Summary
Præsenteret her er en protokol til udførelse af Single-molekyle Förster Resonance energioverførsel til at studere HJ opløsning. To-farve alternerende excitation bruges til bestemmelse af dissociations konstanter. Enfarvet tidsforskydning smFRET påføres derefter i realtid spaltning assays for at opnå den pause tidsfordeling før HJ opløsning.
Abstract
Bulk metoder måle ensemblet opførsel af molekyler, hvor individuelle reaktions rater af de underliggende trin er gennemsnit i hele befolkningen. Single-molekyle Förster Resonance energioverførsel (smFRET) giver en registrering af de konformationsmæssige ændringer, der finder sted af individuelle molekyler i realtid. Derfor er smFRET stærk til at måle strukturelle ændringer i enzymet eller substratet under binding og katalyse. Dette arbejde præsenterer en protokol for single-molekyle billeddannelse af samspillet mellem en fire-vejs Holliday Junction (HJ) og Gap endonuklease I (GEN1), en cytosolisk homologe rekombination enzym. Også præsenteret er enkelt-farve og to-farve alternerende excitation (ALEX) smFRET eksperimentelle protokoller til at følge opløsningen af HJ af GEN1 i realtid. Kinetikken af GEN1-denne bestemmes på HJ, som er blevet foreslået at spille en central rolle i opløsningen af HJ og er forblevet undvigende indtil nu. De teknikker, der beskrives her, kan anvendes bredt for at opnå værdifuld mekanistisk indsigt i mange enzym-DNA-systemer.
Introduction
Enkelt molekyle metoder baseret på fluorescens detektering giver høje signal-støj-nøgletal1. FRET er en spektroskopisk teknik, der kan måle afstande i intervallet 1 – 10 nm, hvilket gør denne teknik som en molekylær lineal til måling af afstande i nanometer området2,3. Acceptors absorptionsspektrum har en delvis spektral overlapning med donorens emissions spektrum ved den kortere bølgelængde. FRET er medieret af stråling-mindre energioverførsel mellem en donor og acceptor par, mens effektiviteten af energioverførsel er afhængig af afstanden og retningen af acceptoren4.
Flere tilgange er blevet implementeret for at minimere baggrunden og forbedre detekterings effektiviteten af fluorescens signalet5,6. En fremgangsmåde er Konfokal mikroskopi, hvor et hul begrænser excitation stedet til en størrelse under diffraktionen grænse7. En anden fremgangsmåde er total intern refleksion fluorescens (TIRF), som er en bred-felt belysning teknik, hvor lyset er rettet off-akse over en kritisk vinkel8. Lyset er derefter helt internt afspejlet i grænsefladen mellem glas og vandig opløsning, genererer en passive bølge, der kun oplyser de fluorophorer fastgjort til glasoverfladen og forhindrer baggrunden fra fluorophorerne i resten af løsningen.
I Konfokal mikroskopi kan molekylerne enten være frit sprede eller overflade immobiliseret. Den opnåede tidsmæssige opløsning kan være inden for mikrosekunder til flere millisekunder9. Konfokal detektering for et enkelt molekyle udføres af Single-photon Avalanche Diode (SPAD) og punkt-for-punktscanning af regionen af interesse10. I TIRF, en tidsserie af et par hundredvis af molekyler immobiliseret på overfladen er registreret af en positions-følsom to-dimensionel ladning koblet detektor (CCD). CCD forstærker fluorescens signalet enten ved intensiveret fosfor-skærm og mikrokanal plade eller på-chip-multiplikation af fotoelektroner (emccd). Den tidsmæssige opløsning er afhængig af udlæsningshastigheden og kvante effektiviteten af CCD og normalt på rækkefølgen af få snesevis af millisekunder6.
HJ er et centralt mellemprodukt i DNA-reparation og rekombination11,12,13,14. HJ har to kontinuerlige og to krydsning tråde, der forbinder mellem de kontinuerlige tråde uden at krydse hinanden. HJ findes i opløsning som X-stacked konformatorer, som undergår kontinuerlig isomerisering af de kontinuerlige tråde bliver krydser og passage tråde bliver kontinuerlig i den anden konformer15. Isomer præference af HJ er afhængig af kernen sekvens og ionisk miljø og er blevet grundigt undersøgt af Fret16,17,18,19.
GEN120 er et monomerisk protein i løsning21 og kræver denne for at kløve HJ, hvilket giver mulighed for korrekt adskillelse af de rekombinerede tråde22,23. Den stabling konformer præference af HJ påvirker resultatet af genetisk rekombination ved at indstille retningen af opløsningen af HJ resolvases24. Forstå hvordan GEN1 binder HJ, koordinerer de to snit, og sikrer sin fulde opløsning har alle været under intensiv undersøgelse21,22,23,25,26 ,27,28,29,30.
I denne undersøgelse anvendes en objektiv baseret TIRF-opsætning som beskrevet tidligere31. To-farve alternerende excitation (Alex) anvendes til at bestemme de konformationsmæssige ændringer på interaktionen af GEN1 med fluoroforet mærket HJ. Alex producerer 2D histogrammer baseret på to ratiometriske parametre fret effektivitet E, som er donor-acceptor distance-afhængige, og støkiometri parameter S, som måler donor-acceptor støkiometri32. ALEX tillader sortering af fluorescerende arter baseret på de støkiometries af fluorophorerne, herunder donor-only, acceptor-only, og blandede delpopulationer. Alex kan udvide brugen af Fret til hele spektret og kan detektere forskelle i fluoroforet lysstyrke og oligomerisering samt overvåge makromolekyle-ligand interaktioner33.
Det er konstateret, at GEN1 konsekvent lykkes at løse HJ inden for levetiden af GEN1-HJ-komplekset. De tidsafhængige konformationsmæssige ændringer er afledt af tids-spor af individuelle molekyler, mens histogrammer repræsenterer fordelingen af de underliggende populationer. Ved hjælp af time-lapse enkelt-farve fret, hurtig on-rate og langsom off-satser for GEN1 dimer er demonstreret, som øger affiniteten af den samlede GEN1 dimer på det første indsnit produkt.
Protocol
1. forberedelse af overflade funktionaliserede dæksedler
-
Rengøring
- Anbring fem dæksedler (24 mm x 60 mm) i ethanol inde i en Coplin-krukke. Sonicate i ethanol derefter i 1 M kaliumhydroxid i 30 min for 3x. Vask i acetone 3x derefter decant.
-
Silanisering
- Forbered en opløsning på 2,8% 3-Aminopropyltriethoxysilane (APTER) i acetone. Forsegl APTES-flasken med en paraffin film, og opbevar den ved 4 °C.
Bemærk: Brug beskyttelsesbriller og arbejde under en røg hætte. Beholderen til silan-opløsningen skal være helt tør og skylles af acetone umiddelbart før og efter, at silan-opløsningen hældes i glasset. - Hæld 70 mL af 2,8% APTES-opløsningen i Coplin-glasset, der indeholder dæksedlerne. Ryst glasset i 4 minutter i en orbital shaker.
- Lad glasset stå på bænken i 5 min, sonikatet i 1 min, og endelig holde krukken på bænken for yderligere 10 minutter for silan at reagere med hydroxyl grupperne på glasoverfladen.
- Sluk reaktionen ved tilsætning af 1 L deioniseret vand ved at hælde vand direkte ind i krukken for hurtig opløsningsmiddel udveksling. Skyl slidene 3x i vand ved sidelæns omrystning af krukken på en flad overflade.
- Tag coverglider ud af krukken og Placer dem på en aluminiumsfolie bakke. Bag dæksedlerne i en ovn ved 110 °C i 30 minutter for at tørre dæksedlerne og helbrede SILANE. Lad bakken stå på bænken, så dæksedlerne afkøles til stuetemperatur.
- Forbered en opløsning på 2,8% 3-Aminopropyltriethoxysilane (APTER) i acetone. Forsegl APTES-flasken med en paraffin film, og opbevar den ved 4 °C.
-
PEGylation
- Opvarmer biotinyleret PIND og PIND, opbevares ved-20 °C til stuetemperatur (RT) for at forhindre kondensation af fugt ved åbning af beholderen.
- Placer fem dæksedler med den silaniseret glasuld overflade opad på en æske. Placer to dækglas (22 mm x 22 mm) som afstandsstykker langs kanterne af de silaniserede dæksedler.
- En gang varmet op, gøre biotinylated PEG og PIND opløsninger i et forhold på ~ 1:100 i 1 mL frisk, 0,1 M natriumbicarbonat opløsning ved at tilføje 1,5 mg biotinyleret PIND og 150 mg af PIND i en 1,5 mL rør.
- Vortex røret for at opløse PEG og spin ned for at fjerne luftbobler.
Bemærk: gå fremad fra dette trin, være hurtig, fordi PEG hydrolyserer i opløsning inden for en tidshorisont på min. - Anvend hurtigt 100 μL af PIND opløsningen på hver dækseddel. Tag en anden bagt dækseddel og Placer dens øvre silaniseret glasuld overflade med forsiden nedad på toppen af dæksedlen med pind opløsningen, hvorved der dannes en glas opløsning-glas sandwich, hvor de 22 mm x 22 mm ikke-silaniserede dæksedler giver de to funktionaliserede dæksedler mulighed for at adskilles nemt.
- Indinkuber dæksedlerne natten over (16 timer) i mørket og ved RT. Når inkubationen er færdig, skal du tage dæksedlerne fra hinanden og derefter skylle 10x ved hjælp af deioniseret vand ved at vaske fra siden med en sprøjte flaske.
- Aftør dæksedlerne under en strøm af tør nitrogen. Opbevar de tørre dæksedler under vakuum.
Bemærk: diasene kan bruges i 1 måned uden forringelse af kvaliteten.
2. klargøring af flowcelle
-
Enkelt kanals flowcelle
- Bore to huller med 1,22 mm diameter i den midterste del af et kvarts dias (50 mm x 20 mm) med de centre, der ligger 37 mm fra hinanden og 6,5 mm fra kanten af diaset (figur 1a).
- Skær en 41 mm x 2,25 mm kanal ind i et 50 mm x 20 mm stykke af en dobbeltklæbende ark ved hjælp af en elektronisk cutter.
- Skræl plast siden af Beskyttelsesdækslet og Juster kanterne af stykket med kanterne af kvarts sliden. Fjern fangede luftbobler ved at trykke forsigtigt med et par polytetrafluorethylen pincet.
- Skræl papir siden af klæbe stykket. Monter arb på den funktionaliserede overflade på dæksedlen.
- Skåret polyethylen slange (id 1,22 mm) i en længde på 11 cm for indløbet og 25 cm for stikkontakten. Indsæt røret i de tidligere borede huller som indløb og udløb for flowcellen.
- Brug 5 min epoxy lim til at forsegle rundt om kanterne af Quartz-Cover slip-grænsefladen og omkring rørene til indløb og udløb.
- Brug straks flowcellen, når den tørrer eller opbevares under tørt vakuum til senere brug.
- Begærlighed i PBS opløses til en koncentration på 0,03 mg/ml. Filtrer gennem 0,2 μm sprøjte filter.
- Flow begærlighed ind i flowcellen ved hjælp af en 1 ml sprøjte. Brug en anden sprøjte fyldt med buffer til at vaske overskydende avidin. Vær omhyggelig med ikke at introducere luftbobler, mens du udveksler sprøjter.
-
Flowcelle med flere kanaler
- Der bor seks huller med en diameter på 1,22 mm på hver af de lange sider af kvarts sliden (76 mm x 25 mm) (figur 1b). Gør hullerne 4,5 mm fra kanten af diaset og 9,3 mm fra hinanden. Sørg for, at afstanden mellem centrene for hvert hulpar er 15 mm.
- Skær seks kanaler (20 mm x 2,25 mm) ud i et 76 mm x 25 mm stykke dobbeltklæbende tape ved hjælp af den elektroniske fræser.
- Skræl plast siden af Beskyttelsesdækslet og Juster kanterne af klæbe stykket med kanterne af kvarts sliden. Fjern eventuelle fangede luftbobler ved at trykke forsigtigt ved hjælp af et par polytetrafluorethylen pincet.
- Skræl papir siden af den klæbende brik, og Monter den på den funktionaliserede overflade på dæksedlen.
Bemærk: sommetider skrælning af papir siden og fastgørelse til kvarts diaset fungerer godt i multikanal flowcellen. - Skær indløbs rørene (11 cm) og udløbs rørene (25 cm) på de seks kanaler. Forbered flowcellen som beskrevet i trin 2.1.6 – 2.1.9.
- Tilslut stikkontakten på den første kanal til pumpen. Placer indløbet i 0,5 mL tube med OSS.
Bemærk: længden af indløbsrøret vælges for at maksimere antallet af hændelser i kløvnings forsøgene udført under kontinuerlig strømning ved at synkronisere tidspunktet for enzym indgangen i flowcellen og påbegyndelsen af billeddannelse og dermed nedsætte for tidlig foto blegning af fluorophorer. - Flyt til en ny kanal ved at frakoble stikkontakten for den brugte kanal. Luk stikkontakten med et stik, der er lavet af en sprøjte kanyle forseglet med lim i plastik delen. Luk den brugte kanals indløb.
3. klargøring af oxygen skyllesystem (OSS)
- 0,2 g (±) -6-hydroxy-2,5, 7, 8-tetramethylchroman-2-carboxylsyre (triplet tilstands QUENCHER, som minimerer blinkende fluorophorer) opløses i 800 μL methanol.
- Tilsæt 6 ml deioniseret H2O og tilsæt 1 N NaOH dråbevis, indtil det opløses. Filtrer gennem et sprøjte filter, foretag i 1 mL aliquoter, og opbevar ved-80 °C. Bestanden koncentration er ~ 100 μM.
- Tilbered en frisk opløsning af 3, 4-dihroxybenzoesyre (PCA) ved at opløse 61 mg PCA-pulver i 4 mL ddH2O. Bestanden koncentration er ~ 100 nM.
- Tilsæt 58 μL 10 N NaOH dropwise, og sørg for at vortex efter hvert fald, indtil PCA er helt opløst (pH = 9).
- 5,3 mg protocatechuat 3, 4-dioxygenase (3, 4-PCD) opløses i 7 mL PCD-lager buffer (tabel 1). 3, 4-PCD fjerner ilt fra bindingen/spaltning buffere ved at katalysere oxidation af protocatechuinsyre Acid34.
- PCD-opløsningen opdeles i 1 mL aliquoter. Bestanden koncentration er ~ 1 μM. fastfryse aliquoterne i flydende nitrogen og opbevares ved-80 °C ved langtidsopbevaring eller ved-20 °C for kort tids opbevaring.
- Forbered en ny bindings buffer (tabel 1). Erstat 2 mM CaCl2 med 2 mm mgcl2 for smfret kavalergang eksperimenter.
- Forbered 1 mL af billedbehandlings bufferen (tabel 1). Opbevar billedbehandlings bufferen på is, indtil den indføres i flowcellen for at opretholde aktiviteten af iltskylle systemet.
4. fremstilling af fluorescently mærkede HJs
- Det lyofiliserede oligonukleotider (tabel 2) rekonstruere i Tris-EDTA buffer (tabel 1) til en koncentration på 100 μM.
- Den syntetiske samling forberedes ved blanding af ækvimolære portioner ~ 3 μl af hvert af de X0 oligoer, der er anført i tabel 1.
- Anneal ved opvarmning ved 95 °C i 5 min efterfulgt af langsom afkøling til RT med en hastighed på 1 °C/min. Brug enten en varmeblok eller PCR-termo cycler til at opnå den ønskede afkølingshastighed.
- Læg blandingen på 8 cm x 8 cm af 10% Tris-boratedta polyacrylamidgel. Påfør 100 V og Kør gelen i ~ 2 h. Båndene er tydeligt set af øjet, og deres farve er lilla.
- Punktafgifts båndet for det udglødede substrat med et rent blad. Gelstykket overføres til et autoklaveres 1,5 ml rør.
- Knus gelstykket inde i røret med et rent stempel, og tilsæt 100 μL TE100 buffer (tabel 1).
- Du ekstrahere HJ ved at ryste røret ved 20 °C ved 1.500 rpm i et termo ixer til ~ 2 timer eller inkubere natten over ved 4 °C.
- Udfør ethanol nedbør på opløsningen, der indeholder substratet35.
- Underlaget opslæmmes i 20 μL TE100 buffer (tabel 1). Den endelige koncentration er 1–3 ΜM. aliquot 2 μl i hvert rør og opbevares ved-20 °c.
5. protein ekspression og oprensning af GEN1
- Konstruere plasmid for ekspression af trunkeret Human GEN11,2,3,4,5 med Hexa histidine-tag på C-Terminus20 ved PCR af indgangs vektoren.
Bemærk: N-terminal tagging vil resultere i inaktivering af GEN1. Den ustrukturerede C-Tail gør rensningen af fuld længde GEN1 betydeligt sværere. Desuden blev den fulde længde GEN1 rapporteret til at udvise mindre aktivitet end trunkeret version23. - Transformér udtryks vektor til E. coli BL21-codonplus (DE3)-RIPL stamme.
- De transformerede celler inokuleres i to 6 L kolber, der hver indeholder 2 L Luria bouillon-medier ved 37 °C med omrystning ved 180 rpm, indtil en OD600 af 0,8 er nået.
- Afkøl kulturen til 16 °C og inducerer GEN1-ekspression med 0,1 mM isopropyl-β-d-thiogalactopyranosid (IPTG) for 48 h.
- Cellerne høstes ved at dreje dem ned ved 4 °C ved 1000 x g i en centrifuge. Hver liter kultur udbytter 5–6 g af pellet.
- Supernatanten kasseres, og de pelleteret celler opslæmmes i lyse buffer (tabel 1) med 4 ml/g celler.
- Udfør celle lysis ved hjælp af en celleforstyrrende stof ved 30 KPSI, og drej derefter ned ved 10.000 x g i 1 time ved 4 °c. Saml supernatanten og Filtrer den på is med 0,45 μm filtre.
- Udfør protein rensning ved hjælp af FPLC ved at passere filtratet gennem en 5 mL ni-NTA kolonne ved 2,5 ml/min strømningshastighed ved hjælp af buffer A (tabel 1).
- Vask med 15 kolonne volumener (CV). Elute med en lineær gradient af buffer A og 500 mM imidazol over 20 CV i 5 mL fraktioner. GEN1 elutter fra kolonnen på omkring 100 mM imidazol.
- Afpipettér 10 μL aliquoter fra de indsamlede fraktioner, tilsæt lige store mængder 2x SDS loading Dye til hver alikvot. Prøverne udtages ved opvarmning ved 90 °C i 5 minutter, afkøles, og prøverne centrifuger.
- Læg prøverne på 10% bis-Tris-gel. Kør gelen for 30–45 min ved 200 V. pletten ved hjælp af Coomassie strålende blå, derefter destain. Saml de fraktioner, der indeholder renset GEN1.
- Saltkoncentrationen af de kombinerede fraktioner reduceres til 100 mM ved fortynding ved hjælp af buffer C (tabel 1).
- Det lave salt protein passerer gennem en 5 mL heparin kolonne med en strømningshastighed på 3 mL/min ved brug af buffer B (tabel 1).
- Vask med 10 CV. Elute ved hjælp af en gradient på 20 CV med buffer B og 1 M NaCl. Saml 5 mL fraktioner, hvor GEN1 elutter omkring 360 mM NaCl.
- Kontroller de eluede fraktioner for rensede GEN1-fraktioner som beskrevet i trin 5,8. Kombinere disse fraktioner og fortyndes til 100 mM NaCl ved hjælp af buffer C.
- Læg det nedre salt protein på en kation udvekslings kolonne ved 1 mL/min strømningshastighed ved hjælp af buffer B.
- Elute med en gradient på 40 CV ved hjælp af buffer B og 1 M NaCl. Saml 1,7 mL fraktioner, hvor GEN1 elutter omkring 300 mM NaCl.
- Kontrollér for renheden af GEN1 i de eluede fraktioner som beskrevet i trin 5,8.
- De reneste fraktioner kombineres og dialyserer ved 4 °C mod opbevarings buffer (tabel 1). Udfør mindst én udveksling af bufferen under dialyse.
- Mål proteinkoncentrationen ~ 0,5–1 mg/ml. Aliquot det dialyserede protein i 10–15 μl volumener i små rør, flash-fryse i flydende nitrogen, og opbevares ved-80 °c.
6. enkelt-molekyle-FRET eksperimenter
Bemærk: smFRET-eksperimenterne udføres på en specialbygget objektiv baseret TIRF-opsætning (figur 1c), der er beskrevet tidligere31.
- Enkeltfarvede FRET-eksperimenter
- Påfør en dråbe af nedsænkning olie på 100x TIRF mål. Indstil EMCCD til passende gevinst for at optimere signalet til baggrunden og forhindre mætning.
Bemærk: Se ikke direkte ind i laserstrålen og bær beskyttelsesbriller, når laseren justeres. - Placer strømningscellen forsigtigt på prøveholderen. Gradvist hæve målet ved hjælp af grov justering, indtil olien rører dæksedlen.
- Tænd for den grønne laser (532 nm). Skift til finjusterings tilstand for målsætningen. Dirigere emissionen til kameraets port for at observere billedet på skærmen.
- Juster højden af målet, indtil den funktionaliserede overflade af dæksedlen er bragt i fokus og kan observeres på skærmen.
Bemærk: billed anskaffelsen ved EMCCD udløser laser excitation via Acousto-optisk tunable filter (AOTF) for at forhindre prøve fotoblegning, når billeder ikke bliver erhvervet. - Kontroller, at baggrunden fra den funktionaliserede overflade af dæksedlerne ikke overstiger få pletter, før flyder i fluorescently mærket HJ.
- Stam substratet fortyndes ca. 1000 gange i TE100 buffer (tabel 1) til en endelig koncentration på 1-5 nm. Der afpipetteres 0,2 – 0,5 μL af det fortyndede substrat i 120 μL af billedbufferen med OSS i et 0,5 mL rør.
- Tilslut strøm cellens udløb til sprøjtepumpen. Indsæt strømnings cellens indløbsslange i 1,5 mL rør, og Betjen sprøjtepumpen med en strømningshastighed på 30 – 50 μL/min for at trække opløsningen ud af røret.
- Kontroller ofte overfladen for god dækning (100 – 300 af homogen fordelt, godt fordelt substrat) ved billeddannelse kort med den grønne laser.
- Hvis overfladen dækning er stadig ikke nok enten vente i nogle få minutter for fluorescently mærket HJ fra opløsningen til at bosætte sig på overfladen eller gentage strømmende trin.
- En anden 120 μL billedbuffer (tabel 1) skal være 30 – 50 μl/min for at vaske ubundet fluorescently mærket HJ. Lad derefter flowcellen sidde i 5 minutter for at tillade, at OSS nedbryder opløst ilt. Foto blegning af fluorophorerne bør være minimal i starten af billeddannelse.
- Indstil eksponeringstid (~ 60 MS), cyklustiden vil automatisk blive indstillet af software baseret på hastigheden af dataoverførsel (~ 104 MS), og angive det ønskede antal cyklusser eller rammer (~ 400). Emissionen fra donor (Cy3) og acceptor (Alexa fluor 647) er opdelt i to farvekanaler af en billed splitter enhed.
- Find et passende område på overfladen, fokusere billedet ved at justere højden af målet og optage og gemme filmen i 16-bit TIFF-format.
- Flytte til et nyt område.
Bemærk: Flyt altid i én retning (dvs. fra udtag til indløb) for at undgå billeddannelse i samme område to gange. - Forbered 1, 2, 5, 10, 25, 50, 75 og 100 nM GEN1 i 120 μL billedbehandlings buffer én ad gangen. Opløsningen gennemstrømningen med en strømningshastighed på 30-50 μL/min.
Bemærk: Hvis den påkrævede måling udføres under Steady State som ved binding af HJ ved GEN1 eller isomeriseringen af den frie HJ, så vent 3 – 5 minutter efter at strømmen stopper for at optage filmen. Få tre til fire film fra nye områder for hver GEN1-koncentration. - Hvis målingen udføres under kontinuerlig strømning som i kavalergang af HJ af GEN1 så start optagelsen 5 – 10 s før indgangen til GEN1 i flowcellen. Gentag målingen ved at flytte til en ny kanal i den seks kanals flowcelle.
- I slutningen, bruge en fast fluorescerende perle slide at kort donor og acceptor partikler til hinanden i billedet opdeling enhed.
- Tilsæt 0,2 μL af 1 μm diameter fluorescerende perler til 500 μL af 1 M tris (pH = 8,0) for at tillade perlerne at holde sig til overfladen.
- Skær en firkant (18 mm x 18 mm) inde i et 22 mm x 22 mm stykke af en dobbeltsidet klæbe forsegling. Skræl af og stick stykket til midten af en 76 mm x 25 mm kvarts slide.
- Placer 50 μL af den fortyndede perler opløsning og lad i 5 – 10 min at bosætte sig. Sæt en 22 mm x 22 mm dækseddel oven på det firkantede stykke. Tør overskydende perler opløsning med væv, derefter forsegle kammeret ved epoxy lim.
- Erhverve 100 frames af perlerne glide på en 60 MS eksponeringstid.
Forsigtig: Sænk laser strømmen og EMCCD Gain til minimum for at undgå mætning af detektoren. - Installer softwarepakken (f. eks. TwoTones), og Åbn filmene deri som angivet i brugermanualen36. Vælg placeringen af de enkelte perler i donor og acceptor kanaler. Generer en Transformations matrix som beskrevet i manualen.
Bemærk: denne software bruger transformation matrix til at matche positioner af partiklerne i donor og acceptor kanaler og korrigere for enhver lille forskydning i billedet opdeling enhed. - Gå til fil, tryk på Indlæs film, og vælg derefter filmfilen, og tryk på Åbn. I menuen filer, tryk på Load tform og vælg transformation matrix genereret fra perler slide. Juster tærsklen for donor og acceptor kanaler, indtil der ikke er nogen falske positiver inkluderet.
- I menuen kanal filter skal du vælge D & & en indstilling for at vælge for partikler, der er mærket med både donor og acceptor. Markér feltet nærmeste nabo grænse for at udelukke molekyler, der er meget tæt på hinanden. Check Max ellipticitet at udelukke meget excentriske molekyler og kontrollere bredde grænser for at udelukke meget brede eller meget smalle molekyler.
- Type Plothistcw som anvist i twotones manual til at konstruere histogrammer.
Bemærk: den "tilsyneladende" FRET effektivitet beregnes af programmet ved at dividere emissionen af acceptoren med de samlede emissioner fra donor og acceptor. Twotones bruger 100 intervaller til bin fordelingen af staterne af molekylerne mod FRET effektivitet. - Skriv Plottimetvæddelw som anvist i Twotones manual for at generere tids spor for hvert molekyle.
Bemærk: tids spor kan analyseres yderligere af vbFRET37 for at identificere forskellige fret-tilstande, deres respektive opholdstid og overgangs rater mellem forskellige stater.
- Påfør en dråbe af nedsænkning olie på 100x TIRF mål. Indstil EMCCD til passende gevinst for at optimere signalet til baggrunden og forhindre mætning.
- To-farve alternerende excitation FRET (ALEX) eksperimenter
- Optag en film bestående af fortløbende frames af donor og acceptor emissioner ved direkte excitationer med de grønne og røde lasere, henholdsvis hver ~ 80 MS i varighed.
- Åbn de erhvervede ALEX-film i Twotones. Indstil den passende detekterings tærskel som ~ 300 for de tre kanaler: donor emission som følge af donor excitation (DexDem); acceptor emission som følge af donor excitation (DexAem); og acceptor emission som følge af direkte excitation (AexAem).
- Anvend kanal filteret DexDem & & DexAem & & AexAem for at vælge de partikler, der både har donor og acceptor. Link partiklerne ~ 200 – 300 i de tre kanaler.
- Brug plotHistALEX MATLAB-koden til at generere ALEX histogrammer. Tilpas forskellige toppe i histogrammer til Gaussisk funktioner og bestemme procentdelen af hver population arealet under kurven ved hjælp af Origin software38.
Bemærk: toppene i bindings analysen svarer til det bundne GEN1-HJ-kompleks, mens toppene i den frie HJ repræsenterer de indbyrdes skiftende isomerer. - Brug Plottimetracealex MATLAB-koden til at generere en tidssporing for hvert molekyle, der viser donor emission ved direkte excitation, og acceptors emissioner på grund af Fret og direkte excitation.
Bemærk: ALEX time-Traces selvstændigt for at vise emissionerne fra både donor og acceptor, men ved lavere tidsmæssig opløsning end enkelt-farve FRET. Svarende til enkelt-farve FRET, ALEX time-Traces kan analyseres yderligere af vbFRET at identificere forskellige FRET stater og deres respektive opholdstid. - Bestem dissociations konstanten ved at tilpasse procentdelene af den bundne population versus GEN1-koncentrationen til en hyperbolske-funktion.
- Time lapse enkelt farve-FRET
- Indstil eksponeringstid for den grønne laser til 60 MS og cyklus tid til 624 MS eller lavere, afhængigt af hastigheden af den observerede dynamik.
- Indstil strømningshastigheden til 110 μL/min i en kanal i den seks kanals flowcelle. Start optagelsen kort før indgangen til GEN1 inde i flowcellen.
Bemærk: kontinuerlig strøm fører til hurtig fotoblegning af fluorophorerne, derfor synkroniserer starten af billeddannelse og protein indtastning maksimerer antallet af tilfangetagne hændelser. Den optimale aflæsning af sprøjtepumpen afhænger af den døde volumen og den nøjagtige slange, der anvendes til at samle flowcellen; i vores tilfælde er det ~ 25 μL. - Erhverve en film af ~ 125 frames for en samlet anskaffelsestidspunkt på 78 s. I slutningen af optagelsen, udsætte prøven til den røde laser for 50 frames hver med 25 MS eksponeringstid for at sonde acceptoren.
Bemærk: denne metode forlænger observationsvinduet i spaltning eksperiment gennem faldende antallet af excitation cyklusser. Kinetic parametre som kon og koff af denne er afledt ved at montere fordelingen til en bi-eksponentiel model30,38.
7. undersøgelser af elektroforetiske mobilitets Skift (EMSA)
- I 50 μL total volumen inkubatér den ønskede koncentration af GEN1 med 50 pM Cy5-mærket HJ ved RT i 30 min i EMSA-bindings buffer (tabel 1).
- Læg prøverne på 8 cm x 8 cm 6% Tris-boratedta gel. Kør gelen med 100 V i 1 h + 20 min i 1x TBE-buffer ved RT.
- Bestem procentdelen af bundet substrat ved en GEN1-koncentration fra dets relative bidrag til den totale fluorescens intensitet af den pågældende vognbane.
Bemærk: GEN1 monomer-HJ (band I) er identificeret ved aftalen af sin størrelse med picomolar binding af GEN1 monomer til den spinalis HJ21,30. GEN1-dimer-HJ er tildelt til band II på grund af den trinvise binding af GEN1 monomer til HJ21,23. - Beregn de tilsyneladende bindings konstanter kd-monomer-app-EMSA og kd-dimer-app-EMSA ved hjælp af ligningen:
Hvor: Max er den koncentration, ved hvilken de respektive arter nåede sin maksimale binding (monomer eller dimer); n er bakke koefficienten; K d-app-EMSA er den tilsyneladende bindende konstant for de respektive arter, der angiver koncentrationen af GEN1, hvor halv-maksimum af monomer eller dimer er til stede.
Representative Results
Conformer bias og isomerisering af HJ
Isomeriseringen af HJ er blevet grundigt undersøgt af Fret gennem mærkning af to tilstødende arme i krydset17,18,39. Donor (Cy3) og acceptor (Alexa fluor 647) er placeret ved de to tilstødende arme, henholdsvis R (streng 2) og X (streng 3) (figur 2a). De stacked-X isomerer blev tildelt af deres to kontinuerlige tråde [dvs., ISO (1, 3) eller ISO (2,4)]. ALEX FRET histogram af tilstødende-label X0 viser to toppe, der svarer til at skifte mellem de mere rigelige ISO (1, 3) (e ~ 0,75) og mindre rigelige ISO (2,4) (e ~ 0,40) (figur 2b).
Single-Color FRET bruges til at erhverve tid-spor til registrering af de hurtige konformationsmæssige ændringer i den frie HJ med høj tidsmæssig opløsning ~ 10 MS via reducere det anvendte område af EMCCD2 kamera. En repræsentativ enkelt-farve FRET tid-Trace af X0 Junction viser overgangene mellem høj og lav fret isomerer (figur 2b). Isomeriserings raterne kISO (1, 3)-ISO (2,4) og kISO (2,4)-ISO (1, 3) opnået fra dvæletid histogrammer af ISO (1, 3) og ISO (2,4) (figur 2c) er i overensstemmelse med dem, der er rapporteret tidligere17.
SMFRET demonstrerer aktiv forvrængning af HJ ved GEN1
HJ gennemgår strukturel omorganisering efter binding til GEN122. Afstanden mellem donor og acceptor er således den samme i både ISO (1, 3) og ISO (2,4) (figur 3a). SmFRET bindings assays blev udført i nærværelse af ca2 + for at forhindre SPALTNING af HJ. Der blev erhvervet FRET histogrammer af det tilstødende-label X0 Junction ved forskellige GEN1-koncentrationer af Alex (figur 3b). Histogrammet er egnet til to Gaussian funktioner: en svarende til den frie høje FRET ISO (1, 3), og den anden svarer til den bundne GEN1-HJ-population efter subtraktion af bidraget fra ISO (2,4) fra Low FRET Peak.
Ved mæthed i GEN1-koncentrationen har FRET-histogrammet på X0 kun en enkelt lav fret-spids, der svarer til GEN1, som er bundet til enten ISOMER af HJ som forudset af model22. Den tilsyneladende monomer dissociationskonstant (Kd-monomer-app) bestemmes ud fra den hyperboske pasform af procentdelen af den GEN1-bundne population som en funktion af Gen1-koncentrationen (figur 3c). Den tilstødende-label NK-X0 repræsenterer en enkeltvis NIKKEDE version HJ, der efterligner produktet, når den første incisionreaktion. På grund af lindring af stabling stamme af den simulerede Nick, NK-X0 er en ikke-isomeriserende struktur40 som tydeligt fra det enkelte substrat peak på E ~ 0,40, i modsætning til X0 (figur 3D vs. figur 3b). Strukturen i GEN1-NK-X0 -komplekset svarer til den i Gen1-x0 -komplekset, som det fremgår af ligheden i fret-effektivitet (E ~ 0,25 for NK-X0 og 0,32 for X0) (figur 3D vs. Figur 3B). Den stærke binding af GEN1 monomer til NK-X0 fremgår af den 40-dobbelte lavere Kd-monomer-app værdi end X0 (figur 3e vs. figur 3c). Denne stramme binding kan fungere som en beskyttelsesmekanisme mod den ufuldstændige opløsning af HJ i det usandsynlige tilfælde af dissociation af GEN1 dimer eller en af dets monomerer.
Trinvis binding af GEN1 monomer til HJ
Bindingen af GEN1 monomer til HJ efterfulgt af dimer formation er en unik funktion for eukaryote HJ resolvase GEN1 sammenlignet med prokaryote resolvases, som findes i dikemeje form i opløsning21,23,41. EMSA af GEN1 ved 50 pM X0 viser den trinvise forening af GEN1 i højere ordre komplekser, som angivet med romertal i det øverste panel (figur 4a). Dissociations konstanten for GEN1 monomer, som er bestemt af EMSA (Kd-monomer-EMSA), falder sammen med dissociations konstanten fra smfret-bindings analysen Kd-monomer-app (figur 4a og figur 3c , hhv. Kvantificeringen af gruppe II anvendes til at beregne ligevægts dissociations konstanten for GEN1 dimer (Kd-DIMER-EMSA). EMSA af GEN1 ved 50 pM NK-X0 viser den fremtrædende monomer binding som angivet af den meget lave Kd-MONOMER-app-EMSA , som er 30 gange lavere end X0, mens dens Kd-dimer-EMSA er sammenlignelig med X0 (figur 4b).
Yderligere dokumentation for, at GEN1 monomer binder og forvrænger HJ er observation af et betydeligt antal spor af uncleaved partikler med stabil lav FRET tilstand (figur 4c) i nærværelse af mg2 + ved lave GEN1-koncentrationer. Antallet af disse spor faldt efter stigende GEN1 koncentration. Løsningen af HJ er drevet af den stramme binding af GEN1 monomer, som understøtter dimer dannelse. Monomer bindingen observeres i tiden-spor af uncleaved NK-X0 i mg2 +, som strækker sig indtil få nanomolær koncentration (figur 4d). Den GEN1 monomer binder stramt til at beskytte NK-X0, i sidste ende at sikre fuld opløsning gennem dimer dannelse.
SMFRET resolution assay af HJ
Udtrykket "spaltning" i smFRET assays anvendes synonymt med "resolution" af HJ, da der i denne analyse kun den produktfrigivelse, der følger den anden spaltning begivenhed detekteres. Begivenhederne er indspillet af time-lapse enkelt farve excitation at minimere foto blegning af foto-følsomme acceptor over erhvervelse tid på ~ 1,3 min.
Skematisk i figur 5a illustrerer indsnit af tråde 1 og 3 af X0 ISO (1, 3) efter BINDING og forvrængning af GEN1 af en X0 knyttet til det funktionaliserede glas. Både donor og acceptor gå i opløsning resulterer i tab af deres signaler efter HJ opløsning. Den første og anden incisioner er afkoblet i NK-X0, som eksemplificerer en prototype for den delvist løste HJ. Ved binding af GEN1, NK-X0 vedtager en lignende struktur til X0. Resolutionen skrider frem med et enkelt snit i streng 1, som illustreret i figur 5b.
Den samtidige afgang af donor og acceptor efter en stabil lav FRET tilstand i spor af løst X0 forekom uden fremkomsten af en mellemliggende fret (E = ~ 0,40) indikerer, at fuldstændig opløsning opstår inden for levetiden af GEN1-HJ kompleks (figur 5c). Derfor tyder disse resultater på, at HJ-opløsningen forekommer inden for GEN1-HJ-kompleksets levetid. Opløsningen af NK-X0 også provenuet efter strukturel omlægning og konkluderer ved afgang af duplex transporterer to fluorophorer (figur 5D) svarende til X0.
Kinetik af GEN1 denne på GEN1 monomer bundet HJ
Tidsforskydning smFRET foranstaltninger τfør-spaltning , som hovedsagelig omfatter den tid, der kræves for dimer dannelse og opløsning af HJ efter FORVRÆNGNING af GEN1 monomer. Ved anvendelse af denne teknik fremstilles der direkte beviser til støtte for påstanden om, at dimer formation er nødvendig for opløsningen af både X0 og NK-X0, da fordelingen af τfør-spaltning er GEN1 koncentrationsafhængig.
Den tilsyneladende hastighed af HJ opløsning (kapp) er defineret som den inverse af middelværdien af τfør-spaltning ved den respektive GEN1 koncentration. Betegnelsen "åbenbar" bruges til at beskrive satsen for HJ-opløsningen, da muligheden for, at GEN1 forbliver bundet til produktet efter HJ-opløsningen, ikke kan udelukkes.
Sandsynligheds tætheden (PDF) af τfør-spaltning af X0 (figur 6a) afspejler tiden for dimerdannelse, som er længere ved lave GEN1-koncentrationer og derefter kortere ved højere GEN1-koncentrationer. Forenings-og dissociations raterne for henholdsvis dimer, kon-dimer og koff-dimerbestemmes ud fra en bi-eksponentiel model30. Også, PDF'er af NK-X0 (figur 6b) viser en lignende fordeling til X0 angiver kravet om dimer dannelse.
Plottet af kapp versus GEN1 koncentration blev monteret på en hyperbolske funktion. De tilsyneladende katalyse rate konstanter (kMax-app) på X0 og nk-X0 er henholdsvis 0,107 ± 0,011 s-1 og 0,231 ± 0,036 s-1(figur 6c). Plots af kapp til X0 og NK-X0 vejkryds skærer ved GEN1 koncentration ~ 5,6 nm på grund af den hurtigere kMax-app og langsommere kon-dimer af spinalis i forhold til det intakte vejkryds.
Kort sagt, den relativt hurtige kon-dimer og langsom koff-dimer føre til progression af den fremadgående reaktion mod HJ opløsning, når dimer er dannet. Den stærke binding af GEN1 monomer til NK-X0 -krydset udgør en fejlsikker mekanisme mod enhver usandsynlig afbrudt anden spaltning eller hjælper med at afhente eventuelle ufuldstændigt uløste HJS efterladt af primære opløsnings veje i cellen.
Figur 1: enkelt-og flerkanals flow celler og layout af den optiske opsætning.
(A) skematisk af en enkelt kanals flowcelle. (B) skematisk af den seks-kanals flowcelle. C) layoutet af det optiske set-up, der skildrer excitation-kilderne, tirf-målsætningen, koldtlysreflektorlamper-spejlet, som er installeret i filter kuben, og de emissions filtre, som anvendes i billed Opdelings enheden. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Conformer bias og isomerisering af HJ observeret af FRET.
A) isomerisering af den tilstødende etiket X-stacked HJ-konformatorer, der er navn lig efter de to kontinuerlige tråde. Strengene er nummereret, mens armene er betegnet med bogstaver. Incisionstederne vises med pile. Donor (grøn) og acceptor (rød) og ændringen i FRET ved isomerisering er indiceret. (B) højre panel: fret time-Trace (sort) og IDEALISERET fret Trace (rød) på X0 ved 50 mm mg2 +. Venstre panel: FRET histogram af X0 ved 50 mm mg2 +. Den fluorescens intensitet af donor (grøn) og acceptor (rød) er vist nedenfor. (C) dén-tids histogrammer af tilstødende-label X0 ISO (1, 3) og ISO (2,4) blev monteret på enkelt eksponentielle funktioner for at bestemme isomeriserings raterne. Usikkerheden indikerer 95% konfidensintervallet for pasformen. Dette tal er blevet ændret fra tidligere publiceret litteratur30.
Figur 3: aktiv forvrængning af HJ ved GEN1.
A) strukturel modifikation af kontinuerlig label HJ baseret på den foreslåede model22. (B) Alex fret histogram af tilstødende-label X0 har en stor høj fret Peak (e = ~ 0,6) svarende til ISO (1, 3) og nedre fret Peak (e = ~ 0,4) for ISO (2,4). Hele histogrammet er egnet til to Gaussian funktioner: en svarende til den frie høje FRET ISO (1, 3), og den anden svarer til den bundne befolkning minus den oprindelige bidrag af ISO (2,4) til den samlede population. C) den tilsyneladende monomer dissociationskonstant (Kd-monomer-app) bestemmes ud fra en hyperbosk pasform af procentdelene af GEN1-BUNDNE populationer som en funktion af GEN1-koncentrationen. D) fret histogrammer af den tilstødende-label NK-X0 ved forskellige GEN1-koncentrationer. Arealet under den lave FRET (E = ~ 0,25) Gaussian svarer til den procentdel af den bundne population. (E) Kd-monomer-appen på NK-X0 bestemmes ud fra den hyperboske pasform af den GEN1-bundne population. Fejllinjerne repræsenterer standardafvigelserne fra to eller flere eksperimenter. Dette tal er blevet ændret fra tidligere publiceret litteratur30. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: trinvis binding af GEN1 til HJ.
A) elektroforetisk mobilitets Skift-analyse (EMSA) af GEN1 ved 50 PM X0. Øvre panel: romertal angiver antallet af GEN1-monomerer i komplekset. Lavere panel: binding af GEN1 monomer til X0. De tilsyneladende dissociations konstanter blev opnået fra en sigmoidal pasform af de respektive arter og repræsenterer gennemsnittet af to eksperimenter. B) EMSA af GEN1 ved 50 PM NK-X0 viser den fremtrædende monomer binding som angivet af den meget lave Kd-monomer-app-EMSA. (C) fret tids spor af bundet, men uncleaved tilstødende-label X0 i mg2 +. Donor excitation for ~ 1,3 min blev udført, efterfulgt af direkte acceptor excitation (skyggefulde pink region). (D) fret tids spor af bundet, men uncleaved tilstødende-label NK-X0 i mg2 +. Dette tal er blevet ændret fra tidligere publiceret litteratur30. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: SMFRET resolution assay af HJ.
(A) skematisk af den tilstødende etiket X0 ISO (1, 3) efter forvrængning af GEN1. Substratet er fastgjort til den funktionaliserede overflade via biotin/Avidin-kobling. Dissociationen af GEN1 efter de to incisioner resulterer i tabet af både donor og acceptor, der går i opløsning. (B) skematisk af opløsningen af tilstødende-label NK-X0 ved at kløvende strand 1. (C) tids spor (sort) ved 2 mm mg2 + af kløvningen af ISO (1, 3). Starten af GEN1-binding danner en stabil, lav FRET tilstand, indtil FRET-signalet er brat tabt på grund af spaltning. Tilsvarende, stigningen i donor og faldet i acceptor fluorescens intensiteter efter GEN1 binding er efterfulgt af den samtidige forsvinden af fluorescens fra begge farvestoffer ved spaltning. D) på samme måde viser tidspunktet for NK-X0 en stabil lav fret-tilstand efter GEN1-binding, som afsluttes med det pludselige tab af Fret-signalet. Dette tal er blevet ændret fra tidligere publiceret litteratur30. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: kinetik af GEN1-denne på GEN1 monomer bundet HJ.
(A) Sandsynligheds TÆTHEDEN (PDF) i τ-før-spaltning- fordelingen af X0 illustrerer dens afhængighed af GEN1-koncentrationen. Hviletiderne for den lave FRET tilstand (τfør-spaltning) ved den respektive GEN1-koncentration blev opnået fra to eller flere eksperimenter og anvendt til at opnå gennemsnitspriser (kapp). De anførte k-app -rater bestemmes ud fra den inverse af den gennemsnitlige τfør-spaltning ved den respektive GEN1-koncentration. Association (kon-dimer) og dissociation (koff-dimer) satser for dimer dannelse er beregnet ud fra en bi-eksponentiel model38. Fejlene repræsenterer SEM af kapp. (B) PDF-plottet af τfør-spaltning udlodninger af NK-X0 og de respektive kapp satser. (C) plot af k-app versus GEN1-koncentration, der er monteret på en hyperbolske-funktion for at bestemme den tilsyneladende katalytiske hastighed (kMax-app). Plottet af kapp til x0 og NK-X0 illustrerer den hurtigere indledende kapp af x0 , som derefter overgået af NK-X0 ovenfor [GEN1] ~ 5,6 nm. Dette tal er blevet ændret fra tidligere publiceret litteratur30. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Buffer | Ideal | ||
| Bindings buffer | 40 mM Tris-HCl pH 7,5, 40 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 1 mm dtt, 0,1% BSA og 5% (v/v) glycerol | ||
| Buffer A | 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM DTT og 300 mM NaCl | ||
| Buffer B | 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM DTT og 100 mM NaCl | ||
| Buffer C | 20 mM Tris-HCl pH 8,0 og 1 mM DTT | ||
| Kløvning buffer | 40 mM Tris-HCl pH 7,5, 40 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 1 mm dtt, 0,1% BSA og 5% (v/v) glycerol | ||
| EMSA bindende buffer | 40 mM Tris-HCl pH 7,5, 40 mM NaCl, 1 mM DTT, 2 mM CaCl2, 0,1 mg/ml BSA, 5% (v/v) glycerol og 5 ng/μl poly-di-DC | ||
| Billedbehandlings buffer (binding) | 40 μL (±) -6-hydroxy-2, 5, 7, 8-tetramethylchroman-2-carboxylsyre (4 μM), 60 μL PCA (6 nM), 60 μL PCD (60 nM) og 840 μL bindings buffer | ||
| Billedbehandlings buffer (kavalergang) | 40 μL (±) -6-hydroxy-2, 5, 7, 8-tetramethylchroman-2-carboxylsyre (4 μM), 60 μL PCA (6 nM), 60 μL PCD (60 nM) og 840 μL af kløvning buffer | ||
| Lysis buffer | 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM β-mercaptoethanol, 300 mM NaCl og 2 mM PMSF | ||
| PCD-lager buffer | 100 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA, 50 mM KCl og 50% glycerol | ||
| lager buffer | 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 100 mM NaCl og 10% glycerol | ||
| TBE-buffer | 89 mM Tris-HCl, 89 mM borsyre og 2 mM EDTA | ||
| TE100 buffer | 10 mM Tris. HCl pH 8,0 og 100 mM NaCl | ||
| Tris-EDTA buffer | 50 mM Tris-HCl pH 8,0 og 1 mM EDTA pH 8,0 | ||
Tabel 1: listen over buffere og deres sammensætninger, der anvendes i dette studie.
| Oligo | Sekvens | ||
| X0-ST1 | ACGCTGCCGAATTCTACCAGTGCCTTGCTAGGACATCTTTGCCCACCTGCAGGTTCACCC | ||
| X0-ST2 | GGGTGAACCTGCAGGTGGG/iCy3/AAAGATGTCCATCTGTTGTAATCGTCAAGCTTTATGCCGT | ||
| X0-ST3 | ACGGCATAAAGCTTGACGA/iAF647-dT/TACAACAGATCATGGAGCTGTCTAGAGGATCCGACTATCG | ||
| X0-ST4 | 5 ' BiotinCGATAGTCGGATCCTCTAGACAGCTCCATGTAGCAAGGCACTGGTAGAATTCGGCAGCGT | ||
| X0-adj | X0-ST1, x0-ST2, x0-ST3 & X0-ST4 | ||
| X0In_st2 | HAR du en af de mest slidte, men ikke så meget at gøre, er det ikke en af de andre. | ||
| X0In_st4 | 5 ' BiotinCGATAGTCGGATCCTCTAGACAGCTCCATGTAGCAAGGCA/iCy3/TGGTAGAATTCGGCAGCGT | ||
| NK-X0 | X0-ST1, x 0-ST2, x0-nk3a, x0-nk3b & X0-ST4 | ||
| X0-nk3a | ACGGCATAAAGCTTGACGA/iAF647-dT/TACAACAGATC | ||
| X0-nk3b | ATGGAGCTGTCTAGAGGATCCGACTATCG | ||
Tabel 2: SMFRET og EMSA HJ substrater. Listen over oligonukleotider, der anvendes til fremstilling af fluorescently mærkede HJs for smFRET og EMSA. Oligoerne blev kommercielt erhvervet. De fluorescently mærkede oligoer var HPLC-renset, og når det var muligt, var oligonukleotider ≥ 60 BP side oprenset.
Discussion
I denne undersøgelse, forskellige smFRET teknikker blev implementeret for at bestemme kinetikken af HJ resolution af GEN130. Lignende smfret tilgange blev brugt til at følge dobbelt-flap DNA konformationsmæssige krav og spaltning af DNA replikation og reparation flap endonuklease 142,43,44. Her diskuteres kritiske trin i denne protokol. Den silanisering reaktion bør være fri for ethvert spor af fugt. Pegylations opløsningen skal anvendes hurtigt på det silaniserede glas, når PIND er opløst for at undgå hydrolyse. I multikanal flowcellen skal enhver fanget luft i klæbe arket fjernes for at undgå lækage mellem tilstødende kanaler. PCA-løsningen skal være frisk tilberedt, da den oxiderer over tid. Tilføjelsen af 10 N NaOH bør være dropwise, med vortexning i mellem. Fluorescens baggrund i dæksedlen skal være minimal, før den flyder fluorescently mærket HJ. Billedbehandlings forløbet i flowcellen skal udføres i én retning for at undgå, at der opstår blegede områder. I ALEX eksperimenter, kraften i den røde laser bør reduceres for at undgå hurtig blegning af acceptoren. I tidsforskudt eksperimenter skal cyklustid være kortere end den hurtigste hændelse.
smFRET er en følsom teknik, der kan give værdifuld real-time indsigt i biomolekulære reaktioner. Men denne metode har flere tekniske udfordringer, blandt hvilke er at opnå målbare ændringer i FRET under den biokemiske reaktion. Dette er nødvendigt for at opnå veladskilte funktioner i histogrammer og skelne stater i tids-spor. I mange tilfælde kræver smfret omhyggelig design af substrater, udvælgelse af fluoroforet par og deres positioner, og forstærkning af Fret ændringer i DNA-substrat på grund af de små strukturelle ændringer i substrat45. En anden metode til at udføre FRET er at bruge mærkede proteiner46. Observationsvinduet i FRET er begrænset af acceptorens stabilitet såsom Cy5 eller Alexa fluor 647, som har tendens til at blege hurtigere end donor (Cy3 i dette tilfælde). Derfor kræver fret en kontinuerlig søgning efter stabile fluorophorer for at forlænge eksperimentets varighed og bestræbelserne på at udvikle iltskylle systemer for at forlænge fluorescens signalet og maksimere signal-støj-forholdet47,48 .
Blandt de tips til fejlfinding i smFRET balancerer de mange parametre, der er involveret i Imaging såsom laser effekt, eksponeringstid, cyklustid, og antallet af cyklusser for at maksimere fluorescens emission, forlænge eksperimentet varighed, og opnå passende prøvetagnings intervaller for enzym dynamikken. Længere observations tider og minimale effekter fra foto blegning er afgørende for at opnå high fidelity dtids fordelinger, der repræsenterer enzym dynamikken. ALEX genererer bedre histogrammer, da denne metode er udsat for lavere bidrag fra foto blegede partikler sammenlignet med enkelt farve-FRET. Men den tidsmæssige opløsning i ALEX er lavere end i enkelt farve-FRET.
Endelig lægger smFRET vægt på at påvise konformationelle/strukturelle ændringer i individuelle molekyler i realtid broer kløften mellem høj opløsning strukturelle teknikker (dvs., røntgenkrystallografi, nuklear magnetisk resonans, elektronmikroskopi), som giver atomare opløsning strukturelle detaljer under statiske forhold og bulk metoder, der leverer ensemble gennemsnit af en målbar egenskab. I mange henseender har smFRET vist sig at være en kraftfuld teknik til at studere biologiske systemer i realtid.
Disclosures
Forfatterne erklærer ikke konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Kong Abdullah University of Science and Technology gennem Core Funding og konkurrencedygtig Research Award (CRG3) til S. M. H.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox) | Sigma-Aldrich | 238813 | |
| 0.1 M sodium bicarbonate buffer | Fisher | 144-55-8 | |
| 10 % Novex Tris-Borate-EDTA gel | Thermo Fisher Scientific | EC6275BOX | |
| 100 X TIRF objective | Olympus | NAPO 1.49 | |
| 3,4-dihroxybenzoic acid (PCA) | Sigma-Aldrich | P5630 | |
| 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) | Sigma-Aldrich | 741442 | |
| 6% Novex Tris-Borate-EDTA gel | Thermo Fisher Scientific | EC6265BOX | |
| Adhesive sheet | Grace bio-labs | SA-S-1L | |
| Benchtop refrigerated centrifuge | Eppendorf | Z605212 | |
| Biotin-PEG | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA 5000 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | New England Biolabs | B9001S | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | 31307 | |
| cation exchange column | GE healthcare | MonoS (4.6/100) | |
| Cell distruptor | Constant Cell Disruption System | TS5/40/CE/GA | |
| Coomassie Brilliant Blue | MP Biomedicals | 808274 | |
| Cy3 emission filter | Chroma | HQ600/40M-25 | |
| Cy5/Alexa Fluor 647 emission filter | Chroma | HQ700/40M-25 | |
| Dichroic for DV2 filter cube | Photometrics | 630dcxr-18x26 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Scientific | R0861 | |
| Drill | Dremel | 200-1/21 | |
| Electronic cutter | Copam | CP-2500 | |
| EMCCD camera | Hamamatsu | C9100-13 | |
| Epoxy glue | Devcon | 14250 | |
| FPLC Aktapurifier UPC 10 | GE Healthcare | 28406268 | |
| GelQuant.NET software | biochemlabsolutions.com | Version 1.8.2 | |
| GEN1 entry vector | Harvard plasmid repository | HSCD00399935 | |
| Glycerol | Sigma Life Science | G5516 | |
| green laser (emission 532 nm) | Coherent | Compass 315M-100 | |
| Heparin column | GE healthcare | HiTrap Heparin column | |
| HEPES | BDH | BDH4162 | |
| Image splitter | Photometrics | Dualview (DV2) | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX81 | |
| Isopropyl-ß-D-thiogalactoside (IPTG) | Goldbio. | 12481C100 | |
| Laser scanner | GE healthcare | Typhoon Trio | |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
| Long pass 532nm filter | Semrock | LPD02-532RU-25 | |
| Magnesium Chloride | Sigma Life Science | M8266 | |
| mPEG | Laysan Bio | mPEG-SVA 5000 | |
| Neutravidin | Pierce | 31000 | |
| Ni-NTA column | GE healthcare | HisTrap FF | |
| NuPAGE 10% Bis-Tris gels | Novex Life technologies | NP0301BOX | |
| NuPAGE 10% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | NP0302PK2 | |
| Origin software | OriginLab Corporation | Version 8.5 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Alexis Biochemicals | 270-184-G025 | |
| Phosphate-buffered saline | GIBCO | 14190 | |
| Polyethylene Tubing (I.D. 0.76 mm O.D. 1.22mm) | Fisher (Becton Dickinson) | 427416 | |
| Protocatechuate 3,4-dioxygenase (3,4-PCD) | Sigma-Aldrich | P8279-25UN | |
| Quad-band dichroic | Chroma Inc | Z405/488/532/640rpc | |
| red laser (emission 640 nm) | Coherent | Cube 640 100C | |
| Sodium Chloride | Fisher Chemical | S271 | |
| Sorvall RC-6 plus centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 46910 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop 2000 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-3007 | |
| Teflon tweezers | Rubis | K35A | |
| Tris Base | Promega | H5135 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima L-90K | |
| Ultrafiltration membrane | Millipore | UFC90300 |
References
- Moerner, W. E., Fromm, D. P. Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy. Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).
- Ha, T. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer. Methods. 25 (1), 78-86 (2001).
- Weiss, S. Fluorescence spectroscopy of single biomolecules. Science. 283 (5408), 1676-1683 (1999).
- Stryer, L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Annual Review of Biochemistry. 47, 819-846 (1978).
- Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
- Walter, N. G., Huang, C. Y., Manzo, A. J., Sobhy, M. A. Do-it-yourself guide: how to use the modern single-molecule toolkit. Nature Methods. 5 (6), 475-489 (2008).
- Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nature Methods. 2 (12), 920-931 (2005).
- Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology. Methods in Enzymology. 361, 1-33 (2003).
- Kim, H. D., et al. Mg2+-dependent conformational change of RNA studied by fluorescence correlation and FRET on immobilized single molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (7), 4284-4289 (2002).
- Lee, T. H., et al. Measuring the folding transition time of single RNA molecules. Biophysical Journal. 92 (9), 3275-3283 (2007).
- Holliday, R. Mechanism for Gene Conversion in Fungi. Genetical Research. 5 (2), 282-304 (1964).
- West, S. C., et al. The Formation and Resolution of Holliday Junctions during the Recombinational Repair of DNA Damages. Journal of Cellular Biochemistry. , 269-269 (1995).
- Cox, M. M., et al. The importance of repairing stalled replication forks. Nature. 404 (6773), 37-41 (2000).
- West, S. C. Molecular views of recombination proteins and their control. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 4 (6), 435-445 (2003).
- Duckett, D. R., et al. The structure of the Holliday junction, and its resolution. Cell. 55 (1), 79-89 (1988).
- Clegg, R. M., et al. Fluorescence resonance energy transfer analysis of the structure of the four-way DNA junction. Biochemistry. 31 (20), 4846-4856 (1992).
- McKinney, S. A., Declais, A. C., Lilley, D. M., Ha, T. Structural dynamics of individual Holliday junctions. Nature Structural Biology. 10 (2), 93-97 (2003).
- Joo, C., McKinney, S. A., Lilley, D. M., Ha, T. Exploring rare conformational species and ionic effects in DNA Holliday junctions using single-molecule spectroscopy. Journal of Molecular Biology. 341 (3), 739-751 (2004).
- Hyeon, C., Lee, J., Yoon, J., Hohng, S., Thirumalai, D. Hidden complexity in the isomerization dynamics of Holliday junctions. Nature Chemistry. 4 (11), 907-914 (2012).
- Ip, S. C., et al. Identification of Holliday junction resolvases from humans and yeast. Nature. 456 (7220), 357-361 (2008).
- Rass, U., et al. Mechanism of Holliday junction resolution by the human GEN1 protein. Genes & Development. 24 (14), 1559-1569 (2010).
- Liu, Y., et al. Crystal Structure of a Eukaryotic GEN1 Resolving Enzyme Bound to DNA. Cell Reports. 13 (11), 2565-2575 (2015).
- Chan, Y. W., West, S. GEN1 promotes Holliday junction resolution by a coordinated nick and counter-nick mechanism. Nucleic Acids Research. 43 (22), 10882-10892 (2015).
- van Gool, A. J., Hajibagheri, N. M., Stasiak, A., West, S. C. Assembly of the Escherichia coli RuvABC resolvasome directs the orientation of holliday junction resolution. Genes & Development. 13 (14), 1861-1870 (1999).
- Lee, S. H., et al. Human Holliday junction resolvase GEN1 uses a chromodomain for efficient DNA recognition and cleavage. eLife. 4, (2015).
- Chan, Y. W., West, S. C. Spatial control of the GEN1 Holliday junction resolvase ensures genome stability. Nature Communications. 5, 4844 (2014).
- Liu, Y., Freeman, A. D., Declais, A. C., Lilley, D. M. J. A monovalent ion in the DNA binding interface of the eukaryotic junction-resolving enzyme GEN1. Nucleic Acids Research. 46 (20), 11089-11098 (2018).
- Zhou, R., et al. Junction resolving enzymes use multivalency to keep the Holliday junction dynamic. Nature Chemical Biology. 15 (3), 269-275 (2019).
- Bellendir, S. P., et al. Substrate preference of Gen endonucleases highlights the importance of branched structures as DNA damage repair intermediates. Nucleic Acids Research. 45 (9), 5333-5348 (2017).
- Sobhy, M. A., et al. Resolution of the Holliday junction recombination intermediate by human GEN1 at the single-molecule level. Nucleic Acids Research. 47 (4), 1935-1949 (2019).
- Sobhy, M. A., et al. Versatile single-molecule multi-color excitation and detection fluorescence set-up for studying biomolecular dynamics. Review of Scientific Instruments. 82 (11), 113702 (2011).
- Kapanidis, A. N., et al. Fluorescence-aided molecule sorting: analysis of structure and interactions by alternating-laser excitation of single molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (24), 8936-8941 (2004).
- Lee, N. K., et al. Accurate FRET measurements within single diffusing biomolecules using alternating-laser excitation. Biophysical Journal. 88 (4), 2939-2953 (2005).
- Rashid, F., et al. Initial state of DNA-Dye complex sets the stage for protein induced fluorescence modulation. Nature Communications. 10 (1), 2104 (2019).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Standard ethanol precipitation of DNA in microcentrifuge tubes. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
- Holden, S. J., et al. Defining the limits of single-molecule FRET resolution in TIRF microscopy. Biophysical Journal. 99 (9), 3102-3111 (2010).
- Bronson, J. E., Fei, J., Hofman, J. M., Gonzalez, R. L. Jr, Wiggins, C. H. Learning rates and states from biophysical time series: a Bayesian approach to model selection and single-molecule FRET data. Biophysical Journal. 97 (12), 3196-3205 (2009).
- Kou, S. C., Cherayil, B. J., Min, W., English, B. P., Xie, X. S. Single-molecule Michaelis-Menten equations. Journal of Physical Chemistry B. 109 (41), 19068-19081 (2005).
- Clegg, R. M., Murchie, A. I., Lilley, D. M. The solution structure of the four-way DNA junction at low-salt conditions: a fluorescence resonance energy transfer analysis. Biophysical Journal. 66 (1), 99-109 (1994).
- Pohler, J. R., Duckett, D. R., Lilley, D. M. Structure of four-way DNA junctions containing a nick in one strand. Journal of Molecular Biology. 238 (1), 62-74 (1994).
- Fogg, J. M., Lilley, D. M. Ensuring productive resolution by the junction-resolving enzyme RuvC: large enhancement of the second-strand cleavage rate. Biochemistry. 39 (51), 16125-16134 (2000).
- Sobhy, M. A., Joudeh, L. I., Huang, X., Takahashi, M., Hamdan, S. M. Sequential and multistep substrate interrogation provides the scaffold for specificity in human flap endonuclease 1. Cell Reports. 3 (6), 1785-1794 (2013).
- Rashid, F., et al. Single-molecule FRET unveils induced-fit mechanism for substrate selectivity in flap endonuclease 1. eLife. 6, e21884 (2017).
- Zaher, M. S., et al. Missed cleavage opportunities by FEN1 lead to Okazaki fragment maturation via the long-flap pathway. Nucleic Acids Research. 46 (6), 2956-2974 (2018).
- Didenko, V. V. DNA probes using fluorescence resonance energy transfer (FRET): designs and applications. BioTechniques. 31 (5), 1106-1116 (2001).
- Toseland, C. P. Fluorescent labeling and modification of proteins. Journal of Chemical Biology. 6 (3), 85-95 (2013).
- Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
- Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without pH drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
