Summary
ここに提示されるのは、幹細胞由来ウイルス抗原(Ag)特異的Tリンパ球の養子細胞転写(ACT)を利用してマウスにおけるB型肝炎ウイルス(HBV)複製の効果的な抑制のためのプロトコルである。この手順は、HBV感染の潜在的なACTベースの免疫療法に適合してもよい。
Abstract
B型肝炎ウイルス(HBV)感染は世界的な健康問題である。世界中で3億5000万人以上の人々が罹患しており、HBV感染は依然として肝臓癌の主な原因です。これは、特に発展途上国において大きな関心事です。HBVに対する効果的な応答をマウントする免疫系の障害は、慢性感染につながる。HBVワクチンが存在し、新しい抗ウイルス薬が作成されていますが、ウイルス貯留細胞の根絶は依然として主要な健康問題です。ここで説明するウイルス抗原(Ag)-特異的CD8+細胞傷害性Tリンパ球(CTL)の生成のための方法は、HBV複製を抑制する能力を有する多能性幹細胞(iPSC)(すなわち、iPSC-CTLs)に由来する。HBV複製は、HBV発現プラスミド、pAAV/HBV1.2の動的誘導を介してマウスで効率的に誘導され、肝臓に誘導される。そして、HBV表面Ag特異的マウスiPSC-CTLが採用的に転移し、肝臓や血液中のHBV複製を大幅に抑制し、肝細胞におけるHBV表面Ag発現を防止する。この方法は、流体力学注入後のマウスにおけるHBV複製を実証し、幹細胞由来のウイルスAg特異的CTLがHBV複製を抑制できることを示す。このプロトコルは、HBV免疫療法のための有用な方法を提供する。
Introduction
急性感染後、適応免疫系(すなわち、体液性および細胞性免疫)は、急性HBV関連肝炎の大部分を制御する。それでも、HBV流行地域の多くの人々は、ウイルスを排除し、その後、慢性的な個人として変換することはできません。世界中の慢性患者の25%以上(>2億5000万人)が進行性肝疾患を発症し、肝硬変および/または肝細胞癌(HCC)1を引き起こす。その結果、ワクチン2が入手可能であり、多数の抗ウイルス薬が開発中であるにもかかわらず、強引に感染した細胞の根絶は、一般的な健康問題のままである。HBV感染の標準的な治療には、IFN-α、ヌクレオシド、ヌクレオチド類似体が含まれる。これらの薬剤は、直接抗ウイルス活性および免疫調節能力を有する。それにもかかわらず、抗HBe抗体(Ab)を有するHBe抗原(Ag)+担体の血清変換および血清HBVデオキシリボ核酸(DNA)の喪失は、治療された患者のおよそ20%に個別に現れ、ウイルスの全免疫学的制御HBsAgの剥奪によって検証された5%以下3.また、治療に対する応答は、多くの場合、耐久性がない。組換えHBs Agによる予防ワクチン接種は感染予防に非常に有効であるが、治療的なHBs Agワクチン接種は有効ではない。明らかに,T細胞媒介性免疫応答はHBV感染および肝障害を制御する上で重要な役割を果たす;しかし、慢性肝炎患者では、HBV反応性T細胞はしばしば削除され、機能不全、または疲弊した4、5、6を変換する。その結果、持続的なHBV感染を有する個体において、抗ウイルス療法、免疫調節性サイトカイン、または治癒免疫によってHBV特異的免疫(すなわち、T細胞ベースの免疫)を復活させる試みは成功していない。
HBV Ag特異的T細胞の養子細胞移植(ACT)は、最終的に残りの肝細胞を根絶するように指示された効率的な治療である。HBV感染マウスに対するHBV特異的CTLのACTは、一過性、軽度の肝炎、および肝細胞におけるHBVリボ核酸(RNA)転写物の劇的な低下を引き起こすことが示されている。これらの研究では、CTLはHBV遺伝子の転写を阻害しなかったが、HBV転写物9の分解を増強した。HBV特異的CTLは、ウイルス感染を予防し、HBV10、11のクリアランスを仲介するために重要である。ACTベースの救済策については、生体内再定住に対する反応性が高いHBV特異的T細胞のインビトロ拡張が理想的な方法12,13,14であることが示唆された。それにもかかわらず、現在のアプローチは、潜在的な治療法のための患者からHBV特異的T細胞の適切な量と品質を生成し、分離し、成長する能力に関して制限されています。
臨床試験は、HBVウイルス感染肝細胞に特異的である工学的T細胞を用いて細胞ベースの治療の安全性、実用性、および将来の治療活性を提示するが、不利な効果に関する懸念がある。T細胞受容体(TCR)15、16、非特異的TCR17によるオフターゲットAg認識およびキメラAg受容体(CAR)によるオンターゲットオフ毒性によるクロス反応性による自己免疫応答から生じる18歳,19健康な組織と.現在、遺伝子組み換えT細胞は、生体内に短期的な持続性しか持てないが、通常は中間またはそれ以降のエフェクターT細胞である。現在までに、多能性幹細胞(PSC)は、ナイーブ単一型Ag特異的T細胞20、21、22、23の多数を生成するために利用可能な唯一の供給源である。誘導PSC(iPSC)は、いくつかの転写因子の遺伝子伝達を使用して患者の体細胞から単に変換されます。その結果、iPSCは胚性幹細胞(ESC)24と同様の特性を持つ。自己更新する無限の能力の柔軟性と可能性のために、組織置換に加えて、iPSCベースの治療は再生医療に広く適用される可能性があります。さらに、iPSCの基礎となる連隊は、現在の細胞ベースの治療法を実質的に改善する可能性がある。
この方法の全体的な目標は、ACTベースの免疫療法のためにiPSC(すなわち、iPSC-CTL)から大量のHBV特異的CTLを生成することです。代替技術に比る利点は、HBV特異的iPSC-CTLが単一タイプのTCRとナイーブ表現型を有し、ACT後により多くのメモリT細胞の発達をもたらすことです。HBV特異的iPSC-CTLsのACTは、肝臓における機能性CD8+T細胞の移行を増加させ、投与マウスの肝臓および血液の両方におけるHBV複製を減少させることを実証した。この方法は、HBV免疫療法に対するウイルスAg特異的iPSC-CTLの潜在的な使用を明らかにし、ウイルス免疫療法のための他のウイルスAg特異的iPSC-T細胞を生成するように適合してもよい。
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Protocol
すべての動物実験は、テキサスA&M大学動物ケア委員会(IACUC;#2018-0006)によって承認され、実験室動物ケアの評価と認定のための協会のガイドラインに従って行われます。マウスは生後6~9週間に使用される。
1. iPSCからのウイルスAg特異的CD8+T細胞の生成(iPSC-CD8+ T細胞)
- レトロウイルス構造の作成
注:TCRαおよびβ遺伝子は2A自己ククリク配列と連結される。レトロウイルスベクター MSCV-IRES-DsRed (MiDR) は DsRed+ 23です。- サブクローンHBs183-191(FLLTRILTI)特異的A2制限ヒトマウスハイブリッドTCR(s183 TCR)遺伝子(Vα34およびVβ28)をMiDRに組み込み、s183 MiDR構築物(図1A)25を作成する。
- レトロウイルス伝達
注:プラチナE(プラット-E)細胞は、レトロウイルス(s183 TCR遺伝子を運ぶ)の包装に使用され、レトロウイルス伝達に使用されます。Plat-E細胞は、293T細胞の基礎となる有効なレトロウイルス包装細胞であり、EF1αプロモーターを介して独自の包装構造を介して開発され、ギャグ、ポール、エコトロピックenvを含むレトロウイルス構造タンパク質を発現します。- 100mm培養皿上で、37°Cのインキュベーターで10%胎児子牛血清(FCS)を含むDMEM培養培地の8mL中の種子3 x 106 Plat-E細胞を5%CO2、トランスフェクションの1日前に行う。
- 0日目に、dnaトランスフェクション試薬25を用いてs183 MiDR構築物をPlat-E細胞にトランスフェクトする。
- 1日目に、ゼラチン前被覆培養プレートに1 x 106 iPSC(GFP+)を播種する。
- 2〜3日目に、1,6-ジブロモエキサン溶液25の存在下でs183 TCRを用いてiPSCをトランスデュースするためにPlat-E細胞培養物からレトロウイルス含有上清を採取する。
- 4日目に、s183 TCR遺伝子変換iPSCをトライプシン化し、遠心分離機を400 x gで5分間、シード3×105 iPSCを100mm培養皿で予めコーティングしたSNL76/7(irSNL76/7)フィーダー細胞25を照射した。
- 合流の5日目または6日目に、細胞をトリプシン化し、5分間400 x gで遠心分離機を用いて、細胞選別のためのプロセスを行う。生細胞にゲーティングし、高速細胞選別機を用いてGFPとDsRED二重陽性細胞(s183 TCR遺伝子変換iPSC)をソートする。ステップ1.2.5と同様に、将来の使用のためにirSNL76/7フィーダーセル上でソートされた細胞を共培養する25.
- HBV特異的iPSC-CD8+T細胞の分化
注:OP9-DL1/DL4間質細胞は、ノッチリガンドDL1およびDL4の両方を過剰発現し、iPSCとiPSCを共培養することで、ノッチシグナル伝達媒介性T細胞分化26を促進できる。- 20%の胎児ウシ血清(FBS)を含むα最小必須培地(MEM)培地中のOP9-DL1-DL4細胞単層におけるs183 TCR遺伝子トランスプリエドiPSC(s183/iPSC)を成長させる。マウスFlt3リガンド(mFlt-3L;最終濃度=5 ng/mL)を培養物に含める。
- 0日目、0.5-1.0 x 105 S183/iPSCをOP9-DL1-DL4細胞で以前に成長させた10cm培養皿に入れた。OP9-DL1-DL4 セルが 80% ~ 90% の合流状態であることを確認します。
- 5日目に、10mLのリン酸緩衝生理食塩基(PBS)でiPSCをすすいで、PBSを吸引し、これを0.25%トリプシンの4mLに加え、37°Cインキュベーターで10分間インキュベートし、その後、iPSC培温の補助8mLを加えて消化を終わらせる。細胞と遠心分離機を含むすべての消化液を15~30°Cで5分間400xgで蓄積します。
- iPSC培養剤の10mLで上清を吸引し、細胞を再中断する。細胞懸濁液を新しい10cmペトリプレートに移し、37°Cで30分間インキュベーターでインキュベーターにインキュベートします。
- 30分後、浮動細胞を含むiPSC培体を回収する。70 μmセルストレーナーを通してセル懸濁液を通過し、セル数を計算します。
- 培養皿中の種子5 x 10 5細胞は、ステップ1.3.1に記載されているように80%〜90%のコンフルエントの条件を持つOP9-DL1-DL4細胞を以前に増殖させた。
注:T細胞分化の場合、各2〜3日、iPSC由来細胞はOP9-DL1-DL4細胞の新鮮な層で再シードする必要があります。
- 評価
- 分化iPSCの形態変化
- 様々な日に顕微鏡下で細胞を観察します。
注:5日目までに、コロニーは中皮のような特徴を持ち、ヒト真皮線維芽細胞に似た古典的な紡錘形状の形態を示し、インビトロで持続的な成長を示す。8日目までに、細胞の小さな丸いクラスターが現れ始めます。
- 様々な日に顕微鏡下で細胞を観察します。
- フローサイトメトリーによるiPSCの分化解析
- 共培養の様々な日に、前述の25(図1B,C)のようにiPSC由来細胞を分析する。
- 分化iPSCの機能解析
- 共培養の28日目に、浮遊細胞の採取を通じて培養からiPSC-CD8+T細胞を採取し、0.25%トリプシンで残り細胞をトリプシン化し、iPSC培地の8mLで再中断し、15~30°Cで400×gで5分間遠心分離機を除去し、培地を除去し、 次に、10 mLのメディアでセルを再中断します。
- 再懸濁した細胞を37°Cのインキュベーターで30分間新鮮な10cm皿に入れ、浮遊細胞を組み立てます。その後、冷たいPBSで細胞を1回すすいで下します。
- H-2クラスIノックアウトの脾臓から3 x 106 T細胞枯渇脾細胞(CD4-CD8-)をインキュベートし、HLA-A2.1-トランスジェニック(HHD)マウスを5 μM s183ペプチド(FLLTRILTI)で30分間4°Cで200 μLの培地で行う。
- s183ペプチドでパルスした脾細胞を有するiPSC-CD8+T細胞の混合物を産生する(T細胞:脾細胞=1:4;0.75 x 106 T細胞を使用する)。CO2インキュベーターで37°Cの細胞の混合物を40時間インキュベートします。最後の7時間の間に、希釈されたブレフェルジンAの4 μLを培養(1x培養培地で希釈される1,000xの最終濃度)を加え、細胞活性化中の輸送プロセスをブロックする。
- 細胞を染色し、前述したように細胞内IFN-γのフローサイトメトリック分析を行う(図2)。
- 分化iPSCの形態変化
2. HBVプラスミドの流体力学的送達を介したHBV複製の誘導
注: pAAV/HBV1.2 コンストラクトは、前述の9として生成されました。HBV 1.2完全DNAはベクターpAAVに組み込まれる。
- 末静脈を通るHBVプラスミドの流体力学的な配達
- 尾静脈を拡張するためにケージ内で5分間ヒートランプを使用してHHDマウスを加熱します。
- 拘束によって動物を拘束し、70%のエタノールスプレーでマウスの尾をきれいにします。
- 肝臓へのプラスミドの送達.
- 測定尺度を使用して、マウスの体重を測定します。
- 体重PBSの8%相当のHBVプラスミドの10 μgを希釈する(例えば、20gマウスの場合は1.6mL)。26 G × 1≥2" (0.45 × 12 mm) 皮下注射針を使用して 3 mL シリンジに希釈プラスミドをロードします。
- 尾の中央の3分の1にある2つの横尾静脈の1つを見つけ、針をどちらかの横静脈に置きます。3~5s以内の尾静脈を通してHBVプラスミドを含む注射を投与する。
- 感染マウスの血清からのウイルス血清の定量化
注:HBV複製は、マウス血清の3日目から35日目に行われます。DNA複製は7日目にピークを迎え、徐々に減少します。HBV DNAは35日目まで血清から取り出されない。- 感染マウスからの血清の採取
- 1.5mLマイクロ遠心管でレトロ軌道出血により感染後3、5、7、10日後に各マウスからマイクロ遠心管に約0.1mLの血液を採取し、室温(RT)で20分間インキュベートする。
- 4°Cで15分間6,000 x gでサンプルを遠心分離し、遠心分離後に血清上清を回収する。
- メーカーの推奨に従って市販のDNA抽出キットを使用して、血清からDNAを浄化します。簡単に言えば、シリカ系カラムで細胞を溶解し、洗い流しを行い、溶出カラムに100%エタノールを加え、1分間6000xgで遠心分離してDNAを抽出します。
- 溶出から100ngのHBV DNAを使用して、リアルタイムPCR解析を行います。次のプライマーとプローブを使用してください: フォワード 5' タググGTGTAGGCATAAtGG 3';逆 5' GCACAGCTTGGAGGCTTGT 3';プローブ 5' TCACCTCTCTAATC 3'。
- 標準曲線にはプラスミドを含むHBVゲノム(pAAV/HBV1.2)を使用し、10μL(図3)の総体積でリアルタイムPCRを実行します。
- 表 1に示すように、PCR 反応を合計体積 10 μL で設定します。
- 表 2に示すように、サーモ サイクラーで PCR プログラムをセットアップします。プログラムされた温度の転移率は変性/アニーリングのための20 °C/sおよび延長のための5 °C/sである。リアルタイムPCRモニタリングのための各サイクルのアニーリング段階の終わりに蛍光を測定します。
- 感染マウスからの血清の採取
3. ウイルスAg特異的iPSC-CD8+T細胞のACTによるHBV複製の低減
- 養子細胞転写(ACT)
- セクション1.3に記載されているように、mFlt-3LおよびmIL-7の存在下でOP9-DL1-DL4間質細胞に対してs183/iPSC(1.3.7)を区別する。
- 22日目に、トリプシンで10cmプレートからiPSC-CD8+T細胞を回収し、10cmプレートを10mLの新鮮な培地で洗浄し、再度塗布します。新鮮な10cmプレートに細胞を追加し、セクション1.3で行われたように30分間インキュベーターに戻ります。30分後、浮遊細胞を集める。
- 70 μmナイロンストレーナーを使用して細胞を通過させ、細胞クラスターを排除し、細胞数をカウントします。冷たいPBS溶液中の1.5 x 107細胞/mLの濃度に細胞を適応させ、70 μmナイロンストレーナーを使用して細胞を通過させ、必要に応じて細胞クラスターを再び排除します。ACTまで細胞を氷の上に置いてください。
- 尾静脈を通して4~6週齢のHHDマウスに200μL細胞懸濁液(3 x 106細胞)を注入する。
- HBVレプリケーションの誘導
- 細胞移植後14日目に、セクション2.1に記載されているように尾静脈を通してHBVプラスミドの流体力学的送達を行う。
- 感染した肝臓からのウイルスタンパク質検出
- 3日目、5日目、7日目、14日目、および21日目のマウスを犠牲にする。安楽死の場合は、各ケージで、第1段階で1~2Lの二酸化炭素(CO2)を使用します。動物が意識喪失を発症すると、CO2吸入を用いてマウス安楽死を行い、約4~5L/分のCO2流量を得る。
- はさみと鉗子を利用してペリトネウムの表面皮膚を切断し、わずかに肝臓をドラッグして、心膜腔内の内側の皮膚を明らかにすることによって肝臓を分離します。感染したマウスの肝臓サンプル(長さx幅x高さ= 0.5 cm x 0.5 cm X 0.3 cm)を収集し、4〜24時間の10%中性バッファーホルマリンでブロックします。
- 2.5 Mギ酸を使用して肝臓サンプルをデカルシフィック;キシレンで3分間すすり、100%エタノールで2xをすすり、95%エタノールで2xをすすり、脱イオン化(DI)水中で2xを2分間すすいで、次いで1mMエチレン科ミネテトラセチン酸(EDTA)で肝臓サンプルを脱石する。サブボイル温度(90°C)で20分間取り扱います。
- 固定肝組織を30分間冷却し、1x PBSで4分間組織をすすり、組織をパラフィンに埋め込みます。エタノールの濃度を上昇させる一連の状態で組織を脱水し、水を置き換え、キシレン浸漬に浸します。浸潤した組織をワックスブロックに埋め込みます。染色のための均等に垂直と水平のセクションを作ります。スライディングマイクロトームで4 μmセクションを準備します。
- キシレンとエタノールを用いてデパラフィン化および水分補給を通して切片を通過し、そのセクションの免疫蛍光染色を行う。
- HBV表面Ag特異的抗体の200 μL(ブロッキング溶液中の1:100希釈)で断面を染色する。75%~100%加湿室でRTで2時間の抗体で切片をインキュベートし、1x PBSで5xを5分間洗浄します。
- 4',6-diamidino-2-フェニリンドール(DAPI)を含むアンチフェード試薬を使用して、スライドを染色するために核染色を行います。希釈DAPI染色液(1x PBSで300nM)の約300μLでカバースリップを追加し、カバースリップ全体を検証します。蛍光顕微鏡下で検査するまで、4°Cの暗闇の中でスライドを保管してください。
- 感染マウスにおける炎症性細胞浸潤
- ステップ3.3.1に記載されているようにマウスを犠牲にする。肝臓を収集し、ステップ 3.3.4 で説明されているようにセクションを作成します。.
- ヘマトキシリンとエオシン(H&E)でセクションを染色し、肝臓への炎症細胞の浸潤を評価します。
- 蛍光顕微鏡下でさらに分析するまで、4°Cで暗闇の中でスライドを保管してください。
- 蛍光顕微鏡下のスライドを可視化し、炎症細胞の肝への浸潤を検出する(図4)。
- 感染した肝臓のHBV DNA検出
- ウイルスDNAの単離
- マウスを安楽死させ、セクション3.3に従って肝臓サンプルを収集する。
- プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む非インデットP-40(NP-40)リシスバッファー(50 mMトリス-HCL、1mM EDTA、1%NP-40)で肝臓組織をlyseします。
- 16,000 x gで簡単に遠心分離し、核と細胞の破片を除去します。
- 微小コッカスヌクレアーゼ(ヌクレアーゼS7;150単位/mL)とCaCl2(5mM)を37°Cで90分間浸炭し、ヌクレオカプシド外の核酸を分解する(NC)。
- 10mM EDTAを添加してヌクレアーゼS7を不活性化する。
- ポリエチレングリコール(PEG)でヌクレオカプシドを沈殿させ、0.5%のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)で破壊し、0.6mg/mLのプロテインサーゼK(PK)で1時間37°Cで消化する。
- フェノールクロロホルム抽出およびエタノール沈殿によりウイルス核酸を回収する。
- 1.2%のアガロースゲルで抽出されたウイルスDNAを解決し、32 P標識HBV DNAプローブを用いて標準的なサザンブロット分析によって検出します。
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Representative Results
ここに示すように、HBVウイルスAg特異的iPSC-CD8+T細胞は、インビトロ培養システムによって生成される。これらのウイルスAg特異的iPSC-CD8+T細胞のACT後、マウスモデルにおけるHBV複製を実質的に抑制する(補足ファイル1)。マウスiPSCは、ヒトマウスハイブリッドHBV TCR遺伝子(HB183-191-特異的、s183)をコードするMIDRレトロウイルス構造体でトランスデュースされ、その後、遺伝子変換されたiPSCは、ノッチリガンドを発現するOP9-DL1/DL4細胞と共培養される(DL1およびDL4の両方)。rFlt3LおよびrIL-7の存在の分子。インビトロ共培養の28日目に、iPSC由来細胞はCD3およびAg特異的TCR(T細胞マーカー)を実質的に発現する。CD3+CD8+母集団のフローサイトメトリック分析は、HBV TCR伝達がウイルスs183特異的CD8+T細胞の生成を劇的に増加させることを示している(図1)。
インビトロ共培養の28日目に、CD4-CD8+単一陽性(SP)iPSC-CD8+T細胞をs183ペプチドでパルスしたT枯渇脾細胞によって単離および刺激され、サイトカイン産生が評価される。iPSC-CTLsは、細胞内染色またはELISA(図2)によって検出されたIL-2およびIFN-)を大量に生成する。HBV感染は、マウスの尾静脈を通してpAAV/HBV1.2 DNAプラスミドの10 μgの流体力学的注射によってHLA-A2.1トランスジェニック(HHD)マウスに誘導される。HBV複製は、HHDマウスの血清中の3~21日目から検出される。DNA複製は6日目にピークを迎え、リアルタイムPCR解析を用いて徐々に減少する(図3)。
ACTの2週間後、マウスはpAAV/HBV1.2 DNAプラスミドの流体力学的注射に挑戦される。ウイルス価射器は、注射後の様々な時点で血清からリアルタイムPCRによって測定される。結果は、HBVウイルスAg特異的T細胞を受け取るマウスにおいて、ウイルス複製が全ての時点で有意に減少することを示している(図4A)。HBV表面タンパク質発現は、上記の治療の設定においても肝臓で調べられる。マウスはHBV注射後様々な日に安楽死させられ、肝臓サンプルは組織学的検査のために単離される。サンプルはHBV表面タンパク質に対して染色され、蛍光顕微鏡下で調べられる。HBV表面タンパク質は、HBVウイルスAg特異的プリiPSC-CTLsを受け取るマウスにおいて実質的に減少したと認められるが、対照細胞を受け取るマウスと比較して(図4B)。この実験は、ウイルスAg特異的iPSC-CD8+T細胞がマウスモデルにおけるHBV複製を減少させる能力を有することを明確に示している。
図1:HBVウイルスAg特異的iPSC-CD8+T細胞の生成。
マウスiPSCは、次のレトロウイルス構造体でトランスベージされます:HBs183-91 TCR(MiDR-s183 TCR)またはOVA257-264 TCR(MiDR-OVA TCR)、および変換されたiPSCは、T系統分化のためのOP9-DL1/DL4ストロム細胞と共培養される。(A)s183特異的TCRを発現するレトロウイルス構造MiDR-s183 TCRの概略表現。3/4 = 包装信号;2A = ピコルナウイルスセルフクッシ2A配列;LTR = 長い端末が繰り返されます。(B)0日目、7日目、14日目、および22日目のT細胞分化の形態。(C)28日目のiPSC由来細胞のフローサイトメトリック分析。CD3+CD8+細胞(左)は、示されているようにゲートされ、CD8およびTCRVβ28(右)の発現について分析される。示されたデータは、3つの個々の実験を代表する。値は平均 ± SD (**p < 0.01; ペア t 検定) を表します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:HBVウイルスAg特異的iPSC-CD8+T細胞の機能解析。
インビトロ共培養の28日目に、SP CD8+s183 TCRペンタマー+iPSC-T細胞がソートされる。MiDR-s183 TCRでトランスメーションしたiPSC-T細胞およびCD8+T細胞は、HHDマウスからのT枯渇性脾細胞(APC)によって刺激され、s183ペプチド(FLLTRILTI)でパルスされる。(A)7時間後のIFN-Εの細胞内染色(CD8+細胞にゲート)(T/APC=1:4)。(B)40時間後のIFN-γのELISAは、示されたデータが3つの個々の実験を代表する。値は平均 ± SD (n.s., p > 0.05; ペア t 検定) を表します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:流体力学注入によるHHDマウスにおけるHBV複製の誘導
HHDマウスは、流体力学的尾静脈注射を介してHBVプラスミドを用いたi.v.を管理する。プラスミドの10μgは、全体重PBSの8%で注入される。注射後の指定された時点で、血清は血液から単離され、DNAはリアルタイムPCRのために抽出される。示されたデータは、3つの個々の実験を代表する。値は平均±SDを表し、データは3つの独立した実験のグループごとに5匹のマウスを表す。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ウイルスAg特異的iPSC-CD8+T細胞のACTによるHBV複製の減少。
HHDマウスは、ウイルスAg特異的iPSC-CD8+T細胞前駆体(インビトロ培養の22日目)で養子的に転写され、細胞転写後の第2週にHBVプラスミドを投与した。(A)血清HBVコピー。注射後の指示された時点で、血清は血液から単離され、リアルタイムのPCR分析のためにDNAを抽出します。示されたデータは、3つの個々の実験を代表する。値は平均±SD.(B)肝組織組織学を表す。マウスは8日目にHBV感染後に安楽死させる。肝臓サンプルは、組織学的検査のために単離され、染色される。上のパネルは、感染したマウスにおけるHBsAgタンパク質発現(IHC染色)を示し、下のパネルは炎症性細胞浸潤(HE染色)を示す。データは、3つの独立した実験のグループあたり5匹のマウスを代表する。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| DNA テンプレート | 2 ミリリットル |
| DNAマスターハイブリダイゼーション混合物(Taq DNAポリメラーゼ、PCR反応バッファー、10mM MgCl2、およびdNTP混合物) | 1 ミリリットル |
| 25 mM MgCl2 | 0.8ミリリットル |
| 0.3 μM プローブ | 3 ミリリットル |
| 各プライマーの5 μM | 3.2ミリリットル |
| 合計 | 10ミリリットル |
表1:PCR反応量
| 温度 | 時間 | |
| 変性 | 95 °C | 5 s |
| 焼鈍 | 53 °C | 10 s |
| 拡張子 | 72 °C | 20 s |
| 5 °C |
表 2: PCR プログラム
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Discussion
このプロトコルは、マウスモデルにおけるHBV複製を抑制するACTとして使用するためのウイルスAg特異的iPSC-CTLを生成する方法を提示する。慢性HBV感染において、ウイルスゲノムは安定なミニ染色体を形成し、肝細胞の寿命を通して持続しうる共有閉じた円形DNA(cccDNA)を形成する。ウイルスミニ染色体のクリアランスを標的とすると、慢性HBV感染の治癒をもたらす可能性がある。現在の抗ウイルス療法はウイルス逆転写酵素を標的とするが、cccDNAによって駆動されるHBV複製に対する免疫学的制御を確立することはめったにない。HBV特異的CD8+CTLは、感染した肝細胞の死を仲介し、cccDNAのクリアランスを加速することができる。それにもかかわらず、HBV特異的CTLは、慢性HBV感染患者の疲労に対して、削除、機能不全、または疲労に屈する。HBV特異的CTLを用いてACTは、慢性HBV感染28、29に対する有利な治療法である。ナイーブまたは中央記憶T細胞由来Tリンパ球(すなわち、高反応性免疫細胞)は、その大きな増殖、末期分化細胞と比較して死亡傾向が低く、優れたACTベースの治療のための理想的なエフェクターです。ホサイトオスタティックサイトカインに応答する能力。しかし、このようなACTは、患者から十分な数のCTLを得ることが困難なため、しばしば実現不可能であった。iPSCからのAg特異的CTLまたはTレグのリプログラミングは、細胞ベースの治療20、23、27、30に使用できることが以前に示されている。本報告は、ウイルスAg特異的iPSC-CTLを生成し、HBV複製のマウスモデルにおけるACTベースの免疫療法にこれらの細胞を使用する方法を示す。
HBV複製のトランスジェニックマウスモデルはありますが、トランスジェニック遺伝子産物によって誘導される中心耐性は、マウスがHBV Agsに対して耐性を持つ原因となるため、これらのモデルは困難です。さらに、トランスジェニックマウスは、統合されたHBVゲノムが各マウス細胞31、32に持続するようにウイルスクリアランスをモニタリングするのに適していない。また、感染を予防するためのワクチンが開発されているにもかかわらず、HBV感染後の治療や免疫療法は開発されていない。さらに、HBV感染の宿主範囲は男性およびチンパンジーに限られており、HBVの伝播のためのインビトロ培養システムでは不十分であるため、HBV病因に対する実験的アプローチは妨げられている。CD8+T細胞は、ウイルス感染の様々なタイプに対して有望なエフェクター細胞です。しかしながら、HBVに対するT細胞応答は豊富ではない。特異性、機能、および免疫応答をマウントするのに十分な数の欠如が原因であり得る。この報告は、マウスにおけるHBV複製を効率的に誘導する流体力学注入の方法を明らかにする。この方法は、肝臓に直接大量のHBVプラスミドを送達することを可能にする。このモデルは、注射後の異なる日にHBV mRNA、タンパク質、およびDNAを検出して8週間以上連続的なウイルス血症を示す。マウスにおけるHBV複製のためのこの方法は、HBV免疫療法に有用である。
要約すると、HBV複製は、動的誘導注射手順を通じてマウスで正常に誘導され、ウイルスAg特異的iPSC-CTLはHBV複製の免疫療法として使用された。しかし、この方法には2つの制限があります:(1)インビトロT細胞分化の3週間以上は、ACTのために生成されたT細胞の翻訳アプリケーションを減少させる可能性があります。そして(2)HBV流体力学注入は、効率的に肝臓でHBV複製を誘導することができます;しかし、持続的なHBV感染の主な理由であるcccDNAを形成しない。それにもかかわらず、この方法はHBV複製および治療のための別のアプローチを提供する。抗HBV薬とウイルスAg特異的iPSC-CTLsのACTを用いた併用レジメンは、HIV貯留槽を減少させ、それによって慢性HIV感染の治療をもたらす可能性が高い。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
著者らは、トロント総合病院研究所のアダム・J・ゲーリング博士に対し、HBs183-91(s183)(FLLTRILTI)-特異的A2制限ヒトマウスハイブリッドTCR遺伝子のcDNAを提供してくれたことに感謝し、国立台湾大学のペイ・ジャー・チェン博士に感謝の意を表した。pAAV/HBV 1.2 コンストラクト。この研究は、国立衛生助成研究所R01AI121180、R01CA221867およびR21AI109239からJ.S.にサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HHD mice | Institut Pasteur, Paris, France | H-2 class I knockout, HLA-A2.1-transgenic (HHD) mice | |
| iPS-MEF-Ng-20D-17 | RIKEN Cell Bank | APS0001 | |
| SNL76/7 | ATCC | SCRC-1049 | |
| OP9 | ATCC | CRL-2749 | |
| pAAV/HBV1.2 plasmid | Dr. Dr. Pei-Jer Chen (National Taiwan University Hospital, Taiwan) | HBV DNA construct | |
| HBs183-91(s183) (FLLTRILTI)-specific TCR genes | Dr. Adam J Gehring (Toronto General Hospital Research Institute, Toronto, Canada) | FLLTRILTI-specific A2-restricted human-murine hybrid TCR genes (Vα34 and Vβ28) | |
| OVA257–264-specific TCR genes | Dr. Dario A. Vignali (University of Pittsburgh, PA) | SIINFEKL-specific H-2Kb-restricted TCR genes | |
| Anti-CD3 (17A2) antibody | Biolegend | 100236 | |
| Anti-CD44 (IM7) antibody | BD Pharmingen | 103012 | |
| Anti-CD4 (GK1.5) antibody | Biolegend | 100408 | |
| Anti-CD8 (53-6.7) antibody | Biolegend | 100732 | |
| Anti-IFN-γ (XMG1.2) antibody | Biolegend | 505810 | |
| Anti-TNF-a (MP6-XT22) antibody | Biolegend | 506306 | |
| α-MEM | Invitrogen | A10490-01 | |
| Anti-HBs antibody | Thermo Fisher | MA5-13059 | |
| ACK Lysis buffer | Lonza | 10-548E | |
| Brefeldin A | Sigma | B7651 | |
| DMEM | Invitrogen | ABCD1234 | |
| FBS | Hyclone | SH3007.01 | |
| FACSAria Fusion cell sorter | BD | 656700 | |
| Gelatin | MilliporeSigma | G9391 | |
| GeneJammer | Agilent | 204130 | |
| HLA-A201-HBs183-91-PE pentamer | Proimmune | F027-4A - 27 | |
| HRP Anti-Mouse Secondary Antibody | Invitrogen | A27025 | |
| mFlt-3L | Peprotech | 250-31L | |
| mIL-7 | Peprotech | 217-17 | |
| Nuclease S7 | Roche | 10107921001 | |
| Paraformaldehyde | MilliporeSigma | P6148-500G | Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic |
| Permeabilization buffer | Biolegend | 421002 | |
| Polybrene | MilliporeSigma | 107689 | |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| QIAamp MinElute Virus Spin Kit | Qiagen | 57704 |
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