBV感染免疫治疗。
Abstract
乙型肝炎病毒（HBV）感染是一个全球性的健康问题。全世界有超过3.5亿人感染乙肝病毒，乙肝病毒感染仍然是肝癌的主要原因。这是一个重大关切，特别是在发展中国家。免疫系统未能对乙肝病毒进行有效反应，导致慢性感染。虽然乙肝疫苗存在，新的抗病毒药物正在研制中，但消灭病毒储存细胞仍然是一个主要的健康主题。本文介绍的一种用于生成病毒抗原 （Ag） - 特异性 CD8–细胞毒性 T 淋巴细胞 （CTLs） 的方法，该细胞来自诱导多能干细胞 （iPSC）（即 iPSC-CTLs），能够抑制 HBV 复制。通过将HBV表达质粒（pAAV/HBV1.2）水动力注射到肝脏，在小鼠中有效诱导HBV复制。然后，HBV表面Ag特异性小鼠iPSC-CTLs被采用转移，这极大地抑制了乙肝病毒在肝脏和血液中的复制，并防止了肝细胞中HBV表面Ag表达。该方法在水动力注射后证明小鼠HBV复制，干细胞衍生的病毒Ag特异性CTL可以抑制HBV复制。该协议为HBV免疫治疗提供了一种有用的方法。
Introduction
急性感染后，适应性免疫系统（即体液和细胞免疫）控制与HBV相关的急性肝炎的大部分。然而，在乙肝病毒流行地区的一些人无法消除病毒，随后转化为慢性个体。全球超过25%的慢性病患者（超过2.5亿人）发展为渐进性肝病，导致肝硬化和/或肝细胞癌（HCC）1。因此，尽管现有疫苗2和许多抗病毒药物正在研制中，但根除持续感染的细胞仍然是一个普遍的健康问题。HBV感染的标准治疗包括IFN-α、核苷和核苷酸类似物。这些制剂具有直接的抗病毒活性和免疫调节能力。然而，HBe抗原（Ag）的血清转化+具有抗HBe抗体（Ab）的载体和血清HBV脱氧核糖核酸（DNA）的流失在大约20%的治疗患者中单独出现，病毒的整个免疫控制经核实，HBsAg的剥夺不超过5%3。此外，对治疗的反应往往不持久。使用重组HBs Ag进行预防性疫苗接种在预防感染方面非常有效，但治疗性HBs Ag疫苗接种无效。显然，T细胞介导的免疫反应在控制HBV感染和肝损伤方面起着关键作用;然而，在慢性肝炎患者中，HBV反应性T细胞经常被删除、功能失调或转换耗尽4，5，6。因此，在持续性乙肝病毒感染者中，没有试图通过抗病毒疗法、免疫调节细胞因子或治疗性免疫恢复HBV特异性免疫（即T细胞基免疫）的努力取得了成功。
HBV AG特异性T细胞的收养细胞转移（ACT）是一种有效的治疗方法，旨在最终根除剩余的肝细胞wih HBV7，8。HBV特异性CTP在HBV感染小鼠中已被证明会导致暂时性、轻度肝炎，肝细胞核糖核酸（RNA）转录本的显著下降。在这些研究中，CTL没有抑制HBV基因的转录，但提高了HBV转录9的降解。HBV特异性CTL对预防病毒感染和调解HBV10、11的清除非常重要。对于基于ACT的补救措施，HBV特异性T细胞在体外扩张，具有高反应性，用于体内再定居，建议其为理想的方法12、13、14;然而，目前的方法在产生、分离和从患者身上产生、分离和生长适当数量的HBV特异性T细胞的能力方面受到限制，以进行潜在的治疗。
尽管临床试验通过针对受HBV病毒感染的肝细胞的工程T细胞提供细胞治疗的安全性、实用性和前瞻性治疗活性，但人们担心这种不良影响由于错误配对T细胞受体（TCR）15、16、非特异性TCR17的离目标Ag识别和由嵌合Ag受体（CAR）对靶向脱毒性的交叉反应，自体免疫反应发生18,19与健康组织。目前，转基因T细胞，只有短期的持久性在体内，通常是中间或后期效应T细胞。迄今为止，多能干细胞（PSCs）是唯一可用于产生大量天真的单型Ag特异性T细胞20、21、22、23的来源。诱导PSCs（iPSCs）通过使用多个转录因子的基因转导，从患者的体细胞中转换。因此，iPSC具有与胚胎干细胞（ESCs）24相似的特性。由于具有无限自我更新能力的灵活性和可能性，除了组织替代外，基于iPSC的治疗可以广泛应用于再生医学。此外，iPSC的底层军团可能会显著改善目前的基于细胞的疗法。
该方法的总体目标是从 iPSC（即 iPSC-CTL）生成大量 HBV 特异性 CTL，用于基于 ACT 的免疫治疗。与替代技术的优点是，HBV 特异性 iPSC-CTL 具有单型 TCR 和天真的表型，这导致在 ACT 之后产生更多的记忆 T 细胞发育。证明HBV特异性iPSC-CTL的ACT可增加肝功能CD8+T细胞的迁移，减少被管理小鼠肝脏和血液中的HBV复制。这种方法揭示了病毒Ag特异性iPSC-CTLs在HBV免疫治疗中的潜在用途，并可能用于生成用于病毒免疫治疗的其他病毒Ag特异性iPSC-T细胞。
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Protocol
所有动物实验均获得德克萨斯A&M大学动物护理委员会（IACUC;#2018-0006）的批准，并符合实验室动物护理评估和认证协会的指导方针。小鼠在6-9周大期间使用。
1. 从 iPSC 生成病毒 Ag 特异性 CD8+ T 细胞（iPSC-CD8+ T 细胞）
- 逆转录病毒结构的创建
注：TCR +和β基因与2A自结序列相关。逆转录病毒载体 MSCV-IRES-DsRed （MiDR） 是 DsRed= 23。- 将HB183-191（FLLTRILTI）特异性A2限制的人类-小鼠杂交TCR（s183 TCR）基因（V+34和V+28）注入MiDR，以创建s183 MiDR构造（图1A）25。
- 逆转录病毒转导
注：铂-E（Plat-E）细胞用于包装逆转录病毒（携带s183 TCR基因），用于逆转录病毒转导。Plat-E细胞是293T细胞的一种有效的逆转录病毒包装细胞，通过EF1+启动子通过独特的包装结构来表达抗逆转录病毒结构蛋白，包括gag、pol和生态基质env。- 在100毫米培养皿上，种子3 x 106 Plat-E细胞在8mL的DMEM培养基中含有10%胎儿小牛血清（FCS），在37°C的培养箱中，在5%CO2，转染前1天。
- 在第0天，使用DNA转染试剂25将s183MiDR结构转染成Plat-E细胞。
- 第 1 天，种子 1 x 106 iPSC （GFP+） 放入明胶预涂培养板中。
- 在第2天至第3天，从Plat-E细胞培养物中收集含有逆转录病毒的上清液，在存在1，6-二溴二溴代二甲酶溶液25的情况下，用s183 TCR转导iPSC。
- 在第4天，胰蛋白酶化s183 TCR基因转导iPSC，在400 x g离心5分钟，种子3× 105 iPSC在100毫米培养盘中预涂3 x 106辐照SNL76/7 （irSNL76/7）进料细胞25。
- 在汇合的第5天或第6天，胰蛋白酶化细胞，在400 x g下离心5分钟，并处理细胞分拣。使用高速细胞分拣机对活细胞进行GFP和DsRED双阳性细胞（s183 TCR基因转导iPSC）排序。与步骤1.2.5类似，共同培养irSNL76/7进纸细胞上的排序细胞，供将来使用25。
- HBV 特异性 iPSC-CD8和T 细胞的分化
注：OP9-DL1/DL4基质细胞过度表示诺奇配体DL1和DL4，与iPSC共同培养iPSC可以促进Notch信号介导的T细胞分化26。- 在 OP9-DL1-DL4 细胞单层中生长 s183 TCR 基因转导 iPSC （s183/iPSC），在含有 20% 胎儿牛血清 （FBS）的β-最小必需介质 （MEM） 介质中生长。在培养中包括鼠阵3配体（mFlt-3L;最终浓度=5纳克/mL）。
- 在第 0 天，种子 0.5×1.0 x 105 S183/iPSC，在 10 厘米培养盘中，以前使用 OP9-DL1-DL4 细胞生长。验证 OP9-DL1-DL4 细胞处于 80%~90% 的汇合状态。
- 第5天，用10mL的磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗iPSC，从PBS中吸出，将其加入4mL0.25%胰蛋白酶，并在37°C培养箱中孵育10分钟。 之后，加入补充8 mL的iPSC培养基，以结束胰蛋白酶的消化。在15~30°C下，在400 x g下积累所有含有细胞和离心机的消化溶液5分钟。
- 在 10 mL 的 iPSC 介质中吸出上清液并重新悬浮细胞。将细胞悬浮液转移到新的10厘米Petri板，并在37°C的培养箱中孵育30分钟。
- 30 分钟后，收集包含浮动细胞的 iPSC 介质。通过70μm细胞过滤器的细胞悬浮液并计算细胞数。
- 种子 5 x 105细胞在培养皿中以前生长的 OP9-DL1-DL4 细胞，条件为 80%-90% 汇入，如步骤 1.3.1 所述。
注：对于T细胞分化，每2~3天，iPSC衍生细胞需要用OP9-DL1-DL4细胞的一层重新播种。
- 评价
- 区分 iPSC 的形态变化
- 在不同的日子里在显微镜下观察细胞。
注：到第5天，菌落具有中皮状特征，表现出类似于人类皮肤成纤维细胞和体外持续生长的经典主轴形状形态。到了第8天，小圆的细胞团开始出现。
- 在不同的日子里在显微镜下观察细胞。
- 流量细胞测定对iPSC的区分分析
- 在共同培养的各种日，分析iPSC衍生细胞，如前25所述（图1B，C）。
- 差异化 iPSC 的功能分析
- 在共培养的第28天，通过收获漂浮细胞从培养物中收集iPSC-CD8+T细胞，用0.25%胰蛋白酶胰蛋白酶胰蛋白酶化剩细胞，在8 mL的iPSC介质中重新悬浮，在15~30°C时在400 x g下离心5分钟，去除介质，然后在 10 mL 的介质中重新悬浮细胞。
- 将重新悬浮的细胞保存在37°C培养箱中的10厘米新鲜培养皿中30分钟，并组装漂浮的细胞。然后用冷PBS冲洗细胞一次。
- 从H-2 I类敲除的脾脏中孵育3 x 106 T细胞耗尽的血细胞（CD4-CD8 -），HLA-A2.1转基因（HHD）小鼠在200μL的介质中孵化，在4°C下孵育30分钟。
- 生产iPSC-CD8+ T细胞的混合物，用s183肽脉冲的ss细胞（T细胞：ssnocell = 1：4;使用0.75 x 106 T细胞）。在CO2培养箱中孵育细胞混合物37°C40小时。在最后7小时，将4μL的稀释性布雷费尔丁A加入培养基（最终浓度为1，000x，在1倍培养基中稀释），以阻止细胞激活过程中的传输过程。
- 染色细胞，并执行细胞内IFN-α的流细胞学分析（图2）。
- 区分 iPSC 的形态变化
2. 通过HBV质粒的流体动力学传递诱导HBV复制
注：pAAV/HBV1.2构造如前9所述生成。HBV 1.2 完整的DNA被纳入载体pAAV中。
- 通过尾静脉的HBV质粒的流体动力学分娩
- 加热HHD小鼠使用热灯在笼子里5分钟，以拉皮尾静脉。
- 用约束剂扣留动物，用70%乙醇喷雾清洁老鼠尾巴。
- 将质粒输送到肝脏。
- 使用测量刻度测量小鼠体重。
- 在相当于身体质量PBS的8%中稀释10μg的HBV质粒（例如，20克小鼠为1.6 mL）。用26G × 1+ 2"（0.45× 12 mm）皮下针在3 mL注射器中装载稀释的质粒。
- 在尾部的中三分之一位置找到两个侧侧尾静脉之一，并将针头插入任一侧静脉。在3-5秒内通过尾静脉管理含有HBV质粒的注射。
- 受感染小鼠血清病毒血症的定量
注：HBV复制从第3天至35日发生在小鼠血清中。脱氧核糖核酸复制在第7天达到高峰，并逐渐减少。HBV DNA 直到第35天才从血清中清除。- 从受感染小鼠身上采集血清
- 在感染后3、5、7和10天，通过1.5 mL微离心管的逆轨出血，从每只小鼠的微离心管中收集约0.1 mL的血液，然后在室温（RT）下孵育20分钟。
- 在6，000 x g下在4°C下将样品离心15分钟，并在离心后收集血清上清液。
- 根据制造商的建议，使用市售的DNA提取试剂盒从血清中纯化DNA。简单地说，在硅基柱中裂解细胞，进行洗液，并通过在洗脱柱中加入100%乙醇，并在6000 x g下离心1分钟，在50μL无RNase水中释放DNA来提取DNA。
- 使用从洗脱中摄取100纳克的HBV DNA进行实时PCR分析。使用以下引推和探针：前进5'TAGGGTATATATATATGG 3';反向 5' GCACAGCGGGGTGT3';探头5'TCACCTCTGCCAATC3'。
- 使用含有质粒（pAAV/HBV1.2）的HBV基因组进行标准曲线，并在总体积为10μL时执行实时PCR（图3）。
- 设置 PCR 反应的总体积为 10 μL，如表 1所示。
- 在热循环器中设置 PCR 程序，如表 2所示。编程温度转换速率为 20 °C/s 用于变性/退火，5 °C/s 用于扩展。测量每个周期退火阶段结束时的荧光，以便进行实时 PCR 监测。
- 从受感染小鼠身上采集血清
3. 通过ACT减少病毒性Ag特异性iPSC-CD8+ T细胞的HBV复制
- 收养细胞转移（ACT）
- 在 mFlt-3L 和 mIL-7 存在的情况下，在 OP9-DL1-DL4 基质细胞上区分 s183/iPSC （1.3.7），为期 8 天，如第 1.3 节所述。
- 第22天，从10厘米板中收集iPSC-CD8+T细胞，用胰蛋白酶，然后用10mL的新鲜介质清洗并重新悬浮每个10厘米板。如第 1.3 节所述，将细胞加入新的 10 厘米板，并返回到培养箱 30 分钟。30分钟后，收集浮动细胞。
- 使用 70 μm 尼龙滤网通过细胞消除细胞簇并计算细胞数。在冷PBS溶液中使细胞浓度为1.5 x 107细胞/mL，并使用70μm尼龙滤网通过细胞，必要时再次消除细胞簇。将细胞放在冰上，直到ACT。
- 通过尾静脉将200μL细胞悬浮液（3 x 106细胞）注射到4-6周大的HHD小鼠中。
- HBV复制的诱导
- 在细胞转移后的第14天，执行HBV质粒通过尾静脉的流体动力学传递，如第2.1节所述。
- 从受感染肝脏检测病毒蛋白
- 在感染后第3天、第5天、7天、14天和21天牺牲小鼠。对于安乐死，在每个笼子中，在第一阶段使用1⁄2升的二氧化碳（CO2）。当动物出现意识丧失时，获得CO2流速约4~5升/分钟。使用CO2吸入进行小鼠安乐死。
- 通过用剪刀和钳子切割围肠的表面皮肤，并稍微将肝脏拖回，以发现围肠腔内侧皮肤，分离肝脏。收集并切割受感染小鼠的肝脏样本（长度 x 宽度 x 高度 = 0.5 厘米 x 0.5 厘米 X 0.3 厘米），以便轻松放入嵌入盒中，并块在 10% 中性缓冲液形式中，为 4-24 小时。
- 使用2.5M的甲酸对肝脏样品进行分化;用二甲苯冲洗3分钟，在100%乙醇中冲洗2次，用95%乙醇冲洗2次，在去离子（DI）水中冲洗2次，然后在1mM乙烯二甲酸（EDTA）中对肝脏样品进行去化。在亚沸点温度（90°C）下处理20分钟。
- 将固定肝组织冷却30分钟，用1x PBS冲洗组织4分钟，并将组织嵌入石蜡中。在一系列增加的乙醇中脱水组织以替代水，然后浸入二甲苯浸泡。将渗透的组织嵌入蜡块中。均匀的垂直和水平切片进行染色。用滑动微缩子准备4个μm截面。
- 使用二甲苯和乙醇通过脱蜡和补液部分，然后对部分进行免疫荧光染色。
- 用200 μL的HBV表面Ag特异性抗体染色部分（阻滞溶液中1：100稀释）。在 75%~100% 加湿室中用抗体在 RT 孵育 2 小时，在 1x PBS 中洗涤 5 倍 5 分钟。
- 使用含有 4'，6-二甲苯-2-苯胺酚 （DAPI） 的防褪色试剂来对抗滑片的染色。将盖玻片与大约 300 μL 的稀释 DAPI 染色溶液（1x PBS 中为 300 nM）添加，并验证覆盖的整个盖玻片。将幻灯片保持在4°C的黑暗中，直到在荧光显微镜下检查。
- 受感染小鼠的炎症细胞渗透
- 如步骤 3.3.1 中所述，牺牲小鼠。收集肝脏，并作出步骤3.3.4中所述的部分。
- 用血氧素和欧辛（H&E）染色部分，以评估炎症细胞渗入肝脏。
- 将幻灯片储存在4°C的黑暗中，直到在荧光显微镜下进一步分析。
- 在荧光显微镜下可视化幻灯片，以检测炎症细胞渗入肝脏（图4）。
- HBV感染肝脏的DNA检测
- 病毒DNA的分离。
- 根据第3.3节，对小鼠实施安乐死并收集肝脏样本。
- 在含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒的诺宁德P-40（NP-40）中，对肝脏组织进行脂质（50 mM Tris-HCL，1 mM EDTA，1%NP-40）。
- 在16，000 x g下短暂离心，以清除核和细胞碎片。
- 用微粒核酸酶（核酸酶S7;150单位/mL）和CaCl2（5 mM）在37°C孵育细胞质解液90分钟，使核细胞外核酸降解。
- 通过添加 10 mM EDTA 使核酸酶 S7 失去活性。
- 用聚乙烯乙二醇 （PEG） 沉淀核胶囊，由 0.5% 硫酸二钠 （SDS） 破坏，并在 37°C 下用 0.6 mg/mL 蛋白酶 K （PK） 消化 1 小时。
- 通过苯氯仿提取和乙醇沉淀回收病毒核酸。
- 在1.2%的胶凝糖凝胶上解析提取的病毒DNA，并使用32P标记的HBVDNA探针通过标准的南方斑点分析检测。
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Representative Results
如此处所示，HBV病毒Ag特异性iPSC-CD8+ T细胞由体外培养系统生成。在这些病毒Ag特异性iPSC-CD8+ T细胞的ACT后，严重抑制HBV复制在鼠模型中（补充文件1）。小鼠 iPSC 与 MIDR 抗逆转录病毒结构进行转导，编码人-小鼠混合 HBV TCR 基因（HBs183-191-特异性，s183），然后基因转导 iPSC 与表达 Notch 配体（DL1 和 DL4）的 OP9-DL1/DL4 细胞共同培养分子在rFlt3L和rIL-7的存在。在体外共培养的第28天，iPSC衍生细胞实质上表达CD3和Ag特异性TCR（T细胞标记）。对CD3+CD8+总体的流式细胞测定分析表明，HBV TCR转导可显著增加病毒s183特异性CD8+T细胞的生成（图1）。
在体外共培养的第28天，CD4-CD8+单阳性（SP）iPSC-CD8+ T细胞被用s183肽脉冲的T-耗尽的血小细胞分离和刺激，并评估细胞因子的产生。iPSC-CTL 产生大量的 IL-2 和 IFN-*，通过细胞内染色或 ELISA 检测出来（图 2）。HLA-A2.1转基因（HHD）小鼠通过小鼠尾静脉通过水动力注射10μg的pAAV/HBV1.2DNA质粒，诱导HBV感染。从HHD小鼠血清中检测HBV复制从第3天至第21天开始。DNA复制在第6天达到峰值，并使用实时PCR分析逐渐减少（图3）。
在ACT实施两周后，小鼠受到水动力注射pAAV/HBV1.2DNA质粒的挑战。病毒性针度在注射后不同时间点通过血清的实时PCR进行测量。结果表明，与接受对照细胞的小鼠相比，在接受HBV病毒Ag特异性T细胞的小鼠的所有时间点，病毒复制均显著减少（图4A）。HBV表面蛋白表达也在上述治疗环境中检查肝脏。小鼠在HBV注射后的各种天被安乐死，肝脏样本被分离进行动物学检查。样品被染色为HBV表面蛋白，并在荧光显微镜下检查。与接受对照细胞的小鼠相比，接受HBV病毒Ag-iPSC-CTL的小鼠中HBV表面蛋白显著减少（图4B）。该实验清楚地表明，病毒Ag特异性iPSC-CD8+ T细胞具有减少紫锥模型HBV复制的能力。
图1：产生HBV病毒Ag特异性iPSC-CD8+ T细胞。
小鼠 iPSC 通过以下抗逆转录病毒结构进行转导：HB183-91 TCR （MiDR-s183 TCR） 或 OVA257*264 TCR （MiDR-OVA TCR），转导 iPSC 与 OP9-DL1/DL4 基质细胞共同培养，用于 T 系骨分化。（A） 逆转录病毒结构 MiDR-s183 TCR 的原理表示，表示 s183 特异性 TCR。• 包装信号;2A = 皮角病毒自下2A序列;LTR = 长端子重复。（B） 第0、7、14和22天T细胞分化的形态。（C） 第28天对iPSC衍生细胞的流式细胞分析。CD3+CD8+细胞（左）按指示进行门控和分析，以表达CD8和TCRV®28（右）。所示数据代表三个单独实验。这些值表示平均值 = SD（\p < 0.01;成对 t 检验）。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：HBV病毒Ag特异性iPSC-CD8+T细胞的功能分析。
在体外共培养的第28天，SP CD8+s183 TCR五角星 +iPSC-T细胞被分类。使用MiDR-s183 TCR转导的iPSC-T细胞由HHD小鼠的T-耗尽的血细胞（ApPC）刺激，用s183肽（FLLTRILTI）脉冲。（A） 7 小时后 IFN-+的细胞内染色（在 CD8+细胞上封闭）（T/APC = 1：4）。（B） IFN-+ 的ELISA在40小时后显示的数据代表三个单独实验。这些值表示平均值 = SD（n.s.，p > 0.05;成对 t 检验）。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：通过水动力注射诱导HHD小鼠HBV复制。
HHD小鼠通过流体动力尾静脉注射与HBV质粒一起管理。10 μg的质粒被注射到总身体质量PBS的8%。在注射后指示的时间点上，从血液中分离血清，提取DNA进行实时PCR。所示数据代表三个单独实验。这些值代表均值=SD。数据代表每组三个独立实验的五只小鼠。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：通过ACT减少病毒性Ag特异性iPSC-CD8+T细胞的HBV复制。
HHD小鼠采用病毒Ag特异性iPSC-CD8+T细胞祖细胞（在体外培养的第22天）进行收养，并在细胞转移后第2周用HBV质粒进行管理。（A） 血清 HBV 副本.在注射后指示的时点，血清从血液中分离出来，提取DNA进行实时PCR分析。所示数据代表三个单独实验。这些值表示平均值 = SD. （B） 肝脏组织组织学.小鼠在HBV感染后第8天被安乐死。肝脏样本被分离和染色进行进行体体检查。上面板显示受感染小鼠的HBsAg蛋白表达（IHC染色），下面板显示炎症细胞渗透（HE染色）。数据代表每组三个独立实验的五只小鼠。请点击此处查看此图的较大版本。
| DNA模板 | 2毫升 |
| 脱氧核糖核酸主杂交混合物（（塔克DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、10mMMgCl2和dNTP混合物） | 1毫升 |
| 25 mM MgCl2 | 0.8毫升 |
| 0.3 μM 探头 | 3 毫升 |
| 每个引漆的5μM | 3.2毫升 |
| 总 | 10毫升 |
表1：PCR反应量
| 温度 | 时间 | |
| 变性 | 95 °C | 5 s |
| 退火 | 53 °C | 10 s |
| 扩展 | 72 °C | 20 s |
| 5°C |
表 2：PCR 程序
补充文件 1：请点击此处下载此文件。
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Discussion
该协议提供了一种生成病毒性Ag特异性iPSC-CTLs的方法，用作ACT，以抑制小鼠模型中的HBV复制。在慢性HBV感染中，病毒基因组形成一个稳定的迷你染色体，即共价闭合的圆形DNA（cccDNA），可以在整个肝细胞的生命周期内持续。靶向病毒小染色体的清除可能导致慢性HBV感染的治愈。目前的抗病毒治疗针对病毒逆转录酶，但很少建立由cccDNA驱动的HBV复制的免疫控制。HBV 特异性 CD8– CTL 可以调解感染肝细胞的杀伤，并加速 cccDNA 的清除。然而，在慢性HBV感染患者中，HBV特异性CTL被删除、功能失调或导致精疲力竭。ACT与HBV特异性CTL是慢性HBV感染的有利治疗28，29。幼稚或中央记忆 T 细胞衍生的 T 淋巴细胞（即高反应免疫细胞）是基于 ACT 的疗法的理想效果，因为它们具有极大的增殖性、与最终分化细胞相比的死亡趋势较低，并且非常优秀对静温细胞因子作出反应的能力。然而，由于难以从患者那里获得足够数量的CTL，这种ACT往往不可行。此前已表明，从iPSC重新编程的Ag特异性CTL或Tregs可用于基于细胞的治疗20，23，27，30。本报告演示了一种生成病毒性Ag特异性iPSC-CTL的方法，并在HBV复制的鼠模型中将这些细胞用于基于ACT的免疫治疗。
虽然有HBV复制的转基因小鼠模型，但这些模型具有挑战性，因为转基因基因产品诱导的中央耐受性使小鼠对HBV Ags具有免疫耐受性。此外，转基因小鼠不适合监测病毒清除，因为整合的HBV基因组在每个小鼠细胞31，32中持续存在。此外，尽管已经研制出预防感染的成功疫苗，但乙肝病毒感染后的治疗或免疫治疗尚未开发。此外，由于HBV感染的宿主范围仅限于男性和黑猩猩，而且HBV传播的体外培养系统不够充分，因此对乙肝病毒发病机制的实验方法受到阻碍。CD8+ T细胞是有望对各种类型病毒感染的效应细胞;然而，T细胞对HBV的反应并不丰富。特异性、功能和缺乏足够的数字来进行免疫反应可能是原因。本报告揭示了在小鼠中有效诱导HBV复制的水动力注射方法。该方法允许将大量的HBV质粒直接输送到肝脏。该模型显示连续病毒血症超过8周，在注射后的不同天检测HBV mRNA、蛋白质和DNA。该方法用于小鼠HBV复制，对HBV免疫治疗有用。
总之，通过水动力注射程序在小鼠中成功诱导HBV复制，病毒Ag特异性iPSC-CTL作为HBV复制的免疫疗法。然而，该方法有两个局限性：（1）超过三周的体外T细胞分化可能减少生成T细胞对ACT的转化应用;（2）HBV水动力注射能有效诱导肝病毒复制;然而，它不形成cccDNA，这是持续性HBV感染的主要原因。然而，该方法为乙肝病毒的复制和治疗提供了另一种方法。使用抗乙肝药物和ACT的病毒Ag特异性iPSC-CTL的组合方案有可能减少艾滋病毒的储存，从而导致慢性艾滋病毒感染的治疗。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢多伦多总医院研究所的Adam J Gehring博士为HBs183-91（S183）（FLLTRILTI）提供cDNA-特定A2限制人-鼠杂交TCR基因，以及台湾国立大学的陈佩杰博士提供pAAV/HBV 1.2 结构。这项工作得到国家卫生补助机构R01AI121180、R01CA221867和R21AI109239到J.S的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HHD mice | Institut Pasteur, Paris, France | H-2 class I knockout, HLA-A2.1-transgenic (HHD) mice | |
| iPS-MEF-Ng-20D-17 | RIKEN Cell Bank | APS0001 | |
| SNL76/7 | ATCC | SCRC-1049 | |
| OP9 | ATCC | CRL-2749 | |
| pAAV/HBV1.2 plasmid | Dr. Dr. Pei-Jer Chen (National Taiwan University Hospital, Taiwan) | HBV DNA construct | |
| HBs183-91(s183) (FLLTRILTI)-specific TCR genes | Dr. Adam J Gehring (Toronto General Hospital Research Institute, Toronto, Canada) | FLLTRILTI-specific A2-restricted human-murine hybrid TCR genes (Vα34 and Vβ28) | |
| OVA257–264-specific TCR genes | Dr. Dario A. Vignali (University of Pittsburgh, PA) | SIINFEKL-specific H-2Kb-restricted TCR genes | |
| Anti-CD3 (17A2) antibody | Biolegend | 100236 | |
| Anti-CD44 (IM7) antibody | BD Pharmingen | 103012 | |
| Anti-CD4 (GK1.5) antibody | Biolegend | 100408 | |
| Anti-CD8 (53-6.7) antibody | Biolegend | 100732 | |
| Anti-IFN-γ (XMG1.2) antibody | Biolegend | 505810 | |
| Anti-TNF-a (MP6-XT22) antibody | Biolegend | 506306 | |
| α-MEM | Invitrogen | A10490-01 | |
| Anti-HBs antibody | Thermo Fisher | MA5-13059 | |
| ACK Lysis buffer | Lonza | 10-548E | |
| Brefeldin A | Sigma | B7651 | |
| DMEM | Invitrogen | ABCD1234 | |
| FBS | Hyclone | SH3007.01 | |
| FACSAria Fusion cell sorter | BD | 656700 | |
| Gelatin | MilliporeSigma | G9391 | |
| GeneJammer | Agilent | 204130 | |
| HLA-A201-HBs183-91-PE pentamer | Proimmune | F027-4A - 27 | |
| HRP Anti-Mouse Secondary Antibody | Invitrogen | A27025 | |
| mFlt-3L | Peprotech | 250-31L | |
| mIL-7 | Peprotech | 217-17 | |
| Nuclease S7 | Roche | 10107921001 | |
| Paraformaldehyde | MilliporeSigma | P6148-500G | Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic |
| Permeabilization buffer | Biolegend | 421002 | |
| Polybrene | MilliporeSigma | 107689 | |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| QIAamp MinElute Virus Spin Kit | Qiagen | 57704 |
References
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