Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Single-molekyl Förster resonans energiöverförings metoder för real tids utredning av Holliday Junction resolution av GEN1

Published: September 18, 2019 doi: 10.3791/60045
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Laboratory of DNA Replication and Recombination, Biological and Environmental Sciences and Engineering Division (BESE), King Abdullah University of Science and Technology (KAUST)
* These authors contributed equally

Summary

Presenteras här är ett protokoll för att utföra Single-molekyl Förster resonans energiöverföring för att studera HJ upplösning. Tvåfärgad omväxlande excitation används för att bestämma dissociationskonstanter. Enfärgad tidsfördröjning smFRET tillämpas sedan i realtid klyvning analyser för att få Dwell tid fördelning före HJ upplösning.

Abstract

Bulkmetoder mäter Ensemble beteendet hos molekyler, där individuella reaktionshastigheter av de underliggande stegen är genomsnittliga i hela populationen. Single-molekyl Förster resonans Energy Transfer (smFRET) ger en inspelning av de överensstämde förändringar som sker genom enskilda molekyler i realtid. Därför är smFRET kraftfull i att mäta strukturella förändringar i enzymet eller substrat under bindning och katalys. Detta arbete presenterar ett protokoll för Single-molekylen avbildning av samspelet mellan en fyra-vägs Holliday korsning (HJ) och gap Endonuklease I (GEN1), en cytosolisk homolog rekombination enzym. Också presenteras är enfärgad och tvåfärgad omväxlande excitation (ALEX) smFRET experimentella protokoll för att följa upplösningen av HJ av GEN1 i realtid. Kinetik av GEN1 Dimerization bestäms vid hj, som har föreslagits att spela en nyckelroll i resolutionen av HJ och har förblivit svårfångade tills nu. De tekniker som beskrivs här kan tillämpas i stor utsträckning för att få värdefulla mekanistiska insikter i många enzym-DNA-system.

Introduction

Enmolekyl-metoder baserade på fluorescensdetektion ger hög signal-till-brus-förhållanden1. FRET är en spektroskopisk teknik som kan mäta avstånd i intervallet 1 – 10 nm, vilket gör denna teknik som en molekylär linjal för att mäta avstånd i nanometer Range2,3. Acceptorens absorptionsspektrum har en partiell spektralöverlappning med givarens emissions spektrum vid den kortare våglängdsänden. FRET förmedlas av strålningen-mindre energiöverföring mellan en givare och acceptor par, medan effektiviteten i energiöverföringen är beroende av avstånd och orientering av acceptor4.

Flera metoder har implementerats för att minimera bakgrunden och förbättra detekterings effektiviteten hos fluorescenssignalen5,6. Ett tillvägagångssätt är konfokalmikroskopi, där ett hål begränsar excitationspotten till en storlek under diffraktionsgränsen7. En annan metod är total inre reflektions fluorescens (TIRF), som är en bred fälts belysning teknik där ljuset riktas off-axeln över en kritisk vinkel8. Ljuset är då helt internt reflekteras i gränssnittet mellan glas och vattenlösning, genererar en försvinnande våg som bara lyser upp fluoroforer fäst vid glasytan och förhindrar bakgrund från fluoroforer i resten av lösningen.

I konfokalmikroskopi kan molekylerna antingen vara fritt diffuserande eller ytimmobiliserade. Den uppnådda temporala upplösningen kan vara inom mikrosekunder till flera millisekunder9. Den konfokala detektering för en enda molekyl utförs av Single-Photon lavin diod (SPAD) och punkt-för-punktskanning av regionen av intresse10. I TIRF, en tidsserie av några hundratals molekyler immobiliserade på ytan registreras av en positions känslig tvådimensionell laddning kopplad detektor (CCD). CCD förstärker fluorescens signalen antingen genom intensifierad fosfor skärm och MicroChannel-plattan eller on-chip multiplikation av photoelektroner (EMCCD). Den temporal upplösningen är anhörigen på avläsning-rusad och quantumeffektivitet av CCD och vanligt på beställa av fåtalet tio av millisekunder6.

HJ är en central intermediär i DNA-reparation och rekombination11,12,13,14. HJ har två kontinuerliga och två korsning strängar som ansluter mellan de kontinuerliga strängarna utan korsande varandra. HJ finns i lösning som X-staplade kon Formations apparater, som genomgår kontinuerlig isomerisering av de kontinuerliga strängarna blir korsning och korsningen strängarna blir kontinuerlig i de andra conformer15. Isomer preferens för hj är beroende av kärnan sekvens och jonisk miljö och har studerats utförligt av FRET16,17,18,19.

GEN120 är ett monomer protein i lösning21 och kräver Dimerization att klyva hj, vilket möjliggör korrekt separation av de rekombinerade delarna22,23. Den stapling conformer preferens för HJ påverkar resultatet av genetisk rekombination genom att fastställa inriktningen av resolutionen av HJ resolvaser24. Förstå hur GEN1 binder hj, samordnar de två snitt, och säkerställer dess fulla upplösning har alla varit under intensiv studie21,22,23,25,26 ,27,28,29,30.

I denna studie, en objektiv baserat TIRF set-up används som beskrivs tidigare31. Tvåfärgad omväxlande excitation (ALEX) tillämpas för att bestämma de överensstämde förändringar på samspelet mellan GEN1 med fluorophore märkt HJ. Alex producerar 2D-histogram baserat på två ratiometriska parametrar FRET effektivitet E, som är givare-acceptor avstånd-beroende, och stökiometri parameter S, som mäter donator-acceptor stökiometri32. ALEX möjliggör sortering av fluorescerande arter baserade på stoichiometrier av fluoroforer, inklusive endast givare, acceptor och blandade subpopulationer. ALEX kan förlänga användningen av FRET till hela sortimentet och kan upptäcka skillnader i fluorophore ljusstyrka och oligomerisering samt övervaka makromolekyl-ligand interaktioner33.

Det finns att GEN1 konsekvent lyckas lösa HJ inom livslängden för GEN1-HJ-komplexet. De tidsberoende kon Formations förändringarna härleds från tids spåren av enskilda molekyler, medan histogrammen representerar fördelningen av de underliggande populationerna. Använda Time-lapse enfärgad FRET, snabb på-priser och långsam off-priser för GEN1 dimer demonstreras, vilket ökar affiniteten av den sammansatta GEN1 dimer vid den första snitt produkten.

Protocol

1. beredning av ytfunktionaliserade täckglas

  1. Rengöring
    1. Placera fem täckband (24 mm x 60 mm) i etanol inuti en Coplin burk. Sonikera i etanol sedan i 1 M kaliumhydroxid i 30 min för 3x. Tvätta i aceton 3x och dekanera sedan.
  2. Silanisering
    1. Bered en lösning på 2,8% 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) i aceton. Försegla APTES-flaskan med en paraffin film och förvara vid 4 ° c.
      Obs: Använd skyddsglasögon och arbeta under ett draghuv. Behållaren till silan-lösningen ska vara helt torr och sköljas av aceton omedelbart före och efter att silanlösningen har hällts i burken.
    2. Häll 70 mL av 2,8% APTES lösningen i Coplin burken som innehåller täckglas. Skaka burken i 4 minuter i en orbitalskak.
    3. Låt burken stå på bänken för 5 min, Sonikera för 1 min, och slutligen hålla burken på bänken för ytterligare 10 min för silan att reagera med hydroxylgrupper på glasytan.
    4. Släck reaktionen genom tillsats av 1 L avjoniserat vatten genom att hälla vatten direkt i burken för snabb utbyte av lösningsmedel. Skölj glasen 3x i vatten genom att skaka burken i sidled på en plan yta.
    5. Ta täckblad ur burken och placera dem på en aluminiumfolie facket. Grädda täckglas i en ugn vid 110 ° c i 30 min för att torka täckglas och bota SILANE. Lämna brickan på bänken för täckglas att svalna till rumstemperatur.
  3. Pegylering
    1. Värm upp en PEG och PEG, förvaras vid-20 ° c till rumstemperatur (RT) för att förhindra kondens av fukt vid öppnandet av behållaren.
    2. Placera fem täckband med den silaniserade ytan vänd uppåt på en låda. Placera två täckglas (22 mm x 22 mm) som distansade längs kanterna på de silaniserade täckglasarna.
    3. En gång värmde upp, göra en PEG och PEG lösningar vid ett förhållande av ~ 1:100 i 1 ml färsk, 0,1 M natriumbikarbonat lösning genom att lägga till 1,5 mg en PEG och 150 mg PEG i en 1,5 ml rör.
    4. Vortex röret för att lösa upp PEG och snurra ner för att ta bort luftbubblor.
      Obs: gå framåt från detta steg, vara snabb, eftersom PEG hydrolyserar i lösning inom en tidsram på min.
    5. Applicera snabbt 100 μL av PEG-lösningen på varje täckslip. Ta en annan bakad täckglas och placera sin övre silaniseras yta framsidan nedåt på täckglas med PEG lösning, därav bildar en glas-lösning-glas smörgås där 22 mm x 22 mm icke-silaniseras täckband gör de två funktionaliserade täckglas att separeras enkelt.
    6. Inkubera täckslinarna över natten (16 h) i mörker och vid RT. När inkuberingen är klar, ta isär täckband, skölj sedan 10X med avjoniserat vatten genom att tvätta från sidan med en spruta flaska.
    7. Torka täckglas under ett flöde av torrt kväve. Förvara de torra täckunderklänningar under vakuum.
      Obs: bilderna kan användas i 1 månad utan kvalitetsförsämring.

2. beredning av flödescell

  1. En-kanals flöde cell
    1. Borra två hål med 1,22 mm diameter i mittdelen av en kvarts bild (50 mm x 20 mm) med de centra som ligger 37 mm isär och 6,5 mm från kanten av bilden (figur 1a).
    2. Klipp ut en 41 mm x 2,25 mm kanal i en 50 mm x 20 mm bit av en dubbelhäftande plåt med hjälp av en elektronisk fräs.
    3. Dra av plast sidan av skyddslocket och rikta in kanterna på pjäsen med kanterna på kvarts bilden. Ta bort fångade luftbubblor genom att trycka försiktigt med ett par polytetrafluoreten pincetter.
    4. Dra av papperets sida av det adhesiva stycket. Montera stycket på den funktionaliserade ytan på täckslip.
    5. Skär polyeten slangar (I.D. 1,22 mm) i en längd av 11 cm för inloppet och 25 cm för utloppet. Sätt in röret i de tidigare borrade hålen som inlopp och utlopp för cellen flöde.
    6. Använd 5 min epoxilim för att täta runt kanterna på Quartz-Coverslip-gränssnittet och runt rören för inloppet och utloppet.
    7. Använd cellen flöde omedelbart när den torkar eller förvara under torr vakuum för senare användning.
    8. Lös upp avidinen i PBS till en koncentration av 0,03 mg/mL. Filtrera genom 0,2 μm sprutfilter.
    9. Flöde avidinen i cellen flöde med hjälp av en 1 mL spruta. Använd en annan spruta fylld med buffert för att tvätta ut överflödigt avidin. Var noga med att inte införa luftbubblor vid byte av sprutor.
  2. Flödescell med flera kanaler
    1. Borra sex hål med en diameter på 1,22 mm på var och en av långsidorna av en kvarts bild (76 mm x 25 mm) (figur 1b). Gör hålen 4,5 mm från kanten av bilden och 9,3 mm isär. Se till att avståndet mellan centralerna i varje hålpar är 15 mm.
    2. Klipp ut sex kanaler (20 mm x 2,25 mm) i en 76 mm x 25 mm bit dubbelhäftande tejp med hjälp av den elektroniska fräsen.
    3. Dra av plast sidan av skyddslocket och rikta in kanterna på det adhesiva stycket med kanterna på kvarts glaset. Ta bort eventuella fångade luftbubblor genom att försiktigt trycka med ett par polytetrafluoreten pincetter.
    4. Dra av pappers sidan av det adhesiva stycket och montera den på täckskenens funktionaliserade yta.
      Obs: ibland skalar av pappers sidan och fästa till Quartz Slide fungerar bra i Multichannel flöde cellen.
    5. Skär inloppsrören (11 cm) och utloppsrören (25 cm) för de sex kanalerna. Förbered flödes cellen enligt beskrivningen i steg 2.1.6 – 2.1.9.
    6. Anslut uttaget på den första kanalen till pumpen. Placera inloppet i 0,5 mL tub med OSS.
      Anmärkning: längden på inloppsröret väljs för att maximera antalet händelser i klyvning experiment utförs under kontinuerligt flöde genom att synkronisera tiden för enzym ingången i cellen flöde och start av avbildning vilket minskar för tidig foto blekning av fluoroforer.
    7. Flytta till en ny kanal genom att koppla bort den använda kanalens utlopp. Stäng utloppet med en plugg gjord av en sprutnål förseglad med lim i plast delen. Stäng inloppet till den använda kanalen.

3. beredning av syre rensnings system (OSS)

  1. Lös upp 0,2 g (±) -6-hydroxy-2, 5, 7, 8-tetramethylchromane-2-karboxylsyra (Triplet State törstsläckare som minimerar blinkande fluoroforer) i 800 μl metanol.
  2. Tillsätt 6 ml avjoniserat H2O och tillsätt 1 N NaOH droppvis tills den löses upp. Filtrera genom en spruta filter, gör i 1 mL alikvoter, och förvara vid-80 ° c. Lager koncentrationen är ~ 100 μM.
  3. Förbered en ny lösning av 3, 4-dihroxybensoesyra (PCA) genom att lösa 61 mg PCA pulver i 4 mL ddH2O. Lager koncentrationen är ~ 100 nM.
  4. Tillsätt 58 μL av 10 N NaOH dropwise, se till att virvel efter varje droppe tills PCA är helt upplöst (pH = 9).
  5. Lös upp 5,3 mg protocatechuat 3, 4-dioxygenas (3, 4-PCD) i 7 mL PCD-lagringsbuffert (tabell 1). 3, 4-PCD avlägsnar syre från bindnings-/klyvningsbuffertarna genom att katalysera oxidationen av protocatechuic Acid34.
  6. Dela upp PCD-lösningen i 1 mL-aliquots. Lager koncentrationen är ~ 1 μM. snap-Freeze alikvoter i flytande kväve och förvara vid-80 ° c för långtidslagring eller vid-20 ° c för korttidsförvaring.
  7. Förbered en ny bindningsbuffert (tabell 1). Suppleant 2 mM CaCl2 med 2 mm mgcl2 för smfret klyvning experiment.
  8. Förbered 1 mL av bildningsbufferten (tabell 1). Förvara bildbufferten på is tills den förs in i cellen flöde för att bibehålla aktiviteten hos syre rensnings systemet.

4. beredning av överföras märkta HJS

  1. Rekonstituera den frystorkade oligos (tabell 2) i Tris-EDTA-bufferten (tabell 1) till en koncentration av 100 μm.
  2. Förbered den syntetiska korsningen genom att blanda ekvimolära portioner ~ 3 μl av varje X0 oligos anges i tabell 1.
  3. Anneal genom upphettning vid 95 ° c i 5 min följt av långsam kylning till RT med en hastighet av 1 ° c/min. Använd antingen en värmeblock eller PCR termocycler för att uppnå önskad kylhastighet.
  4. Fyll på blandningen på 8 cm x 8 cm 10% Tris-Borat-EDTA polyakrylamidgel. Applicera 100 V och kör gelen för ~ 2 h. Banden är tydligt ses av ögat, och deras färg är lila.
  5. Punktskatten på det glödgat substrat med ett rent blad. Överför gel biten till ett autoklaverat 1,5 mL-rör.
  6. Krossa gel biten inuti röret med en ren kolv och tillsätt sedan 100 μL TE100 buffert (tabell 1).
  7. Extrahera HJ genom att skaka röret vid 20 ° c vid 1 500 rpm i en termomixer för ~ 2 h eller Inkubera över natten vid 4 ° c.
  8. Utför etanol nederbörd på den lösning som innehåller substratet35.
  9. Omsuspendera substratet i 20 μL TE100 buffert (tabell 1). Den slutliga koncentrationen är 1–3 ΜM. alikvot 2 μl i varje tub och förvara vid-20 ° c.

5. protein uttryck och rening av GEN1

  1. Konstruera plasmid för uttrycket av stympad humant GEN11,2,3,4,5 med hexa Histidine-tag vid C-terminus20 med PCR av posten vektorn.
    Anmärkning: N-Terminal märkning skulle resultera i inaktivering av GEN1. Den ostrukturerade C-tail gör rening av full längd GEN1 betydligt hårdare. Också, full längd GEN1 rapporterades att uppvisa mindre aktivitet än trunkerad version23.
  2. Omvandla uttrycks vektorn till E. coli BL21-codonplus (de3)-Ripl-stam.
  3. Inokulera de transformerade cellerna i två 6 L-kolvar vardera innehållande 2 L Luria buljong media vid 37 ° c med skakning vid 180 rpm tills en OD600 av 0,8 uppnås.
  4. Kyla ner kulturen till 16 ° c och inducera GEN1 uttryck med 0,1 mM isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside (IPTG) för 48 h.
  5. Skörda cellerna genom att snurra ner dem vid 4 ° c vid 1000 x g i en centrifug. Varje liter kultur ger 5–6 g av pelleten.
  6. Kassera supernatanten och Omsuspendera de pelleterade cellerna i lyseringsbufferten (tabell 1) med hjälp av 4 ml/g celler.
  7. Utför celllys med hjälp av en cell disruptor vid 30 kPsi och snurra sedan ner på 10 000 x g för 1 h vid 4 ° c. Samla supernatanten och filtrera den på is med hjälp av 0,45 μm filter.
  8. Utför Proteinrening med hjälp av FPLC genom att passera filtratet genom en 5 mL ni-NTA-kolonn vid 2,5 ml/min-flöde med hjälp av buffert A (tabell 1).
  9. Tvätta med 15 spalt volymer (CV). Elute med en linjär gradient av buffert A och 500 mM Imidazol över 20 CV i 5 mL fraktioner. GEN1 eluerar från kolonnen på runt 100 mm Imidazol.
  10. Pipettera över 10 μL alikvoter från de insamlade fraktionerna, tillsätt lika stora mängder 2x laddnings färg för SDS till varje alikvot. Denaturera proverna genom upphettning vid 90 ° c i 5 min, kyla och snurra ner proverna.
  11. Fyll på proverna på 10% bis-Tris gel. Kör gelen i 30–45 min vid 200 V. fläcken med hjälp av Coomassie lysande blå, sedan destain. Samla in bråk som innehåller renad GEN1.
  12. Minska salt koncentrationen av de kombinerade fraktionerna till 100 mM genom utspädning med hjälp av buffert C (tabell 1).
  13. Passera det låga salt proteinet genom en 5 mL heparin kolonn med en flödeshastighet på 3 mL/min med hjälp av buffert B (tabell 1).
  14. Tvätta med 10 CV. Elute med en gradient på 20 CV med buffert B och 1 M NaCl. Samla 5 ml fraktioner där GEN1 eluerar runt 360 mm NaCl.
  15. Kontrollera eluerade fraktioner för renade GEN1 fraktioner som beskrivs i steg 5,8. Kombinera dessa fraktioner och späd till 100 mM NaCl med hjälp av buffert C.
  16. Fyll på det lägre salt proteinet på en katjonbytarkolonn med 1 mL/min flödeshastighet med hjälp av buffert B.
  17. Eluten med en gradient på 40 CV med buffert B och 1 M NaCl. Samla 1,7 ml fraktioner där GEN1 eluerar runt 300 mm NaCl.
  18. Kontrollera renhet av GEN1 i eluerade fraktioner som beskrivs i steg 5,8.
  19. Kombinera de renaste fraktionerna och dialyze vid 4 ° c mot lagringsbufferten (tabell 1). Utföra minst ett byte av bufferten under dialys.
  20. Mät protein koncentrationen ~ 0,5–1 mg/ml. Alikvot det dialyserade proteinet i 10–15 μl volymer i små rör, blixt frysning i flytande kväve, och förvara vid-80 ° c.

6. Single-molekyl FRET experiment

Obs: den smFRET experiment utförs på ett specialbyggt mål baserat TIRF set-up (figur 1c) beskrivs tidigare31.

  1. Enfärgad FRET experiment
    1. Applicera en droppe av nedsänkning olja på 100x TIRF mål. Ställ in EMCCD till lämplig förstärkning för att optimera signalen till bakgrunden och förhindra mättnad.
      Obs: Titta inte direkt in i laserstrålen och Använd skyddsglasögon när du justerar lasern.
    2. Placera flödes cellen försiktigt på provhållaren. Gradvis höja målet med grovjustering tills oljan vidrör täckslip.
    3. Slå på den gröna lasern (532 nm). Växla till fin justeringsläge av målet. Rikta utsläppet till kamerans port för att observera bilden på bildskärmen.
    4. Justera höjden på målet tills den funktionaliserade ytan på täckslip tas i fokus och kan observeras på monitorn.
      Obs: bild förvärvet av EMCCD utlöser laser excitation via acousto-Optic avstämbart filter (AOTF) för att förhindra prov foto blekning när bilder inte förvärvas.
    5. Kontrollera att bakgrunden från funktionaliserade ytan av täckglas inte överstiger några fläckar innan flyter i fluorescerande märkt HJ.
    6. Späd ut lager substratet ungefär 1000 gånger i TE100 buffert (tabell 1) till en slutlig koncentration på 1 – 5 nm. Pipettera 0,2 – 0,5 μL av det utspädda underlaget till 120 μL av bildningsbufferten med OSS i ett 0,5 mL-rör.
    7. Anslut flödes cellens utlopp till sprutpumpen. Sätt in inloppsröret i flödes cellen i 1,5 mL-röret och Använd sprutpumpen med en flödeshastighet på 30 – 50 μL/min för att dra ut lösningen från röret.
    8. Kontrollera ofta ytan för god täckning (100 – 300 av homogena fördelade, väl fördelade substrat) genom avbildning kort med den gröna lasern.
    9. Om ytan täckningen är fortfarande inte tillräckligt antingen vänta några minuter för fluorescerande märkt HJ från lösningen att bosätta sig på ytan eller upprepa flödande steg.
    10. Strömma ytterligare 120 μL bildbuffert (tabell 1) vid 30 – 50 μl/min för att tvätta obunden Fluorescent märkt hj. Låt sedan flödes cellen sitta i 5 minuter för att möjliggöra för OSS att tömma upplöst syre. Foto blekning av fluorofoforer bör vara minimal i början av avbildning.
    11. Ställ in exponeringstid (~ 60 MS), cykeltid kommer att ställas in automatiskt av programvara baserat på hastigheten på dataöverföring (~ 104 MS), och ange önskat antal cykler eller ramar (~ 400). Utsläppet från givare (Cy3) och acceptor (Alexa fluor 647) delas upp i två färgkanaler av en bild delnings enhet.
    12. Hitta ett lämpligt område på ytan, fokusera bilden genom att justera höjden på målet och spela in och spara filmen i 16-bitars TIFF-format.
    13. Flytta till ett nytt område.
      Obs: rör sig alltid endast i en riktning (dvs. från utlopp till inlopp) för att undvika avbildning i samma område två gånger.
    14. Förbered 1, 2, 5, 10, 25, 50, 75 och 100 nM GEN1 i 120 μL bildbuffert en i taget. Flöde lösningen med en flödeshastighet på 30-50 μL/min.
      Obs: om den erforderliga mätningen görs under steady state som i bindningen av HJ av GEN1 eller Isomerization av den fria HJ, vänta sedan 3 – 5 min efter att flödet stannar för att spela in filmen. Förvärva tre till fyra filmer från nya områden för varje GEN1 koncentration.
    15. Om mätningen utförs under kontinuerligt flöde som i klyvning av HJ av GEN1 sedan börja spela in 5 – 10 s före ingången till GEN1 i cellen flöde. Upprepa mätningen genom att flytta till en ny kanal i cellen sex-kanals flöde.
    16. I slutet, Använd en fast fluorescerande pärla glida att kartlägga givaren och acceptor partiklar till varandra i bilden dela enhet.
    17. Tillsätt 0,2 μL av fluorescerande pärlor med 1 μm diameter till 500 μL på 1 M tris (pH = 8,0) så att pärlorna kan fastna på ytan.
    18. Skär en kvadrat (18 mm x 18 mm) inuti en 22 mm x 22 mm bit av en dubbelsidig självhäftande tätning. Dra av och sticka pjäsen till mitten av en 76 mm x 25 mm kvarts bild.
    19. Placera 50 μL av den utspädda pärllösningen och låt verka i 5 – 10 minuter för att reglera. Fäst en 22 mm x 22 mm täckslip ovanpå torget pjäs. Torra överskott pärlor lösning med vävnad, sedan täta kammaren med epoxilim.
    20. Förvärva 100 bildrutor av pärlor glida vid en 60 MS exponeringstid.
      FÖRSIKTIGHET: Sänk lasereffekten och den EMCCD-förstärkning som minimum för att undvika mättnad av detektorn.
    21. Installera programvarupaketet (t. ex. TwoTones) och öppna filmerna där som anges i bruksanvisningen36. Välj positionerna för de enskilda pärlorna i givar-och acceptorkanalerna. Generera en omformningsmatris enligt beskrivningen i manualen.
      Anmärkning: denna programvara använder Transformation Matrix för att matcha positionerna av partiklarna i givaren och acceptor kanaler och korrekt för någon liten förskjutning i bilden uppdelning enhet.
    22. Gå till Arkiv, tryck på Ladda film och välj sedan filmfilen och tryck på Öppna. I Arkiv-menyn trycker du på load TFORM och väljer den omformningsmatris som genereras från pärlbilden. Justera tröskeln för givaren och acceptorkanalerna tills inga falska positiva identifieringar ingår.
    23. I menyn kanal filter väljer du D & & ett alternativ för att välja för partiklar märkta med både givare och acceptor. Kontrollera närmaste granne gräns fält för att utesluta molekyler som är mycket nära varandra. Kontrollera Max ellipticity att utesluta mycket excentriska molekyler och kontrollera bredden gränser för att utesluta mycket breda eller mycket smala molekyler.
    24. Skriv Plothistcw enligt instruktionerna i twotones handbok för att konstruera histogram.
      Anmärkning: den "uppenbara" bandet effektivitet beräknas av programmet genom att dividera utsläpp av acceptorn av de totala utsläppen från givaren och acceptorn. Twotones använder 100 intervall för att bin fördelningen av staterna i molekylerna mot bandet effektivitet.
    25. Skriv Plottimetracecw enligt instruktionerna i twotones manual för att generera tids spårningar för varje molekyl.
      Obs: Time-spår kan ytterligare analyseras av vbFRET37 att identifiera olika FRET stater, deras respektive Dwell gånger, och övergångs hastigheter mellan olika stater.
  2. Tvåfärgad omväxlande excitation FRET (ALEX) experiment
    1. Spela in en film bestående av på varandra följande ramar av givare och acceptor utsläpp av direkt Magnetiseringar med de gröna och röda lasrar, respektive ~ 80 ms i varaktighet.
    2. Öppna de förvärvade ALEX-filmerna i Twotones. Ställ in lämplig detektions tröskel som ~ 300 för de tre kanalerna: givar emission på grund av donatorexcitation (DexDem); acceptor emission orsakad av donator excitation (DexAem); och acceptor emission på grund av direkt excitation (AexAem).
    3. Applicera kanal filtret DexDem & & DexAem & & AexAem att välja för de partiklar som har både givare och acceptor. Länka partiklarna ~ 200 – 300 i de tre kanalerna.
    4. Använd plotHistALEX MATLAB-koden för att generera ALEX histograms. Passa olika toppar i histogrammen till Gaussisk funktioner och bestämma procentandelen av varje population området under kurvan med ursprung programvara38.
      Anmärkning: topparna i bindnings analysen motsvarar den bundna GEN1-HJ komplex, medan det i den fria HJ, toppar representerar de skiftande isomerer.
    5. Använd Plottimetracealex MATLAB-koden för att generera en tid-spår för varje molekyl som visar givaren utsläpp av direkt excitation, och acceptor utsläpp på grund av FRET och direkt excitation.
      Obs: ALEX Time-spår självständigt för att Visa utsläppen av både givaren och acceptorn, men vid lägre temporala upplösning än enfärgad FRET. Liknar enfärgad FRET, ALEX Time-spår kan ytterligare analyseras av vbFRET att identifiera olika FRET stater och deras respektive Dwell Times.
    6. Bestäm dissociationskonstanten genom att montera procentsatserna för den bundna populationen kontra GEN1 koncentrationen till en hyperbolisk funktion.
  3. Tidsförlopp enfärgad FRET
    1. Ställ in exponeringstiden för den gröna lasern till 60 MS och cykeltid till 624 MS eller lägre, beroende på hastigheten på den observerade dynamiken.
    2. Ställ in flödeshastigheten till 110 μL/min i en kanal i cellen med sex kanaler. Starta inspelningen kort innan ingången till GEN1 inuti cellen flöde.
      Obs: kontinuerligt flöde leder till snabb foto blekning av fluoroforer, därför synkroniserar starten av Imaging och protein inträde maximerar antalet fångade händelser. Den optimala sprutpumpens avläsning beror på dödvolymen och den exakta slangen som används för att montera flödes cellen; i vårt fall är det ~ 25 μL.
    3. Förvärva en film av ~ 125 ramar för en total förvärvs tid på 78 s. I slutet av inspelningen, exponera provet till den röda lasern för 50 ramar vardera med 25 MS exponeringstid att sonden acceptorn.
      ANMÄRKNINGAR: den här metoden förlänger observations fönstret i klyvning experiment genom att minska antalet excitation cykler. Kinetiska parametrar som kpå och kav Dimerization härleds genom att montera distributionen till en bi-exponentiell modell30,38.

7. elektroforetisk rörlighet Shift-analyser (EMSA)

  1. I 50 μL total volym, inkubera den önskade koncentrationen av GEN1 med 50 pM Cy5-märkt HJ vid RT i 30 min i EMSA-bindningsbuffert (tabell 1).
  2. Fyll på proverna på 8 cm x 8 cm 6% Tris-borate-EDTA gel. Kör gelen med 100 V för 1 h + 20 min i 1x TBE buffert vid RT.
  3. Bestäm procentandelen av bundet substrat vid en GEN1 koncentration från dess relativa bidrag till den totala fluorescensintensiteten hos respektive körfält.
    Obs: GEN1 monomer-hj (band I) identifieras genom avtalet av dess storlek med picomolar bindning av GEN1 monomer till Hack hj21,30. Gen1-dimer-hj är tilldelad till band II på grund av den stegvis bindningen av GEN1 monomer till hj21,23.
  4. Beräkna de skenbara bindnings konstanterna Kd-monomer-app-EMSA och Kd-dimer-app-EMSA med ekvationen:
    Equation
    Där: Max är den koncentration vid vilken respektive art nådde sin maximala bindning (monomer eller dimer). n är Kullkoefficienten; K d-app-EMSA är den skenbara bindnings konstanten för respektive art, som betecknar koncentrationen av GEN1 vid vilken hälften-maximum av monomer eller dimer är närvarande.

Representative Results

Conformer bias och isomerisering av HJ

Den Isomerization av HJ har undersökts utförligt genom FRET genom märkning av två angränsande armar av korsningen17,18,39. Givaren (Cy3) och acceptorn (Alexa fluor 647) är placerade vid de två angränsande armarna, R (strand 2) och X (del 3), respektive (figur 2A). Staplade-X isomerer tilldelades av sina två kontinuerliga strängar [dvs ISO (1,3) eller ISO (2, 4)]. Den ALEX FRET histogram angränsande-Label X0 visar två toppar som motsvarar att byta de mer riklig ISO (1,3) (e ~ 0,75) och mindre riklig ISO (2, 4) (e ~ 0,40) (figur 2b).

Enfärgad FRET används för att förvärva tid-spår för inspelning av snabba överensstämande förändringar i den fria HJ med hög temporala upplösning ~ 10 MS via minska den använda delen av EMCCD2 kamera. En representativ enfärgad FRET Time-spår av X0 Junction visar övergångarna mellan hög och låg bandet isomerer (figur 2b). Isomeriseringshastigheter kISO (1,3)-ISO (2, 4) och kISO (2, 4)-ISO (1,3) som erhålls från uppehållstiden histogrammen av ISO (1,3) och ISO (2, 4) (figur 2C) är förenliga med de som rapporteras tidigare17.

SMFRET visar aktiv snedvridning av HJ av GEN1

HJ genomgår strukturell omordning vid bindning till GEN122. Avståndet mellan givaren och acceptorn är således likartat i både ISO (1,3) och ISO (2, 4) (figur 3a). Den smFRET bindande analyser utfördes i närvaro av ca2 + för att förhindra KLYVNING av hj. FRET histogram av intilliggande-Label X0 korsningen vid olika GEN1 koncentrationer förvärvades av Alex (figur 3b). Histogrammet är lämpligt att två Gaussian funktioner: en som motsvarar den fria hög FRET ISO (1,3), och den andra motsvarande den bundna GEN1-HJ befolkningen efter subtrahera bidraget från ISO (2, 4) från Low FRET Peak.

Vid mättning GEN1 koncentration, bandet histogram av X0 har bara en enda låg FRET topp motsvarar GEN1 bunden till antingen isomer av HJ som förutspådde av modellen22. Den skenbara monomerdissociationskonstanten (Kd-monomer-app) bestäms från hyperbolisk passform av procentandelen gen1-bunden population som en funktion av gen1 koncentration (figur 3c). Den angränsande-Label NK-X0 representerar en enstaka Hack version hj som härmar produkten efter den första snitt reaktionen. På grund av lindring av stapling stam av den simulerade Nick, NK-X0 är en icke-isomerizing struktur40 som framgår av den enda substrat topp på E ~ 0,40, till skillnad från X0 (figur 3D vs figur 3b). Strukturen för GEN1-NK-X0 Complex liknar den i gen1-x0 Complex, vilket INDIKERAS av likheten i FRET effektivitetsvinster (E ~ 0,25 för NK-x0 och 0,32 för X0) (figur 3D vs. Figur 3B). Den starka bindningen av GEN1 monomer till NK-X0 framgår av 40-faldigt lägre Kd-monomer-app värde än X0 (figur 3e vs. figur 3c). Denna snäva bindande kan fungera som en skyddsmekanism mot ofullständig upplösning av HJ i den osannolika händelsen av dissociation av GEN1 dimer eller en av dess monomerer.

Stepwise bindning av GEN1 monomer till HJ

Bindningen av GEN1 monomer till hj följt av dimer formation är en unik funktion för eukaryota hj resolvase GEN1 jämfört med prokaryota resolvaser, som finns i dimeriskt form i lösning21,23,41. EMSA av GEN1 på 50 PM X0 visar stegvis Association of gen1 i högre ordning komplex, vilket indikeras av de romerska siffrorna i den övre panelen (figur 4a). Dissociationskonstant av GEN1 monomer bestäms av EMSA (Kd-MONOMER-EMSA) sammanfaller med dissociationskonstant från Smfret bindande assay Kd-monomer-app (figur 4a och figur 3c , respektive). Kvantifieringen av band II används för att beräkna jämvikts dissociationskonstant av GEN1 dimer (Kd-dimer-EMSA). EMSA av GEN1 på 50 pM NK-X0 visar den framstående monomerbindningen som indikeras av den mycket låga Kd-MONOMER-app-EMSA som är 30-faldig lägre än för X0, medan dess Kd-dimer-EMSA är jämförbar med X0 (figur 4b).

Ytterligare bevis för att GEN1 monomer binder och snedvrider HJ är observation av ett betydande antal spår av uncleaved partiklar med stabila Low FRET tillstånd (figur 4c) i närvaro av mg2 + vid låga GEN1 koncentrationer. Antalet av dessa spår minskade vid ökande GEN1 koncentration. Upplösningen av HJ drivs av den snäva bindningen av GEN1 monomer, som stöder dimer formation. Den monomer bindningen observeras i tid-spår av den uncleaved NK-X0 i mg2 +, som sträcker sig fram till få nanomolar koncentration (figur 4D). Den GEN1 monomer binder tätt för att skydda NK-X0, så småningom säkerställa full upplösning genom dimer formation.

SMFRET upplösning assay av HJ

Termen "klyvning" i smfret analyser används omväxlande med "resolution" av HJ, eftersom i denna analys endast produkt release som följer den andra klyvning händelsen upptäcks. Händelserna registreras av Time-lapse enfärgad excitation för att minimera photoblekning av fotokänsliga acceptor över förvärvs tiden ~ 1,3 min.

Den schematiska i figur 5a illustrerar snitt av delarna 1 och 3 av X0 ISO (1,3) efter bindningen och distorsionen av GEN1 av en X0 fäst vid det funktionaliserade glaset. Både givare och acceptor gå till lösning som resulterar i förlusten av sina signaler efter HJ upplösning. Den första och andra snitt är frikopplad i NK-X0, som exemplifierar en prototyp för den delvis lösta hj. Vid bindning av GEN1, NK-X0 antar en liknande struktur till X0. Resolutionen utgår från ett enda snitt i programområde 1, vilket illustreras i Figur 5b.

Samtidig avgång givaren och acceptorn efter en stabil låg FRET tillstånd i spår av lösta X0 inträffade utan uppkomsten av en mellanliggande FRET (E = ~ 0,40) indikerar att fullständig upplösning sker inom livslängden för GEN1-hj komplex (figur 5c). Därför, dessa resultat tyder på att HJ-upplösningen sker inom GEN1-HJ komplexa livstid. Upplösningen av NK-X0 fortsätter också efter strukturell omordning och avslutar vid avvikelsen av duplex bära två fluorophores (figurera 5D) liknande till X0.

Kinetics av GEN1 Dimerization på GEN1 monomer bunden HJ

Time-lapse smFRET åtgärder τföre klyvning som främst omfattar den tid som krävs för dimer bildning och upplösning av HJ efter distorsionen av GEN1 monomer. Tillämpa denna teknik, direkta bevis ges för att stödja påståendet att dimer bildas krävs för upplösningen av både X0 och NK-X0, eftersom distributionen av τföre klyvning är GEN1 koncentrationsberoende.

Den skenbara frekvensen av HJ-upplösningen (kapp) definieras som inversen till medelvärdet av τföre klyvning vid respektive GEN1 koncentration. Termen "uppenbara" används för att beskriva graden av HJ upplösning, eftersom möjligheten att GEN1 förblir bunden till produkten efter HJ-upplösningen inte kan uteslutas.

Sannolikheten densitet funktioner (PDF) av τföre klyvning fördelningar av X0 (figur 6a) återspeglar tiden för dimer formation, som är längre vid låga gen1 koncentrationer, sedan kortare vid högre gen1 koncentrationer. Föreningen och dissociation priser för dimer, kon-dimer och koff-dimer, respektive, bestäms av en bi-exponentiell modell30. Dessutom visar PDF-filer av NK-X0 (figur 6b) en liknande fördelning till X0 som anger kravet på dimer formation.

Handlingen i kapp kontra GEN1 koncentration var monterad på en hyperbolisk funktion. De skenbara katalyshastighetskonstanterna (kMax-appen) på X0 och NK-X0 är 0,107 ± 0,011 s-1 och 0,231 ± 0,036 s-1, respektive (figur 6c). De tomter av kapp för X0 och NK-X0 korsningar skär på GEN1 koncentration ~ 5,6 Nm på grund av den snabbare kMax-app och långsammare kpå-dimer av Hack jämfört med den intakta korsningen.

Sammanfattningsvis, den relativt snabba kpå-dimer och långsam koff-dimer leda till utvecklingen av den främre reaktionen mot hj upplösning när dimer bildas. Den starka bindningen av GEN1 monomer till NK-X0 korsningen utgör en felsäker mekanism mot någon osannolik avbruten andra klyvning eller hjälper till att plocka upp någon ofullständigt olösta HJS kvar av primära upplösning vägar i cellen.

Figure 1
Bild 1: flödesceller för en och flera kanaler och layouten för den optiska uppsättningen.
(A) Schematisk av cellen för enkanals flöde. (B) schematiskt av den sex-kanals flöde cellen. (C) utformningen av den optiska set-up föreställande magnetiseringskällorna, tirf mål, Dichroic spegel installerad inne i filterkuben, och utsläpp filter som används i bilden splitter enhet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Conformer bias och isomerisering av HJ observerats av FRET.
(A) isomerisering av intilliggande-Label X-staplade hj-FORMERARE uppkallad efter de två kontinuerliga strängarna. Strängarna är numrerade, medan armarna betecknas med bokstäver. Snitt platserna visas med pilar. Placerar av donatorn (gräsplan) och acceptor (rött) och ändringen i FRET på Isomerization indikeras. (B) höger panel: fret Time-trace (svart) och IDEALISERAD FRET trace (röd) av X0 vid 50 mm mg2 +. Vänster panel: FRET histogram av X0 vid 50 mm mg2 +. Fluorescensintensiteten hos givaren (grön) och acceptor (röd) visas nedan. (C) uppehållstiden histogram av angränsande-Label X0 ISO (1,3) och ISO (2, 4) var monterade på Single-exponentialfunktioner för att bestämma Isomerization priser. Osäkerheterna indikerar 95% konfidensintervall för passformen. Denna siffra har modifierats från tidigare publicerad litteratur30.

Figure 3
Figur 3: aktiv snedvridning av HJ av GEN1.
(A) strukturell modifiering av angränsande etikett hj baserat på den föreslagna modellen22. (B) Alex FRET histogram angränsande-Label X0 har en stor hög FRET Peak (E = ~ 0,6) motsvarande ISO (1,3) och lägre FRET Peak (E = ~ 0,4) för ISO (2, 4). Hela histogrammet är lämpligt att två Gaussian funktioner: en som motsvarar den fria hög FRET ISO (1,3), och den andra som motsvarar den bundna befolkningen minus den ursprungliga bidraget av ISO (2, 4) till den totala befolkningen. (C) den skenbara monomerdissociationskonstanten (Kd-monomer-appen) bestäms utifrån en hyperbolisk passform av procentandelen gen1-bundna populationer som en funktion av gen1 koncentration. (D) FRET histogram av angränsande-Label NK-X0 vid olika GEN1 koncentrationer. Området under lowen bandet (E = ~ 0,25) Gaussian motsvarar till procentsatsen av den destinerade befolkningen. (E) Kd-monomer-app av NK-X0 bestäms från hyperbolisk passform av GEN1-bunden population. Felstaplar representerar standardavvikelser från två eller flera experiment. Denna siffra har modifierats från tidigare publicerad litteratur30. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: stegvis bindning av GEN1 till HJ.
(A) elektroforetisk rörlighet Shift assay (EMSA) av GEN1 på 50 PM X0. Övre panelen: de romerska siffrorna anger antalet GEN1 monomerer i komplexet. Nedre panelen: bindning av GEN1 monomer till X0. De skenbara dissociationskonstanterna erhölls från en sigmodala passning av respektive art och representerar genomsnittet av två experiment. (B) EMSA av GEN1 på 50 PM NK-X0 visar den framstående monomerbindningen som indikeras av den mycket låga Kd-monomer-app-EMSA. (C) FRET tid-spår av bunden men uncleaved angränsande-Label X0 i mg2 +. Donator excitation för ~ 1,3 min utfördes, följt av direkt acceptor excitation (skuggad rosa region). (D) FRET tid-spår av bunden men uncleaved angränsande-Label NK-X0 i mg2 +. Denna siffra har modifierats från tidigare publicerad litteratur30. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: SMFRET upplösning assay av HJ.
(A) Schematisk av intilliggande-Label X0 ISO (1,3) efter distorsion av GEN1. Underlaget är fäst vid den funktionaliserade ytan via biotin/Avidin-länkage. Dissociation av GEN1 efter de två snitt resulterar i förlusten av både givare och acceptor som går till lösning. (B) Schematisk lösning av angränsande-Label NK-X0 genom att klyva strand 1. C) tidsspårning (svart) vid 2 mm mg2 + av klyvning av ISO (1,3). Uppkomsten av GEN1 bindning bildar en stabil låg FRET tillstånd tills bandet signalen är plötsligt förlorad på grund av klyvning. Motsvarande, ökningen av givaren och minskningen av acceptor fluorescens intensiteter på GEN1 bindning följs av det samtidiga försvinnandet av fluorescens från båda färgerna vid klyvning. (D) på samma sätt, den tid-spår av NK-X0 visar en stabil låg FRET tillstånd på GEN1 bindning som ingås av abrupt förlust av bandet signalen. Denna siffra har modifierats från tidigare publicerad litteratur30. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: kinetik av GEN1 Dimerization på GEN1 monomer bunden HJ.
(A) funktionen för sannolikhets täthet (PDF) för den τföre klyvning fördelningen av X0 illustrerar dess beroende av GEN1 koncentration. Dwell Times av Low FRET State (τföre klyvning) vid respektive GEN1 koncentrationen erhölls från två eller flera experiment och används för att få genomsnittliga priser (kapp). De listade kapp priser bestäms från inversen av medelvärdet τföre klyvning vid respektive GEN1 koncentration. Föreningen (kon-dimer) och dissociation (koff-dimer) priser för dimer formation beräknas från en bi-exponentiell modell38. Felen representerar SEM av kapp. (B) PDF-handlingen i τföre klyvning fördelningarna av NK-X0 och respektive kapp priser. (C) Plot av kapp kontra GEN1 koncentration monterad på en hyperbolisk funktion för att bestämma den skenbara katalytiska Rate (kMax-app). Handlingen i kapp för x0 och NK-X0 illustrerar snabbare första kapp av x0 som sedan överträffas av NK-X0 ovan [GEN1] ~ 5,6 Nm. Denna siffra har modifierats från tidigare publicerad litteratur30. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Buffert Compostion
Bindningsbuffert 40 mM Tris-HCl pH 7,5, 40 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 1 mm dtt, 0,1% BSA och 5% (v/v) glycerol
Buffert A 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM DTT och 300 mM NaCl
Buffert B 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM DTT och 100 mM NaCl
Buffert C 20 mM Tris-HCl pH 8,0 och 1 mM DTT
Klyvning buffert 40 mM Tris-HCl pH 7,5, 40 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 1 mm dtt, 0,1% BSA och 5% (v/v) glycerol
Bindningsbuffert för EMSA 40 mM Tris-HCl pH 7,5, 40 mM NaCl, 1 mM DTT, 2 mM CaCl2, 0,1 mg/ml BSA, 5% (v/v) glycerol och 5 ng/μl Poly-di-dC
Bildbuffert (bindning) 40 μL (±) -6-hydroxy-2,5, 7, 8-tetramethylchromane-2-karboxylsyra (4 μM), 60 μL PCA (6 nM), 60 μL PCD (60 nM) och 840 μL bindningsbuffert
Bildbuffert (klyvning) 40 μL (±) -6-hydroxy-2, 5, 7, 8-tetramethylchromane-2-karboxylsyra (4 μM), 60 μL PCA (6 nM), 60 μL PCD (60 nM) och 840 μL Klyvningsbuffert
Lysis buffert 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM β-merkaptoetanol, 300 mM NaCl och 2 mM PMSF
PCD lagringbuffert 100 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA, 50 mM KCl och 50% glycerol
lagringbuffert 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 100 mM NaCl och 10% glycerol
TBE-buffert 89 mM Tris-HCl, 89 mM borsyra och 2 mM EDTA
TE100 buffert 10 mM Tris. HCl pH 8,0 och 100 mM NaCl
Tris-EDTA buffert 50 mM Tris-HCl pH 8,0 och 1 mM EDTA pH 8,0

Tabell 1: listan över buffertar och deras sammansättningar som används i denna studie.

Oligo Sekvens
X0-ST1 ACGCTGCCGAATTCTACCAGTGCCTTGCTAGGACATCTTTGCCCACCTGCAGGTTCACCC
X0-ST2 GGGTGAACCTGCAGGTGGG/iCy3/AAAGATGTCCATCTGTTGTAATCGTCAAGCTTTATGCCGT
X0-ST3 ACGGCATAAAGCTTGACGA/iAF647-dT/TACAACAGATCATGGAGCTGTCTAGAGGATCCGACTATCG
X0-ST4 5 ' BiotinCGATAGTCGGATCCTCTAGACAGCTCCATGTAGCAAGGCACTGGTAGAATTCGGCAGCGT
X0-adj X0-ST1, x0-ST2, x0-ST3 & X0-ST4
X0In_st2 GGGTGAACCTGCAGGTGGGCAAAGATGTCCATCTGTTGTAATCGTCAAGCTTTATGCCGT
X0In_st4 5 ' BiotinCGATAGTCGGATCCTCTAGACAGCTCCATGTAGCAAGGCA/iCy3/TGGTAGAATTCGGCAGCGT
NK-X0 X0-ST1, x0-ST2, x0-nk3a, x0-nk3b & x0-ST4
X0-nk3a ACGGCATAAAGCTTGACGA/iAF647-dT/TACAACAGATC
X0-nk3b ATGGAGCTGTCTAGAGGATCCGACTATCG

Tabell 2: SMFRET och EMSA hj substrat. Förteckningen över oligonukleotider som används för beredning av den fluorescerande märkta HJs för smFRET och EMSA. Oligos erhölls kommersiellt. Den fluorescerande märkta oligos var HPLC-renad och, om möjligt, oligos av ≥ 60 BP var sida-renas.

Discussion

I denna studie, olika smFRET tekniker genomfördes för att bestämma kinetik av HJ upplösning av GEN130. Liknande smfret metoder användes för att följa dubbel-flik DNA-överensstämmningskrav och klyvning av DNA-replikation och reparation flik Endonuklease 142,43,44. Här diskuteras kritiska steg i detta protokoll. Silaniseringsreaktionen bör vara fri från alla spår av fukt. Pegylationslösningen bör snabbt appliceras på det silaniserade glaset när PEG är upplöst för att undvika hydrolys. I cellen flerkanaligt flöde bör eventuell instängd luft i limmet avlägsnas för att undvika läckage mellan angränsande kanaler. PCA-lösningen bör vara nyberedd eftersom den oxiderar med tiden. Tillsatsen av 10 N NaOH bör vara dropwise, med vortexa däremellan. Fluorescensbakgrunden i täckglåtet bör vara minimal innan du strömmar den Fluorescent som heter HJ. Bildtagning i cellen flöde bör utföras i en riktning för att undvika Imaging blekt områden. I ALEX experiment, kraften i den röda lasern bör reduceras för att undvika snabb blekning av acceptorn. I tids fördröjnings experimenten måste cykelns tid vara kortare än den snabbaste händelsen.

smFRET är en känslig teknik som kan ge värdefulla insikter i realtid i biomolekylära reaktioner. Emellertid, denna metod har flera tekniska utmaningar, bland vilka är att uppnå mätbara förändring i FRET under den biokemiska reaktionen. Detta är nödvändigt för att få väl separerade funktioner i histogrammen och distinguishable stater i tid-spår. I många fall kräver smFRET noggrann utformning av substrat, val av fluorophore par och deras positioner, och förstärkning av FRET förändringar i DNA-substrat på grund av de små strukturella förändringarna i substratet45. En annan metod för att utföra FRET är att använda märkta proteiner46. Observations fönstret i FRET begränsas av stabiliteten i acceptorn som Cy5 eller Alexa fluor 647 som tenderar att bleka snabbare än givaren (Cy3 i detta fall). Därför kräver FRET en kontinuerlig sökning efter stabila fluoroforer att förlänga experimentets varaktighet och ansträngningar för att utveckla syre rensning system för att förlänga fluorescenssignalen och maximera signal-brus-förhållande47,48 .

Bland de tips för felsökning i smFRET balanserar flera parametrar inblandade i Imaging såsom lasereffekt, exponeringstid, cykeltid, och antal cykler för att maximera fluorescensutsläpp, förlänga experimentets varaktighet, och uppnå lämpliga provtagningsintervall för enzymdynamiken. Längre observations tider och minimala effekter från foto blekning är nödvändiga för att erhålla hög fidelity Dwell Time-distributioner som representerar enzymdynamiken. ALEX genererar bättre histogram eftersom denna metod utsätts för lägre bidrag från photoblekt partiklar jämfört med enfärgad FRET. Men den temporala upplösningen i ALEX är lägre än i enfärgad FRET.

Slutligen, smFRET betoning på att upptäcka kon Formations struktur/strukturella förändringar i enskilda molekyler i realtid överbryggar klyftan mellan hög upplösning strukturella tekniker (dvs., röntgen kristallografi, kärnmagnetisk resonans, elektronmikroskopi), som ger atomär upplösning strukturella Detaljer under statiska förhållanden och bulkmetoder som ger ensemblen genomsnittet av en mätbar egenskap. I många avseenden har smFRET visat sig vara en kraftfull teknik för att studera biologiska system i realtid.

Disclosures

Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av kung Abdullah University of Science and Technology genom Core finansiering och konkurrenskraftig forskning Award (CRG3) till S. M. H.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox) Sigma-Aldrich 238813
0.1 M sodium bicarbonate buffer Fisher 144-55-8
10 % Novex Tris-Borate-EDTA gel Thermo Fisher Scientific EC6275BOX
100 X TIRF objective Olympus NAPO 1.49
3,4-dihroxybenzoic acid (PCA) Sigma-Aldrich P5630
3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) Sigma-Aldrich 741442
6% Novex Tris-Borate-EDTA gel Thermo Fisher Scientific EC6265BOX
Adhesive sheet Grace bio-labs SA-S-1L
Benchtop refrigerated centrifuge Eppendorf Z605212
Biotin-PEG Laysan Bio Biotin-PEG-SVA 5000
Bovine Serum Albumin (BSA) New England Biolabs B9001S
Calcium Chloride Dihydrate Sigma-Aldrich 31307
cation exchange column GE healthcare MonoS (4.6/100)
Cell distruptor Constant Cell Disruption System TS5/40/CE/GA
Coomassie Brilliant Blue MP Biomedicals 808274
Cy3 emission filter Chroma HQ600/40M-25
Cy5/Alexa Fluor 647 emission filter Chroma HQ700/40M-25
Dichroic for DV2 filter cube Photometrics 630dcxr-18x26
Dithiothreitol (DTT) Thermo Scientific R0861
Drill Dremel 200-1/21
Electronic cutter Copam CP-2500
EMCCD camera Hamamatsu C9100-13
Epoxy glue Devcon 14250
FPLC Aktapurifier UPC 10 GE Healthcare 28406268
GelQuant.NET software biochemlabsolutions.com Version 1.8.2
GEN1 entry vector Harvard plasmid repository HSCD00399935
Glycerol Sigma Life Science G5516
green laser (emission 532 nm) Coherent Compass 315M-100
Heparin column GE healthcare HiTrap Heparin column
HEPES BDH BDH4162
Image splitter Photometrics Dualview (DV2)
Imidazole Sigma-Aldrich I2399
Inverted microscope Olympus IX81
Isopropyl-ß-D-thiogalactoside (IPTG) Goldbio. 12481C100
Laser scanner GE healthcare Typhoon Trio
LB Broth Fisher Scientific BP1426-500
Long pass 532nm filter Semrock LPD02-532RU-25
Magnesium Chloride Sigma Life Science M8266
mPEG Laysan Bio mPEG-SVA 5000
Neutravidin Pierce 31000
Ni-NTA column GE healthcare HisTrap FF
NuPAGE 10% Bis-Tris gels Novex Life technologies NP0301BOX
NuPAGE 10% Bis-Tris Protein Gels Thermo Fisher Scientific NP0302PK2
Origin software OriginLab Corporation Version 8.5
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Alexis Biochemicals 270-184-G025
Phosphate-buffered saline GIBCO 14190
Polyethylene Tubing (I.D. 0.76 mm O.D. 1.22mm) Fisher (Becton Dickinson) 427416
Protocatechuate 3,4-dioxygenase (3,4-PCD) Sigma-Aldrich P8279-25UN
Quad-band dichroic Chroma Inc Z405/488/532/640rpc
red laser (emission 640 nm) Coherent Cube 640 100C
Sodium Chloride Fisher Chemical S271
Sorvall RC-6 plus centrifuge Thermo Fisher Scientific 46910
Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific Nanodrop 2000
Syringe pump Harvard Apparatus 70-3007
Teflon tweezers Rubis K35A
Tris Base Promega H5135
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima L-90K
Ultrafiltration membrane Millipore UFC90300

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Moerner, W. E., Fromm, D. P. Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy. Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).
  2. Ha, T. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer. Methods. 25 (1), 78-86 (2001).
  3. Weiss, S. Fluorescence spectroscopy of single biomolecules. Science. 283 (5408), 1676-1683 (1999).
  4. Stryer, L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Annual Review of Biochemistry. 47, 819-846 (1978).
  5. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
  6. Walter, N. G., Huang, C. Y., Manzo, A. J., Sobhy, M. A. Do-it-yourself guide: how to use the modern single-molecule toolkit. Nature Methods. 5 (6), 475-489 (2008).
  7. Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nature Methods. 2 (12), 920-931 (2005).
  8. Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology. Methods in Enzymology. 361, 1-33 (2003).
  9. Kim, H. D., et al. Mg2+-dependent conformational change of RNA studied by fluorescence correlation and FRET on immobilized single molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (7), 4284-4289 (2002).
  10. Lee, T. H., et al. Measuring the folding transition time of single RNA molecules. Biophysical Journal. 92 (9), 3275-3283 (2007).
  11. Holliday, R. Mechanism for Gene Conversion in Fungi. Genetical Research. 5 (2), 282-304 (1964).
  12. West, S. C., et al. The Formation and Resolution of Holliday Junctions during the Recombinational Repair of DNA Damages. Journal of Cellular Biochemistry. , 269-269 (1995).
  13. Cox, M. M., et al. The importance of repairing stalled replication forks. Nature. 404 (6773), 37-41 (2000).
  14. West, S. C. Molecular views of recombination proteins and their control. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 4 (6), 435-445 (2003).
  15. Duckett, D. R., et al. The structure of the Holliday junction, and its resolution. Cell. 55 (1), 79-89 (1988).
  16. Clegg, R. M., et al. Fluorescence resonance energy transfer analysis of the structure of the four-way DNA junction. Biochemistry. 31 (20), 4846-4856 (1992).
  17. McKinney, S. A., Declais, A. C., Lilley, D. M., Ha, T. Structural dynamics of individual Holliday junctions. Nature Structural Biology. 10 (2), 93-97 (2003).
  18. Joo, C., McKinney, S. A., Lilley, D. M., Ha, T. Exploring rare conformational species and ionic effects in DNA Holliday junctions using single-molecule spectroscopy. Journal of Molecular Biology. 341 (3), 739-751 (2004).
  19. Hyeon, C., Lee, J., Yoon, J., Hohng, S., Thirumalai, D. Hidden complexity in the isomerization dynamics of Holliday junctions. Nature Chemistry. 4 (11), 907-914 (2012).
  20. Ip, S. C., et al. Identification of Holliday junction resolvases from humans and yeast. Nature. 456 (7220), 357-361 (2008).
  21. Rass, U., et al. Mechanism of Holliday junction resolution by the human GEN1 protein. Genes & Development. 24 (14), 1559-1569 (2010).
  22. Liu, Y., et al. Crystal Structure of a Eukaryotic GEN1 Resolving Enzyme Bound to DNA. Cell Reports. 13 (11), 2565-2575 (2015).
  23. Chan, Y. W., West, S. GEN1 promotes Holliday junction resolution by a coordinated nick and counter-nick mechanism. Nucleic Acids Research. 43 (22), 10882-10892 (2015).
  24. van Gool, A. J., Hajibagheri, N. M., Stasiak, A., West, S. C. Assembly of the Escherichia coli RuvABC resolvasome directs the orientation of holliday junction resolution. Genes & Development. 13 (14), 1861-1870 (1999).
  25. Lee, S. H., et al. Human Holliday junction resolvase GEN1 uses a chromodomain for efficient DNA recognition and cleavage. eLife. 4, (2015).
  26. Chan, Y. W., West, S. C. Spatial control of the GEN1 Holliday junction resolvase ensures genome stability. Nature Communications. 5, 4844 (2014).
  27. Liu, Y., Freeman, A. D., Declais, A. C., Lilley, D. M. J. A monovalent ion in the DNA binding interface of the eukaryotic junction-resolving enzyme GEN1. Nucleic Acids Research. 46 (20), 11089-11098 (2018).
  28. Zhou, R., et al. Junction resolving enzymes use multivalency to keep the Holliday junction dynamic. Nature Chemical Biology. 15 (3), 269-275 (2019).
  29. Bellendir, S. P., et al. Substrate preference of Gen endonucleases highlights the importance of branched structures as DNA damage repair intermediates. Nucleic Acids Research. 45 (9), 5333-5348 (2017).
  30. Sobhy, M. A., et al. Resolution of the Holliday junction recombination intermediate by human GEN1 at the single-molecule level. Nucleic Acids Research. 47 (4), 1935-1949 (2019).
  31. Sobhy, M. A., et al. Versatile single-molecule multi-color excitation and detection fluorescence set-up for studying biomolecular dynamics. Review of Scientific Instruments. 82 (11), 113702 (2011).
  32. Kapanidis, A. N., et al. Fluorescence-aided molecule sorting: analysis of structure and interactions by alternating-laser excitation of single molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (24), 8936-8941 (2004).
  33. Lee, N. K., et al. Accurate FRET measurements within single diffusing biomolecules using alternating-laser excitation. Biophysical Journal. 88 (4), 2939-2953 (2005).
  34. Rashid, F., et al. Initial state of DNA-Dye complex sets the stage for protein induced fluorescence modulation. Nature Communications. 10 (1), 2104 (2019).
  35. Sambrook, J., Russell, D. W. Standard ethanol precipitation of DNA in microcentrifuge tubes. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
  36. Holden, S. J., et al. Defining the limits of single-molecule FRET resolution in TIRF microscopy. Biophysical Journal. 99 (9), 3102-3111 (2010).
  37. Bronson, J. E., Fei, J., Hofman, J. M., Gonzalez, R. L. Jr, Wiggins, C. H. Learning rates and states from biophysical time series: a Bayesian approach to model selection and single-molecule FRET data. Biophysical Journal. 97 (12), 3196-3205 (2009).
  38. Kou, S. C., Cherayil, B. J., Min, W., English, B. P., Xie, X. S. Single-molecule Michaelis-Menten equations. Journal of Physical Chemistry B. 109 (41), 19068-19081 (2005).
  39. Clegg, R. M., Murchie, A. I., Lilley, D. M. The solution structure of the four-way DNA junction at low-salt conditions: a fluorescence resonance energy transfer analysis. Biophysical Journal. 66 (1), 99-109 (1994).
  40. Pohler, J. R., Duckett, D. R., Lilley, D. M. Structure of four-way DNA junctions containing a nick in one strand. Journal of Molecular Biology. 238 (1), 62-74 (1994).
  41. Fogg, J. M., Lilley, D. M. Ensuring productive resolution by the junction-resolving enzyme RuvC: large enhancement of the second-strand cleavage rate. Biochemistry. 39 (51), 16125-16134 (2000).
  42. Sobhy, M. A., Joudeh, L. I., Huang, X., Takahashi, M., Hamdan, S. M. Sequential and multistep substrate interrogation provides the scaffold for specificity in human flap endonuclease 1. Cell Reports. 3 (6), 1785-1794 (2013).
  43. Rashid, F., et al. Single-molecule FRET unveils induced-fit mechanism for substrate selectivity in flap endonuclease 1. eLife. 6, e21884 (2017).
  44. Zaher, M. S., et al. Missed cleavage opportunities by FEN1 lead to Okazaki fragment maturation via the long-flap pathway. Nucleic Acids Research. 46 (6), 2956-2974 (2018).
  45. Didenko, V. V. DNA probes using fluorescence resonance energy transfer (FRET): designs and applications. BioTechniques. 31 (5), 1106-1116 (2001).
  46. Toseland, C. P. Fluorescent labeling and modification of proteins. Journal of Chemical Biology. 6 (3), 85-95 (2013).
  47. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  48. Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without pH drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).

Tags

Genetik fråga 151 Holliday Junction singel-molekyl FRET homolog rekombination 5 ' nucleases Gap Endonuklease I GEN1 Holliday Junction resolvaser
Single-molekyl Förster resonans energiöverförings metoder för real tids utredning av Holliday Junction resolution av GEN1
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sobhy, M. A., Bralić, A.,… More

Sobhy, M. A., Bralić, A., Raducanu, V. S., Tehseen, M., Ouyang, Y., Takahashi, M., Rashid, F., Zaher, M. S., Hamdan, S. M. Single-Molecule Förster Resonance Energy Transfer Methods for Real-Time Investigation of the Holliday Junction Resolution by GEN1. J. Vis. Exp. (151), e60045, doi:10.3791/60045 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter